Curs 6Cromatograma procesulul GPC se pezinta sub forma unor picuri care rep calitativ natura compusului separate si respectiv prin suprafata de sub pic cantitatea de produs separate.Intre volumul de elutie necesar in cromatografie si dimesiunile (masele moleculare) ale speciilor separate exita o corelatie sub forma unei curbe care daca este efectuata cu ajutorul uner proteine cu mase moleculare cunoscute poate fi considerate curba de calibrare sip e baza ei, prin interpolare, se pot determina masele moleculare ale speciilor separate in urma elutiei.DIALIZA-este un process fizic asemanat cu cromatografia de permeatie prin gel, deosebirea fundamentala de aceasta se refera la faptul ca in dializa nu se utilizeaza coloane cromatografice ci se utilizeaza membrane semipermeabile naturale sau artificiale care poseda ochiuri de retea prin care se poate realiza o filtrare selective a moleculelor aflate de o parte si cealalta a membrane.Prin ochiurile de retea ale membranelor pot circula prin difuzie simpla (coeficientul gradientului de concentratie) doar moleculele sau particulele care au dimensiuni mai mici decat ochiul de retea.Moleculele cu dimensiuni mai mari decat ochiurile de retea nu pot participa la procesull difuziv prin membrane si raman in compartimentul de origine.Membranele untilizate in dializa din laboratorul de specialitate de regula sunt de natura sintetica sau artificiala (natural prelucrat) si pot fi din celofan, acetat celuloza sau nitroceluloza.Pentru ca procesul difuziv sa se desfasoare este necesara prezenta unor conditii de temperature si de agitare propice.In procesul de dializa din bilogie se utilizeaza saci de dializa in care se introduce amestecurile de separate (de dializat) si acesti saci de dializa umpluti sunt introdusi intr-o saolutie de dializa prevazuta cu un sistem de agitare unde compusii din proba de analizat difuzeaza daca poseda dimensiuni moleculare mai mici decat ochii de retea.CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC (IEC)Coloana cromatografica in IEC contine o faza stationara polimerica pe baza de schimbatori de ioni. Faza mobile antreneaza ca si in cazurile anterioare componentii din proba de analizat iar procesul de separare se bazeaza pe afinitatea componentilor (solutiilor) fata de faza stationara care poseda sarcini electrice deci si componentii care urmeaza sa fie separate trebuie sa fie de natura ionica.Gradul de incarcare al fazei stationare este dependent de valorile PH-ului eluentului care actioneaza la nivelul gruparilor funtionale grefate de-a lungul laturilor macromoleculare ale fazei stationare dependent de valoarea punctului izoelectric.PUNCTUL IZOELECTRIC este acea valoare a PH-ului mediului in care se gaseste o macromolecula, un complex sau un agregat la care suma algebrica a tuturor sarcinilor electrice este nula.Sub puntul isoelectric exista un excedent de protoni si din acesta cauza sistemul e ste in carcat pozitiv (+) iar peste puntul isoelectric exista un excedent de ioni hidroxid si sistemul se incarca negativ (-).Pentru fazele stationare care poseda valori ale PH-ului mai mari decat punctual isoelectric se definesc ca anioniti: se incarca pozitivi si sunt capabili sa selecteze anionii din amestecul de saparat. Atunci cand valorile PH-ului sunt mai mici decat punctul isoelectric, fazele stationare se numesc cationiti: incarcate negative si leaga prin intemediul fazelor ionice cationi.Interactiunea care se realizeaza la nivelul fazelor stionare sunt de natura ionica si sunt cu atat mai puternice cu cat exista sarcini mai mari in valoarea absoluta de semen opuse la nivelul solutiei de separat.Atunci cand proba de analizat este antrenata de faza mobile prin faza stationara, compusii neincarcati electric si care au acelasi semn cu faza staionara vor circula rapid prin coloana fara sa interactioneze cu gruparile funtionale de pe faza stationara si vor folosi coloana cromatografica primele.In schimb solutii care poseda incarcare electrica opusa fazei stationare vor interactiona cu aceasta si se vor fixa prin intermediul fortelor de interactiune electrostatica pe faza stationara. Dupa ce toti compusii neincarcati electric sau incarcati cu faza stationara au fost total eliminate urmeaza sa fie eliminati din coloana si compusii fixate pe faza stationara. Pentru aceasta exista 2 posibilitati: - soc de PH Soc de forta ionicaIn socul de PH se modifica brusc si brutal valoare PH-ului in asa fel incat interactiunea de natura electrostatica dintre analiti si faza stationara sa fie distrusa si astfel compusii eliberati sa fie eluati in vederea recuperarilor din coloana. Atunci cand se utilizeaza un soc de forta ionica se mareste puternic concentratia sarurilor din eluent iar acestea la nivelul interactiunii de natura electrostatica competitioneaza cu compusii fixati anterior pe care ii dislocuie si astfel in prezenta eluentului pot fi recuperati din coloana.CROMATOGRAFIA DE AFINITATE Exploateaza interactinea de recunoastere dintre speciile moleculare care au la baza afinitatea specifica a unui compus in raport cu altul.In procesul de recunoastere biologica trebuie sa existe o interrelatie intre cel putin 2 specii care se bazeaza pe forte de natura slaba (Van der Waals, hidrofobe si legaturi de hidrogen).In general in coloana cromatografica se introduce faza stationara inerta pe care se fixeaza unul dintre componentii interactiunii de afinitate iar faa mobila antreneaza celalalt component al interactiunii de recunoastere alaturi de alti compusi de care urmeaza sa fie separati.

Curs 7ELECTROFOREZA (deplasare in camp electric)Este un proces calitativ si cantitativ care se desfasoara in camp electric continuu si prezinta importanta analitica atunci cand produsii din proba de analizat (molecule, macromolecule, agregate macromoleculare) sunt incarcati electric. In prezenta campului electric continuu compusii incarcati electri tind in prima faza sa se orienteze in raport cu polii sursei si in faza urmatoare tind sa se deplaseze catre electrozii sursei de semn opus, fara ca sa atinga electrozii sursei si sa se descarce la acesc nivel (electroliza).Procesul de electoforeza presupune deci electromigrarea speciilor incarcate electric catre polii de semne opuse ale sursei de curent continuu.Procesul electroforetic se poate realiza fie in faza omogena (in solutii), fie in faza heterogena. Cu aplicabilitate in practica este electroforeza zonala (heterogena) care necesita un suport inert pe care se aseaza un suport electroforetic de natura poroasa capabil sa realizeze separarea analitilor din amestecul de separat pe diferite cai.Suportul electroforetic poseda ca si in cromatografie ochiuri de retea care permit diferitelor molecule sitarea speciilor moleculare dependent de structura si masele lor moleculare.In procesul electroforetic suportul inert cromatografic desparte 2 compartimente cu electrozi care fac contactul intre electrozi si suportul cromatografic care poate sa fie o hartie speciala cu pori controlati sau diferite geluri.Electrolitii de regula sunt solutii omogene de tampon. Au rolul de a prelua analiti din amestecul de separat si de a-i transport prin masa electroforetica in vederea separarii lor.Suportul electroforetic trebuie sa aiba:-caracteristici mecanice-stabilitate fizico-chimica-insolubilitate-accesibilitate-toxicitateTipuri de suport:-hartie Whatman-acetat de celuloza-APV-agar-silicogel-PAA-amidon-agarozaElectrolit: sistem tampon (PH, f.i.)Electrozii sursei de curent trebuie sa fie inerti chimic si de regula sunt confectionati din: aur, argint, platina.In procesul de electroliza pt ca se deplaseaza ordonat sarcini electrice intr-un mediu apar curenti paraziti de electrosmoza opusi ca sens curentului principal (inductor). Acesti curenti paraziti trebuie sa fie lauti in calcul atunci cand se realizeaza electroforeza deoarece acestia pot modifica substantial sensul de electromigrare al compusilor din amestecul de separat.1