U.M.F Iaşi An Universitar 2004-2005Facultatea de MedicinăDisciplina Parazitologie-MicologieProf. Dr. Mariana Luca

LP rezidenţi Medicină de laborator

Diagnosticul parazitologic în leishmanioză

Leishmanioza este o parazitoză cauzată de protozoare flagelate din genul Leishmania.În funcţie de specie se disting: leishmanioza cutanată, cutaneo-mucoasă şi viscerală.Leishmaniile sub formă de amastigot* habitează în celulele sistemului mononuclear fagocitar în piele şi viscere.Uneori pot fi decelate în mononuclearele din sângele periferic.

Diagnostic clinic febră adenohepatosplenomegalie pancitopenie

Simptomatologia clinică nu permite diferenţierea leishmaniozei viscerale de alte cauze de splenomegalie febrilă.

Produse patologice:- puncţia măduvii osoase: 54-86 % pozitivitate- puncţie ganglioni limfatici: 64 % pozitivitate- puncţie splenică: 98 % pozitivitate

Diagnostic de laboratorDiagnostic de orientare (în formele viscerale)

Hemograma (pancitopenie)- anemie normocromă, hemolitică, fără eritroblastoză (insuficienţă

medulară)- neutropenie importantă- trombocitopenie

VSH-ul crescut Imunoelectroforeza

Puncţia splenică este o tehnică cu risc crescut. Nu există consens asupra utilizării acestei tehnici.Dezavantaje: risc hemoragicAvantaje: - sensibilitate diagnostică crescută

- nu necesită materiale speciale- este mai puţin dureroasă decât puncţia medulară- este relativ facilă pentru un medic experimentat

În leishmanioza viscerală acută, când splina este mică şi dificil de palpat se recomandă puncţia medulară sau ganglionară.Precauţii:- determinarea TQ - determinarea nr. plachete (>40.000/mm3)

1

- creşterea IgG

Diagnostic parazitologic (forma cutanată şi viscerală)Examen direct- coloraţia MGG *Cultura- mediul NNN **(Novy-McNeal-Nicolle), incubare la 27ºC timp de 1 săptămână; se obţine forma promastigot٭٭٭.Inocularea la hamsterul auriu- dezvoltă o infecţie mortală în 3-6 luni.

* Leishmaniile apar sub formă de amastigot, intracelular (uneori în număr mic sau nedecelabile în forma viscerală).

Examenul microscopic: celule rotunde sau ovalare de 3-5 µm, ce prezintă două mase colorate în roşu:

- una rotunjită: nucleul,- cealaltă baciliformă:kinetoplastul.

**Mediul NNN MaterialSânge agar bază Difco………………………………………………………………8 gApă distilată …………………………………………………………………….200 mlSânge de iepure defibrinat…………………………………...0,6 ml pentru 5 ml mediu

Prepararea sângelui de iepure defibrinatRecoltaţi 20 ml sânge de iepure într-un recipient steril conţinând circa 100 bile de sticlă de 4mm diametru. Defibrinaţi sângele cu ajutorul unui agitator rotativ timp de 5 minute. Adăugaţi 200 UI Penicilină, 200 mg Gentamicină şi 2 mg Streptomicină la ml de sânge defibrinat.Preparare

1. Puneţi 200 ml apă distilată într-un recipient, adăugaţi geloză, amestecaţi şi încălziţi până fierbe apa aşa încât geloza să fie complet dizolvată.

2. Împărţiţi mediul în fracţiuni de 5 ml în recipiente de probă cu dop înfiletat (capacitate 20 ml). Se sterilizează la autoclav (dopurile desfiletate uşor) la 121ºC timp de 15 minute şi se lasă geloza să se răcească până la 45-50ºC.

3. Se adaugă 0,6 ml sânge de iepure defibrinat steril în fiecare recipient şi se amestecă uşor. Lăsaţi mediul să se solidifice în recipiente în poziţie înclinată.

4. Se lasă recipientele la temperatura camerei timp de 24 ore, pentru a se putea face condensarea. Recipientele trebuiesc apoi conservate la 4-6ºC până când vor fi folosite.

Notă: Acest mediu trebuie preparat în condiţii riguroase de asepsie.Utilizare

Se poate procura de la Laboratoarele Difco, PO Box 10587, Detroit, Michigan 482333, Statele Unite ale Americii

2

1. Inoculaţi aseptic circa 0,1 ml de eşantion în lichidul de condensare a două recipiente la temperatura camerei.

2. Se incubează culturile la 24º(±2ºC) la întuneric.3. Se examinează la fiecare 4 zile. Pentru aceasta se recoltează o picătură de

cultură cu ajutorul unei anse sterile de platină şi aceasta se depune pe o lamă pentru a căuta promastigoţii.

Notă: Culturile negative trebuie reînsămânţate după 8 zile pe un mediu proaspăt, apoi examinate la fiecare 4 zile timp de încă 20 de zile.

Examinarea lamă-lamelă a lichidului de condensare evidenţiază forma promastigot:

corpusculi alungiţi de 14-20 µm cu un nucleu central vizibil şi un flagel liber.Promastigoţii sunt grupaţi în rozete (cu flagelii orientaţi central).

: Forma promastigot ٭٭٭

Diagnosticul serologic: cercetarea anticorpilor serici are valoare diagnostică şi terapeutică în leishmanioza viscerală.Se utilizează: IF.Pentru confirmare: IEP.

Limite: la persoanele HIV pozitive.

3