LUCRARE PRACTIC|

139

METODE FIZICE DE EVALUARE A PROTEINELOR

DIN SERUL SANGUIN

A. Date teoretice: refractometrie B. M\surarea prin refractometrie a concentra]iei

proteinelor totale din serul sanguin

C. Date teoretice: electroforez\, imunoelectroforez\

D. Separarea electroforetic\ a frac]iunilor proteice ale serului sanguin

E. Date teoretice: fotocolorimetria

F. Evaluarea fotocolorimetric\ a concentra]iei frac]i-

unilor proteice ale serului sanguin

G. Aplica]ii în practica medical\

H. Întreb\ri [i exerci]ii

Evaluarea proteinelor serice este una din cele mai des `ntâlnite determin\ri `n practica clinic\. Medicul poate ob]ine informa]ii deosebit de utile m\surând atât cantitatea total\ de proteine din serul pacientului (proteinemia), cât [i diferitele tipuri de proteine care pot fi separate `n prezent prin metode electroforetice. Astfel, cantitatea de albumine sc\zut\ poate indica o alterare a sintezei hepatice sau o pierdere a lor la nivel renal, `n diverse afec]iuni. Gamaglobulinele permit aprecierea func]iei imunitare etc. ~n lucrarea practic\ vor fi prezentate cele mai uzuale metode `ntâlnite `n laboratorul clinic pentru determinarea proteinelor, dar vor fi f\cute referiri [i la alte metode mai complexe, care permit o separare mai bun\ a acestor molecule.

�7

LUCRARE PRACTIC|

140

PARTEA PRACTIC|

Scopul refractometriei este mmmm \\\\ s u r a r e as u r a r e as u r a r e as u r a r e a c o n c e n t r a ] i e i u n e i s u b s t a n ] ec o n c e n t r a ] i e i u n e i s u b s t a n ] ec o n c e n t r a ] i e i u n e i s u b s t a n ] ec o n c e n t r a ] i e i u n e i s u b s t a n ] e . De exemplu, de interes medical este determinarea concentra]iei proteinelor totale din serul sanguin. Metoda se bazeaz\ pe faptul c\ i n d i c e l e d e i n d i c e l e d e i n d i c e l e d e i n d i c e l e d e r e f r a c ] i e v a r i a zr e f r a c ] i e v a r i a zr e f r a c ] i e v a r i a zr e f r a c ] i e v a r i a z \\\\ ` n f u n c ] i e d e ` n f u n c ] i e d e ` n f u n c ] i e d e ` n f u n c ] i e d e c o n c e n t r a ] i a m o l e c u l e l o r d i n m e d i u l c o n c e n t r a ] i a m o l e c u l e l o r d i n m e d i u l c o n c e n t r a ] i a m o l e c u l e l o r d i n m e d i u l c o n c e n t r a ] i a m o l e c u l e l o r d i n m e d i u l rrrr eeee f r i n g e n t c o n s i d e r a tf r i n g e n t c o n s i d e r a tf r i n g e n t c o n s i d e r a tf r i n g e n t c o n s i d e r a t , dup\ o ecua]ie de forma:

( )n = f c

~n exemplul de mai sus, dac\ din sângele integral `ndep\rt\m prin coagulare elementele figurate (care sunt puternic refringente), vom ob]ine serul sanguin. I n d i c e l e sI n d i c e l e sI n d i c e l e sI n d i c e l e s \\\\ u d e r e f r a c ] i e u d e r e f r a c ] i e u d e r e f r a c ] i e u d e r e f r a c ] i e d e p i n d e n um a i d e c o n ] i n u t u l ` n d e p i n d e n um a i d e c o n ] i n u t u l ` n d e p i n d e n um a i d e c o n ] i n u t u l ` n d e p i n d e n um a i d e c o n ] i n u t u l ` n p rp rp rp r oooo t e i n et e i n et e i n et e i n e , deoarece ionii au o putere refringent\ foarte mic\. Aceasta `nseamn\ c\ evaluarea concentra]iei proteinelor din serul sanguin se poate face m\surând fie indicele de refrac]ieindicele de refrac]ieindicele de refrac]ieindicele de refrac]ie al lichidului biologic, fie unghiul limitunghiul limitunghiul limitunghiul limit\\\\ corespunz\tor (care depinde de indicele de refrac]ie). Ca urmare, exist\ dou\ tipuri de refractometre:

I.I.I.I. R e f r a c t om e t r u l A b bR e f r a c t om e t r u l A b bR e f r a c t om e t r u l A b bR e f r a c t om e t r u l A b bé - a c\rui scal\ gradat\ permite citirea direct\ a i n d i c e l u i d e r e f r a c ] i ei n d i c e l u i d e r e f r a c ] i ei n d i c e l u i d e r e f r a c ] i ei n d i c e l u i d e r e f r a c ] i e al lichidului de cercetat; II.II.II.II. R e f r a c t om e t r u l P u l f r i c hR e f r a c t om e t r u l P u l f r i c hR e f r a c t om e t r u l P u l f r i c hR e f r a c t om e t r u l P u l f r i c h - pe scala c\ruia se cite[te u n g h i u l l i m i tu n g h i u l l i m i tu n g h i u l l i m i tu n g h i u l l i m i t \\\\ ,,,, care va fi apoi transformat `n indice de refrac]ie [i concentra]ie de substan]\. I. ~n cazul refractometrului P u l f r i c hP u l f r i c hP u l f r i c hP u l f r i c h , piesa esen]ial\ care permite m\surarea unghiului limit\ este

B. M\surarea prin refractometrie a concentra]iei proteinelor totale din serul sanguin �

Fig. 3Fig. 3Fig. 3Fig. 3 Refractometrul Pulfrich (1921)

LUCRARE PRACTIC|

141

p r i s m a d e mp r i s m a d e mp r i s m a d e mp r i s m a d e m \\\\ s u rs u rs u rs u r \\\\ , confec]ionat\ din sticl\ optic\ cu un indice de refrac]ie cunoscut. ~ntre una din fe]ele acestei prisme (numit\ fa]a de inciden]fa]a de inciden]fa]a de inciden]fa]a de inciden]\\\\, corespunzând prismei de m\sur\) [i substan]a a c\rui indice de refrac]ie se determin\, se stabile[te un contact optic. Acesta constituie suprafa]a de separare pe care are loc refrac]ia total\. Razele emergente se observ\ `n lunet\ prin cea de-a doua fa]\ - fa]a de fa]a de fa]a de fa]a de convergen]convergen]convergen]convergen]\\\\ a prismei, care corespunde prismei de iluminare. S\ urm\rim fenomenul care se produce la limita de separa]ie `n acest caz (fig. 4). Conform principiului reversibilit\]ii razelor de lumin\, consider\m un fascicul de radia]ii monocromatice care p\trunde `n mediul mai pu]in dens (cu indice de refrac]ie n1) sub un unghi de

aproximativ 90°. ~n acest caz, unghiul de refrac]ie va avea valoarea corespunz\toare unghiului limit\ (llll). Legea a doua a refrac]iei se poate scrie:

sin

sin

ir

= =n

nn2

1

Dar i = 90°, iar r va fi `nlocuit cu l; `n acest caz rela]ia se va scrie:

sin

sin

90°=

ln

n2

1

dar sin 90° = 1 [i atunci rela]ia devine: n n sin1 2= ⋅ l

Aceasta este rela]ia fundamentalAceasta este rela]ia fundamentalAceasta este rela]ia fundamentalAceasta este rela]ia fundamental\\\\ pe care se bazeaz\ construc]ia [i folosirea refractometrelor. Din rela]ia precedent\ se observ\ c\, m\surând valoarea unghiului limit\ (l) [i cunoscând valoarea indicelui de refrac]ie al sticlei (n2), putem afla care este valoarea indicelui de refrac]ie al mediului mai pu]in dens (n1). D e s c r i e r e a r e f r a c t om e t r u l u i P u l f r i c hD e s c r i e r e a r e f r a c t om e t r u l u i P u l f r i c hD e s c r i e r e a r e f r a c t om e t r u l u i P u l f r i c hD e s c r i e r e a r e f r a c t om e t r u l u i P u l f r i c h ~n cazul lucr\rii noastre, evaluarea concentra]iei proteinelor totale se va face cu ajutorul refractometrului Pulfrich, a c\rui schem\ de principiu este redat\ `n figura 5. Pricipiul de func]ionare al acestuia se bazeaz\ pe f e n om e n u l d e r e f l e x i e t o t a lf e n om e n u l d e r e f l e x i e t o t a lf e n om e n u l d e r e f l e x i e t o t a lf e n om e n u l d e r e f l e x i e t o t a l \\\\ ....

Fig. 5Fig. 5Fig. 5Fig. 5 Refractometrul PuRefractometrul PuRefractometrul PuRefractometrul Pullllfrichfrichfrichfrich 1 - prism\ de m\sur\; 2 - prism\ de iluminare; 3 - compensator; 4 - ocular; 5 - [urub micrometric; 6 - sistem pentru etalonare; 7 - termometru

6 3 4

2 1 5

7

i≅90°

l

n1

n2

Fig. 4Fig. 4Fig. 4Fig. 4 Fenomenul de reflexie total\ la limita de separare a prismei de m\sur\ `n cazul refractometrului Pulfrich

LUCRARE PRACTIC|

142

Refractometrul Pulfrich se compune din trei p\r]i principale: un s i s t em d e p r i sm es i s t em d e p r i sm es i s t em d e p r i sm es i s t em d e p r i sm e , t u b u l t u b u l t u b u l t u b u l o p t i co p t i co p t i co p t i c [i c omp ec omp ec omp ec omp e nnnn s a t o r u ls a t o r u ls a t o r u ls a t o r u l . Partea principal\ a refractometrului o constituie s i s t em u l d e p r i sm es i s t em u l d e p r i sm es i s t em u l d e p r i sm es i s t em u l d e p r i sm e format din p r i sm a d ep r i sm a d ep r i sm a d ep r i sm a d e mmmm \\\\ s u r a r es u r a r es u r a r es u r a r e [i p r i s m a d e i l um i n a r ep r i s m a d e i l um i n a r ep r i s m a d e i l um i n a r ep r i s m a d e i l um i n a r e . Cele dou\ prisme delimiteaz\ `ntre ele un spa]iu `n care se va introduce lichidul a c\rui concentra]ie dorim s\ o m\sur\m (`n cazul nostru serul sanguin). Deoarece indicele de refrac]ie variaz\ cu temperatura, sistemul de prisme este prev\zut cu o manta de termostatare. Prin aceasta circul\ ap\ men]inut\ la temperatur\ constant\ de c\tre un ultratermostat. T u b u l o p t i cT u b u l o p t i cT u b u l o p t i cT u b u l o p t i c al refractometrului este prev\zut cu un ocular ce are o scal\ divizat\ `n unit\]i cuprinse `ntre -5 [i 100, pentru citirea limitei de separa]ie dintre zona luminoas\ [i cea `ntunecat\ (fig. 5). C omp e n s a t o r u lC omp e n s a t o r u lC omp e n s a t o r u lC omp e n s a t o r u l este format dintr-un sistem de prisme Amici, care au rolul de a recombina lumina dispersat\, atunci când nu se lucreaz\ cu lumin\ monocromatic\. Fenomenul de dispersie apare `n cazul `n care se utilizeaz\ lumin\ alb\ deoarece indicele de refrac]ie [i, implicit, unghiul limit\ depind de lungimea de und\ a radia]iei incidente (fig. 6). Ca surs\ de lumin\ monocromatic\ se poate folosi o lamp\ de sodiu. ~n cazul refractometrului Pulfrich, razele p\trund sub diverse inciden]e prin prisma de iluminare, trecând apoi prin lichidul de cercetat (ser) (fig. 8). Razele care ajung aproximativ paralele cu fa]a prismei de m\sur\ `n contact cu

lichidul (i = 90°) vor fi refractate sub un unghi egal cu unghiul limit\ (fig. 9). Toate razele care cad pe prisma de m\sur\ sub

un unghi de inciden]\ mai mic de 90° vor fi refractate sub unghiuri mai mici decât unghiul limit\ [i vor contribui la apari]ia zonei luminoase `n ocular. Deasupra razei limit\ se va observa `n ocular zona `ntunecat\.

Fig. 7Fig. 7Fig. 7Fig. 7 Dispersia luminii prin prismele refractometrului Pulfrich `n cazul folosirii luminii albe

n1

n2

l

l

n1<n2

n1

n2

l

n1<n2

Fig. 6Fig. 6Fig. 6Fig. 6 Scala refractometrului

Pulfrich

100 90 80 70 60

50 40 30 20 10 0 -5

LUCRARE PRACTIC|

143

M o d d e l u c r uMo d d e l u c r uMo d d e l u c r uMo d d e l u c r u

Se parcurg doi timpi principali de lucru:

1. Verificarea exactit\]ii refractometrului; 2. M\surarea unghiului limit\ pentru serul sanguin.

1.1.1.1. Ve r i f i c a r e a e x a c t i tV e r i f i c a r e a e x a c t i tV e r i f i c a r e a e x a c t i tV e r i f i c a r e a e x a c t i t \\\\ ] i i ] i i ] i i ] i i r e f r a c tr e f r a c tr e f r a c tr e f r a c t oooom e t r u l u im e t r u l u im e t r u l u im e t r u l u i necesit\ urm\toarele opera]iuni:

• Se conecteaz\ lampa de sodiu sau sursa de lumin\ alb\ la re]eaua de 220 V [i se ac]ioneaz\ comutatorul plasat pe alimentator.

• Se conecteaz\ ultratermostatul la re]eaua de 220V,

temperatura de lucru (17,5° C) fiind fixat\ de personalul tehnic al laboratorului.

• Sistemul de prisme fiind `nchis, cu ajutorul unei pipete Pasteur se introduc câteva pic\turi de ap\ distilat\ `ntre cele dou\ prisme, prin orificiul din arm\tura prismelor.

NU introduce]i vârful pipetei adânc `n orificiul din arm\tura prismelor pentru a nu zgâria

suprafe]ele acestora!!!!

• Se a[eaz\ [urubul micrometric la zero ([urubul micrometric se afl\ lâng\ ocularul refractome-trului).

• Când se prive[te prin ocularul refractometrului se observ\ o zon\ luminoas\, o zon\ `ntunecat\ [i, de asemenea, imaginea scalei. Dac\ limita de separare a celor dou\ zone precum [i diviziunile scalei nu se v\d clar, se rote[te ocularul pentru a stabili claritatea imaginii.

O b s e r v a ] i eO b s e r v a ] i eO b s e r v a ] i eO b s e r v a ] i e : dac\ limita de demarca]ie `ntre cele dou\ zone nu se observ\ clar, `nseamn\ c\ filmul (pelicula) de lichid de pe suprafa]a prismelor nu este continuu, existând bule de aer care au alt indice de refrac]ie fa]\ de mediul studiat. ~n acest caz se deschide sistemul de prisme, se [terg suprafe]ele cu o

r l i

Lunet\

Prism\ de iluminare

Prism\ de m\sur\

Fig. 9Fig. 9Fig. 9Fig. 9 Razele aproximativ paralele cu fa]a prismei de m\sur\ sunt refractate sub un unghi egal cu unghiul limit\

Raze care vin din toate direc]iile

Raze difuzate `n toate direc]iile Fa]\ de

inciden]\

Prism\ de iluminare

Prism\ de m\sur\

Fig. 8Fig. 8Fig. 8Fig. 8 Drumul razelor de lumin\ ajunse sub diverse inciden]e la prisma de iluminare

P

�

LUCRARE PRACTIC|

144

buc\]ic\ de tifon `nmuiat\ `n ap\ [i apoi `n xilol, se `nchid prismele [i se reintroduce apa distilat\. ~n cazul apei distilate, linia de demarca]ie se va afla `ntre diviziunile 85 [i 86. Rotind viza micrometric\, aduce]i linia de demarca]ie la valoarea 85. Cifra pe care o indic\ viza micrometric\ reprezint\ valoarea zecimalei. Pentru ap\ distilat\ ve]i ob]ine valoarea 85,5 (orice abatere indic\ faptul c\ aparatul nu este bine pus la punct; solicita]i reglarea aparatului). Datorit\ faptului c\ suprafa]a de m\sur\ a prismei este `ndreptat\ `n sus, iar cea a prismei de iluminare `n jos, pozi]ia limitei de separare este `ntoars\ [i de aceea va trebui ca valorile ce se ob]in s\ fie sc\zute din 100. ~n cazul apei distilate, valoarea unghiului limit\ va fi:

100 - 85,5 = 14,5

2 .2 .2 .2 . MMMM\\\\ s u r a r e a u n g h i u l u i l i m i ts u r a r e a u n g h i u l u i l i m i ts u r a r e a u n g h i u l u i l i m i ts u r a r e a u n g h i u l u i l i m i t \\\\ p e n t r u p e n t r u p e n t r u p e n t r u s e r u l s as e r u l s as e r u l s as e r u l s a nnnn g u i ng u i ng u i ng u i n

Pentru serul sanguin, opera]iunile ce trebuie executate sunt identice celor de la ap\ distilat\, cu men]iunea c\ `naintea determin\rii se cur\]\ suprafe]ele celor dou\ prisme. Valorile unghiului limit\ citite pe scala refractometrului Pulfrich sunt convertite `n valori ale concentra]iei proteinelor din ser (g/l) cu ajutorul unor tabele speciale numite t a b e l e W at a b e l e W at a b e l e W at a b e l e W a gggg n e rn e rn e rn e r .

P r e z e n t a r e a r e z u l t a t e l o r P r e z e n t a r e a r e z u l t a t e l o r P r e z e n t a r e a r e z u l t a t e l o r P r e z e n t a r e a r e z u l t a t e l o r d e t ed e t ed e t ed e t e rrrr m i nm i nm i nm i n \\\\ r i l o rr i l o rr i l o rr i l o r

Valorile ob]inute de fiecare dintre membrii subgrupei sunt trecute `ntr-un tabel asem\n\tor celui de mai jos: Nr. det.Nr. det.Nr. det.Nr. det. Unghiul limitUnghiul limitUnghiul limitUnghiul limit\\\\ Concentra]ia prConcentra]ia prConcentra]ia prConcentra]ia prooooteinelor teinelor teinelor teinelor

(g/l)(g/l)(g/l)(g/l)

1 2 3 4

Materiale necesare:Materiale necesare:Materiale necesare:Materiale necesare: • Refractometru Pulfrich cu

prisme termostatate. • Lamp\ de sodiu cu transfor-

mator la 220 V sau surs\ de lumin\ alb\.

• Ultratermostat. • Dou\ pipete Pasteur. • Eprubet\ cu circa 2 ml ser

sanguin. • Flacon de 500 ml cu ap\

distilat\. • Tifon. • Hârtie de filtru.

Condi]ii de lucru cerute de Condi]ii de lucru cerute de Condi]ii de lucru cerute de Condi]ii de lucru cerute de mmmmeeeetodtodtodtod\\\\:::: • temperatur\ constant\ [i

cunoscut\ (17,5°C); • suprafe]ele prismelor perfect

cur\]ate.

LUCRARE PRACTIC|

145

*Valoarea normal\ a concentra]iei proteinelor `n serul sanguin este cuprins\ `ntre 6 06 06 06 0 ---- 8 0 g / l8 0 g / l8 0 g / l8 0 g / l .

Tabel WagnerTabel WagnerTabel WagnerTabel Wagner SerulSerulSerulSerul sanguinsanguinsanguinsanguin ExudateExudateExudateExudate [i

tratratratrannnnsudatesudatesudatesudate Diviz Diviz Diviz Diviz scalscalscalscal\\\\

Proteine Proteine Proteine Proteine (g/l)(g/l)(g/l)(g/l)

Calcularea Calcularea Calcularea Calcularea zeczeczeczeciiiimalelormalelormalelormalelor

Diviz Diviz Diviz Diviz scalscalscalscal\\\\

ProteineProteineProteineProteine (g/l)(g/l)(g/l)(g/l)

25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

6,3 8,6 10,8 13,0 15,2 17,4 19,6 21,8 24,0 26,2 28,4 30,6 32,8 35,0 37,2 39,4 41,6 43,8 46,0 48,1 50,3 52,5 54,7 56,8 59,0 61,2 63,4 65,5 67,7 69,8 72,0 74,2 76,3 78,5 80,6 82,8 84,9 87,1 89,2 91,4 93,5 95,7 97,8 99,9 102,0 104,1

DifeDifeDifeDiferen]a de ren]a de ren]a de ren]a de zecimizecimizecimizecimi 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Diferen]a de Diferen]a de Diferen]a de Diferen]a de zecimizecimizecimizecimi 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Diferen]a de Diferen]a de Diferen]a de Diferen]a de zecimizecimizecimizecimi 1 2 3 4 5 6 7 8 9

2,02,02,02,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,12,12,12,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,1 1,3 1,5 1,7 2,22,22,22,2 0,2 0,4 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 2,0

25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70

7,7 9,7 11,8 13,8 15,9 18,0 20,1 22,1 24,2 26,2 28,3 30,4 32,4 34,5 36,5 38,6 40,7 42,7 44,8 46,8 48,9 51,0 53,0 55,0 57,0 59,0 61,1 63,1 65,1 67,1 69,1 71,2 73,2 75,2 77,2 79,2 81,2 83,2 85,2 87,2 89,2 91,2 93,2 95,2 97,2 99,1

Cum folosim tabelul WaCum folosim tabelul WaCum folosim tabelul WaCum folosim tabelul Waggggnernernerner? Presupunând c\ refractometrul indic\ 44,5, valoarea unghiului limit\ va fi:

100 - 44,5 = 55,5 C\ut\m `n coloana valorilor `ntregi cifra 55 [i not\m valoarea corespunz\toare a concentra]iei proteinelor, `n cazul nostru 72,0 g/l. Pentru a stabili valoarea concentra]iei corespunz\toare zecimalei proced\m astfel: se face diferen]a dintre valorile `ntregi 56 [i 55 (unghiul limit\ este situat `ntre aceste dou\ valori), adic\:

74,2 - 72,0 = 2,2 C\ut\m `n coloana co-

respunz\toare diferen]ei `n zecimi ob]inut\, adic\ 2,2. Corespunz\tor valorii 5 (zecimalei) g\sim valoarea

concentra]iei 1,1. Valoarea final\ a concentra-]iei va fi :

72,0 + 1,1 = 73,1 g/l

�

LUCRARE PRACTIC|

146

II. II. II. II. R e f r a c t om e t r u l A b b éR e f r a c t om e t r u l A b b éR e f r a c t om e t r u l A b b éR e f r a c t om e t r u l A b b é (fig. 10) permite m\surarea indicelui de refrac]ie al lichidelor cu precizie de ordinul 10-4.

P\r]ile componente ale refractometrului (fig.11) sunt urm\toarele: a.)a.)a.)a.) Sistemul de prismeSistemul de prismeSistemul de prismeSistemul de prisme reprezint\ partea principal\ a aparatului, fiind alc\tuit dintr-o prism\ de m\sur\ situat\ `n partea inferioar\ [i o prism\ de iluminare. Ambele prisme sunt confec]ionate din sticl\ flint (n=1,75), au dou\ fe]e de contact (care nu se ating) [i formeaz\ un bloc paralelipipedic. Fiecare prism\ este fixat\ `ntr-o montur\ metalic\ prin care circul\ un curent de ap\ cu temperatur\ constant\, de la un ultratermostat. Temperatura poate fi citit\ la un termometru (10) ata[at la sistemul de prisme. ~ntre planele prismelor se introduc 1-2 pic\turi din lichidul de cercetat, al c\rui indice de refrac]ie este mai mic decât indicele de refrac]ie al prismelor. Valoarea indicelui de refrac]ie al prismelor reprezint\ limita superioar\ a scalei de m\sur\ a aparatului. Sursa de lumin\ utilizat\ este o lamp\ de sodiu (13) situat\ `n fa]a prismei de iluminare, f\când corp comun cu aceasta. Razele de lumin\ ce provin de la surs\ sunt reflectate cu ajutorul oglinzii (14) situat\ la partea inferioar\ a prismelor. Fa]a de contact a prismei

Fig. 10Fig. 10Fig. 10Fig. 10 Refractometrul Abbé (AR 3 - Krüss Optronic )

4444

1111

6666

2222

8888

5555

3333

9999 10101010

11111111

12121212

13131313

14141414

7777

4444

F i g . 1 1F i g . 1 1F i g . 1 1F i g . 1 1 S c h em a r e f r a c t o m e t r u l u i A b b é 1 - ocular; 2 , 3 - racorduri pentru termostatarea prismei

de iluminare; 4 - [urub pentru reglarea compensatoru-

lui; 5, 11 - racorduri pentru termostatarea prismei

de iluminare; 6 - [urub pentru manevrarea scalei; 7 - luneta; 8 - tambur pentru deschiderea blocului de

prisme; 9 - sursa de iluminare a scalei; 10 - termometru; 12 - prisma de iluminare; 13 - lampa de sodiu; 14 - oglind\.

�

LUCRARE PRACTIC|

147

de iluminare este mat\ [i difuzeaz\ lumina care o str\bate `n toate direc]iile. Datorit\ reflexiei totale, razele care p\trund `n prisma de m\sur\ vor face cu normala la fa]a de contact a acesteia un unghi mai mic sau egal cu unghiul limit\; b.) Lunetb.) Lunetb.) Lunetb.) Luneta a a a este alc\tuit\ dintr-un sistem de lentile convergente având rolul de a capta razele care emerg din prisma de m\sur\. ~n câmpul vizual al lunetei se observ\ o zon\ luminoas\ [i una `ntunecat\ (fig. 12). Limita de separa]ie `ntre cele dou\ zone corespunde razelor cu `nclinare maxim\ fa]\ de normala la suprafa]a prismei. Pozi]ia acestei limite de separa]ie poate fi modificat\ rotind [urubul (6). ~n ocularul lunetei sunt fixate dou\ fire reticulare, perpendiculare `ntre ele (fig. 12). Pentru determinarea indicelui de refrac]ie, limita dintre zona `ntunecat\ [i cea luminoas\ se aduce exact la punctul de intersec]ie al firelor reticulare. ~n partea inferioar\ a câmpului vizual al lunetei se afl\ un fir reticular vertical `n fa]a c\ruia se deplaseaz\ o scal\ gradat\ `n indici de refrac]ie (1,300-1,700) [i o scal\ `n procente Brix (fig. 13). Scala Brix (dup\ numele inventatorului ei, omul de [tiin]\ german Adolf Brix) este `n direct\ corela]ie cu indicele de refrac]ie [i exprim\ procentual (0-95%) cantitatea de substan]\ solid\ (ex.: sucroz\, clorur\ de sodiu, etc.) dizolvat\ `n 100 ml de ap\. Cele dou\ scale sunt iluminate cu ajutorul unei surse de lumin\ alb\ (9); c.) Compensatorulc.) Compensatorulc.) Compensatorulc.) Compensatorul este situat `ntre blocul de prisme [i lunet\ [i este alc\tuit din dou\ prisme Amici identice. Compensatorul are rol de a recombina lumina dispersat\ `n prisma de m\sur\, ob]inându-se o limit\ de separa]ie net\ `ntre zona `ntunecoas\ [i cea luminoas\. Compensatorul se regleaz\ `n pozi]ia corect\ rotind [urubul (4).

0%

1,300 1,700

95%

Fig. 13Fig. 13Fig. 13Fig. 13 Scala refractometrului Abbé

Fig. 12Fig. 12Fig. 12Fig. 12 Limita de separa]ie `ntre zona luminoas\ [i cea `ntunecat\

LUCRARE PRACTIC|

148

M od d eMod d eMod d eMod d e l u c r ul u c r ul u c r ul u c r u S e p a r c u r g u rm\ t o a r e l e e t a p e : 1. Verificarea exactit\]ii refractometrului Abbé; 2. M\surarea indicelui de refrac]ie al serului sanguin. 1.)1.)1.)1.) Verificarea exactitVerificarea exactitVerificarea exactitVerificarea exactit\\\\]ii refractometrului Abbé ]ii refractometrului Abbé ]ii refractometrului Abbé ]ii refractometrului Abbé se face cu ap\ distilat\ al c\rei indice de refrac]ie la

temperatura de 17,5 °°°°C este 1,3329. • Se conecteaz\ transformatorul la re]ea (220 V) [i se ac]ioneaz\ `ntrerup\torul plasat pe conductorii de alimentare a surselor; ATEN}IEATEN}IEATEN}IEATEN}IE! ! ! ! Nu modifica]i polaritatea curentului de alimentare a surselor!

• Se conecteaz\ ultratermostatul la re]ea, temperatura

de lucru (17,5 °C) fiind reglat\ de personalul tehnic al laboratorului;

• Cu ajutorul [urubului (8) se deschide sistemul de prisme. Fe]ele de contact ale celor dou\ prisme se cur\]\ cu o bucat\ de tifon umezit\ cu alcool [i se las\ s\ se usuce;

• cu o pipet\ Pasteur se a[eaz\ pe suprafa]a lucioas\ a prismei de m\sur\ 1-2 pic\turi de ap\ distilat\;

Nu atinge]i suprafa]a prismei cu vârful pipetei!

• Se `nchide sistemul de prisme [i se a[teapt\ câteva minute pentru egalarea temperaturii lichidului de cercetat cu cea a apei din termostat. Temperatura se cite[te de pe scala termometrului (10);

• Privind `n ocularul lunetei se observ\ o zon\ `ntunecat\, una luminoas\ [i imaginea scalei. Se regleaz\ pozi]ia ocularului astfel `ncât imaginea s\ fie clar\;

• Cu ajutorul [urubului (6) se aduce limita de separa]ie dintre cele dou\ zone la punctul de intersec]ie al firelor reticulare (fig. 12).

• Se rote[te [urubul (4) pân\ ce limita de separa]ie `ntre cele dou\ zone devine net\;

Tabel 1. Tabel 1. Tabel 1. Tabel 1. Corec]ia de temperatur\ pentru indicele de refrac]ie al apei distilate

TemperaturaTemperaturaTemperaturaTemperatura

((((°°°°C)C)C)C) Indice de Indice de Indice de Indice de refrac]ierefrac]ierefrac]ierefrac]ie

10101010 11111111 12121212 13131313 14141414 15151515 16161616 17171717 18181818 19191919 20202020 21212121 22222222 23232323 24242424 25252525 26262626 27272727 28282828 29292929 30303030 31313131 32323232 33333333 34343434 35353535 36363636 37373737 38383838 39393939 40404040

1,33369 1,33364 1,33358 1,33352 1,33346 1,33339 1,33331 1,33324 1,33316 1,33307 1,33299 1,33290 1,33280 1,33271 1,33261 1,33250 1,33240 1,33229 1,33217 1,33206 1,33194 1,33182 1,33170 1,33157 1,33144 1,33131 1,33117 1,33104 1,33090 1,33075 1,33061

P

�

LUCRARE PRACTIC|

149

• Se cite[te valoarea indicelui de refrac]ie de pe scal\, `n dreptul firului vertical. Pentru temperatura de lucru, valoarea indicelui de refrac]ie m\surat\ cu refractometrul Abbé trebuie s\ coincid\ cu cea din tabelul 2.

2.) 2.) 2.) 2.) Se [terg prismele [i se trece la mmmm\\\\surarea indisurarea indisurarea indisurarea indicelui celui celui celui de refrac]ie al serului sanguinde refrac]ie al serului sanguinde refrac]ie al serului sanguinde refrac]ie al serului sanguin, parcurgându-se acelea[i etape ca `n cazul apei distilate. Valorile indicelui de refrac]ie citite pe scala refractometrului Abbé sunt convertite `n valori ale concentra]iei proteinelor din ser (g/l) cu ajutorul tabelului 2.

Datele ob]inute de fiecare dintre membrii subgrupei sunt trecute `ntr-un tabel asem\n\tor celui al\turat.

Re f r a c t ome t r u l c l i n i c po r t ab i l Re f r a c t ome t r u l c l i n i c po r t ab i l Re f r a c t ome t r u l c l i n i c po r t ab i l Re f r a c t ome t r u l c l i n i c po r t ab i l ( f i g . 14) permite m\surarea direct\ a concentra]iei de al-bumine din serul sanguin (g/dl) [i a densita]ii urinii (g/cm3). Mod de l uc ru :Mod de l uc ru :Mod de l uc ru :Mod de l uc ru :

1.) Verificarea exactit1.) Verificarea exactit1.) Verificarea exactit1.) Verificarea exactit\\\\]ii refractometrului:]ii refractometrului:]ii refractometrului:]ii refractometrului:

• se `ndreapt\ refractometrul cu prisma spre o surs\ de lumin\, astfel `ncât, rotind [urubul ocularului (5) s\ ob]inem o imagine clar\ a scalei refractometrului;

• se ridic\ lama de protec]ie (2) [i se depun cu o pipet\ din plastic 1-2 pic\turi de ap\ distilat\ pe suprafa]a prismei;

• cu ajutorul [urubului (3) se regleaz\ scala astfel `ncât linia de separa]ie `ntre zona luminoas\ [i cea `ntunecat\ s\ coincid\ cu reperul W W W W (fig. 15);

2.)2.)2.)2.) Se ridic\ lama de protec]ie (2), se [terge u[or suprafa]a prismei cu hârtie de filtru [i se trece la mmmm\\\\ su r a r e a conc en t r a ] i e i d e a l bumine d in s u r a r e a conc en t r a ] i e i d e a l bumine d in s u r a r e a conc en t r a ] i e i d e a l bumine d in s u r a r e a conc en t r a ] i e i d e a l bumine d in s e r u l s angu inse ru l s angu inse ru l s angu inse ru l s angu in , parcurgându-se acelea[i etape ca `n cazul apei distilate. Limita de separa]ie `ntre zona luminoas\ [i cea intunecat\ va indica concentra]ia de albumine din ser. ~n acela[i mod se procedeaz\ pentru m\surarea densit\]ii urinii. Scala pentru m\surarea concentra]iei de albu-

mine este gradat\ pentru temperaturi `ntre 5-35°C, `n

Nr. det.Nr. det.Nr. det.Nr. det. Indice de Indice de Indice de Indice de refrac]ierefrac]ierefrac]ierefrac]ie

Concentra]iaConcentra]iaConcentra]iaConcentra]ia prprprprooooteinelor teinelor teinelor teinelor (g/l)(g/l)(g/l)(g/l)

1 2 3 4

Fig. 14Fig. 14Fig. 14Fig. 14 Refractometrul clinic portabil: 1 - prism\ de m\sur\, 2 - lam\ transparent\ pentru protec]ia prismei,

3 - [urub pentru reglajul scalei, 4 - tub optic, 5 - ocular.

1111

2222

3333

4444

5555

1,0001,0001,0001,000

12121212

0000

WWWW

1,0401,0401,0401,040

albumine `nalbumine `nalbumine `nalbumine `n ser (g/dl)ser (g/dl)ser (g/dl)ser (g/dl)

densitatea densitatea densitatea densitatea urinii urinii urinii urinii (g/cm(g/cm(g/cm(g/cm3333))))

Fig. 15Fig. 15Fig. 15Fig. 15 Scala refractometrului portabil

P

LUCRARE PRACTIC|

150

diviziuni cu valoarea de 0,2 g/dl, iar pentru densitatea urinii diviziunea are valoarea de 0,002 g/cm3.

Tabel 2. Tabel 2. Tabel 2. Tabel 2. Concentra]ia proteinelor `n func]ie de indicele de refrac]ie pentru temperatura de 17,5 °C

Indice de refrac]ieIndice de refrac]ieIndice de refrac]ieIndice de refrac]ie (17,5(17,5(17,5(17,5°°°°C)C)C)C)

Concentra]ia proteineConcentra]ia proteineConcentra]ia proteineConcentra]ia proteinelorlorlorlor serice ( g%)serice ( g%)serice ( g%)serice ( g%)

Concentra]ia proteinelor `nConcentra]ia proteinelor `nConcentra]ia proteinelor `nConcentra]ia proteinelor `n exudate [i transudate (g%)exudate [i transudate (g%)exudate [i transudate (g%)exudate [i transudate (g%)

1,33705 1,33743 1,33781 1,33820 1,33858 1,33896 1,33934 1,33972 1,34010 1,34048 1,34086 1,34124 1,34162 1,34199 1,34237 1,34275 1,34313 1,34350 1,34388 1,34426 1,34463 1,34500 1,34537 1,34575 1,34612 1,34650 1,34687 1,34724 1,34761 1,34798 1,34836 1,34873 1,34910 1,34947 1,34984 1,35021 1,35058 1,35095 1,35132 1,35169 1,35205 1,35242 1,35279 1,35316 1,35352 1,35388

6,3 8,6 10,8 13 15,2 17,4 19,6 21,8 24 26,2 28,4 30,6 32,8 35 37,2 39,4 41,6 43,8 46 48,1 50,3 52,5 54,7 56,8 59 61,2 63,4 65,5 67,7 69,8 72 74,2 76,9 78,5 80,6 82,8 84,9 87,1 89,2 91,4 93,5 95,7 97,8 99,9 102 104,1

7,7 9,7 11,8 13 15,9 17 20,1 22,1 24,2 26,2 28,3 30,4 32,4 34,5 36,5 38,6 40,7 42,7 44,8 46,8 48,9 51 53 55 57 59 61,1 63,1 65,1 67,1 69,1 71,2 73,2 75,2 77,2 79,2 81,2 83,2 85,2 87,2 89,2 91,2 93,2 95,2 97,2 99,1

LUCRARE PRACTIC|

151

PARTEA PRACTIC|

~n metoda electroforezei pe hârtie de filtru (metoda uzual\ folosit\ `n spitale) se utilizeaz\ o hârtie de filtru de tip Whatmann `mbibat\ `ntr-o solu]ie tampon cu pH = 8,6. Banda de hârtie este `ntins\ `ntr-un spa]iu `nchis (camera de electroforez\), `n care s-a creat un câmp electric prin introducerea a doi electrozi. Serul de analizat este aplicat pe banda de hârtie sub form\ de pic\tur\ sau dung\ [i sub influen]a tensiunii electrice aplicate la capetele benzii acesta se deplaseaz\ [i se desface `n frac]iuni: albumine [i

globuline (α1, α2, β, γ). Cele cinci frac]iuni proteice ale serului sanguin devin vizibile pe banda de hârtie dac\ dup\ migrare se coloreaz\ cu un colorant specific. Acesta poate fi de exemplu albastru de bromfenol, care se absoarbe diferen]iat, `n func]ie de concentra]ia de protein\ `ntâlnit\. Se ob]ine astfel e l e c t re l e c t re l e c t re l e c t r oooo f o r e g r am af o r e g r am af o r e g r am af o r e g r am a .

I n s t a l a ] i a d e e l e c t r o f oI n s t a l a ] i a d e e l e c t r o f oI n s t a l a ] i a d e e l e c t r o f oI n s t a l a ] i a d e e l e c t r o f o r e zr e zr e zr e z \\\\ sssse constituie din: camera de electroforez\ [i alimentatorul electric. C am e r a d e e l e c t r o f o r e zC am e r a d e e l e c t r o f o r e zC am e r a d e e l e c t r o f o r e zC am e r a d e e l e c t r o f o r e z \\\\ prezentat\ `n figura 23 este o cutie etan[\ din material plastic. Ridicând capacul vom observa la fiecare cap\t al cutiei cuvele pentru solu]ia tampon. Fiecare cuv\ are dou\ compartimente, unul `n care p\trunde electrodul de platin\, iar cel\lalt `n care p\trunde cap\tul benzii de hârtie. Cele dou\ compartimente comunic\ `ntre ele prin orificii. A[a cum am precizat, capacul `nchide etan[ camera de electroforez\ pentru a preveni evaporarea solu]iei tampon [i uscarea hârtiei.

Fig. 23Fig. 23Fig. 23Fig. 23 Aparat de electroforez\

Tampon

Hârtie de filtru

+ -

Electrod

D. SEPARAREA ELECTROFORETIC| A FRAC}IUNILOR PROTEICE ALE SERULUI SANGUIN

☺

LUCRARE PRACTIC|

152

A l i m e n t a t o r u l e l e c t r i cA l im e n t a t o r u l e l e c t r i cA l im e n t a t o r u l e l e c t r i cA l im e n t a t o r u l e l e c t r i c este un generator de curent continuu cu tensiune reglabil\ (0-500 V) [i o intensitate maxim\ reglabil\ de 50 mA, printr-o redresare a curentului alternativ de la re]ea. Generatorul electric este prev\zut cu miliampermetru [i cu voltmetru. Evaluarea cantitativ\ a frac]iunilor separate electroforetic se bazeaz\, `n general, pe m\surarea cantit\]ii de colorant care se leag\ de aceste frac]iuni.

Aceast\ m\surare se poate realiza pe dou\ c\i: a) a) a) a) ` n m o d d i r e c t` n m o d d i r e c t` n m o d d i r e c t` n m o d d i r e c t , prin determinarea densit\]ii optice, cu un spectrofotometru; b) b) b) b) ` n m o d i n d i r e c t` n m o d i n d i r e c t` n m o d i n d i r e c t` n m o d i n d i r e c t , prin elu]ie [i m\surarea extinc]iei cu un fotocolorimetru.

a) a) a) a) M e t o d a d i r e c tM e t o d a d i r e c tM e t o d a d i r e c tM e t o d a d i r e c t \\\\ de m\surare a densit\]ii optice presupune o opera]ie numit\ d i a f a n i z a r ed i a f a n i z a r ed i a f a n i z a r ed i a f a n i z a r e , care const\ `n `mbibarea electroforegramelor cu un lichid cu indice de refrac]ie egal cu cel al celulozei, banda de hârtie devenind translucid\. Dupa `mbibare, hârtia se preseaz\ `ntre dou\ pl\ci sub]iri de sticl\ [i se introduce `n dispozitivul de fotometrare. Concomitent cu m\surarea continu\ a absorb]iei se `nscriu grafic valorile corespunz\toare, iar prin intermediul unui dispozitiv integrator se `nscrie curba de integrare a suprafe]elor delimitate de curba de absorban]\ care corespunde fiec\rei frac]iuni (v. fotocolorimetria). Valorile ob]inute sunt direct propor]ionale cu cantit\]ile de colorant [i deci cu concentra]iile de substan]\ separat\ `n fiecare frac]iune.

b) b) b) b) P r o c e d e u l e l u ] i e iP r o c e d e u l e l u ] i e iP r o c e d e u l e l u ] i e iP r o c e d e u l e l u ] i e i este simplu, destul de precis [i nu necesit\ o aparatur\ deosebit\. Metoda const\ `n decuparea electroforegramei `n sec]iuni dup\ zone [i extrac]ia colorantului prin tratarea fiec\rei sec]iuni cu o aceea[i cantitate de solu]ie de eluent. Fiecare solu]ie se m\soar\ apoi fotocolorimetric.

Figura 24 v\ prezint\ aspectul unei electro-foregrame ob]inut\ pe hârtia de filtru, precum [i curba extinc]iilor (ob]inut\ prin metoda direct\) a celor cinci frac]iuni proteice separate din serul uman.

α1α2

βγ

g lobu l i n e

Fig. 24Fig. 24Fig. 24Fig. 24 Electroforegrama proteinelor serice

a l bumine

LUCRARE PRACTIC|

153

M o d d e l u c r uMo d d e l u c r uMo d d e l u c r uMo d d e l u c r u :::: • Se umecteaz\ benzile de hârtie `n solu]ia tampon; se elimin\ excesul de lichid prin tamponarea lor cu hârtie de filtru obi[nuit\.

• Se introduc volume egale din solu]ia tampon `n cele dou\ compartimente ale cuvei.

• Se `ntind benzile de hârtie `n pozi]ie perfect orizontal\ pe suportul din cuv\, imersându-se capetele lor `n solu]ia tampon din cele dou\ compartimente.

• Se las\ s\ circule curentul electric timp de 15 min. pentru diminuarea fenomenelor de electroendos-moz\.

• Se aplic\ cu o micropipet\ 50 ml ser; aplicarea se face prin mi[c\ri liniare repetate ale vârfului micropipetei de-a lungul liniei de start marcat\ `n prealabil cu creionul, având grij\ s\ se p\streze un spa]iu liber de 0,5 cm pân\ la marginile benzii. (Linia de start se amplaseaz\ spre catod, deoarece direc]ia de migrare a proteinelor va fi spre anod.)

• Se `nchide capacul cuvei. • Se conecteaz\ sursa de curent continuu la tensiunea de 150-200 V.

Timpul necesar separ\rii frac]iunilor proteice este de aproximativ 7-8 ore, `n func]ie de tensiunea aplicat\. Dup\ migrare, hârtia de electroforez\ este colorat\ cu albastru de bromfenol pentru punerea `n eviden]\ a spoturilor corespunz\toare frac]iunilor de proteine [i pentru dozarea lor cantitativ\ (prin fotocolorimetrie).

~n aceast\ sec]iune a]i `nv\]at s\ separa]i 5 frac]iuni din totalitatea proteinelor prezente `n serul sanguin uman. Pentru a [ti cum afl\m `n ce cantitate se g\se[te fiecare din aceste frac]iuni, trebuie s\ `n]elege]i metoda fotocolorimetric\.

Materiale necesare:Materiale necesare:Materiale necesare:Materiale necesare: • hârtie de filtru Whatmann

sub form\ de benzi; • solu]ie tampon veronal-

medinal cu pH = 8,6; • cuva de electroforez\; • surs\ de curent continuu; • ser; • micropipet\.

P

o pauză ... vă rog ...

LUCRARE PRACTIC|

154

PARTEA PRACTIC|

Fo t o c o l o r im e t r u l P u l f r i c hF o t o c o l o r im e t r u l P u l f r i c hF o t o c o l o r im e t r u l P u l f r i c hF o t o c o l o r im e t r u l P u l f r i c h Este un aparat ce permite compararea a dou\ fluxuri luminoase provenind de la aceea[i surs\. P\r]ile componente ale aparatului sunt prezentate `n fig. 30. Aparatul se compune din: d i s p o z i t i v u l d e d i s p o z i t i v u l d e d i s p o z i t i v u l d e d i s p o z i t i v u l d e i li li li l uuuu m i n a r em i n a r em i n a r em i n a r e , s u p o r t u l p e n t r u c u v es u p o r t u l p e n t r u c u v es u p o r t u l p e n t r u c u v es u p o r t u l p e n t r u c u v e [i c a p u l c a p u l c a p u l c a p u l f o t o m e t r i cf o t om e t r i cf o t om e t r i cf o t om e t r i c . Lumina provenind de la o surs\ (L) este divizat\ `n dou\ fascicule paralele prin intermediul unor oglinzi (O1, O2). Cele dou\ fascicule trec prin cuvele C1, respectiv C2 ce sunt a[ezate pe suportul special. ~n figura 31 sunt reprezentate fenomenele fizice care se produc la trecerea fasciculului de lumin\ prin cuvele cu solu]ii ale fotocoale fotocoale fotocoale fotocollllorimetrului.orimetrului.orimetrului.orimetrului. Un sistem de prisme cu reflexie total\ P1 [i P2 apropie cele dou\ fascicule dup\ traversarea cuvelor, trecându-le prin luneta de observa]ie (Oc) spre ochiul observatorului. Egalizarea fluxului luminos se poate face prin intermediul unor diafragme D1 si D2 care sunt ac]ionate de tamburii grada]i T1 [i T2, pe care se

O1

L

O2

D2

D2 T2

T1

Oc P2

P1

F

C1

C2

Fig. 30Fig. 30Fig. 30Fig. 30 Fotocolorimetrul Pulfrich (explica]ii în text)

F.F.F.F. EVALUAREA FOTOCOLORIMETRIC| AEVALUAREA FOTOCOLORIMETRIC| AEVALUAREA FOTOCOLORIMETRIC| AEVALUAREA FOTOCOLORIMETRIC| A CONCENTRA}IEI FRAC}IUNILOR PROTEICE CONCENTRA}IEI FRAC}IUNILOR PROTEICE CONCENTRA}IEI FRAC}IUNILOR PROTEICE CONCENTRA}IEI FRAC}IUNILOR PROTEICE

DIN SERUL SANGUINDIN SERUL SANGUINDIN SERUL SANGUINDIN SERUL SANGUIN

I I0

solu]ie

difuzie

reflexie

difuzie

absorb]ie

Fig. 31Fig. 31Fig. 31Fig. 31 Surse de eroare care apar la trecerea unui fascicul de lumin\ prin cuva de m\sur\

c

LUCRARE PRACTIC|

155

pot citi direct diferen]ele de extinc]ie sau transmisie dintre cele dou\ solu]ii. Se rote[te tamburul din dreptul solu]iei mai transparente, `nchizându-se astfel diafragma corespunz\toare [i mic[orând fluxul luminos care ajunge la ochiul observatorului, pân\ când devine egal cu cel de partea opus\. Restul sistemului optic con]inut `n capul fotometric permite ochiului observatorului s\ vad\ câmpul fotometric format din dou\ semicercuri desp\r]ite printr-o linie fin\. Pentru m\rirea sensibilit\]ii metodei, capul fotometric con]ine un sistem de filtre care las\ s\ treac\ numai un domeniu `ngust de lungimi de und\ din spectrul vizibil. De obicei se recomand\ s\ se selecteze un filtru colorat `n culoarea complementar\ culorii solu]iei de m\surat. Astfel se elimin\ razele care nu sunt absorbite de substan]\, dar care ar impresiona retina ochiului observatorului. Pentru m\rirea sensibilit\]ii [i preciziei metodei, precum [i pentru evitarea erorilor subiective, sistemul prisme - lunet\ din capul fotocolorimetrului Pulfrich se poate `nlocui cu un sistem de dou\ celule fotoelectrice montate `n opozi]ie fa]\ de un ampermetru. Lumina este astfel transformat\ `n curent electric. Egalizarea celor dou\ fluxuri luminoase se realizeaz\ `n acela[i mod. Condi]ia de egalitate se `ndepline[te atunci când intensitatea curen]ilor de sens opus este aceea[i, deci aparatul de m\sur\ va ar\ta valoarea 0.

FoFoFoFotocolorimetrului FEK 56Mtocolorimetrului FEK 56Mtocolorimetrului FEK 56Mtocolorimetrului FEK 56M Fotoelectrocolorimetrul FEK 56M prezentat `n figurile 32 [i 33 este alc\tuit dintr-un sistem optic, dou\ elemente active reprezentate de cele dou\ fotoelemente [i dintr-o parte mecanic\. • S i s t em uS i s t em uS i s t em uS i s t em u l o p t i cl o p t i cl o p t i cl o p t i c este format din:

1. S u r s a d e l um i nS u r s a d e l um i nS u r s a d e l um i nS u r s a d e l um i n \\\\ (11) ce poate fi o lamp\ cu filament incandescent pentru domeniul vizibil

Fig. 32Fig. 32Fig. 32Fig. 32 Fotocolorimetrul FEK 56M: 1- comutator; 2- capac superior; 3- vizor scal\; 4- tambur; 5- tambur amplificare fotocurent; 6- tambur cu ajutorul c\ruia se aduce ini]ial acul microam-permetrului la zero; 7- tambur filtre; 8- cadranul microampermetrului; 9- tambur; 10- tambur pentru manevrarea suportului mobil.

1

2

3

7 6

4 5

8

10

9

t

LUCRARE PRACTIC|

156

(utilizând filtrele de la 3 la 9) sau o lamp\ cu mercur-cuar] pentru domeniul UV (filtrele 1-2).

2. F i l t r e l e d e l um i nF i l t r e l e d e l um i nF i l t r e l e d e l um i nF i l t r e l e d e l um i n \\\\ (12), numerotate de la 1 la 9, sunt montate `ntr-un disc ce se poate roti cu ajutorul tamburului (7). ~n tabelul 3 sunt prezentate lungimile lor de und\. Filtrele de lumin\ sunt mediile colorate (sticle, pelicule, solu]ii) care las\ s\ treac\ prin ele numai radia]iile unui anumit domeniu spectral. Cunoscând curba de absorb]ie a luminii de c\tre solu]ia de analizat, se poate alege un filtru care las\ s\ treac\ prin el numai radia]iile absorbite de solu]ie [i le re]ine pe toate celelalte. Cu filtrul de lumin\ se separ\ deci acel domeniu de cercetat al spectrului care este absorbit de substan]\. Când nu se cunosc caracte-risticile spectrale ale solu]iei de analizat (nu se cunoa[te spectrul de absorb]ie), filtrul se alege astfel `ncât culoarea lui s\ fie complementar\ culorii solu]iei.

3. P r i sm a o p t i cP r i sm a o p t i cP r i sm a o p t i cP r i sm a o p t i c \\\\ (13) care divide fasciculul incident `n dou\ fascicule (drept [i stâng) de aceea[i intensitate.

4. L e n t i l e l eL e n t i l e l eL e n t i l e l eL e n t i l e l e (15, 15’, 18, 18’) [i o g l i n z i l eo g l i n z i l eo g l i n z i l eo g l i n z i l e (14, 14’) permit trecerea fasciculelor luminoase prin cuve.

• E l em e n t e l e a c t i v eE l em e n t e l e a c t i v eE l em e n t e l e a c t i v eE l em e n t e l e a c t i v e sunt dou\ fotoelemente (20, 20’) de Sb-Cs sensibile la radia]iile cuprinse `ntre 315 - 630 nm, fiind introduse `n montaj prin intermediul unui microampermetru (8).

• P a r t e a m e c a n i cP a r t e a m e c a n i cP a r t e a m e c a n i cP a r t e a m e c a n i c \\\\ este format\ din: 1. S u p o r t p e n t r u c u v eS u p o r t p e n t r u c u v eS u p o r t p e n t r u c u v eS u p o r t p e n t r u c u v e , situat `n interiorul aparatului, la care se poate accede prin ridicarea capacului (2). ~n partea dreapt\ se afl\ suportul mobil pe care se a[eaz\ dou\ cuve, `n dreapta cuva cu martorul M1, iar `n stânga cuva cu proba P. Schimbarea cuvelor din fa]a fasciculului monocromatic drept se face prin rotirea tamburului exterior (10) pân\ la refuz. ~n fa]a fasciculului monocromatic din stânga se monteaz\ o singur\ cuv\ ce con]ine martorul M2.

Nr. fiNr. fiNr. fiNr. filllltrutrutrutru Lungimea de Lungimea de Lungimea de Lungimea de undundundund\\\\ λ λ λ λ (nm)(nm)(nm)(nm)

DomeniuDomeniuDomeniuDomeniu

1 2

315 ± 5 364 ± 5

Ultraviolet

3 4 5 6 7 8 9

400 ± 5 440 ± 10 490 ± 10 540 ± 10 582 ± 10 597 ± 10 630 ± 10

Vizibil

Tabel 3Tabel 3Tabel 3Tabel 3.... Lungimile de und\ asociate filtrelor fotocolorimetrului FEK 56 M

Fig. 33Fig. 33Fig. 33Fig. 33 Fotocolorimetrul FEK 56M: 11-sursa de lumin\; 12-filtru de lumin\; 13-prism\; 14,14’-oglinzi; 15,15’, 18,18’-lentile; 16,16’-cuve; 17,17’-diafragme variabile; 19,19’-sticl\ mat\; 20,20’-fotoelemente

13

15’ 15

12

11

14

16’ 16

18’ 18

17’ 17

14’ 14 20’ 20 19’ 19

LUCRARE PRACTIC|

157

2. Dou\ d i a f r a gm e v a r i a b i l ed i a f r a gm e v a r i a b i l ed i a f r a gm e v a r i a b i l ed i a f r a gm e v a r i a b i l e "ochi de pisic\" reglabile cu ajutorul tamburilor (4 [i 9) modific\ intensitatea fasciculului luminos ce cade pe fotoelement. Fotoelectrocolorimetrul FEK 56M este prev\zut cu un bloc de alimentare.

Mod d e l u c r uMod d e l u c r uMod d e l u c r uMod d e l u c r u Se decupeaz\ spoturile electroforegramei co- respunz\toare celor cinci frac]iuni proteice. Se introduc fragmentele de hârtie rezultate `n cinci flacoane, peste care se adaug\ câte 8 ml solu]ie eluent, cu ajutorul pipetei gradate. Are loc fenomenul de elu]ie, adic\ de trecere a colorantului de pe hârtia de filtru `n solu]ie. Timpul de elu]ie este de aproximativ 20 min, cu men]iunea c\ aceste flacoane trebuie agitate din 5 `n 5 minute.

T e h n i c a d e l u c r u c u T eh n i c a d e l u c r u c u T eh n i c a d e l u c r u c u T eh n i c a d e l u c r u c u f o t o c of o t o c of o t o c of o t o c o llll o r im e t r u l P u l f r i c ho r im e t r u l P u l f r i c ho r im e t r u l P u l f r i c ho r im e t r u l P u l f r i c h

Practic, m\surarea extinc]iei cu ajutorul fotoco- lorimetrului cuprinde doi timpi de lucru: verificarea etalon\rii aparatului [i m\surarea extinc]iei probelor

de analizat. Pentru v e r i f i c a r e a e t a l o nv e r i f i c a r e a e t a l o nv e r i f i c a r e a e t a l o nv e r i f i c a r e a e t a l o n \\\\ r i ir i ir i ir i i aparatului se umplu cuvele cu ap\ distilat\ [i se introduc `n suportul lor.

• Se introduce filtrul S57 prin rotirea discului cu filtre pân\ când `n fereastra suportului discului cu filtre apare cifra 6.

• Se conecteaz\ fotocolorimetrul la bornele de 6 V ale transformatorului. Fi[a transformatorului se conecteaz\ la re]eaua de 220 V.

• Se a[eaz\ tamburii T1 [i T2 la grada]ia 0-100 (valoarea 0 corespunde extinc]iei minime; valorile extinc]iei sunt trecute pe partea interioar\ a

Materiale necesare: • fotocolorimetru Pulfrich tip

IOR cu alimentator la 6-8V; • fotoelectrocolorimetru FEK

56M cu alimentator [i cuve de 10 mm grosime;

• electroforegrama developat\ [i uscat\;

• solu]ie de NaOH 0,1 N; • 5 flacoane pentru elu]ie; • pipet\ gradat\ de 10 ml; • foarfece; • hârtie de filtru; • ap\ distilat\.

P

LUCRARE PRACTIC|

158

tamburului, culoare ro[ie). ~n aceste condi]ii, dac\ aparatul este etalonat, vom observa privind prin ocular cele dou\ semicercuri egal iluminate.

Pentru mmmm\\\\ s u r a r e a e x ts u r a r e a e x ts u r a r e a e x ts u r a r e a e x t i n c ] i e i p r o b e l o ri n c ] i e i p r o b e l o ri n c ] i e i p r o b e l o ri n c ] i e i p r o b e l o r se procedeaz\ astfel:

• Se gole[te cuva din stânga, se usuc\ [i se introduce `n ea lichidul colorat corespunz\tor albuminelor.

• Privind prin ocular, vom roti tamburul din dreapta pân\ când câmpul este uniform iluminat (se rote[te tamburul din dreapta deoarece prismele foto-metrului inverseaz\ direc]ia razelor de lumin\, astfel c\ lumina ce trece prin cuva stâng\ ilumineaz\ partea dreapt\ a câmpului).

• Se noteaz\ valoarea extinc]iei corespunz\toare albuminelor.

• Se procedeaz\ `n mod asem\n\tor [i cu celelalte patru probe, notându-se de fiecare dat\ valoarea extinc]iei.

T e h n i c a d e l u c r u c u T eh n i c a d e l u c r u c u T eh n i c a d e l u c r u c u T eh n i c a d e l u c r u c u f o t o e l e c t r o c of o t o e l e c t r o c of o t o e l e c t r o c of o t o e l e c t r o c o llll o r im e t r u l FEK 5 6Mo r im e t r u l FEK 5 6Mo r im e t r u l FEK 5 6Mo r im e t r u l FEK 5 6M

Se vor m\sura fotocolorimetric tot extinc]iile celor 5 solu]ii ob]inute prin elu]ia colorantului din spoturile electroforegramei. Ca tehnic\ de lucru se folose[te metoda de zero: cele dou\ fascicule luminoase cad pe fotoelemente; fotocuren]ii se compenseaz\ reciproc [i acul micro-ampermetrului conectat `n circuit nu deviaz\. La a[ezarea solu]iei de analizat are loc perturbarea compens\rii. Pozi]ia zero a acului microamperme-trului se restabile[te prin diminuarea fluxului luminos din dreptul cuvei cu ap\ distilat\.

• Se fixeaz\ filtrul 7 prin intermediul tamburului (7).

• Se conecteaz\ blocul alimentator la re]ea, se pune comutatorul acestuia pe pozi]ia "pornit" [i se verific\ dac\ comutatorul l\mpii este pe pozi]ia "vizibil".

• Cu ajutorul tamburului (6) se aduce acul microampermetrului la zero.

Spre exemplu, presupunem c\ am ob]inut urm\toarele valori pentru extinc]ii: albumine 0,252, α1 globuline 0,018, α2 globuline 0,027, β globuline 0,056 [i γ globuline 0,061. Suma lor este 0,414. Se calculeaz\ procentul pentru fiecare frac]iune, considerând valoarea total\ a extinc]iilor egal\ cu 100. Exemplu: 0,414extinc]ie............0,252extinc]ie

total\ albumine 100.......................................x

x =0,252 100⋅ =

0 014610

0,

P

LUCRARE PRACTIC|

159

• ~n suportul pentru cuve din stânga se pune ap\ distilat\; suportul din dreapta are la rândul s\u dou\ l\ca[uri: `n cel din stânga se pune proba, iar `n cel din dreapta tot ap\ distilat\. Ini]ial, `n dreptul fasciculului de lumin\ se afl\ cuva cu proba de determinat.

• Se aduce comutatorul (1) `n pozi]ia "deschis".

• La `nceputul determin\rii, cele dou\ diafragme sunt complet deschise (tamburii 4 [i 9 se afl\ la diviziunea 0-100). Ca urmare a absorb]iei luminii de c\tre solu]ie, pe fotoelementul din dreapta cade un fascicul luminos de intensitate mai mic\ decât cel din stânga [i acul microampermetrului deviaz\.

• Se rote[te tamburul diafragmei variabile din stânga [i se `nchide fanta pân\ când intensit\]ile celor dou\ fascicule se egaleaz\ [i acul microamperme-trului revine la zero.

• Se aduce acum `n dreptul fasciculului luminos din dreapta cuva cu martor (ap\ distilat\) prin rotirea tamburului (10). Acul microampermetrului va devia `n sens opus celui ini]ial (fasciculul din dreapta este acum mai intens).

• Se rote[te tamburul diafragmei variabile din dreapta pân\ când se egaleaz\ din nou fluxurile luminoase, iar acul microampermetrului ajunge din nou la zero.

• ~n acest moment se cite[te extinc]ia pe tamburul din dreapta. C a l c u l u l [ i i n t e r p r e t a r e a r e z u l t a tC a l c u l u l [ i i n t e r p r e t a r e a r e z u l t a tC a l c u l u l [ i i n t e r p r e t a r e a r e z u l t a tC a l c u l u l [ i i n t e r p r e t a r e a r e z u l t a t eeee l o rl o rl o rl o r

1 .1 .1 .1 . Ca l c u l u l p r o c e n t u a l a l d i f e r i t e l o r C a l c u l u l p r o c e n t u a l a l d i f e r i t e l o r C a l c u l u l p r o c e n t u a l a l d i f e r i t e l o r C a l c u l u l p r o c e n t u a l a l d i f e r i t e l o r f r a c ] i u n i p r o t e i c e ( v a l o r i r e l a t i v e )f r a c ] i u n i p r o t e i c e ( v a l o r i r e l a t i v e )f r a c ] i u n i p r o t e i c e ( v a l o r i r e l a t i v e )f r a c ] i u n i p r o t e i c e ( v a l o r i r e l a t i v e )

Se face suma extinc]iilor citite [i se calculeaz\ ce procent reprezint\ extinc]ia ob]inut\ pentru fiecare frac]iune `n parte.

2 .2 .2 .2 . Ca l c u l u l c o n c e n t r a ] i e i f r a c ] i u n i l o r C a l c u l u l c o n c e n t r a ] i e i f r a c ] i u n i l o r C a l c u l u l c o n c e n t r a ] i e i f r a c ] i u n i l o r C a l c u l u l c o n c e n t r a ] i e i f r a c ] i u n i l o r p r o t e i c e ` n g / l ( v a l o r i a b s o l u t e )p r o t e i c e ` n g / l ( v a l o r i a b s o l u t e )p r o t e i c e ` n g / l ( v a l o r i a b s o l u t e )p r o t e i c e ` n g / l ( v a l o r i a b s o l u t e )

Pentru determinarea valorii absolute a diferitelor frac]iuni proteice (g/l) se va ]ine seama `n calcul de valoarea concentra]iei proteice totale stabilit\

S\ presupunem c\ refractometric am g\sit o concentra]ie proteic\ total\ de 72,0g ‰. Calculul se va efectua astfel: 100 g proteine..............61g albumine 72 g proteine.......................y

y =61 72

100g albumine

⋅ = 43 9,

c

LUCRARE PRACTIC|

160

refractometric [i de procentul frac]iunii respective rezultat din calculul extinc]iilor. Cu valorile absolute ob]inute pentru fiecare frac]iune proteic\ se va calcula raportul:

A

G

albumine

globuline=

~n mod normal acest raport este supraunitar.

P r e z e n t a r e a r e z u l t a t e l o r P r e z e n t a r e a r e z u l t a t e l o r P r e z e n t a r e a r e z u l t a t e l o r P r e z e n t a r e a r e z u l t a t e l o r e xe xe xe x p e rp e rp e rp e r iiii m e n t a l em e n t a l em e n t a l em e n t a l e Valorile ob]inute se trec `n urm\torul tabel:

Frac]iunea Frac]iunea Frac]iunea Frac]iunea proteicproteicproteicproteic\\\\

EEEExxxxtinc]iatinc]iatinc]iatinc]ia

Valori Valori Valori Valori relrelrelrelaaaativetivetivetive ( %)( %)( %)( %)

Valori Valori Valori Valori absabsabsabsoooolute lute lute lute (g/l(g/l(g/l(g/l))))

Valori Valori Valori Valori relrelrelrelaaaative tive tive tive nonononorrrrmale male male male (%)(%)(%)(%)

Valori Valori Valori Valori absolute absolute absolute absolute normale normale normale normale (g/l)(g/l)(g/l)(g/l)

Albumine 60 36-54

α1 Globuline 4 2,4-3,6

α2 Globuline 8 4,8-7,2

β Globuline 12 7,2-10.8

γ Globuline 16 9,6-14,4