METODE CROMATOGRAFICE

Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care include mai multe metode de separare i totodat de analiz a componenilor amestecului din prob. n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de un numr mare de ori, a echilibrului de distribuie ntre dou faze. Una dintre faze este imobil i poart denumirea de faz staionar (aflat de regul ntr-un tub numit coloan) iar cealalt - faza mobil - aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze. Separarea se petrece n coloana cromatografic, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobil, denumit i eluent - scurgndu-se continuu (deci cu vitez constant) prin interstiiile fazei staionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componeni ai amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separrii se introduce sub form de soluie la nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microsering), i se afl iniial fixat ntr-o zon ngust de la nceputul coloanei. Splai de eluent, o parte din componenii probei migreaz apoi prin coloan cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaz interaciunilor fizice specifice, dintre moleculele probei i faza staionar (desigur, nu orice molecul poate migra pe orice faz staionar). Efectul, este numit retenie i aceasta provoac o aa-numit migrare difereniat. Adic moleculele migreaz n grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelai fel. Aceasta face posibil sesizarea componenilor, pe rnd, la prsirea coloanei, de ctre un instrument, n grupurile respective - denumite uneori zone. Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai muli (n mod ideal la oricare) dintre componeni ce ies din coloan i care este plasat n eluent, imediat dup ieirea din coloan. Acest analizor, denumit detector este capabil s dea un semnal proporional cu masa sau cu concentraia soluiei de component n faza mobil. n consecin, dispozitivul, "marcheaz" trecerea fiecreia din substanele ce formeaz iniial proba, similar cu o fotocelul care nregistreaz trecerea concurenilor la sosire n atletism. Reprezentarea grafic a semnalului detectorului n funcie de timp poart numele de cromatogram.Clasificarea tehnicilor cromatograficeS-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei staionare. Astfel se distinge cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid, cromatografia de gaze (GC) cnd aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil este un lichid aflat peste temperatura critic. n cadrul cromatografiei de lichide se mai face distincie ntre cromatografia pe coloan deschis i cea pe coloan nchis Pe de alt parte, n cadrul fiecreia dintre acestea, distingem mai multe variante.n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare: Cromatografia de adsorbie utilizat pentru separarea substanelor organice cu molecule de dimensiuni mici i medii pe adsorbeni, ca silicagel i alumin, folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solveni organici. Cromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar solid, poroas, format din materiale specifice - schimbtorii de ioni - substane cu o reea solid afnat, de natur organic sau anorganic, pe care se gsesc grefate, prin procesul de obinere, nite centre de schimb ionic. Cele mai rspndite sunt rinile schimbtoare de ioni - organice - la care scheletul-suport este unul organic - un polimer poros. Pe aceste centre are loc o reacie ionic sau o interaciune ntre substana din soluie (electrolit sau neelectrolit) i funciunea legat chimic de suportul solid, numit reacie de schimb ionic. Cromatografia de excluziune steric se desfoar pe faze staionare poroase dar cu porozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor moleculelor supuse separrii. O parte dintre molecule intr prin pori, reuind s interacioneze cu suportul solid, prin fore de adsorbie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic nereinute odat cu faza mobil. Se obine astfel un soi de sit la scar molecular separarea moleculelor fcndu-se n funcie de dimensiune. Tehnica se mai ntlnete i sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeaie prin geluri n funcie de natura apoas sau organic a fazei mobile. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza staionar este o faz lichid, nemiscibil cu cea mobil i imobilizat pe un suport solid, ntr-o coloan. Aici suportul solid este, cel puin principial, inert fa de componentele din prob. ntruct simpla impregnare a unui suport poros cu un lichid permitea splarea acestuia n timp, s-a recurs la legarea pe cale chimic a acestora de suport, obinndu-se nite faze cu totul specifice - faze staionare legate chimic. Molecule organice 4 de dimensiuni mici sunt, prin sintez, legate de suportul poros, fenomenul de pierdere prin splare de ctre faza mobil, fiind practic anulat. Acest tehnic este cea mai rspndit devenind aproape sinonim cu cromatografia de lichide. Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC), se refer la un grup de tehnici nrudite cu cele din LC, care au toate n comun faptul c faza mobil circul printr-un material poros dispus ntr-un plan i formnd un strat relativ subire, dar de compoziie asemntoare cu cele menionate la cromatografia pe coloan. Se disting: Cromatogafia pe hrtie, tehnic n care faza staionar este o hrtie poroas din celuloz (iniial o hrtie de filtru) care este irigat de solvent prin fore capilare - o tehnic, azi, de importn istoric. Cromatografia pe strat subire (TLC), n care faza staionar pulverulent este fixat de suportul plan (sticl, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subire (0.1-0.5mm) de asemenea irigat prin capilaritate. Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC), n care faza staionar are granulaie extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i viteza acestora.Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost cobort, dar totodat prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe coloan sub presiune ridicat (HPLC) varianta modern a LC.n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (cromatografia n faz gazoas), denumit prescurtat GC se disting urmtoarele tehnici: Cromatografia gaz-lichid n care faza staionar este un lichid nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o coloan n aa-numita cromatografie de gaze convenional sau chiar pe pereii coloanei, confecionat de dimensiuni capilare, n cromatografia pe coloan capilar. Cromatografia gaz-solid este analog cu cele discutate la cromatografia de adsorbie i la cea de excluziune steric cu deosebirea c schimbarea gazului nu modific selectivitatea.Faza staionar o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare nite silicai naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de important pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)Din punct de vedere istoric, evoluia cromatografiei a cunoscut o suit de progrese, care au adus-o din situaia iniial de metod de separare i purificare de laborator la o tehnic de separare i analiz chimic cu o arie de aplicare aproape universal. Iniial rusul vet, a introdus n 1903 cromatografia de lichide pe coloan (LC). Aceast metod a fost uitat mult vreme i abia dup 1930, anul descoperirii cromatografiei n strat subire pe alumin, s-a perfecionat metoda utiliznd coloana, o dat cu nevoile de separare i purificare a compuilor organici naturali sau sintetici implicai n biochimie. n 1941 enlezii Martin i Synge descoper cromatografia de repartiie pe hrtie, reuind s separe cu ajutorul unui amestec de solveni care irig o band de hrtie de filtru (coninnd o pictur de prob) aproape toi aminoacizii, descoperire extrem de important pentru dezvoltarea ulterior a biochimiei. Doar n 1952 aceiai A. J. P. Martin and R. L. M. Synge [102] au nlocuit faza mobil lichid cu un gaz, realiznd pentru prima oar cromatografia de repartiie gaz-lichid. n aceast variant, detecia a fost realizat fizico-chimic, n efluentul gazos, dup ieirea din coloan, reuind astfel s mbunteasc marcant separrile. Din acest moment asistm la demarajul extraordinar al acestor tehnici, devenite azi cteva din principalele mijloace de analiz n chimia organic i biochimie, dar i n criminalistic, igien, controlul alimentelor, industria metalurgic etc. Din 1968 Halazs, (profesor la Franckfurt/Main), a pus la punct LC folosind un solvent sub presiune n calitate de faz mobil i detecie fizico-chimic n efluentul lichid, acesta fiind nceputul dezvoltrii cromatografiei de lichide sub presiune nalt (200 atm). Din 1980 s-a reuit i obinerea unor separri analitice performante bazate pe schimb ionic prin introducerea eluenilor diluai i a supresorului ionic - datorate americanilor Hamisch i Schmall, tehnic care de atunci a primit denumirea de cromatografie ionic (IC). Azi se lucreaz nu numai cu cromatografe de laborator, analitice, ci i cromatografe de proces, dedicate analizelor automate ale proceselor industriale sau cromatografe preparative, destinate obinerii de substane pure n industria farmaceutic sau n biotehnologii.Cromatograma: elementele acesteia i mrimi fundamentalen orice tip de cromatografie detectorul d un semnal proporional, uneori cu concentraia, alteori cu masa componentului aflat n celula de msur, semnal ce poate fi nregistrat n funcie de timp. Diagrama semnal, funcie de timp sau de volumul de eluent se numete cromatogram. Pe cromatogram distingem o serie de maxime, numite picuri (peak = vrf n l. englez), care se produc deasupra liniei de baz sau a poriunii orizontale a curbei, paralel cu axa timpului. Aceasta apare ori de cte ori n detector nu apare nici un component, n afara eluentului evident.Oricare pic are, n cazul ideal, forma distribuiei normale Gauss. S considerm cea mai simpl cromatogram posibil: cazul introducerii unui singur component, ntr-un gaz, C, care conine urme de aer - aerul fiind un component inert. Aspectul acestei cromatograme este cel prezentat n fig. 1. Pe axa absciselor s-a considerat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului - n uniti arbitrare. Distingem urmtoarele elemente de baz:Picurile cromatografice. n cazul prezentat n fig. 1, cele dou semnale sau vrfuri sunt denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile n analiza calitativ i cantitativ n toate metodele cromatografice. Primul pic, mai mic, corespunde unui component inert (aerul de exemplu n CG) - care nu este reinut de loc - iar cel de-al doilea, notat cu C, corespunde componentului (unic n cazul de fa) al probei considerate i este datorat moleculelor care se distribuie pe parcursul migrrii prin coloan ntre faza mobil i cea staionar i care, n consecin, ies mai trziu din coloan.Timpul mort, tM - este timpul n care un component, complet nereinut de ctre faza staionar, parcurge coloana i tuburile de legtur pn la detector. Acesta nu poate fi zero. n cazul CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retenie al aerului: tM = Tr (R = Retenie). Deci, cu alte cuvinte, reprezint timpul scurs de la injectarea (introducerea) probei n coloan i apariia maximului de concentraie n detector, pentru componentul nereinut. Timpul de retenie, tR - o mrime caracteristic pentru fiecare component al amesteculuiseparat de coloan - reprezint timpul scurs de la injectarea probei i apariia maximului deconcentraie n detector [103]. De exemplu, n cazul prezentat anterior n fig. 1, acesta estedistana de la axa ordonatelor (nceputul cromatogramei) pn la verticala prin vrfulpicului C. Acest timp, pentru un component i o coloan (plus condiii experimentale) dateeste constant, indiferent dac componentul respectiv este singur sau n amestec. Volumul de retenie, VR este volumul de eluent corespunztor timpului de retenie (legat detimpul tR prin intermediul debitului eluentului, Fe):VR = tRFe (1) Timpul de retenie ajustat, tR'- introdus n cromatografie pentru a se putea compara timpiimsurai pe coloane diferite, n cazul aceluiai component - este dat de diferena:tR' = tR - tM (2) Corespunztor exist i un volum de retenie ajustat, VR' = VR - VM unde VM este volumulmort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei, Fe, prin produsul: VM =tMFe, i reprezint volumul golurilor din coloan plus volumul tuburilor de legtur de lacoloan la detector.

CROMATOGRAME IDEALE I REALEAspectul unui pic dintr-o cromatogram ideal este acelai cu curba obinut prin reprezentarea grafic a funciei de distribuie a erorilor (Gauss), a crei expresie, scris n coordonate carteziene x,y este:

unde - o constant - simbolizeaz media distribuiei; n cazul cromatografiei aceasta corespunde chiar timpului de retenie, iar - abaterea standard a distribuiei - tot o constant care reprezint distana pe axa absciselor de la maxim la punctul de inflexiune al curbei de eluie. Valoarea reflect chiar lrgirea picului la trecerea acestuia prin coloan.O expresie i mai simpl a acestei funcii consider c axa ordonatelor trece chiar prin maximul picului (= 0) iar = 1 (ec. 3).Ultima ecuaie este o curb simetric cu un maxim pentru xmax = 0 i ymax = 1/2 = 0.399 care mai are i dou puncte de inflexiune, pentru x = 1 i y = 0.242 adic ~60,6% din valoarea ymax. Limea picului la punctul de inflexiune este 2 pentru ecuaia (3) i evident =1 pentru reprezentarea funciei (4).Prin convenie, n cromatografie w1/2 simbolizeaz limea picului la jumtate din nimea sa [104] i w1/2 = 2.35 iar 2 poart numele de dispersia picului. Limea picului la baz notat w se msoar de fapt la 13.5% din nlime unde n mod riguros w = 4.Picurile reale nu respect ntotdeauna forma gaussian din mai multe motive. Pe de-o parte, coeficientul de distribuie K nu este constant la orice concentraie iar pe alt parte, mai exist i diferene ntre viteza eluentului transversal prin coloan i anume n vecintatea pereilor aceasta este practic zero pe cnd la mijloc este maxim.Formele posibile pentru picuri depind de forma funciei CS = f(CM) adic de izoterma de adsorbie (desigur mecanismul nu este ntotdeauna acesta). Cnd izoterma este liniar (I) avem picuri simetrice. Cnd aceasta este convex (II) sau concav (III) avem picuri asimetrice (fig. 2). Acest asimetrie, ntlnit relativ frecvent, se evalueaz cu un factor de asimetrie (sau de trenaj), Ft. Acest factor se calculeaz prin raportul distanelor, de la dreapta y = xmax la cele dou ramuri, msurat la 10% din nlime, adic:Ft = b/an cazul izotermelor convexe Ft > 1 iar n cazul celor concave Ft < 1, ultimele fiind extrem de rare.

Mrimi i ecuaii caracteristice unei coloaneFactorul de retenie, RF reprezint raportul, subunitar, dintre vitezele de deplasare princoloan ale unui component i ale eluentului. Cum vitezele amintite se pot calcula dinraportul spaiului parcurs n unitatea de timp, lungimea coloanei fiind notat LCOL, avemconform definiiei:coloR Mf ocol R RMLR = t = t = V L t Vtn (4)Coeficientul de distribuie, K (sau KD) este o mrime identic celei din extracie(repartiia ntre faze) definit ntotdeauna prin raportul dintre concentraiile componentului nchestiune din fazele staionar, CS, respectiv mobil, CM. Conform definiiei (dup Nernst):SMK = CC(5)n cazul cromatografiei de adsorbie acesta a fost denumit coeficient de adsorbie, ncazul cromatografiei de schimb ionic (denumit ulterior cromatografie ionic), coeficient dedistribuie ionic iar n cadrul cromatografiei de excluziune steric coeficient de difuziune.Factorul de capacitate, k (notat n tratate mai vechi k') se definete ca raportul dintrenumrul de moli distribuii ntre fazele: staionar, , respectiv mobil. Numrul de moli dinfaza staionar pot fi exprimai prin produsul CSVS iar din cea mobil CMVM unde C saunotat concentraiile molare i cu VS respectiv VM s-au notat volumele fazelor - staionarrespectiv mobil - din coloan, volumul ultimei fiind egal numeric cu volumul mort alcoloanei. Ecuaia de definiie pentru k este aadar:n ultimul timp a primit i denumirea de factor de separare. Acest factor este legat detimpul de retenie, respectiv de cel mort, printr-o ecuaie simpl:tR = tM(1+k) (7)Deci, cu ct factorul de capacitate este mai mare coloana reine mai puternic uncomponent iar timpul de retenie crete. Pe de alt parte din ecuaia anterioar se poate vedeac dac k = 0 atunci tR = tM.Pentru determinarea practic a valorii k se exprim aceast mrime din ecuaia de maisus, i innd cont de cele amintite anterior, anume: tR' = tR - tM se obine relaia de calcul:k = tR '/tM (8)Retenia relativ, , a mai fost denumit i factorul de separare tocmai pentru c, cuct valoarea acestuia este mai mare cu att poziia picurilor pe aceiai cromatogram este mai distanat - deci separarea pe coloana respectiv este mai net. S-a constatat c influenavariabilelor experimentale este cu mult mai redus dac se utilizeaz pentru exprimareareteniei aceast retenie relativ. Pentru calculul acesteia trebuie efectuat msurarea, attpentru componentele probei ct i pentru o substan considerat etalon (sau standard) atimpului (sau volumului) de retenie, n condiii absolut identice. De multe ori substanaetalon este parte a probei i nu este adugat intenionat. Retenia relativ se poate exprimaastfel:2/1 = tR'/(tR')std = K2/K1 (9)unde K2 i K1 sunt coeficienii de distribuie (vezi expresia K de mai sus) ai substanelor 2respectiv 1, iar cu 1 s-a notat substana etalon (standard). Substanele recomandate n calitatede substane standard n GC, n vederea calculrii reteniei relative, sunt n - alcanii.Numrul de talere teoretice al coloanei, n. Conform teoriei talerelor migrarea uneisubstane separate prin coloan se poate descompune teoretic ntr-o succesiune de deplasriprin dreptul a n mici incinte din interiorul coloanei n care au loc echilibre perfecte ntrefazele staionar, din incinte, i cea mobil. Similar cu distilarea pe coloane prevzute cutalere, aceste mici incinte ideale au fost denumite talere teoretice. Lungimea poriunii dintr-ocoloan, ce corespunde unei asemenea incinte, pe parcursul creia se realizeaz un echilibrutermodinamic, se noteaz cu H i poart numele de nlime echivalent a unui taler teoretic.Aceasta caracterizeaz performana coloanei i se poate calcula din raportul:H = Lcol/N (10)unde cu LCOL s-a notat lungimea coloanei iar cu N numrul de talere teoretice. Cu ct valoareaH este mai mare separarea este mai bun. Numrul n se poate calcula pe baza cromatogrameiobinute experimental din limea picului la baz, wb, care dup cum se vede din fig. 1, estede 4 ori valoarea dispersiei curbei gaussiene care modeleaz matematic picul, ceea ce permitescrierea ecuaiei:wb = 4 (11)Valoarea numrului de talere teoretice N constituie de asemenea o msur aeficacittii (totale) a coloanei cromatografice utilizate ntr-o separare sau analiz concret.Pentru un component dat acest numr reprezint patratul raportului dintre timpul de retenie ideviaia standard asociat picului corespunztor:N = tR2/2 (12)La o examinare mai atent acest raport reprezint patratul numrului de picuri ce arncpea pe o cromatogram n intervalul corespunztor timpului tR, picurile fiind separatetoate doar parial (de exemplu cele cu rezoluia RS = 0.75, aa cum se prezint pe fig. 3a.Se poate observa c, nlocuind din ecuaia (11), avem: