LP 8. Microscopia optică a preparatelor native, a frotiurilor colorate.

Identificarea principalelor categorii microscopice microbiene

1. Microscopul este format din:

-o parte mecanică ( piciorul, corpul ansamblului mişcărilor, braţul, masa port obiect);

- o parte optică ( sistem de lentile: obiective, oculare);

- sistem de iluminare.

Puterea de mărire a unui microscop =produsul dintre puterea de mărire a obiectivului, a

ocularului şi a capului binocular.

2. Preparate microscopice

2.a Preparate microscopice umede

Indicaţii:

- evidenţierea motilităţii microorganismelor;

- observarea fungilor, protozoarelor, spirochetelor

microscopia cu fond întunecat este metoda de elecţie pentru evidenţierea

spirochetelor

- depistarea şi identificarea rapidă a unor elemente celulare şi necelulare în produse

patologice.

2.b Preparate microscopice fixate (colorate)

Indicaţii: evidenţierea caracterelor morfologie ale bacteriilor ( mărime, formă, aşezarea,

unele structuri speciale) şi afinitatea tinctorială (în coloraţii diferenţiale).

Frotiul este materialul microbian (produs patologic, cultură microbiană) etalat în strat cât

mai subţire şi uniform pe suprafaţa unei lame de microscop.

Etapele efectuării frotiului.

1. Etalarea.

2. Uscarea.

3. Fixarea prin caldură.

Coloraţii:

- simple: albastru de metilen- evidenţiază morfologia bacteriilor

- diferenţiale: Gram, Ziehl- Neelsen

-coloraţii speciale (flageli, spori)

3. Coloraţia Gram

Principiu: Peretele bacterian nu este colorabil, dar prin structura sa chimică

condiţionează colorabilitatea protoplastului în coloraţiile diferenţiale.

Pentru a explica comportarea diferită a bacteriilor în coloraţia Gram există două ipoteze (

ambele bazate pe diferenţa de structură a peretelui bacterian)

1. Peretele bacteriilor Gram - negative conţine până la 20% lipide şi este mai subţire

decât cel al bacteriilor Gram - pozitive. Alcoolul solubilizează lipidele şi face, astfel,

peretele permeabil pentru complexul violet iod care se îndepărtează .

2. Peretele bacteriilor gram pozitive nu conţine lipide. Alcoolul deshidratează peretele

şi, astfel, reduce diametrul porilor prin care ar putea difuza la exterior complexul

colorant violet-iod.

Etapele coloraţiei diferenţiale Gram:

Nr.

crt

Etapa Descrierea etapei Bacterii gram

pozitive

Bacterii gram

negative

1 Colorarea violet de metil, un minut, se spală Violet Violet

2 Mordanţarea Lugol, două minute, se varsă .

Nu se spală!

Violet Violet

3 Diferenţierea amestec alcool acetonă, 5-10

secunde, spală.

Violet Incolor

4 Recolorarea soluţie de fucsină fenicată Ziehl

diluată 1/10, 30 secunde, se spală.

Violet Roşu

Rezultat: bacterii gram pozitive=violet

bacterii gram negative=roşii

Controlul de calitate

- frotiu martor - suspensie care conţine un amestec de bacterii gram pozitive şi bacterii gram

negative ( ex: coci gram pozitivi şi bacili gram negativi)

-pe frotiurile efectuate din produs patologic, leucocitele sunt întotdeauna roşii.

Leucocite roşii şi bacterii gram pozitive = coloraţie Gram bine efectuată

Leucocite roşii şi bacterii gram negative= trebuie să examinăm frotiul martor.

Surse de eroare: -subdecolorarea

-supradecolorarea

Importanţa medicală a coloraţiei Gram

Prima etapă în identificarea bacteriilor

Orientează antibioterapia de primă intenţie

5. Microscopia cu imersie şi descrierea unui frotiu

Descrierea:

-forma – coci

-bacili

-variaţia formei- coci rotunzi (stafilococi, streptococi), ovali (streptococi), lanceolaţi

(pneumococi), reniformi (neisserii).

- bacili cu capetele rotunde, cu capetele tăiate drept (Genul Bacillus), cu

capetele măciucate (bacilii difterici)

-aşezarea: în grămezi (stafilococii), în lanţuri (streptococii), în diplo (pneumococii,

neisserii), în litere chinezeşti (bacilii difterici)

-mărime relativă: mic, mare

-afinitatea tinctorială : Gram pozitiv, Gram negativ

-prezenţa capsulei: pneumococii

- prezenţa sporului: -forma: oval (clostridii), sferic (C. tetani; Genul Bacillus)

-aşezare: central (Genul Bacillus), terminal (C.tetani), subterminal

(clostridii)

-dimensiune: mare, mic

Avantajele microscopiei:

- rapidă;

- cost redus;

-uşor de efectuat;

-orientează următoarele etape de diagnostic microbiologic;

-putem evidenţia bacterii necultivabile sau pe cele cu creştere lentă;

-informaţii cantitative ( 1 bacterie/câmp~ 105 UFC/ ml)

Dezavantajele microscopiei: sensibilitatea si specificitate redusă.

Cultivarea microorganismelor: scopuri, medii de cultură, metode de

cultivare şi urmărire a culturilor

1. Scopurile cultivării:

Medical - diagnosticul etiologic al infecţiilor bacteriene

- testarea sensibilităţii la antibiotice

Se discută cu studenţii necesitatea obţinerii “culturii pure”

Cultură pură = constituită din bacterii de acelaşi fel

= etapa indispensabilă identificării şi testării sensibilităţii la antibiotice

Industrial - obţinerea de antigene, vaccinuri, produse de biosinteză, bioconversie sau

fermentare

2. Definiţie Mediul de cultură = soluţie apoasă a unor substanţe nutritive (nutrienţi, factori de

creştere).

Nutrienţi = substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică.

Alimente = material crud din care derivă nutrienţii, prin digestie.

Factori de creştere = metaboliţi esenţiali pentru creştere: aminoacizi, baze azotate, vitamine.

Bacterii fastidioase = dependente de numeroşi factori de creştere

Condiţii pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură:

- să fie nutritiv.

- să asigure presiunea osmotică (în general, medii izotone) şi pH (în general, 7-7,5)

(similare celor din mediul intern).

- să fie steril, pentru a cultiva exclusiv microorganismele din produsul investigat.

- să fie transparent – facilitează urmărirea culturii.

- să permită separarea, unele de altele, a microorganismelor dintr-un produs microbian.

Clasificarea mediilor de cultură (criterii, repartizarea mediilor, exemple)

a. după provenienţa nutrienţilor:

- empirice – ingrediente de origine animală sau vegetală

- sintetice – ingrediente chimic pure → studiul necesităţilor nutritive ale bacteriilor

b. în raport de valoarea nutritivă:

-simple - bacterii nepretenţioase nutritiv

- îmbogăţite - bacterii pretenţioase nutritiv

c. după consistenţă:

- lichide – produse patologice monobacteriene

- solide – produse patologice pluribacteriene

- semisolide – studiul mobilităţii şi conservarea tulpinilor bacteriene.

d. după scopul utilizării:

- de izolare

uzuale - satisfac exigenţele nutritive pentru o gamă largă de specii bacteriene

diferenţiale - conţin substratul pentru anumite enzime bacteriene şi un indicator care atestă

atacarea acestui substrat un caracter metabolic diferenţiază între ele bacterii cu aspect al

culturii identic pe mediile simple.

selective - medii solide

- inhibă dezvoltarea bacteriilor de contaminare a prelevatelor

- frecvent sunt şi diferenţiale

de îmbogăţire - medii lichide

- favorizează multiplicarea bacteriilor a căror izolare o urmărim

- inhibă selectiv flora de asociaţie.

- de identificare – studiul activităţii biochimice a bacteriilor în scopul încadrării într-un

gen/specie.

- de conservare.

3. Cultivarea şi izolarea bacteriilor în cultură pură

Tehnicile uzuale de cultivare a bacteriilor: însămânţarea bacteriilor pentru obţinerea

culturii pure – se efectuează demonstrativ însămânţarea prin epuizare în 4 cadrane, pe

geloză simplă .

Însămânţare = depunerea în mediul de cultură a materialului bacterian, inoculum.

Cultură = totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicare

Colonie = masă de cultură, vizibilă cu ochiul liber pe suprafaţa unui mediu de cultură solid,

rezultată prin multiplicarea unei singure celule bacteriene sau a unui grup de celule, numit

unitate formatoare de colonii/UFC.

Descrierea caracterelor de cultură:

condiţii optime de cultivare:

- bacterii cultivabile vs. necultivabile;

- exigenţe nutritive: bacterii pretenţioase vs. nepretenţioase nutritiv;

- temperatura optimă de cultivare: psihrotrofe / psihrofile / mezofile / termofile;

- atmosfera optimă de cultivare: strict aerobe / strict anaerobe / facultativ anaerobe /

microaerofile / carboxifile;

- pH: neutru / bacterii acidofile / bacterii bazofile;

- presiune osmotică: bacterii care cultivă pe medii izotone/ bacterii halofile.

aspectul culturii pe medii lichide / solide (sublinierea diferenţelor):

- forma de cultură S şi forma de cultură R pe mediu lichid / solid:

- aspectul coloniilor: diametru, circumferinţa, relief, suprafaţă, culoare, transparenţa,

consistenţă, aderenţa la mediu;

modificări ale mediilor de cultură induse de cultivare (se prezintă comparativ mediile

sterile cu cele însămânţate)

- hemoliza pe agar-sânge: alfa / beta / gamma

- reacţii pe medii diferenţiale zaharate

- producerea de pigment difuzibil în mediu

- producerea unui miros particular.

Forma de cultură Mediu lichid Mediu solid

S - tulbură omogen mediile

lichide

- suprafaţa netedă, lucioasă

- contur circular

R - cultivă sub formă de grunji,

lăsând mediul supernatant

clar

- suprafaţa uscată, rugoasă

- margini neregulate