criterii semi-cantitative şi cantitative în patologia tumorală mamară

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE “GRIGORE T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE MEDICINĂ

CRITERII SEMI-CANTITATIVE ŞI CANTITATIVE ÎN PATOLOGIA

TUMORALĂ MAMARĂ

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC

PROF. DR. IRINA-DRAGA CĂRUNTU

DOCTORAND

DANIELA CIOACĂ (MIHALACHE)

2013

i

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT

CAPITOLUL 1

GLANDA MAMARĂ NORMALĂ – ELEMENTE STRUCTURALE ȘI FUNCȚIONALE 1

1.1. CITOLOGIA GLANDEI MAMARE NORMALE 1

1.2. STRUCTURA HISTOLOGICĂ A GLANDEI MAMARE 2

1.3. ELEMENTE DE MORFOGENEZĂ ȘI HISTOFIZIOLOGIE 3

1.4. CELULELE STEM ÎN DEZVOLTAREA NORMALĂ ŞI CARCINOGENEZA GLANDEI

MAMARE 8

CAPITOLUL 2

TRĂSĂTURI CITO-HISTOLOGICE ALE CANCERULUI MAMAR 10

2.1. CLASIFICAREA CARCINOAMELOR MAMARE 10

2.2. ASPECTE CITOLOGICE ALE CARCINOAMELOR MAMARE 12

2.3.ASPECTE HISTOLOGICE ALE CARCINOAMELOR MAMARE 18

CAPITOLUL 3

TEHNICI DE LUCRU CHIRURGICALE UTILIZATE PENTRU DIAGNOSTICUL

CITOLOGIC ȘI HISTOLOGIC AL CANCERULUI MAMAR

26

3.1. EXAMENUL CITOLOGIC. PUNCȚIA ASPIRATIVĂ CU AC FIN (FNA) 26

3.2. EXAMENUL HISTOLOGIC 28

3.3. TERMINOLOGIA UTILIZATĂ ÎN DIAGNOSTICUL CITOLOGIC ȘI HISTOLOGIC AL

PUNCȚIEI ASPIRATIVE ȘI PUNCȚIEI BIOPSIE MAMARE (DIAGNOSTIC NON-

OPERATIV)

31

CAPITOLUL 4

MOTIVAŢIA ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI DOCTORAL 35

CAPITOLUL 5

CRITERII DE GRADARE ÎN CITOLOGIA MAMARĂ 36

5.1. INTRODUCERE 36

5.2. MATERIAL ȘI METODĂ 37

5.2.1. LOTUL DE STUDIU. ORGANIZAREA BAZEI DE DATE 37

5.2.2. METODOLOGIA DE LUCRU 38

5.2.2.1. EXAMENUL CITOLOGIC 39

5.2.2.2. GRADAREA CITOLOGICĂ 40

5.2.2.3. EXAMENUL HISTOPATOLOGIC 43

5.2.2.4. ANALIZA STATISTICĂ 45

5.3. REZULTATE 45

5.3.1. EVALUAREA GRADING-ULUI CITOLOGIC 45

5.3.2. EVALUAREA GRADING-ULUI HISTOLOGIC 57

5.3.3. CORELAȚII GRADING CITOLOGIC VERSUS GRADING HISTOLOGIC 58

5.4. DISCUȚII 61

5.4.1. EVALUAREA IMPORTANȚEI GRADINGULUI CITOLOGIC 61

5.4.2. GRADING CITOLOGIC VERSUS GRADING HISTOPATOLOGIC 65

CAPITOLUL 6

CRITERII DE GRADARE ÎN HISTOPATOLOGIA MAMARĂ 67

6.1. INTRODUCERE 67

6.2. MATERIAL ŞI METODǍ 68

6.2.1. LOTUL DE STUDIU. ORGANIZAREA BAZEI DE DATE 68

6.2.2. METODOLOGIA DE LUCRU 69

6.2.2.1. EXAMENUL HISTOPATOLOGIC 69

6.2.2.2. SISTEMUL DE GRADARE NOTTINGHAM 69

6.2.2.3. STADIALIZAREA PTMN 69

6.3. REZULTATE 71

6.3.1. PROFILUL HISTOPATOLOGIC ŞI IMUNOHISTOCHIMIC 71

ii

6.3.2. GRAD DE DIFERENŢIERE ŞI SCOR NOTTINGHAM 79

6.3.3. CARACTERISTICILE CLINICO-PATOLOGICE - SINOPSIS 84

6.4. DISCUŢII 85

6.4.1. VALOAREA SCORULUI NOTTINGHAM 85

6.4.2. VALOAREA PROFILULUI IMUNOHISTOCHIMIC 86

CAPITOLUL 7

CRITERII OPERAŢIONALE ÎN EVALUAREA MORFOMETRICĂ A LEZIUNILOR

GLANDEI MAMARE – CONCEPERE ŞI DEZVOLTARE DE TEHNICĂ

91

7.1. INTRODUCERE 91

7.2. CRITERII MORFOMETRICE ÎN CITOLOGIA MAMARĂ 93

7.2.1. MATERIAL ŞI METODĂ 93

7.2.2. REZULTATE 97

7.2.2.1. ALGORITM DE EVALUARE PRIN MORFOMETRIE COMPUTERIZATA 97

7.2.2.1.1. CONCEPEREA ŞI TESTAREA MACROULUI MAMAR_CIT 97

7.2.2.1.2. TEXTUL SURSA AL MACROULUI MAMAR_CIT 99

7.2.2.2. TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CITOLOGIA BENIGNĂ ŞI CITOLOGIA MALIGNĂ 106

7.2.2.3. TRASATURI MORFOMETRICE IN CITOLOGIA MALIGNA VERSUS GRADING CITOLOGIC 109

7.2.2.4. TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CITOLOGIA MALIGNĂ VERSUS GRADING HISTOLOGIC 110

7.2.3. DISCUŢII 111

7.2.3.1. REPERE FUNDAMENTALE PENTRU APLICAŢIILE MORFOMETRIEI ÎN CITOLOGIA MAMARĂ 111

7.2.3.2. PARAMETRI MORFOMETRICI FIABILI 112

7.3. CRITERII MORFOMETRICE ÎN HISTOPATOLOGIA MAMARĂ 114

7.3.1. MATERIAL ŞI METODĂ 114

7.3.2. REZULTATE 115

7.3.2.1. ALGORITM DE EVALUARE PRIN MORFOMETRIE COMPUTERIZATĂ 115

7.3.2.1.1. CONCEPEREA ŞI TESTAREA MACROULUI MAMAR_HP 115

7.3.2.1.2. TEXTUL SURSĂ AL MACROULUI MAMAR_HP 115

7.3.2.2. TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CARCINOM DUCTAL INVAZIV 116

7.3.2.3. TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CARCINOMUL NEDIFERENŢIAT 117

7.3.2.4. TRĂSĂTURI MORFOMETRICE ÎN CARCINOMUL DUCTAL INVAZIV VERSUS CARCINOM

NEDIFERENŢIAT 118

7.3.3. DISCUŢII 120

7.3.3.1. REPERE FUNDAMENTALE PENTRU APLICAŢIILE MORFOMETRIEI ÎN HISTOPATOLOGIA

MAMARĂ 120

7.3.3.2. PARAMETRI MORFOMETRICI FIABILI 121

7.4. MORFOMETRIA COMPUTERIZATĂ – VALOAREA METODEI 123

7.5. DEZVOLTAREA “KNOW-HOW”-ULUI ÎN ANALIZA DE IMAGINE ASISTATĂ DE

CALCULATOR – CONTRIBUŢII PERSONALE 125

CAPITOLUL 8

CONCLUZII 127

BIBLIOGRAFIE 128

Teza de doctorat este ilustrată prin 91 figuri şi 27 tabele. În rezumat sunt incluse doar unele tabele

selectate din ansamblul celor prezente în teză.

CRITERII SEMI-CANTITATIVE ŞI CANTITATIVE ÎN PATOLOGIA TUMORALĂ MAMARĂ

1

INTRODUCERE

Glanda mamară este caracterizată printr-o histoarhitectonie particulară, rezultat al interacţiunii dintre

elementele epiteliale şi ţesutul conjunctiv specializat, de tip mixoid, hormono-dependent (Cunha, 1994).

Glanda mamară prezintă o structură complexă ramificată, formată din două componente principale: unitatea

terminală ducto-lobulară (UTDL) şi marele sistem ductal (McCarty, Nath, 1997), deosebit de importante

datorită relației directe cu patologia glandei mamare (Rosai, 2004). UTDL este formată din lobuli şi ducte

terminale şi reprezintă porţiunea secretorie a glandei. Întregul sistem epitelial ducto-lobular este tapetat de un

epiteliu bistratificat specializat, ce prezintă aspecte distincte ultrastructurale şi imunohistochimice. Numeroase

cercetări au demonstrat că cele două linii celulare de bază – epitelială şi mioepitelială - derivă dintr-o celulă

comună, cu aspecte fenotipice de celulă stem (Amălinei, 2005, Mills, 2012).

În mecanismul patogenic al carcinogenezei mamare, se consideră că rolul de promotor revine unei

populaţii de celule tumorale cu caracteristici de celule stem, numite „celule stem canceroase” (Al-Hajj et al.,

2003, Stingl, Caldas, 2007). Pentru definirea compartimentului celulelor stem și al celulelor precursor ale

cancerului mamar este relevantă diferențierea transformărilor de la nivelul țesutului mamar uman din etapa

de dezvoltare fetală, pubertate, homeostazie tisulară ciclică lunară și perioada de sarcină (Petersen, Polyak,

2010). Celulele stem/progenitor mamare pot fi la originea unuia din cele cinci subtipuri moleculare de

carcinom mamar (luminal A, luminal B, HER2, bazal-like și normal-like) (Sorlie et al., 2003), fapt ce susţine

existența unor stadii diferite de diferenţiere a celulelor epiteliale mamare și explică heterogenitatea

morfologică şi moleculară a cancerului mamar (Polyak, 2007, Donțu et al., 2004, Behbod, Rosen, 2005,

Stingl, Caldas, 2007).

Având în vedere morbiditatea și mortalitatea prin cancer mamar, asistăm la eforturi deosebite de a

depista această afecțiune cât mai precoce. Un diagnostic patologic precoce al leziunilor palpabile solide sau

chistice sau leziunilor nepalpabile, detectate mamografic, ultrasonografic sau prin rezonanță magnetică (MRI

sau RMN) (Koss et al., 2006) se poate realiza prin puncția aspirativă cu ac fin (FNA) (Ku et al., 1994).

Metoda de investigare prezintă două avantaje majore: scăderea morbidității prin evitarea intervenției

chirurgicale și, consecutiv, evitarea tratamentului excesiv al tumorilor low-grade și, simultan, selectarea

cazurilor care ar beneficia de terapia neoadjuvantă (Saha et al., 2013). Această metodă nu necesită spitalizare,

putându-se efectua în sala de operaţie, nu lasă cicatrici, spre deosebire de biopsii, oferă confort psihic mai bun

decât o intervenţie chirurgicală, fiind mai puţin traumatizantă (Mogoanta et al., 2007). În realizarea

citodiagnosticului, este foarte important cunoaşterea aspectelor normale și a variațiilor fiziologice ale

celulelor, precum şi a celorlaltor modificări morfologice care, în absența cancerului, determină anomalii

celulare substanțiale (procese inflamatorii diverse, modificări proliferative, metaplazice, degenerative,

procese neoplazice benigne, alterări celulare iatrogene) (Koss, Melamed, 2006).

Grupurile de cercetare axate asupra citologiei mamare au propus, în timp, diferite sisteme de scor,

urmărind o caracterizare cât mai precisă a modificărilor celulare şi, respectiv, nucleare, astfel încât

încadrarea diagnostică într-un anumit grading citologic să reflecte cât mai bine gradul de severitate al

leziunilor, în corespondenţă directă cu imaginea histopatologică corespondentă. Cel mai înalt grad de

reproductibilitate îl oferă sistemul de gradare Robinson (Elston, Ellis, 1991, Sinha et al., 2009).

CAPITOLUL 4.

OBIECTIVELE ŞI MOTIVAŢIA STUDIULUI PERSONAL

Cancerul mamar reprezintă cel mai frecvent tip de neoplazie care afectează sexul feminim, cu

morbiditate şi mortalitate în continuă creştere – în pofida progreselor înregistrate în diagnosticul precoce şi

terapia adjuvantă.

Studiul doctoral realizat a avut, ca punct de plecare, experienţa personală de diagnostic citologic şi

histopatologic în patologia tumorală mamară. Rolul patologului în evaluarea citologiei mamare este uneori

mai dificil decât în formularea diagnosticului patologic. În evoluţia conceptelor diagnostice, evaluarea

convenţională, bazată pe aprecierea subiectivă a caracteristicilor microscopice, fundamentată pe cunoştinţe

teoretice şi practice solide, a fost permanent completată cu o serie de criterii semi-cantitative, în scopul de a

oferi criterii cât mai obiective care să permită o încadrare cât mai precisă. Aceste criterii, aplicate în

diagnosticul citologic şi histopatologic, au fost completate în ultimele decade prin facilităţile analizei de

imagine asistată de calculator, care au condus la dezvoltarea tehnicilor de morfometrie computerizată, cu

rezultate cantitative care se pot transfera spre caracterizarea transformării maligne.

Pornind de la aceste considerente generale, tema de cercetare pentru studiul doctorala fost axată pe


2

evaluarea unor criterii semi-cantitative şi cantitative în patologia tumorală malignă. În mod concret,

obiectivele urmărite au vizat:

- compararea unor criterii de gradare operaţionale în citologia mamară, prin analiza a 8 tipuri de

scoruri, şi corelarea grading-ului citologic cu grading-ul histologic;

- analiza criteriilor de gradare operaţionale în examenul histopatologic, şi a gradului de

diferenţiere tumorală versus sistem de gradare Nottingham, urmărind aplicabilitatea lor în

practica curentă de diagnostic;

- dezvoltarea unei tehnici originale de citometrie computerizată, care să permită un studiu

complex în citopatologia şi histopatologia mamară.

CAPITOLUL 5.

CRITERII DE GRADARE ÎN CITOLOGIA MAMARĂ

5.1. INTRODUCERE

Cancerul mamar constituie un domeniu de interes major în cercetarea medicală. Eforturile concertate

ale comunităţii medicale preocupate de acest subiect sunt orientate asupra căilor moleculare complexe care

fundamentează carcinogeneza mamară, urmărind nu numai descifrarea mecanismului patogenic, ci şi

identificarea de markeri cu valoare predictivă şi prognostică. Heterogenitatea markerilor moleculari în raport

cu tipul histologic primar complică evoluţia şi răspunsul la terapie, fiind departe de a avea răspunsuri cu

valoare de adevăr ştiinţific absolut.

Conform studiilor efectuate de multiple echipe de cercetători, gradarea citologică a cancerului

mamar și-a dovedit fezabilitatea. Este astfel recomandată includerea gradingului obținut pe materialul obținut

prin citologie aspirativă cu ac fin în cadrul unor rapoarte cu valoare prognostică (Abati, McKee, 1998, Saha

et al., 2013).

Analiza literaturii de specialitate relevă că în 1955 a fost introdus conceptul de gradare nucleară

(Black et al., 1955), modificat ulterior (Fisher et al, 1980, Cajulis et al., 1997). Pentru aprecierea grading-ului

nuclear au fost propuse, în timp, numeroase sisteme de scor. Sistemul Scarff Bloom Richardson cu

modificările Nottingham, descris de Elston și Ellis, denumit și metoda Bloom Richardson modificată de

Elston, constituie cel mai apreciat sistem de gradare, acceptat și apreciat pe plan internațional (Elston, Ellis,

1991, Ellis et al., 2002). Suplimentar, analiza morfometrică poate aduce informații prețioase în asociere cu

sistemul recunoscut de gradare citologică (Kalhan et al., 2010).

În mod concret, obiectivele urmărite în cadrul studiului doctoral au constat în:

- analiza comparativă a 8 sisteme de scor aplicate pentru gradarea nucleară în examenul citologic,

în scopul extragerii unor informații prețioase privind valoarea lor individuală prin prisma

avantajelor pentru diagnostic, terapie și prognostic;

- analiza comparativă dintre grading-ul nuclear citologic şi cel obținut în gradarea histologică, în

scopul stabilirii corelaţiei existente între cele două tipuri de grading, prin prisma corespondenţei

de încadrare diagnostică citologică versus histopatologică.

5.2. MATERIAL ŞI METODǍ

5.2.1. Lotul de studiu. Organizarea bazei de date

Lotul de studiu a inclus 137 de cazuri diagnosticate citologic în perioada 1 ianuarie 2010 – 1 iulie

2013, la Serviciul de Anatomie Patologică şi Prosectură, Spitalul Judeţean Brăila, şi Cytopath SRL Brăila.

Conform protocolului studiului doctoral, cercetarea a fost avizată de Comisia de Etică a U.M.F.

„Grigore T. Popa” Iaşi, în baza consimţământului informat al pacientelor, în vederea utilizării produsului

biologic.

Din totalul celor 137 de cazuri, 90 de cazuri au prezentat caractere citologice de malignitate, iar 47

de cazuri au fost încadrate ca leziuni benigne. Un rezultat citologic de tip benign a fost fals negativ,

examenul histopatologic susţinând diagnosticul de carcinom ductal invaziv. Un caz cu diagnostic citologic

de malignitate a fost exclus din lotul analizat, deoarece diagnosticul a fost de melanom. În baza examenului

citologic standard, cele 90 de cazuri au fost încadrate iniţial în următoarele subtipuri histologice: carcinom

mamar ductal invaziv- 76 cazuri; carcinom mamar lobular invaziv - 11 cazuri; carcinom medular - 3 cazuri.

Cazurile au fost reevaluate prin aplicarea a 8 sisteme de scor de gradare nucleară, urmărindu-se

analizarea utilității scorurilor în examenul citologic în diagnosticul afecțiunilor glandei mamare.

Din cele 90 de cazuri încadrate diagnostic în categoria malignă, un număr de 20 de cazuri au fost


3

investigate prin puncție-biopsie. Încadrarea diagnostică histopatologică a fost de carcinom ductal invaziv, cu

următoarele grade de diferenţiere şi valori de scor pentru grading-ul nuclear histologic, conform sistemului

Nottingham: carcinom ductal invaziv bine diferențiat (G1): 2 cazuri; carcinom ductal infiltrativ moderat

diferențiat (G2): 12 cazuri (8 cazuri scor 6 și 4 cazuri scor 7); carcinom ductal infiltrativ slab diferențiat

(G3): 6 cazuri (4 cazuri scor 9 și 2 cazuri scor 8).

5.2.2. Metodologia de lucru

Metodologia de lucru a constat în următoarele etape: evaluarea citologică primară; gradarea cazurilor

cu aspect malign, utilizând scoruri diverse; diagnosticul histopatologic cu clasificarea SBR modificată și

gradarea citologică – pentru cazurile care au beneficiat de puncţie biopsie; evaluarea corespondenței între

cele două tipuri de examinare, respectiv citologic și histopatologic și aprecierea sistemelor de gradare

nucleară citologică, din punct de vedere al gradului de concordanță cu gradarea nucleară histologică.

5.2.2.1. Examenul citologic

Examenul citologic s-a efectuat pe produsul obținut prin biopsie aspirativă (puncţie aspirativă cu ac

fin (FNA – eng. fine-needle aspiration).

5.2.2.2. Gradarea citologică

Gradarea citologică a celor 90 de cazuri investigate s-a realizat conform morfologiei celulare.

Parametrii au fost urmăriţi prin utilizarea unui micrometru ocular. Analiza citologică a implicat reevaluarea

cazurilor de către doi anatomopatologi (doctorand şi, respectiv, membru în Comisia de îndrumare), în mod

independent şi, în cazurile în care s-au înregistrat diferenţe de opinie, gradarea a necesitat punerea de acord a

celor doi examinatori. Prezentăm în continuare scorurile utilizate, a căror aplicare este fundamentată pe

aprecierea unor criterii morfologice prin valori numerice. Scorurile au valori de la 1 la 3, gradarea fiind

rezultatul sumării criteriilor independente.

Criteriile Hunt (Hunt et al., 1990) includ următoarele criterii:diametrul nuclear; pleomorfismul

nuclear;prezența nucleolilor. În urma aplicării acestor criterii, tumorile mamare se pot clasifica în: tumori de

grad citologic redus (low-grade); tumori de grad citologic înalt (high-grade).

Criteriile Black (simplificate și modificate) au fost ulterior aplicate, introducându-se paternul

cromatinian și mitozele drept criterii suplimentare. Sistemul Black simplificat a fost utilizat mai ales datorită

criteriilor logice utilizate și a reproductibilității sale înalte, prin raportarea la doar două criterii, în loc de trei

(Cajulis et al., 1997). Rezultatele gradării Black modificate sunt considerate drept ”golden standard”

deoarece se corelează în măsura cea mai mare cu sistemul de gradare histologică (Elston, Ellis, 2002).

Modificările aduse de Fisher criteriilor Black ale gradării nucleare au condus la individualizarea

următoarelor criterii de valuare a gradului tumoral (Black et al., 1955, Fisher et al., 1980): anizonucleoză;

membrană nucleară; cromazie nucleară; nucleoli; pattern cromatinian; mitoze.

Sistemul Masood al indexului citologic (Masood et al., 1991) include celulele mioepiteliale și

exclude mărimea celulară și mitozele din criteriile de gradare citologică, fiind util mai ales în stabilirea

diagnosticului diferențial între leziunile benigne vs. leziunile maligne mamare, astfel încât are o valoare

limitată în gradarea carcinoamelor mamare.

Sistemul Howell utilizează următoarele criterii: formarea de tubuli; pleomorfismul nuclear; numărul

de mitoze.

Sistemul Mouriquand (Mouriquand, Pasquier,1980, Mouriquand et al., 1986) este bazat pe

caracteristicile celulare, aspectele nucleare, aspectul nucleolului şi figurile mitotice.

Sistemul Robinson de grading include două noi criterii (disocierea celulară și marginile nucleare)

(Robinson et al., 1994). Conform sistemului Robinson, gradele asociate scorurilor au fost următoarele: grad I

– scor 6-11; grad II – scor 12-14; grad III – scor 15-18.

Sistemul Khan (Khan et al., 2009) a urmărit gradarea parametriilor nucleari: grad I – scor 6-10;

grad II – scor 11-14; grad III – scor 12-19.

Sistemul Taniguchi, include 7 parametri citologici, după cum urmează (Taniguchi et al., 2000):

necroza; mărimea celulară; raportul nucleo-citoplasmatic; pleomorfismul nuclear; nucleoli; granularitatea

nucleară; densitatea cromatinei. Gradele asociate scorurilor au fost următoarele: grad I – scor 6-19; grad II –

scor 10-11; grad III – scor 12-19.

5.2.2.3. Examenul histopatologic

Examenul histopatologic a fost realizat pe preparate incluse la parafină, etapele de prelucrare

urmărind protocolului standard practicat în laboratoarele de anatomie patologică.

5.2.2.4. Analiza statistică

Toate analizele statistice au fost efectuate în SPSS, versiunea20 (SPSS Inc, Chicago, IL, SUA). În

cazul variabilelor categoriale s-au folosit teste specifice de corelație neparametrică, avându-se în vedere

corelația Spearman Rank R şi coeficientul de acord kappa (k). Analiza a folosit scara de referință propusă de


4

Landis și Koch în cadrul căreia gradul de acord poate fi calificat drept "slab" (k <0), "ușor" (k =0-0,20),

"bun" (k =0,21-0,40), "moderat" (k =0,41 – 0,60), "substanțial" (k =0,61-0,80) și"aproape perfect" (k =0,81 –

1,00), în funcție devaloarea coeficientului Kappa. Nivelul de semnificație al testelor a fost considerat pentru

valori p<0,05 (95%CI).

5.3. REZULTATE

5.3.1. Evaluarea grading-ului citologic

Aplicarea sistemelor de gradare descrise în literatura de specialitate (Hunt, Black, Fisher, Masood,

Howell, Mouriquand, Robinson, Khan, Taniguchi) a condus la o evaluare comparativă a încadrării

diagnosticului citologic din punctul de vedere al severităţii leziunilor.

Aplicarea criteriilor Hunt a condus la identificarea a 70 cazuri high-grade, 20 cazuri low-grade.

Aplicarea criteriilor Black simplificate a condus la identificarea a 5 cazuri grad I; 40 cazuri grad II;

45 cazuri grad III.

Aplicarea modificărilor aduse de Fisher criteriilor Black a condus la clasificarea următoare: 7 cazuri

grad I; 37 cazuri grad II; 46 cazuri grad III:

Aplicarea criteriilor Masood a condus la confirmarea diagnosticului de malignitate în toate cele 90

de cazuri, gradarea acestora fiind dificilă.

Aplicarea criteriilor Howell a condus la clasificarea următoare: 12 cazuri grad I; 43 cazuri grad II; 35

cazuri grad III.

Aplicarea criteriilor Mouriquand a condus la clasificarea următoare: 9 cazuri grad I; 39 cazuri grad

II; 42 cazuri grad III.

Aplicând criteriile Robinson s-au putut grada tumorile examinate citologic în următoarele categorii:

18 cazuri gradul I; 38 cazuri gradul II; 34 cazuri gradul III.

Aplicarea sistemului Khan de gradare a condus la următoarea clasificare după gradul tumoral: 20

cazuri gradul I; 41 cazuri gradul II; 29 cazuri gradul III.

Aplicând criteriile sistemului Taniguchis-au putut grada tumorile examinate citologic în următoarele

categorii: 21 cazuri gradul I; 49 cazuri gradul II; 20 cazuri gradul III.

5.3.2. Evaluarea grading-ului histologic

Cele 20 de cazuri investigate prin biopsie și examen histopatologic au prezentat următoarea

încadrare citologică, în raport de grading-ul citologic: 3 cazuri grad I; 10 cazuri grad II; 7 cazuri grad III. În

urma evaluării morfologiei celulelor tumorale, conform sistemului de grading Nottingham, cazurile au fost

încadrate în cele 3 categorii de scor, după cum urmează: 3 cazuri grad I (scor 3-5); 9 cazuri grad 2 (scor 6-7);

8 cazuri grad 3 (scor 8-9).

5.3.3. Corelaţii grading citologic versus grading histologic

Corespondenţa dintre grading-ul citologic şi histopatologic a relevat următoarele aspecte. Din cele 3

cazuri care au fost diagnosticate ca prezentând grad I citologic, histopatologic 2 cazuri au prezentat grad I, şi

1 caz – gradul II.În consecință, concordanța între gradarea citologică și cea histopatologică a fost, pentru

gradul I, de 66,67%. Din cele 10 cazuri diagnosticate citologic cu grad II, încadrarea histopatologică a avut

următoarea corespondenţă: 1 caz grad I; 7 cazuri grad II; 2 cazuri grad III.În consecință, concordanța între

gradarea citologică și cea histopatologică a fost de 70% pentru gradul II. Pentru cele 7 cazuri încadrate

citologic corespunzător gradului III, s-a observat următoarea distribuție histopatologică: 1 caz grad II; 6

cazuri grad III.În consecință, concordanța între gradarea citologică și cea histopatologică a fost de 85,71%

pentru gradul III. Rezultatele încadrării în cele 2 tipuri de sisteme de gradare sunt ilustrate în tabelul 5.6.

Tabel 5.6. Corespondenţa cazurilor în raport de gradingul citologic şi histologic

Grad histologic Nottingham

Grad citologic Robinson 1 2 3 Total

1 2 1 0 3

% 66,67% 33,33% 0%

2 1 7 2 10

% 10% 70% 20%

3 0 1 6 7

% 0% 14,29% 85,71%

Analiza statistică bazată pe teste specifice de corelație neparametrică (corelația Spearman Rank R şi

coeficientul de acord kappa(k)) a indicat o asociere semnificativă a rezultatelor celor două criterii de


5

încadrare (χ2=15.35, p=0.0041), coeficientul kappa corespunzând unui grad moderat de acord al rezultatelor,

dar semnificativ statistic (k=0.592, p<<0.01, 95%CI).

Studiul a urmărit totodată corelarea gradelor de severitate a leziunilor evaluate prin cele două metode

(citologic, histopatologic). Rezultatul corelaţiei neparametrice (Spearman Rank R) a indicat prezenţa

corelaţiei între încadrarea citologică şi grading-ul histologic (r=0.739, p<<0.01. 95%CI).

5.4. DISCUŢII

5.4.1. Evaluarea importanței gradingului citologic

Valoarea explorării citologice, ca și componentă a triplului test în diagnosticarea leziunilor mamare

palpabile, este pe deplin susținută în investigația noastră.

În perioada 2010-2011, cazurile investigate se caracterizează prin existența unei diferențe de

aproximativ o decadă (8,79 ani) între vârsta medie a pacientelor cu patologie benignă și cea a pacientelor cu

patologie malignă. Această diferență este justificată de perioada necesară cumulărilor stimulilor

hormonali nebalansați cât și a altor carcinogene, în tumorigeneza mamară. În ansamblul celor 137 de

cazuri am înregistrat un caz fals negativ. Diagnosticul clinic al pacientei a fost de tumoră mamară la nivelul

sânului stâng, iar examenul citologic a evidenţiat prezența de țesut fibroadipos, rare placarde epiteliale

coezive și rare celule individuale cu raport nucleo-citoplasmatic păstrat, aspectul fiind compatibil cu un

fibroadenom mamar, indicându-se necesitatea controlului histopatologic. Examenul histopatologic a relevat,

ulterior, prezența unui carcinom ductal invaziv, moderat diferențiat G2, fapt ce demonstrează superioritatea

examenului histopatologic și limitele examenului citologic în diagnosticul tumorilor mamare. Examenul

citologic dintr-un caz cu limfoganglion axilar a pus în evidenţă frecvente placarde epiteliale cu hipertrofii

nucleare, raport nucleo-citoplasmatic peste 1, pleomorfism celular și nuclear, relative frecvente hematii și

rare limfocite – elemente elocvente pentru o metastază carcinomatoasă. Consecutiv, în cazul acesta, a fost

demonstrată valoarea puncției limfoganglionare care, suplimentar puncției citologice din nodulul mamar

suspect, devine, prin depistarea depozitelor metastatice, definitoriu pentru diagnostic și stadializare.

Prin aplicarea comparativă, în cazuistica noastră, a sistemelor de scor propuse de diverși cercetători,

se poate constata că există diferenţe mari între numărul de cazuri încadrate în fiecare categorie (grad I, II,

respectiv III), în raport de sistemele de scor aplicate. În mod paradoxal, dacă numărul de cazuri apreciate cu

un anumit grad este relativ apropiat între anumite sisteme de scor, această situaţie nu se repetă şi pentru

cazurile apreciate cu celelalte două grade. Explicaţia pentru neconcordanţele care apar în încadrarea

diagnostică are la bază criteriile diferite cu care acestea operează. Dintre cele 8 sisteme de gradare utilizate,

doar 4 au utilizat criterii obiective de scor pentru fiecare parametru – sistemele Black şi Fisher nu au sistem

de scor pentru fiecare parametru, iar sistemul Mouriquand nu permite categorizarea lor (Saha et al., 2013).

Sistemele Robinson, Howell, Khan si Taniguchi susţin realizarea unei gradări eficiente (Saha et al., 2013). În

sistemul Taniguchi, raportul nucleo-citoplasmatic este mai puțin corelat cu gradul final (Saha et al., 2013). În

sistemul Robinson, mărimea celulară și nucleolii nu prezintă o semnificație concretă în gradarea citologică

finală. În sistemul Khan, mărimea nucleară nu este corelată cu gradarea citologică finală (Saha et al., 2013).

În sistemul Taniguchi, 4 dintre cei 7 parametri utilizați nu au semnificație concretă în gradarea citologică

finală (Saha et al., 2013). Sistemul de grading Robinson asigură cel mai înalt grad de acurateţe în evaluarea

modificărilor calitative specifice celulelor maligne, conform studiilor efectuate de numeroase colective de

cercetare (Bhargava et al., 2008, Sinha et al., 2009, Rekha et al., 2011, Saha et al., 2013, Vasudev et al.,

2013). În baza experienţei personale, considerăm că studiul nostru accentuează valoarea scorului Robinson în

evaluarea citologică a tumorilor mamare, ținând cont atât de posibilitatea realizării de categorii succesive de

grading, cât și de criteriile operaționale facile de grading. Rezultatele noastre nu susţin valoarea rapoartelor

de cercetare care pledează pentru introducerea în practica curentă de diagnostic a unor noi scoruri de gradare.

5.4.2. Grading citologic versus grading histopatologic

Asocierea examenelor complementare, citologic (mai ales aspirativ), histopatologic (mai ales

bioptic), examenului clinic și radiologic poate ridica acuratețea diagnosticului până spre 99%. Acurateţea şi

precizia ridicată a examenului citologic realizat, demonstrată de corespondența cu diagnosticul

histopatologic realizat pe piesele bioptice în procent de 98,88% (un singur diagnostic citologic fals negativ și

un diagnostic citologic fals negativ, pe produsul obținut prin puncția - aspirație cu ac fin a nodulului tumoral,

compensat prin diagnosticul pozitiv realizat dintr-un limfoganglion axilar), confirmă datele din literatură

(Vasudev et al., 2013).

Gradul înalt de corelație citologie - histopatologie constatat în cazuistica noastră, în concordanță cu

datele din literatura de specialitate (Pandit, Parekh, 2000, Sinha et al., 2009), determină aserțiunea că

gradarea citologică constituie un foarte bun factor de predicție a gradului histologic, datorită corelației


6

semnificative existente între acestea. Corespondența dintre grading-ul evaluat prin citologie și cel obținut

prin examenul histopatologic și, concomitent, cu prognosticul, este susținută în literatura de specialitate.

Totuşi, rezultatele noastre au relevat valori diferite pentru corespondenţa dintre grading-ul citologic şi cel

histopatologic, suprapunerea diagnostică fiind 66,67% pentru gradul I, 70% pentru gradul II şi 85,71%

pentru gradul III, comparativ cu raportările de 95% pentru gradul I, de 70% pentru gradul II și de 45% pentru

gradul III (Mouriquand et al., 1986). Subliniem faptul că analiza de corelaţie neparametrică Spearman Rank

R a evidenţiat o asociere semnificativă a rezultatelor celor două criterii de încadrare (χ2 = 15,35, p = 0,0041),

şi prezenţa corelaţiei între încadrarea citologică şi grading-ul histologic (r = 0,739, p<<0,01, 95%CI).

Valoarea practică a gradării citologice este cu atât mai importantă cu cât în studiul nostru corespondența a

fost maximă în gradul III (> 85,71%), ceea ce reprezintă un beneficiu pentru ameliorarea prognosticului,

permițând instituirea terapiei cu Tamoxifen imediat după examenul citologic. Deşi rezultatele noastre au

relevat, conform scalei de referinţă Landis și Koch, un un grad moderat de acord al rezultatelor, acesta a fost

semnificativ statistic (k = 0,592, p<<0,01, 95%CI).

Considerăm că procentul mai redus, deși consistent (66,67%), constatat în cazul gradului I se poate

explica prin dificultățile legate în special de evaluarea unor atipii minore caracteristice tumorilor bine

diferențiate și paucicelularității celulare relative. Analiza minuțioasă a cazurilor discordante a condus la

rezultate interesante, și anume că aspectele sesizate se pot atribui, cel puțin parțial, numărului relativ redus de

grupe celulare disponibile pentru examinare pe frotiurile realizate (sub 8 pe un frotiu), pe când analiza

cazurilor concordante a relevat faptul că niciunul din acestea nu prezenta mai puțin de 8 grupe celulare pe

fiecare frotiu. Suplimentar, s-au putut depista alte surse de eroare, cum ar fi: procent important de necroză

tumorală sau o fibroză densă care împiedică obținerea și vizualizarea celulelor tumorale. În urma studiului

efectuat, considerăm ca minim necesare pentru evaluarea citologică un număr de cel puțin 8 grupe celulare,

deși se recomandă ca minim necesare un număr de cel puțin 6 grupe celulare, în literatura de specialitate

(National Breast Cancer Centre, 2004). În caz contrar, s-au constatat discrepanțe între gradingul citologic și

cel histopatologic.

CAPITOLUL 6.

CRITERII DE GRADARE ÎN HISTOPATOLOGIA MAMARĂ

6.1. INTRODUCERE

Un indicator puternic al prognosticului în cancerul mamar îl constituie gradingul histopatologic, în

cadrul căruia gradul nuclear a constituit mult timp criteriul de bază (Black et al., 1955). Acestui criteriu i s-au

adăugat, ulterior, proporția tumorală constituită din tubuli și rata mitotică (Bloom, Richardson, 1957, Scarff,

Torloni, 1968). Cele mai utilizate sisteme pentru grading-ul cancerului mamar în SUA sunt sistemul Scarff-

Bloom-Richardson (SBR) și sistemul Black, pe când în Europa se preferă aplicarea modificărilor Elston-Ellis

ale sistemului SBR (sistemul de gradare Nottingham), care aduc un plus de obiectivitate și rigurozitate

(Elston, Ellis, 2002, Cardiff, Jensen, 2013). Astfel, se exclud nucleii hipercromi, celulele apoptotice și se

cuantifică în mm2 ariile evaluate. Îmbunătățirile aduse au determinat creșterea reproductibilității

diagnosticului realizat de către anatomo-patologi și a gradului de acceptabilitate a acestuia de către clinicieni

(Cardiff, Jensen, 2013). Unii cercetători consideră că utilizarea exclusivă a ratei mitotice este suficientă ca și

indicator predictiv (Clayton, 1991).

Progresele relativ recente ale analizei imagistice creează premisele unei contribuții din ce în ce mai

eficiente în acest domeniu, astfel încât să asistăm la o mai bună orientare terapeutică și o evaluare

prognostică de o mare fidelitate.

În mod concret, obiectivele urmărite în cadrul studiului doctoral au constat în:

- analiza criteriilor de gradare operaţionale în examenul histopatologic, urmărind aplicabilitatea

lor în practica curentă de diagnostic;

- evaluarea comparativă a gradului de diferenţiere tumorală şi a valorilor sistemului de gradare

Nottingham, în scopul aprecierii utilităţii lor efective pentru caracterizarea agresivităţii tumorale.

6.2. MATERIAL ŞI METODǍ

6.2.1. Lotul de studiu. Organizarea bazei de date

Lotul de studiu a inclus un număr de 98 de cazuri de tumori mamare maligne, cu vârste cuprinse

între 40 și 83 de ani, diagnosticate în perioada 1 ianuarie 2010 – 1 iulie 2013 în cadrul Serviciului de

Anatomie Patologică şi Prosectură, Spitalul Judeţean Brăila. Cazurile selectate au fost reevaluate

histopatologic, urmărindu-se analiza utilității gradingului în diagnosticul cancerelor glandei mamare.


7

Suplimentar, un număr de 44 de cazuri au fost investigate imunohistochimic pentru identificarea

profilului receptorilor estrogenici (RE) și progesteronici (RP), iar 33 de cazuri – pentru expresiei HER2/neu.

Pentru investigaţia imunohistochimică pacientele au contactat individual diferite laboratoare de specialitate

din ţară, la recomandarea patologului şi clinicianului, care au avut acces la rezultate pentru formularea

diagnosticului complex şi, respectiv, stabilirea conduitei de diagnostic.

Baza de date creată a inclus: date de identificare a pacientelor, vârsta la momentul diagnosticului;

data diagnosticului (conform buletinului anatomo-patologic); localizarea tumorii și aspectul său clinic;

prezența clinică a adenopatiei axilare; stadializarea clinică TNM; diagnosticul histopatologic; scorul

Nottingham; stadializarea pTMN; expresia RE, RP, Her2/neu.

6.2.2. Metodologia de lucru

6.2.2.1. Examenul histopatologic

În scopul realizării examenului histopatologic, s-au realizat toate etapele necesare prelucrării

histologice, prin includere la parafină, urmate de colorația de rutină (Hematoxilin-Eozină).

6.2.2.2. Sistemul de gradare Nottingham

În sistemul de gradare Nottingham, pentru fiecare aspect urmărit se notează un scor de la 1 la 3, în

funcție de severitatea acestora (Cardiff, Jensen, 2013).

Prin sumarea celor 3 componente se obține gradul. Cel mai mic scor este 1+1+1=3, acesta indicând

tumorile bine diferențiate, care formează tubuli în mare parte din tumoră și au o rată mitotică scăzută. Cel

mai mare scor este 3+3+3=9, indicând tumorile agresive.

6.2.2.3. Stadializarea pTMN

Stadializarea s-a realizat după anumite norme, utilizând aceleași trei noţiuni cheie, din stadializarea

clinică, la care se adaugă perfixul ”p” (informațiile provin din examenul ”patologic”), astfel: pT

simbolizează tumora primară, pN simbolizează nodulii limfatici, pM simbolizează metastazele.

6.3. REZULTATE

6.3.1. Profilul histopatologic şi imunohistochimic

Încadrarea diagnostică a cazuisticii analizate este sumarizată în tabelul 6.1. Carcinoamele mamare

invazive sau infiltrative au reprezentat 98,97% din ansamblul cazurilor analizate.

Tabel 6.1. Frecvenţa tipurilor histologice de carcinom mamar

TIPURI HISTOLOGICE DE CARCINOAME

Carcinom

ductal

invaziv

Carcinom

papilar

Carcinom

mucinos

Carcinom

lobular

invaziv

Carcinom

mixt ductal

și lobular

Carcinom

mixt ductal

și mucinos

Carcinom

ductal in

situ

Carcinom

tubular

75 7 6 4 2 1 2 1

76,53% 7,14% 6,12% 4,08% 2,04% 1,02% 2,04% 1,02%

98

Rezultatele examenului imunohistochimic (realizat în alte centre medicale) pentru evaluarea

pozitivității receptorilor estrogenici și progesteronici și a pozitivității HER2/neu sunt sumarizate în tabelul

6.2. Am constatat că negativitatea receptorilor hormonali a fost asociată într-o proporție semnificativă din

cazuri carcinoamelor ductale moderat și slab diferențiate (75% G2 și 25% G3 din cazurile RE negative și,

respectiv, 57,14% G2, 35,71% G3 din cazurile RP negative).

Tabel 6.2. Expresia RE, RP şi Her2/neu

MARKER NUMAR CAZURI

POZITIVE > 10%

NUMĂR CAZURI

NEGATIVE < 10% TOTAL

RE 36 8 44

RP 30 14 44

Her2/neu 5 27 32

6.3.2. Grad de diferenţiere şi scor Nottingham

Ca urmare a analizei comparative între gradul de diferenţiere şi valorile scorului Nottingham,

corespondenţa obţinută este prezentată în tabelul 6.3.


8

Tabel 6.3. Corespondenţa grad de diferenţiere – scor Nottingham

Grad

diferenţiere

Scor Nottingham

(număr cazuri, %)

3 4 5 6 7 8 9 Total

G1 1 (50%) 1 (50%) 2

G2 28

(43,08)

28

(43,08) 7 (10,77) 2 (3,07) 65

G3 4 (12,90) 5 (16,13) 10

(32,27)

12

(38,70) 31

6.3.3. Caracteristicile clinico-patologice - sinopsis

În ansamblul lotului analizat, cele 98 de cazuri au prezentat un tablou clinico-patologic complex,

principalele caracteristici clinico-patologice ale pacientelor fiind sumarizate în tabelul 6.4.

Tabel 6.4.Caracteristicile clinico-patologice ale lotului de studiu

CARACTERISTICI

CLINICO-PATOLOGICE

Cazuri (n =98)

N (98) %

Vârstă (ani)

≤55 26 26,53

>55 72 73,47

TIPUL HISTOLOGIC

Carcinom ductal invaziv 75 76,53

Carcinom lobular invaziv 4 4,08

Alte subtipuri morfologice 19 19,38

Carcinom papilar 7 7,14

Carcinom tubular 1 1,02

Carcinom mucinos 6 6,12

Carcinom ductal in situ 2 2,04

Carcinom mixt 3 11,90

STADIUL pT

pI 4 5,79

pII 28 40,57

pIII 14 20,29

pIV 23 33,33

Nestadializat 29 29,59%

STADIUL pN

pNx 13 18,84

pN0 21 30,43

pN1 17 24,63

pN2+pN3+pN4 18 26,08

Nestadializat 29 29,59%

STADIUL pM

pMx 66 95,65

pM0 1 1,44

pM1 2 2,88

Nestadializat (margini infiltrate) 29 29,59%

GRAD DE DIFERENŢIERE

G1 (bine diferenţiate) 2 2,04

G2 (moderat diferenţiate) 65 66,32

G3 (slab diferenţiate) 31 31,63

6.4. DISCUȚII

6.4.1. Valoarea scorului Nottingham

Studiul nostru aduce dovezi importante care susţin faptul că aplicarea sistemului de gradare

Nottingham este extrem de utilă pentru evaluarea prognostică a carcinoamelor. În mod concret, atragem

atenţia asupra variabilităţii cazurilor încadrate ca având grad de diferenţiere G2, al căror comportament este


9

extrem de diferit. Astfel, în această categorie, 28 cazuri (43,08%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham

6, 28 cazuri (43,08%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 7, 7 cazuri (10,77%) au fost cuantificate cu

scorul Nottingham 8, iar 2 cazuri (3,07%) - cu scorul Nottingham 9. Mai mult, şi în cadrul cazurilor

încadrate ca avînd grad de diferenţiere G3, 4 cazuri (12,90%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 6, 5

cazuri (16,13%) au fost cuantificate cu scorul Nottingham 7, 10 cazuri (32,27%) au fost cuantificate cu

scorul Nottingham 8, iar 12 cazuri (38,70%) - cu scorul Nottingham 9. Aceste rezultate ne permit să

accentuăm valoarea scorului Nottingham, care oferă patologului şi, ulterior, clinicianului, o perspectivă

suplimentară asupra agresivităţii tumorale, valorile 6 şi 7 fiind corespondente unui grad intermediar de

agresivitate, iar valorile 8 şi 9 – unui grad ridicat de agresivitate.

În literatura de specialitate s-a lansat deja propunerea clasificării tumorilor G2 în 2 subclase, una G1-

like care nu necesită terapie sistemică și una G3-like care necesită chimioterapie (Sotiriou et al., 2006).

Consecutiv, tumorile G2 cu scor 7 pot fi orientate spre chimioterapie adjuvantă pe când cele G1 și G2 (cu

scor 6 și RE+) pot fi monitorizate pe termen lung, în paralel cu administrarea unei terapii adjuvante

endocrine, cu Tamoxifen.

Limitele gradingului histopatologic constituie și motivul pentru care acesta nu a fost inclus în

clasificările OMS. Acestea se referă în special la standardizarea tehnicii de prelucrare histopatologică și, în

măsură mai redusă, la un grad de subiectivitate al examinatorului. Limitele pot fi depășite printr-un program

de standardizare a tehnicii și de instruire continuă și perfecționare a histopatologilor implicați în domeniul

patologiei mamare, ceea ce constituie un deziderat și în rândul histopatologilor din țara noastră.

6.4.2. Valoarea profilului imunohistochimic

Introducerea unor markeri cu valoarea certă ca indicatori de evaluare prognostică (receptorii

hormonali și HER-2) a fost urmată de formularea conceptului de clasificare moleculară (utilizând

suplimentar citokeratinele CK5/6 și receptorul factorului epidermic de creștere EGFR) care introduce 5 tipuri

moleculare de cancer mamar: tip luminal A, tip luminal B, tip HER-2, tip bazal-like și, respectiv, tip

neclasificabil sau normal-like (Sorlie et al., 2001).

Statusul RE este utilizat pentru a determina sensibilitatea la tamoxifen şi la inhibitorii de aromatază

(Clemons et al., 2002). Tumorile RE pozitive conferă un prognostic mai bun comparativ cu tumorile RE

negative, nivelul expresiei RE fiind util orientării terapiei endocrină (Johnston, 2010). În cazuistica noastră,

un procent ridicat (81,81%) din cele 44 de cazuri investigate au prezentat expresii puternice ale RE,

conferind pacientelor șansa terapiei endocrine. Cazurile negative s-au atribuit formelor mai puțin diferențiate

și apartenenței la categoriile mai vîrstnice.

Statusul RP este un marker important pentru răspunsul la terapia hormonală şi pentru prognostic în

cancerul mamar (Cork et al., 2008). Tumorile RP negative au în general un prognostic mai rezervat decât

tumorile RP pozitive (Cork et al., 2008). În cazuistica noastră, din cele 44 de cazuri investigate, un procent

de 68,18% a prezentat o expresie semnificativ pozitivă a PR, 6 cazuri RE pozitive fiind RP negative și 5

cazuri RE negative fiind RP pozitive. .

Her2/neu constituie nu doar un biomarker important, ci şi o ţintă pentru agenţii terapeutici, evaluarea

expresiei Her2/neu fiind indicată pentru monitorizarea eficacităţii terapiei ţintă şi selectarea pacientelor

cărora li se poate oferi această terapie, în cancerul metastatic (Carney et al., 2007). Supraexpresia HER-2/neu

este asociată cu forme agresive de boală şi prognostic rezervat (Sorlie et al., 2001). Cele 33 cazuri investigate

au prezentat un procent de 15,62% al pozitivității HER2/neu, considerându-se că majoritatea pacientelor

investigate nu necesită terapie adjuvantă cu trastuzumab.

Toate aceste consideraţii constituie o pledoarie pentru introducerea în practica curentă de diagnostic

a evaluării imunohistochimice a RE, RP şi her2/neu, cei 3 markeri fiind esenţiali pentru caracterizarea

minimală a cancerelor mamare și selectarea pacientelor care pot beneficia de terapie adjuvantă.

CAPITOL 7.

CRITERII OPERAŢIONALE ÎN EVALUAREA MORFOMETRICĂ A LEZIUNILOR GLANDEI

MAMARE – CONCEPERE ŞI DEZVOLTARE DE TEHNICĂ

7.1. INTRODUCERE

Analiza şi procesarea imagistică asistată de calculator s-au constituit ca direcţie de cercetare in

domeniul bio-medical abia la începutul anilor 90. După 1995 însă, prin publicarea pe piaţa software a unor

produse dedicate acestui tip de cercetări de către cele mai importante firme specializate, s-au creat şi

implementat noi seturi de standarde care au stat la baza conceperii şi raportării studiilor orientate pe acest

subiect (Shapiro, Stockman, 2001, Pratt, 2001, Căruntu, 2002).


10

Cancerul mamar este considerat o boală heterogenă, motiv pentru care simpla încadrarea într-o

anumită categorie de diagnostic nu oferă clinicianului informaţii suficiente pentru deciziile de tratament şi

pentru formularea unui prognostic (Kronqvist et al., 2002). O potenţială modalitate de a depăşi problemele

asociate cu evaluările subiective histologice este de a dezvolta tehnici analitice obiective şi reproductibile,

prin introducerea unor parametri obiectivi, determinaţi morfometric, corespondenţi trăsăturilor /

caracteristicilor pe care patologii le folosesc pentru a descrie caracterul histopatologic al leziunii de sân

(Kronqvist et al., 2002).

Cu referire strictă la componenta nucleară, în abordarea morfometrică a cancerului mamar atribuirea

gradului de transformare malignă nucleară se bazează pe mai multe criterii care caracterizează morfologia

nucleară şi care au fost introduse ca variabile măsurate prin contribuţia semnificativă a unor colective de

cercetare axate asupra acestui subiect (Baak et al., 1982, Baak et al., 1985, Kronqvist et al., 1995, Kronqvist

et al., 1997, Kronqvist et al., 1998a, Kronqvist et al., 1998b, Kronqvist et al., 2000a, Kronqvist et al., 2000b,

Kronqvist et al., 2002). Studiile care au urmărit o abordare morfometrică au condus la o ierarhizarea mai

corectă leziunilor în trepte de malignitate, în comparaţie cu clasificare subiectivă – inclusiv prin introducerea

categoriei intermediare (Kronqvist et al., 2002). În funcţie de rezultatele obţinute, investigarea morfometrică

poate fi aplicată pentru utilizarea ei clinică prognostică şi de orientare a deciziilor terapeutice.

În acest context, abordarea morfometrică realizată în cadrul studiului doctoral îşi justifică caracterul

de noutate asociat. Trebuie menţionat faptul că studiul de morfometrie computerizată a putut fi dezvoltat în

condiţiile unei experienţe solide în cadrul colectivului Laboratorului de Histologie a U.M.F. Iaşi, existând

preocupări constante pentru această direcţie de cercetare. Aceste preocupări au avut, ca rezultat concret,

raportări în fluxul principal de publicaţii (Căruntu, 2002, Căruntu et al., 2005), elaborarea unei monografii cu

caracter de noutate absolută la nivel naţional (Căruntu, 2003), precum şi în contribuţii originale în cadrul

unor studii doctorale axate patologiei tumorale orale, cervicale, digestive, mamare şi testiculare (Scutariu,

2003, Vişan, 2004, Bădescu, 2005, Stancu, 2007, Hopulele, 2007, Marinca, 2011). În contextul experienţei

existente în cadrul acestui laborator, am considerat că potenţialele rezultate obţinute în cercetarea doctorală

axată pe patologia tumorală mamară pot complementa „viziunea morfometrică” asupra transformărilor

specifice procesului de transformare malignă, prin obiectivitatea datelor numerice.

În mod concret, obiectivul principal urmărit a constat în dezvoltarea unei tehnici originale de

citometrie computerizată, care să permită un studiu complex în citopatologia şi histopatologia mamară.

Consecutiv, obiectivele specifice urmărite au fost reprezentate de:

- analiza unor descriptori geometrici celulari şi nucleari aplicabili în citologia mamară, şi corelarea

lor cu trăsăturile calitative, urmărind accentuarea diferenţelor existente între profilul celular

benign şi malign;

- analiza comparativă a unor descriptori geometrici nucleari aplicabili în histopatologia mamară,

urmărind caracterizarea modificărilor populaţiei celulare în cursul transformării maligne.

7.2. CRITERII MORFOMETRICE ÎN CITOLOGIA MAMARĂ

7.2.1. Material şi metodă

Materialul de studiu a fost reprezentat de un număr de 20 cazuri cu frotiuri mamare corespondente

(Serviciul de Anatomie Patologică şi Prosectură, Spitalul Judeţean Brăila, Cytopath SRL), recoltate prin

puncţie cu ac fin şi colorate Papanicolaou, încadrate, sub raportul diagnosticului, ca leziuni benigne (lotul 1:

10 cazuri) şi maligne (lotul 2: 10 cazuri - carcinom ductal).

Cele 10 cazuri cu diagnostic citologic de carcinom ductal au fost evaluate şi prin prisma sistemului

de grading nuclear Black modificat de Fisher (Fisher et al., 1980), având următoarea distribuţie: grad

citologic 1 – 3 cazuri, grad citologic 2 – 3 cazuri, grad citologic 3 – 4 cazuri.

Toate frotiurile au fost utilizate pentru realizarea de imagini digitizate corespunzătoare unor câmpuri

reprezentative, sub raportul celularităţii. Metodologia de lucru a utilizat mediul software Zeiss KS400

(Kontron Electronik, 2002), disponibil în cadrul Disciplinei de Histologie, UMF „Gr. T. Popa” Iaşi şi a

constat în analiza cantitativă computerizată a imaginilor digitizate, prin conceperea şi implementarea unui

macrou dedicat citologiei mamare.

7.2.2. Rezultate

7.2.2.1. Algoritm de evaluare prin morfometrie computerizată

7.2.2.1.1. Conceperea şi testarea macroului MAMAR_CIT

Pentru fiecare frotiu, din imaginile digitizate, considerate imagini sursă, am realizat selectarea

interactivă, cu ajutorul editorului grafic, a unui număr cuprins între 150 – 250 celule de interes. Macroul

conceput şi implementat a avut ca scop aplicarea algoritmului de măsurare în dinamică, utilizând imaginile

sursă individuale pentru obţinerea de imagini mască pe care au fost realizate, prin procedee automate,


11

măsurătorile propriu-zise. Măsurătorile au vizat următoarele trăsături geometrice definite prin intermediul

macroului: aria celulară, aria nucleară, raportul nucleo-citoplasmatic, diametrul echivalent şi factorul de

formă. Pentru înregistrarea datelor numerice rezultate în urma măsurătorilor a fost creată o bază de date,

capabilă să permită extragerea individuală sau cumulativă a datelor şi organizarea lor sub formă de tabel.

Baza de date a fost creată astfel încât să asigure sumarizarea separată a tuturor informaţiilor numerice

corespondente fiecărui caz în parte – în mod concret, a celulelor selectate de pe imaginile digitizate preluate

de pe fiecare frotiu.

7.2.2.1.2. Textul sursă al macroului MAMAR_CIT

Textul sursă al macroului MAMAR_CIT conceput şi implementat include, în maniera particulară de

scriere a mediului KS400, toate instrucţiunile de programare.

7.2.2.2. Trăsături morfometrice în citologia benignă şi citologia malignă

Pentru fiecare caz în parte, pe baza informaţiilor numerice corespunzătoare măsurătorilor realizate pe

toate celulele de interes selectate, a fost calculată media SD, pentru toţi cei 5 parametri definiţi: aria

celulară, aria nucleară, raport nucleo-citoplasmatic diametrul echivalent şi factorul de formă (tabelul 7.1,

7.2). Pentru lotul 1 – citologie benignă, valorile medii ale trăsăturilor morfometrice determinate au fost

următoarele: arie citoplasmatică 38,21 10,10 m2, arie nucleară 53,72 7,02 m2, raport nucleo-

citoplasmatic 0,58, diametru echivalent 8,24 0,53 m, factor de formă 0,84 0,05. Pentru lotul 2 –

citologie malignă, valorile medii ale trăsăturilor morfometrice determinate au fost următoarele: arie

citoplasmatică 54,02 18,34 m2, arie nucleară 208,97 37,00 m2, raport nucleo-citoplasmatic 0,79,

diametru echivalent 16, 23 1,43 m, factor de formă 0,87 0,03.

Tabel 7.1. Valori numerice ale descriptorilor geometrici – citologie benignă

Caz Celule

(număr)

A_cit

(medie SD,

m2)

A_nucl

(medie SD,

m2)

Nc/Cit

(medie)

D

(medie SD,

m)

F

(medie SD)

1 208 56,04 9,56 63,20 10,78 0,53 8,95 0,74 0,87 0,03

2 150 23,51 3,10 47,75 6,28 0,67 7,78 0,50 0,90 0,05

3 175 30,64 9,07 52,18 15,45 0,63 8,14 1,12 0,79 0,15

4 200 42,97 7,52 59,35 8,76 0,58 8,68 0,62 0,82 0,09

5 250 31,52 8,03 47,28 12,05 0,60 7,74 0,94 0,93 0,05

6 186 35,42 4,92 65,78 9,15 0,65 9,14 0.61 0,85 0,08

7 240 49,35 17,28 45,56 15,95 0,48 7,60 1,23 0,78 0,13

8 166 29,81 8,43 50,76 14,36 0,63 8,02 1,07 0,84 0,08

9 158 37,22 5,62 55,83 8,43 0,60 8,42 0,61 0,90 0,03

10 217 45,73 10,67 49,55 11,55 0,52 7,93 0,87 0,76 0,13

195 38,21 10,10 53,72 7,02 0,58 8,24 0,53 0,84 0,05

*A_cit – arie citoplasmatică, A_nucl – arie nucleară, Nc/Cit – raport nucleo-citoplasmatic, D – diametru echivalent, F –

factor de formă

Tabel 7.2. Valori numerice ale descriptorilor geometrici – citologie malignă

Caz Celule

(număr)

A_cit

(medie SD,

m2)

A_nucl

(medie SD,

m2)

Nc/Cit

(medie)

D

(medie SD,

m)

F

(medie SD)

1 205 74.47 18,30 280.15 31,45 0.79 18.86 1,03 0.87 0,13

2 170 32.33 13,47 183.25 77,20 0.85 15.25 2,93 0.88 0,07

3 210 44.43 12,84 189.43 54,76 0.81 15.51 2,10 0.82 0,15

4 185 52.16 20,32 165.18 48,12 0.76 14.48 1,97 0.90 0,03

5 240 85.34 28,33 219.45 72,86 0.72 16.69 2,57 0.90 0,08

6 150 77.50 9,64 232.50 25,80 0.75 17.18 0,93 0.90 0,06

7 230 44.53 13,02 157.89 46,18 0.78 14.16 1,95 0.87 0,05

8 190 37.55 9,30 212.78 52,95 0.85 16.43 1,84 0.90 0,07

9 250 42.67 9,09 208.35 44,39 0.83 16.26 1,65 0.83 0,09

10 180 49.31 14,07 240.77 68,72 0.83 17.48 2,34 0.85 0,07

201 54,02 18,34 208,97 37,00 0,79 16, 23 1,43 0,87 0,03


factor de formă


12

Analiza statistică de corelaţie realizată în comparaţia citologie benignă versus citologie malignă a

indicat diferenţe semnificative între ariile celulare (p = 0,02), ariile nucleare (p < 0,001), valoarea raportului

nucleo-citoplasmatic (p < 0,001), şi diametru echivalent (p < 0,001). Pentru factorul de formă nu au fost

înregistrate diferenţe semnificative statistic (p = 0,14).

7.2.2.3 Trăsături morfometrice în citologia malignă versus grading citologic

În raport de grading-ul citologic, încadrarea celor 10 frotiuri maligne a fost următoarea:

- grad 1: caz 2, caz 4, caz 17;

- grad 2: caz 3, caz 8, caz 9;

- grad 3: caz 1, caz 5, caz 6, caz 10.

Tabelul 7.3 prezintă corespondenţa dintre parametrii morfometrici evaluaţi şi gradul citologic, în

condiţiile în care am calculat, în baza valorilor medii individuale ale cazurilor încadrate în fiecare categorie

de grading citologic, valoarea medie a acestor parametri.

Tabel 7.3. Valori numerice ale descriptorilor geometrici – citologie malignă, în raport de gradingul citologic

Grad citologic

A_cit

(medie SD,

m2)

A_nucl

(medie SD, m2)

Nc/Cit

(medie)

D

(medie SD,

m)

F

(medie SD)

1 43,00 10,00 168,77 13,05 0,79 14,63 0,56 0,88 0,01

2 41,55 3,57 203,52 12,40 0,83 16,06 0,48 0,85 0,04

3 71,65 15,58 243,21 26,13 0,77 17,55 0,93 0,88 0,02

*A_cit – arie citoplasmatică, A_nucl – arie nucleară, Nc/Cit – raport nucleo-citoplasmatic, D – diametru echivalent,

F – factor de formă

Analiza statistică de corelaţie a relevat prezenţa diferenţelor semnificative între parametrii morfometrici,

în raport de gradul citologic, astfel: pentru aria celulară – grad 1 versus grad 3, grad 2 versus grad 3; pentru aria

nucleară, între toate gradele; pentru diametrul echivalement - grad 1 versus grad 3, grad 2 versus grad 3 (Tabel

7.4). Absenţa diferenţelor semnificative a fost notată pentru aria citoplasmatică şi diametrul echivalent – grad 1

versus grad 2, şi pentru raportul nucleo-citoplasmatic şi factorul de formă – pentru toate gradele (Tabel 7.4).

Tabel 7.4. Semnificaţia statistică a descriptorilor geometrici în raport de gradingul citologic

Grad citologic

A_cit

(medie SD,

m2)

A_nucl

(medie SD,

m2)

Nc/Cit

(medie)

D

(medie SD,

m)

F

(medie SD)

1 vs 2 0,86 0,03 0,47 0,13 0,19

1 vs 3 0,03 0,005 0,53 0,003 0,83

2 vs 3 0,02 0,05 0,09 0,04 0,36

7.2.2.4. Trăsături morfometrice în citologia malignă versus grading histologic

În baza diagnosticului histopatologic corespunzător celor 10 frotiuri maligne analizate, am realizat

reîncadrarea cazurilor în raport de grading-ul histologic, distribuţia cazurilor fiind prezentată în tabelul 7.5.

Tabel 7.5. Corespondenţa cazurilor în raport de gradingul citologic şi histologic

Grad citologic Cazuri (număr)

Grad histologic

1 2 3

Cazuri (număr) Cazuri (număr) Cazuri (număr)

1 3 2 1

2 3 1 2

3 4 1 3

Menţionăm faptul că cea mai bună suprapunere de diagnostic a fost înregistrată pentru gradul 1 şi

gradul 3, în sensul că 2 din cele 3 cazuri considerate citologic cu grad 1 au prezentat acelaşi grad histologic,

şi 3 din cele 4 cazuri considerate citologic cu grad 3 au prezentat acelaşi grad histologic. Modificările de

încadrare au fost următoarele:

- 1 caz cu grad citologic 1 a prezentat grad histologic 2;

- 2 cazuri cu grad citologic 2 au prezentat grad histologic 3;

- 1 caz cu grad citologic 3 a prezentat grad histologic 2;

Tabelul 7.6 prezintă corespondenţa dintre parametrii morfometrici evaluaţi şi gradul histologic, în

condiţiile în care am calculat, în baza valorilor medii individuale ale cazurilor încadrate în fiecare categorie

de grading histologic, valoarea medie a acestor parametri.


13

Tabel 7.6. Valori numerice ale descriptorilor geometrici – citologie malignă, în raport de gradingul histologic

Grad histologic

A_cit

(medie SD,

m2)

A_nucl

(medie SD, m2)

Nc/Cit

(medie)

D

(medie SD,

m)

F

(medie SD)

1 48,34 5,39 161,53 5,15 0,77 14,23 0,22 0,88 0,02

2 38,10 6,06 195,15 15,57 0,83 15,72 0,62 0,86 0,04

3 65,85 18,71 236,24 27,48 0,78 17,29 0,99 0,87 0,03


factor de formă

Analiza statistică de corelaţie a relevat prezenţa diferenţelor semnificative între parametrii

morfometrici, în raport de gradul histologic, după cum urmează: pentru aria celulară – grad 2 versus grad 3;

pentru aria nucleară, între toate gradele; pentru raportul nucleo-citoplasmatic – grad 1 versus grad 2; pentru

diametrul echivalement – între toate gradele (Tabel 7.7). Absenţa diferenţelor semnificative statistic a fost

înregistrată pentru aria citoplasmatică – grad 1 versus grad 2, grad 1 versus grad 3, pentru raportul nucleo-

citoplasmatic – grad 1 versus grad 3, grad 2 versus grad 3 şi pentru factorul de formă – între toate gradele

(Tabel 7.7).

Tabel 7.7. Semnificaţia statistică a descriptorilor geometrici în raport de gradingul histologic

Grad histologic

A_cit

(medie SD,

m2)

A_nucl

(medie SD,

m2)

Nc/Cit

(medie)

D

(medie SD,

m)

F

(medie SD)

1 vs 2 0,16 0,05 0,02 0,04 0,56

1 vs 3 0,41 0,002 0,5 0,04 0,56

2 vs 3 0,02 0,03 0,08 0,03 0,91


factor de formă

7.2.3. Discuţii

7.2.3.1. Repere fundamentale pentru aplicaţiile morfometriei în citologia mamară

Un prim studiu de morfometrie computerizată, cu valoare de referinţă pentru domeniu, a vizat

modificările celulare în epiteliul glandei mamare în raport de ciclul menstrual (Malberger et al., 1987). Un

alt studiu de pionierat în investigarea automată a leziunilor citologice mamare (Spina et al., 1992) a

utilizat densitometria nucleară a celulelor epiteliale benigne şi maligne, în frotiurile obţinute prin

biopsie cu ac fin. O diferenţă semnificativă a fost obţinută între populaţiile de celule epiteliale benigne şi

maligne, prin analiza de varianţă a tuturor valorilor pentru indexul de gradient de contrast nuclear. Odată cu

dezvoltarea tehnicilor de analiză automată a imaginilor a fost introdusă analiza fractală, în scopul de a evalua

potenţialul standardizării măsurării automate a dimensiunii fractale în diferenţierea celulelor benigne şi,

respectiv, maligne (Ohri et al., 2004).Mai mult, morfometria computerizată nucleară a fost studiată prin prisma

valorii de biomarker în trialurile de chimioprevenţie, datele obţinute indicînd faptul că metoda, fezabilă pe

frotiurile mamare obţinute prin puncţie cu ac fin, poate identifica transformările kariometrice semnificative

induse de terapie (Serrano et al, 2008).

7.2.3.2. Parametri morfometrici fiabili

Studiul nostru completează preocupările constante axate asupra identificării şi validării celor mai

fiabili parametri morfometrici care să permită o diferenţiere cât mai sigură între populaţia celulară benignă

şi, respectiv, malignă. Rezultatele noastre au indicat, prin prisma parametrilor morfometrici cuantificaţi în

celulele benigne versus maligne, existenţa diferenţelor semnificative statistic între ariile celulare (p = 0,02),

ariile nucleare (p < 0,001), raportul nucleo-citoplasmatic (p < 0,001), şi diametrul echivalent (p < 0,001). În

mod surprinzător, contrar aşteptărilor noastre, diferenţe semnificative de formă nucleară specifică celulelor

benigne şi, respectiv, maligne, reflectate prin valorile factorului de formă, nu au fost validate (p = 0,14).

Datele obţinute contribuie, în mod cert, la completarea profilului morfometric al celularităţii

mamare, benigne şi maligne. Relevanţa acestui profil trebuie discutată în contextul ideii de realizare a unui

clasificator automat al leziunilor de sân, pentru a diferenţia leziunile citologice de tip benign şi, respectiv,

malign (Herrera-Espiñeira et al., 1998). Ca perspectivă deschisă de prezentul studiu doctoral, considerăm că

rezultatele obţinute, completate prin extinderea numărului de cazuri analizate şi completarea bazei de date

numerice, pot conduce la conceperea unui astfel de clasificator, care să includă mai puţine variabile, optimizând

astfel timpul de răspuns automat.


14

Un element care trebuie discutat este valoarea corelaţiei între parametrii morfometrici corespondenţi

celulelor maligne şi gradul citologic. Rezultatele noastre au relevat existenţa diferenţelor semnificative

pentru aria celulară – grad 1 versus grad 3 (p = 0,03), grad 2 versus grad 3 (p = 0,02), pentru aria nucleară,

grad 1 versus grad 2 (p = 0,03), grad 2 versus grad 3 (p = 0,05), grad 1 versus grad 3 (p = 0,005), precum şi

pentru diametrul echivalement - grad 1 versus grad 3 (p = 0,003), grad 2 versus grad 3 (p = 0,04). Absenţa

diferenţelor semnificative statistic a fost notată pentru aria citoplasmatică – grad 1 versus grad 2 (p = 0,86) şi

diametrul echivalent – grad 1 versus grad 2 (p = 0,13), pentru raportul nucleo-citoplasmatic – grad 1 versus

grad 2 (p = 0,47), grad 1 versus grad 3 (p = 0,53), grad 2 versus grad 3 (p = 0,09) şi pentru factorul de formă

– grad 1 versus grad 2 (p = 0,19), grad 1 versus grad 3 (p = 0,83), grad 2 versus grad 3 (p = 0,36). Aceste

date trebuie interpretate prin prisma dificultăţii de a diferenţia, în context citologic sugestiv pentru

malignitate, între gradul de severitate a leziunilor. În conformitate cu rezultatele numerice obţinute, putem

afirma că parametrul morfometric arie nucleară este cel mai fiabil, prin diferenţele semnificative existente

între cele 3 grade succesive de severitate citologică; ca ierarhizare, aria nucleară este urmată de parametrii

morfologici arie citoplasmatică şi diametru echivalent, ale căror valori numerice diferă semnificativ între

gradul citologic 1 şi 3, respectiv 2 şi 3. Prin absenţa diferenţelor semnificative statistic, datele noastre au

indicat faptul că valorile raportului nucleo-citoplasmatic şi ale factorului de formă nu furnizează indicaţii

care pot fi corelate cu grading-ul citologic de severitate.

Această secţiune a studiului morfometric a fost completată de analiza de corelaţie între parametrii

morfometrici corespondenţi celulelor maligne şi gradul histologic, stabilit prin examenul histopatologic al

cazurilor investigate iniţial citologic. În această analiză comparativă, parametrul morfologic arie nucleară a

menţinut poziţia principală de indicator fiabil, cu aceleaşi diferenţe semnificative prezente între cele 3 grade

succesive de severitate histologică - grad 1 versus grad 2 (p = 0,05), grad 1 versus grad 3 (p = 0,002), grad 2

versus grad 3 (p = 0,03). În mod similar, au fost înregistrate diferenţe semnificative pentru diametrul

echivalent grad 1 versus grad 2 (p = 0,04), grad 1 versus grad 3 (p = 0,04), grad 2 versus grad 3 (p = 0,03).

Pentru aria citoplasmatică au fost înregistrate diferenţe semnificative numai pentru gradul histologic 2 versus

3 (p = 0,02), iar pentru raportul nucleo-citoplasmatic, numai între gradul histologic 1 versus 2 (p = 0,02).

Factorul de formă nu a prezentat diferenţe semnificative statistic în raport de grading-ul histologic.

Consecutiv, aceste rezultate subliniază diferenţele relative şi similitudinile sau suprapunerile existente între

morfologia celulară specifică examenului citologic şi cea specifică examenului histopatologic. Valoarea ariei

nucleare stabilită prin morfometrie citologică poate fi extrapolată spre aprecierea grading-ului histologic

specific examenului histopatologic, iar acest parametru morfometric este dublat prin valoarea diametrului

echivalent. Aria citoplasmatică determinată citologic îşi diminuează valoarea prin raportare la grading-ul

histologic, iar raportul nucleo-citoplasmatic poate fi luat în considerare, în comparaţia grad histologic 1

versus 2. Astfel, putem aprecia că determinările cantitative realizate pe preparate citologice permit stabilirea

unei corespondenţe relative cu gradul de severitate al leziunilor, stabilit prin examen histopatologic, în baza

valorilor ariei nucleare şi a diametrului echivalent.

Dificultăți similare sunt raportate şi în cazul analizei exclusive a patologiei benigne – de exemplu

separarea entităţilor patologice fibroadenom şi, respectiv, fibroadenom cu atipie, pentru care este susţinută

dificultatea evaluării atipiilor chiar şi prin intermediul criteriilor obiective morfometrice nucleare, fiind

necesare abordări de tipul texturii cromatiniene şi a dimensiunilor fractale (Nijhawan et al., 2005).

Rezultatele negative în raport cu valoarea factorului de formă sunt concordante cu cele obţinute în

caracterizarea morfometrică a celulelor cilindrice prezente în citologia mamară (Lim et al., 2006), şi care indică

absenţa diferenţelor între celulele prismatice cu atipii, comparativ cu cele fără atipii, în ceea ce priveşte factorul

de circularitate.

Ca perspectivă deschisă de prezentul studiu doctoral, considerăm că rezultatele obţinute, completate

prin extinderea numărului de cazuri analizate şi completarea bazei de date numerice, pot aduce argumente

pertinente pentru a defini şi susţine tipuri de corespondenţă între examenul citologic şi cel histopatologic.

Demersul nostru trebuie raportat la studiile de morfometrie computerizată publicate în fluxul

principal. Direcţionarea investigaţiei asupra diferenţierii gradului de severitate a leziunilor celulare maligne

complementează studiile existente, orientate asupra identificării criteriilor de diferenţiere morfometrică între

tipuri de leziuni benigne, respectiv maligne, în citologia mamară (Dey et al., 2000, Ozkara et al., 2002,

Rajesh et al., 2002, Lim et al., 2006).

Documentarea realizată asupra morfometriei computerizate, precum şi rezultatele proprii ne permit

să apreciem că studiul nostru, axat asupra parametrilor morfometrici care caracterizează celule în leziuni

benigne şi, respectiv, maligne, are asigurat caracterul de originalitate prin: introducerea şi evaluarea

diametrului echivalent şi a factorului de formă în cadrul parametrilor morfologici selectaţi; confirmarea

valorii diametrului echivalent;dezvoltarea de know-how prin tehnica concepută şi implementată.


15

7.3. CRITERII MORFOMETRICE ÎN HISTOPATOLOGIA MAMARĂ

7.3.1. Material şi metodă

Materialul de studiu a fost reprezentat de un număr de 10 cazuri de carcinom ductal invaziv (lotul 1)

şi 10 cazuri de carcinom nediferenţiat, caracterizat prin asocierea de zone de carcinom ductal invaziv cu

carcinom nediferenţiat (lotul 2), diagnosticate în Serviciului de Anatomie Patologică şi Prosectură, Spitalul

Judeţean Brăila.

Toate cazurile au fost utilizate pentru realizarea de imagini digitizate corespunzătoare unor câmpuri

reprezentative, sub raportul celularităţii. Metodologia de lucru a fost similară cu cea utilizată în analiza

criteriilor morfometrice în citologia mamară (secţiunea 7.2.1.) – respectiv mediul software Zeiss KS400,

disponibil în cadrul Disciplinei de Histologie, UMF „Gr. T. Popa” Iaşi, prin intermediul căruia s-a realizat

analiza cantitativă computerizată a imaginilor digitizate, prin conceperea şi implementarea unui macrou

dedicat histopatologiei mamare.

Trebuie menţionat faptul că această parte a cercetării doctorale completează şi dezvoltă datele

obţinute într-un alt studiu doctoral în care analiza morfometrică computerizată, limitată la două cazuri de

carcinom mamar, a fost realizată în laboratorul Disciplinei de Histologie, utilizând mediul KS400 (Hopulele,

2007) şi benefiind de experienţa existentă în cadrul colectivului sus-menţionat.

7.3.2. Rezultate

7.3.2.1. Algoritm de evaluare prin morfometrie computerizată

7.3.2.1.1. Conceperea şi testarea macroului MAMAR_HP

În conceperea şi testarea macroului MAMAR_HP au fost respectate aceleaşi etape ca şi în cazul

macroului MAMAR_CIT (secţiunea 7.2.2.1.1.). Pentru fiecare specimen microscopic corespunzător unui

caz, din imaginile digitizate, considerate imagini sursă, am realizat selectarea interactivă, cu ajutorul

editorului grafic, a unui număr cuprins între 500-1000 celule de interes.

Pentru lotul 1, au fost selectate separat celulele localizate în periferia nodulilor tumorali şi, respectiv,

din zona centrală a acestora, urmărindu-se ca numărul de celule selectate din cele două teritorii să fie relativ

apropiat. Pentru lotul 2, selectarea a vizat celulele existente în ariile nediferenţiate.

Macroul conceput şi implementat a avut ca scop aplicarea algoritmului de măsurare în dinamică,

utilizând imaginile sursă individuale. Etapele parcurse au fost susţinute prin imagini digitizate.

Măsurătorile au vizat: aria nucleară, factorul de formă şi diametrul echivalent. Baza de date a fost

creată similar celei corespondente macroului MAMAR_CIT.

7.3.2.1.2. Textul sursă al macroului MAMAR_HP

Textul sursă al macroului MAMAR_HP a fost realizat similar cu cel al macroului MAMAR_CIT,

respectând maniera particulară de scriere a mediului KS400.

7.3.2.2. Trăsături morfometrice în carcinom ductal invaziv

Analiza computerizată a trăsăturilor morfometrice de interes determinate a relevat faptul că, în valori

numerice absolute, aria nucleară medie, factorul de formă şi diametrul echivalent sunt mai mici pentru celulele

tumorale din zonele periferice (aria nucleară 48,58 ± 6,17 m2, factor de formă 0,86 ± 0,03, diametru

echivalent 7,83 ± 0,49 m), comparativ cu cele din zonele centrale (aria nucleară 62,27± 4,83m2, factor de

formă 0,89 ± 0,02, diametru echivalent 8,88 ± 0,34m) ale insulelor tumorale. Valorile numerice obţinute, ca

medie şi derivaţie standard medie, sunt prezentate pentru fiecare caz în parte în Tabelele 7.8 şi 7.9.

Tabel 7.8. Trăsături morfometrice de interes în carcinomul ductal invaziv, zona periferică

Caz Celule

(număr)

A_nucl

(medie ± SD,

m2)

F

(medie ± SD)

D

(medie ± SD,

m)

1 920 41,55 ± 21,88 0,83 ± 0,11 7,26 ± 1,71

2 860 45,80 ± 18,60 0,85 ± 0,07 7,62 ± 1,42

3 840 44,28 ± 19,40 0,84 ± 0,05 7,49 ± 1,50

4 510 43,20 ± 20,76 0,90 ± 0,07 7,40 ± 1,61

5 790 59,54 ± 21,40 0,91 ± 0,04 8,69 ± 1,44

6 970 47,30 ± 20,45 0,87 ± 0,07 7,75 ± 1,52

7 910 57,44 ± 15,86 0,88 ± 0,06 8,54 ± 1,10

8 500 45,20 ± 17,38 0,90 ± 0,04 7,57 ± 1,34

9 735 53,67 ± 21,77 0,85 ± 0,90 8,25 ± 1,53

10 690 47,83 ± 16,30 0,84 ± 0,06 7,79 ± 1,23

TOTAL 7725 48,58 ± 6,17 0,86 ± 0,03 7,83 ± 0,49

* A_nucl – arie nucleară, D – diametru echivalent, F – factor de formă


16

Tabel 7.9. Trăsături morfometrice de interes în carcinomul ductal invaziv, zona centrală

Caz Celule

(număr)

A_nucl

(medie ± SD,

m2)

F

(medie ± SD)

D

(medie ± SD,

m)

1 870 59,34 ± 21,86 0,85 ± 0,03 8,68 ± 1,47

2 810 56,38 ± 17,44 0,90 ± 0,05 8,46 ± 1,22

3 790 61,75 ± 22,58 0,92 ± 0,02 8,85 ± 1,49

4 550 55,97 ± 21,55 0,87 ± 0,05 8,42 ± 1,50

5 750 66,76 ± 19,20 0,92 ± 0,03 9,20 ± 1,24

6 890 68,47 ± 23,28 0,90 ± 0,04 9,32 ± 1,47

7 950 62,44 ± 18,77 0,87 ± 0,07 8,90 ± 1,25

8 570 69,50 ± 20,74 0,91 ± 0,04 9,39 ± 1,31

9 780 63,65 ± 21,95 0,88 ± 0,06 8,99 ± 1,43

10 630 58,44 ± 17,27 0,89 ± 0,04 8,61 ± 1,19

TOTAL 7590 62,27 ± 4,83 0,89 ± 0,02 8,88 ± 0,34


În analiza statistică de comparaţie a trăsăturilor morfometrice caracteristice pentru zona periferică şi

zona centrală au fost obţinute următoarele rezultate:

- existenţa unei diferenţe semnificative statistic pentru aria nucleară (p < 0,001);

- existenţa unei diferenţe semnificative statistic pentru factorul de formă (p = 0,04);

- existenţa unei diferenţe semnificative statistic pentru diametrul echivalent (p < 0,001).

7.3.2.3. Trăsături morfometrice în carcinomul nediferenţiat

Analiza computerizată a trăsăturilor morfometrice de interes determinate a relevat faptul că, în valori

numerice absolute, aria nucleară medie are valorea 50,30 ± 4,00 m2, factorul de formă are valorea 0,85 ±

0,01, iar diametrul echivalent are valorea 7,98 ± 0,31. Valorile numerice obţinute (medie şi derivaţie standard

medie) sunt prezentate pentru fiecare caz în parte în Tabelul 7.10.

Tabel 7.10. Trăsături morfometrice de interes în carcinomul nediferenţiat

Caz Celule

(număr)

A_nucl

(medie ± SD,

m2)

F

(medie ± SD)

D

(medie ± SD,

m)

1 840 51,44 ± 21,30 0,85 ± 0,08 8,08 ± 1,53

2 970 48,12 ± 18,67 0,87 ± 0,05 7,81 ± 1,39

3 730 54,85 ± 29,50 0,85 ± 0,09 8,34 ± 2,01

4 950 44,45 ± 20,86 0,87 ± 0,08 7,51 ± 1,59

5 670 52,78 ± 20,15 0,83 ± 0,10 8,18 ± 1,44

6 920 52,20 ± 18,30 0,85 ± 0,03 8,14 ± 1,32

7 890 56,89 ± 20,33 0,87 ± 0,06 8,50 ± 1,40

8 790 48,92 ± 24,54 0,85 ± 0,08 7,88 ± 1,77

9 880 47,73 ± 20,57 0,89 ± 0,03 7,78 ± 1,53

10 930 45,68 ± 17,68 0,85 ± 0,08 7,61 ± 1,36

TOTAL 8570 50,.30 ± 4.00 0,85 ± 0,01 7,98 ± 0,31


7.3.2.4. Trăsături morfometrice în carcinomul ductal invaziv versus carcinomul nediferenţiat

Analiza statistică a trăsăturilor morfometrice caracteristice pentru carcinomul ductal invaziv şi, respectiv,

carcinomul nediferenţiat au relevat:

- existenţa unei diferenţe semnificative statistic între aria nucleară periferică din carcinomul ductal invaziv şi,

respectiv, aria nucleară din carcinomul nediferenţiat (p < 0,001);

- absenţa unei diferenţe semnificative statistic între aria nucleară centrală din carcinomul ductal invaziv şi,

respectiv, aria nucleară din carcinomul nediferenţiat (p = 0,37);

- absenţa unei diferenţe semnificative statistic între factorul de formă caracteristic celulelor din zona

periferică a carcinomului ductal invaziv şi, respectiv, din carcinomul nediferenţiat (p = 0,45);

- prezenţa unei diferenţe semnificative statistic între factorul de formă caracteristic celulelor din zona

centrală a carcinomului ductal invaziv şi, respectiv, din carcinomul nediferenţiat (p = 0,01);

- absenţa unei diferenţe semnificative statistic între diametrul echivalent caracteristic celulelor din zona

periferică a carcinomului ductal invaziv şi, respectiv, din carcinomul nediferenţiat (p = 0,34);


17

- existenţa unei diferenţe semnificative statistic între diametrul echivalent caracteristic celulelor din zona

centrală a carcinomului ductal invaziv şi, respectiv, din carcinomul nediferenţiat (p < 0,001).

7.3.3. Discuţii

7.3.3.1. Repere fundamentale pentru aplicaţiile morfometriei în histopatologia mamară

Trecerea în revistă a literaturii de specialitate relevă că, pentru patologia mamară, studiile axate pe

morfometrie computerizată au vizat dezvoltarea de tehnici analitice de examinare şi procesare a imaginilor

care să ofere criterii obiective de diferenţiere a leziunilor benigne de cele maligne (Bacus et al., 1999, Susnik

et al., 1995, Hoque et al., 2001).

Pentru clasificarea leziunilor nucleare din carcinomul mamar, patologii evaluează de obicei, în mod

subiectiv, o serie largă de caracteristici: pleomorfismul celular, variaţii în mărimea nucleului, neregularităţile

conturului nuclear, textura cromatinei nucleare, valoarea raportului nucleo-citoplasmatic, poziţia nucleului în

interiorul celulei (inclusiv polarizarea), numărul de nucleoli, prezenţa sau absenţa mitozelor, necroza.

Multe dintre aceste caracteristici pot fi supuse evaluării cantitative prin analiză de imagine asistată de

calculator, pentru a oferi criterii obiective de caracterizare. În categoria trăsăturilor morfometrice definite

sunt incluse aria nucleară şi parametrii de formă, care reflectă variaţiile de la sfericitatea (rotunjimea)

nucleară, variaţii angulare în conturul nuclear şi neregularităţi la nivelul membranei nucleare. Trăsăturile de

textură descriu variaţii în absorbanţa la nivelul ariei nucleare, iar conţinutul în ADN reflectă absorbanţa

integrată la nivelul ariei nucleare, comparativ cu cea a limfocitelor folosite drept control intern.

Literatura raportează o reproductibilitate crescută în evaluarea trăsăturilor morfometrice, de textură

şi de conţinut ADN, criterii de diferenţiere a leziunilor benigne de cele maligne (Bacus et al., 1999, Susnik et

al., 1995, Hoque et al., 2001), şi corelarea acestor caracteristici cu prognosticul evolutiv.

7.3.3.2. Parametri morfometrici fiabili

Pornind de la datele existente în fluxul principal de publicaţii, studiul nostru a vizat 3 trăsături

morfometrice nucleare pe care le-am considerat relevante pentru a caracteriza modificările populaţiei

celulare transformate malign, în două entităţi patologice diferite.

Alegerea celor 3 trăsături morfometrice a fost realizată în baza următoarelor argumente:

- aria nucleară este un indicator relevant pentru transformarea malignă, proces reflectat prin valorile

efective ale dimensiunilor nucleului, care se repercută asupra raportului nucleo-citoplasmatic care se

modifică considerabil, în raport cu statusul de normalitate celular;

- factorul de formă permite aprecierea gradului de apropiere a conturului real de un contur circular,

condiţia factor de formă = 1 fiind îndeplinită numai pentru regiunile de interes (nuclei) delimitate de

contururi circulare;

- diametrul echivalent se defineşte drept diametrul discului având aceeaşi arie cu cea a regiunii de interes

(nucleu) considerată, şi este un criteriu geometric riguros care poate permite evaluarea abaterilor de la

conturul circular.

Cele două entităţi patologice asupra cărora ne-am concentrat atenţia au fost carcinomul ductal

invaziv şi carcinomul nediferenţiat. Trebuie subliniat faptul că datele raportate în literatură, referitoare la

morfometria în cancerul mamar, fac referire predominantă la carcinomul ductal invaziv şi carcinomul ductal

in situ, iar trăsăturile morfometrice analizate nu includ factorul de formă şi diametrul echivalent – într-o

analiză comparativă.

Abilităţile de lucru specifice morfometriei computerizate acumulate personal, sub coordonarea

colectivului Disciplinei de Histologie, au făcut posibilă extinderea studiului de morfometrie computerizată

dezvoltat anterior, lotul nostru incluzând 10 cazuri din fiecare categorie diagnostică. Rezultatele obţinute

reflectă 7725 celule din ariile periferice şi 7590 celule din ariile centrale, măsurate în cele 10 cazuri de

carcinom ductal invaziv, şi cele 8570 celule măsurate în cele 10 cazuri de carcinom nediferenţiat.

În mod concret, în evaluarea carcinomului ductal invaziv, rezultatele noastre au indicat diferenţe

semnificative statistic între zona periferică şi, respectiv, zona centrală, pentru aria nucleară (p < 0,001),

factorul de formă (p = 0,04) şi diametrul echivalent (p < 0,001). Ulterior, analiza statistică dintre datele

obţinute în caracterizarea morfometrică a carcinomului nediferenţiat şi datele specifice celor două zone din

carcinomul ductal invaziv a pus în evidenţă diferenţe semnificative statistic pentru aria nucleară, între zona

periferică a carcinomului ductal invaziv şi carcinomul nediferenţiat (p < 0,001), iar pentru factorul de formă şi

diametrul echivalent, între zona centrală a carcinomului ductal invaziv şi carcinomul nediferenţiat (p = 0,01,

respectiv p < 0,001).

Analiza morfometrică realizată în prezentul studiu atrage atenţia asupra câtorva elemente care pot fi

discutate prin prisma semnificaţiei modificărilor nucleare care caracterizează etape evolutive în secvenţa

transformării maligne.Consecutiv, putem discuta despre o creştere a gradului de agresivitate celulară în

interiorul aceleiaşi tumori, posibil odată cu procesul de diviziune celulară continuat, implicit, printr-o


18

expansiune spre zonele externe. De asemenea, considerăm că absenţa unei diferenţe semnificative statistic

între ariile nucleare periferice din carcinomul ductal invaziv şi, respectiv, ariile nucleare din carcinomul

nediferenţiat indică, din punctul de vedere al prognosticului, un element negativ, indicând o evoluţie spre un

profil agresiv al leziunilor deja instalate.

Conform rezultatelor nostre, severitatea transformării maligne este puternic corelată cu creşterea

dimensiunilor nucleului şi cu modificările diametrului echivalent, cei doi descriptori geometrici fiind criterii

mai fidele de apreciere al agresivităţii decât factorul de formă. Caracteristicile morfometriei nucleare sunt

concordante cu raportări similare prezente în fluxul principal de publicaţii, care indică că aria nucleară creşte

semnificativ de la ţesutul mamar la leziunile benigne şi, respectiv, maligne, iar valorile numeric crescute

reprezintă un indicator pentru carcinomul mamar mai agresiv şi mai puţin diferenţiat (El Sharkawy, Farrag,

2008). Modificările identificate în studiul nostru, susţinute prin date numerice, pot fi asociate evenimentelor

de progresie tumorală, în cadrul cărora amplificarea migrării celulare este legată de modificarea morfologiei

nucleare, ca dimensiuni şi formă - elongarea (alungirea) formei susţinând transformarea epitelio-

mezenchimală (Bissell et al., 1999).

Rezultatele noastre se înscriu în cadrul cercetărilor axate asupra valorii morfometriei computerizate

în caracterizarea cât mai precisă a carcinomului mamar, complementând informaţiile furnizate de evaluarea

calitativă sau semi-cantitativă consecutivă examenului histopatologic clasic. Din această perspectivă,

considerăm necesară prezentarea câtorva dintre rezultatele cele mai relevante, pentru a putea sublinia,

ulterior, particularităţile cercetării noastre.

Pentru carcinomul ductal invaziv, metodele histologice standardizate de clasificare utilizate,

completate prin metode computerizate de cuantificare (Baak et al., 1982, Baak et al., 1985, Aaltomaa et al.,

1991, Aaltomaa et al., 1992, Eskelinen et al., 1992, Kronqvist et al., 1998a), sunt axate asupra nivelelor de

clasificare stabilite pe baza a trei subcaracteristici - pleomorfism nuclear, activitate mitotică şi diferenţiere

tubulară - care pot fi exprimate în termeni numerici (Haapasalo et al, 1989, Kronqvist et al., 1995, Kronqvist

et al., 1997, Kronqvist et al., 1999, Kuopio, Collan, 1996, Collan et al., 1996). Informaţiile numerice obţinute

au condus la stabilirea de praguri cantitative (Kronqvist et al, 1998a, Kronqvist et al, 1998b, Kronqvist et al.,

2000a) alocate pentru clasificarea pentru fiecare subcaracteristică, conform scorurilor 1, 2, 3. Rezultatele

publicate demonstrează că sistemul morfometric are o foarte bună eficienţă în stabilirea prognosticul cancerului

mamar, prin definirea, în conformitate cu măsurătorile între care există diferenţe semnificative statistic, a unor

grupe favorabile (clasa I), intermediare (gradul II) şi nefavorabile (gradul III) (Kronqvist et al., 2002).

7.4. MORFOMETRIA COMPUTERIZATĂ – VALOAREA METODEI

Perioada de pionierat în morfometrie a fost dominată de rolul observatorului uman, a cărui

intervenţie efectivă constă în proiectarea măsurătorilor, realizarea lor şi calculul numeric corespondent, prin

intermediul grilelor-test de numărare. Acest tip de morfometrie constituie morfometria clasică.

Progresele rapide înregistrate de tehnica de calcul au permis rafinarea măsurătorilor cu ajutorul

calculatorului (Pratt, 2001). Morfometria computerizată s-a dezvoltat în paralel cu conceptul de computer

vision – vedere computerizată, fiind în esenţă un segment din procesul complex al prelucrării şi analizei de

imagine asistate de calculator.

Intervenţia calculatorului în tehnica morfometrică a condus la creşterea performanţei în investigarea

trăsăturilor cantitative la nivel celular şi tisular, reflectată în principal în precizia măsurătorilor. Din acest de

vedere, pot fi separate două metode. Prima metodă se bazează pe tiparul morfometriei clasice, de data

aceasta calculatorul realizând aplicarea automată a grilelor-test peste imaginea digitizată, cuantificarea şi

calculul măsurătorilor efectuate, în timp ce observatorul uman are rol strict doar în marcarea elementelor ce

vor constitui obiectul măsurătorilor, în raport cu grilele-test. Structura grilei reprezintă elementul de referinţă

pentru precizia măsurătorilor, în sensul că, cu cât numărul de pătrate din grilă este mai mare, cu atât

acurateţea măsurătorilor este mai mare. Cea de a doua metodă implică o succesiune de operaţii complexe de

tipul preprocesare, segmentare, operaţii binare şi analiză cantitativă care, în ansamblul lor reprezintă

“procesare (prelucrare) numerică de imagine” sau “procesare (prelucrare) de imagine asistată de calculator”.

Operaţiile complexe sus-menţionate sunt fundamentate pe unitatea indivizibilă specifică imaginilor digitale, şi

anume pixelul, fapt care conferă măsurătorilor o precizie net superioară.

Introducerea morfometriei computerizate în caracterizarea cancerului mamar deschide perspective

pentru realizarea unei clasificări performante, fundamentată pe principii, metode şi criterii mai exacte şi

reproductibile. Dezavantajul major, reprezentat de timpul necesar investigaţiei morfometrice, este

contrabalansat de avantajele asupra eficienţei prognostice, vizându-se dezvoltarea unui indice morfometric în

care, pentru fiecare caracteristică morfometrică de clasificare, să fie stabilit un coeficient care să reflecte

ponderea acelei caracteristici în prognosticare (Hoque et al., 2001). Sistemele de morfometrie computerizată,


19

odată aplicate, au valoare şi în procedura de audit al controlului calităţii (Hoque et al., 2001).

Tehnica de morfometrie computerizată prezintă dezavantaje şi avantaje (Hoque et al., 2001). În

prima categorie trebuie inclus timpul alocat, mai mare comparativ cu cel necesar unei interpretări subiective.

Avantajul major constă însă în eliminarea variabilităţii inter-observatori, inerentă în aprecierea subiectivă a

caracteristicilor morfologice (pleomorfism nuclear, proeminenţă nucleolilor, hiperchromazia, alungirea şi

excentricitatea nucleară, modificări ale texturii nucleare) (Hoque et al., 2001). În clasificarea leziunilor

maligne în raport de gradul de diferenţiere nucleară, variabilitatea inter-observatori poate constitui o

problemă - chiar şi în cazul patologilor cu experienţă (Hoque et al., 2001). Datele din literatură (Hoque et al.,

2001) indică faptul că reproductibilitatea observatorilor de a distinge leziunile nucleare de grad 3 şi 2 este

superioară celei pentru gradul 1, cu rezultate diferite în 30 -40% pentru leziunile nucleare gradul 2 şi 3 şi în

mai mult 60% pentru leziunile de grad 1 şi 2 (Sneige et al., 1999, Douglas-Jones et al., 1996).

7.5. DEZVOLTAREA “KNOW-HOW”-ULUI ÎN ANALIZA DE IMAGINE ASISTATĂ DE

CALCULATOR – CONTRIBUŢII PERSONALE

Stadiul actual de dezvoltare al resurselor software cu care pot fi dotate calculatoarele permite

înglobarea instrumentelor de procesare a imaginilor histopatologice în aplicaţii de mare complexitate

organizate pe principiul sistemelor expert, unele conţinând chiar elemente de inteligenţă artificială. Un astfel

de sistem expert asigură nu numai realizarea automată a operaţiilor de măsurare, dar şi interpretarea datelor

numerice, prin semnificaţia lor în raport de procesul patologic analizat – ceea ce constituie, în conceptul

clasic al histopatologiei, atributul inteligenţei umane (Baak, 1998, Shapiro, Stockman, 2001, Pratt, 2001,

Alvira et al., 2000).

Macroul care susţine această secţiune a cercetării doctorale, alături de studiile de morfometrie

computerizată coordonate în cadrul Laboratorului Disciplinei de Histologie pe parcursul altor cercetări

doctorale (Căruntu et al., 1999-2004, Scutariu, 2003, Vişan, 2004, Bădescu, 2005, Căruntu et al., 2005,

Stancu, 2007, Hopulele, 2007, Marinca, 2011) constituie o dovadă solidă pentru adaptabilitatea şi eficienţa

utilizării mediului KS400 în domeniul histologiei şi histopatologiei.

În mod concret, contribuţia personală la dezvoltarea know-how-ului în analiza de imagine asistată de

calculator este reprezentată de conceperea şi testarea unui macrou dedicat investigării citologiei şi

histopatologiei mamare. Acest rezultat a fost susţinut prin dezvoltarea, pe parcursul studiilor doctorale, a

abilităţilor personale de scriere în limbajul specific KS400, utilizând sintaxa specifică şi eliminând

manipularea cutiilor de dialog, ceea ce conferă o eficientizare a cercetării, prin diminuarea tipului de lucru.

Macroul conceput asigură implementarea măsurătorilor sub formă de program, astfel încât ele sunt realizate

automat, mediul KS400 returnând informaţia numerică aferentă acestora. Precizia ridicată pe care o asigură

această tehnică este o consecinţă a rafinării măsurătorilor la nivel de pixel.

Rezultatele obţinute ca urmare a aplicării lor în investigarea cazuisticii noastre susţin calitatea de

instrument operaţional a morfometriei computerizate, care poate asigura o analiză obiectivă a celulelor

tumorale din cancerul mamar, ale căror modificări nucleare şi citoplasmatice semnificative pot constitui

elemente de referinţă pentru gradarea leziunilor. Considerăm că trăsăturile morfometrice definite, anume aria

celulară, aria nucleară, raportul nucleo-citoplasmatic, diametrul echivalent şi factorul de formă, sunt

relevante pentru caracterizarea în detaliu a celulelor normale, benigne şi maligne, oferind criterii

cuantificabile care pot susţine o diferenţiere a patologiei benigne de cea malignă în diagnosticul citologic.

Valoarea studiului de morfometrie computerizată realizat rezidă în dezvoltarea de know-how, prin

confluenţa dintre formaţia mea ca histopatolog şi experienţa acumulată în analiza de imagine asistată de

calculator. Trebuie subliniat faptul că în literatura dedicată domeniului morfometriei computerizate autorii nu

oferă decât rareori date concrete referitoare la etapa de programare esenţială în realizarea unei aplicaţii

automatizate, care poate fi utilizată repetitiv pe preparate microscopice cu caracteristici similare de culoare.

Absenţa acestor informaţii reflectă în esenţă interesul major pentru protecţia know-how-ului, ca proprietate

intelectuală. În baza acestor evidenţe, subliniem faptul că cercetarea doctorală este fundamentată prin

conceperea şi dezvoltarea unei metodologii de investigaţie proprie care oferă, pornind de la cadrul general al

unui software comercial, un program personalizat, individualizat, dedicat strict obiectivului definit în

concordanţă cu subiectul tezei de doctorat.

CAPITOLUL 8.

CONCLUZII

1. Scorurile recent propuse pentru grading-ul citologic nu oferă criterii de evaluare superioară

scorurilor clasice.


20

2. Utilizarea în paralel a mai multor scoruri de gradare nu aduce beneficii reale în formularea

diagnosticului citologic.

3. Aplicarea scorului Robinson în gradarea citologică constituie un foarte bun factor de predicție a

gradului histologic, datorită corelației semnificative existente între acestea.

4. Comparativ cu gradul de diferenţiere, valoarea scorului Nottingham oferă patologului şi, ulterior,

clinicianului, o perspectivă suplimentară asupra agresivităţii tumorale.

5. În contexul realităților socio-economice naţionale, dificultăţile financiare legate de introducerea în

practica curentă de diagnostic a investigaţiei imunohistochimice trebuie surmontate, cuantificarea expresiilor

RE, RP şi Her2/neu fiind obligatorie pentru caracterizarea complexă a carcinoamelor mamare.

6. Morfometria computerizată constituie un instrument operaţional care poate asigura o analiză

obiectivă a celulelor tumorale din cancerul mamar, ale căror modificări nucleare şi citoplasmatice

semnificative pot constitui elemente de referinţă pentru gradarea leziunilor. Trăsăturile morfometrice definite

oferă criterii cuantificabile care susţin o diferenţiere a patologiei benigne de cea malignă, şi permit o

cunoaştere aprofundată a transformărilor celulare în cursul procesului de carcinogeneză, contribuind la

trasarea unor repere obiective, cantitative, în cadrul conceptului încă incomplet descifrat al heterogenităţii

tumorale.

7. Dezvoltarea de know-how, cu rezultat în realizarea unei aplicaţii automatizate, permite utilizarea

repetitivă pe preparate microscopice cu caracteristici similare de culoare.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Aaltomaa S, Lipponen P, Eskelinen M et al. The significance of nuclear morphometric variables as prognostic

predictors in breast cancer. Anticancer Res 1991; 11: 1663–1670.

Aaltomaa S, Lipponen P, Papinaho S et al. Nuclear morphometry and DNA flow cytometry as prognostic factors in

female breast cancer. Eur J Surg 1992; 158: 135–141.

Abati A, McKee G. Grading of breast carcinoma in fine-needle aspiration cytology. Diagn Cytopathol 1998; 19(2):

153-154.

Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc

Natl Acad Sci U S A2003; 100(7): 3983˗3988.

Amălinei C. Histologie specială. Iași: Ed. Junimea, 2005.

Baak JPA, Kurver PHJ, de Snoo-Niewlaat AJE et al. Prognostic indicators in breast cancer - morphometric methods.

Histopathology 1982; 6 :327–339.

Baak JPA, Van Dop H, Kurver PHJ, Hermans J. The value of morphometry to classic prognosticators in breast cancer.

Cancer 1985; 56: 374–382.

Bacus JW, Boone CW, Bacus JV et al. Image morphometric nuclear grading of intraepithelial neoplastic lesions with

applications to cancer chemoprevention trials. Cancer Epidemiol Biomark Prev 1999; 8: 1087–1094.

Bădescu ME. Interesarea hepatică în afecţiuni ale căilor biliare. Teză de doctorat, U.M.F. “Grigore T. Popa” Iaşi,

2005.

Behbod F, Rosen M. Will cancer stem cells provide new therapeutic targets? Carcinogenesis 2005; 26(4): 703˗711.

Bissell MJ, Weaver VM, Lelievre SA et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and

malignant breast. Cancer Res 1999; 59 (Suppl. 7):1757s–1764s.

Bhargava V, Jain M, Agarwal K, Thomas S, Singh S. Critical appraisal of cytological nuclear grading in carcinoma of

the breast and its correlation with ER/PR expression, J Cytol 2008; 25(2): 55-58.

Black, M.M., Opler S.R. and Speer F.D. Survival in breast cancer in relation to structure of the primary tumor and

regional lumph nodes. Surg Gynecol Obster 1955; 100:543-551.

Cajulis RS, Hessel RG, Frias-Hidvegi D, Yu GH. Cytologic grading of fine needle aspirates of breast carcinoma by

private practice pathologists. Acta Cytol 1997; 41: 313-320.

Cardiff RD, Jensen RA. Histological Grading of Breast Cancer.

http://ccm.ucdavis.edu/bcancercd/311/grading_diagram.html, 2013.

Carney WP, Leitzel K, Ali S et al. HER-2/neu diagnostics in breast cancer. Breast Cancer Res 2007; 9: 207˗217.

Căruntu ID, Balan R, Vişan C. Quantitative versus qualitative in the analysis of cervical squamous cell carcinoma. Rom

J Morphol Embryol 2005; 46, 2: 149–155.

Căruntu ID, Vişan C, Cotuţiu C. Morphologic evaluation of radiotherapy in cervical carcinoma – a computerized

morphometric approach. Rom J Morphol Embryol 1999-2004; 45: 83-90.

Căruntu ID. Highly effective techniques in computerized dental tissue morphometry. J Cell Mol Med 2002; 6, 4: 631-

642.

Căruntu ID. Morfometrie computerizată în histologie şi histopatologie. Iaşi: Ed. Gr. T. Popa, 2003.

Clemons M, Danson S, Howell A. Tamoxifen (Nolvadox): A Review. Cancer Treat Rev 2002; 28(4): 165˗180.

Cork DMW, Lennard TWJ, Tyson-Capper AJ. Alternative splicing and the progesterone receptor in breast ancer. Breast

Cancer Res 2008; 10(3): 207˗214.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Al-Hajj%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12629218

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wicha%20MS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12629218

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Benito-Hernandez%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12629218

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12629218



21

Cunha GR. Role of mesenchymal-epithelial interactions in normal and abnormal development of the mammary gland

and prostate. Cancer 1994; 74: 1030-1044.

Dey P, Ghoshal S, Pattari SK. Nuclear image morphometry and cytologic grade of breast carcinoma. Anal Quant Cytol

Histol 2000; 22(6): 483-485.

Donţu G, El-Ashry D, Wicha MS. Breast cancer, stem/progenitor cells and the estrogen receptor. Trends Endocrinol

Metab 2004; 15(5): 193˗197.

Douglas-Jones AG, Gupta SK, Attanoos RL et al. A critical appraisal of six modern classifications of ductal carcinoma

in situ of the breast (DCIS): correlation with grade of associated invasive cancer. Histopathology 1996; 29: 397–

409.

El Sharkawy SL, Farrag AR. Mean nuclear area and metallothionein expression in ductal breast tumors: correlation

with estrogen receptor status. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2008; 16(2): 108-112.

Ellis I, Collins L, Ichihara S, MacGrogan G. Invasive carcinoma of no special type (NST). In: Lakhani S, Ellis IO,

Schnitt SJ, Tan P-H, van de Vijver MJ (eds.). WHO Classification of Tumors of the Breast. Lyon: IARC Press

2012; 34-38.

Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer:

experience from a large study with long-term follow-up. Histopathology 1991; 19(5): 403-410.

Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. The value of histological grade in breast

carcinoma. Experience from a large study with long- term follow-up. Histopathology 2002; 41: 152-153.

Eskelinen M, Lipponen P, Papinaho S et al.DNA flow cytometry, nuclear morphometry, mitotic indices and steroid

receptors as independent prognostic factors in female breast cancer. Int J Cancer 1992; 51: 555–561.

Fisher ER, Redmond C, Fisher B. Histologic grading of breast cancer. Pathol Annu 1980; 15: 239-251.

Haapasalo H, Pesonen E, Collan Y. Volume corrected mitotic index (M/V INDEX). The standard of mitotic activity in

neoplasms. Pathol Res Pract 1989; 185: 551–554.

Hopulele D. Relaţia între markerii biologici ai agresivităţii tumorale şi infiltratul inflamator în cancerul mamar. Teză

de doctorat, U.M.F. “Grigore T. Popa” Iaşi, 2007.

Hoque A, Lippman SM, Boiko IV et al. Quantitative nuclear morphometry by image analysis for prediction of

recurrence of ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer Epidemiol Biomark Prev 2001; 10: 249–259.

Hunt CM, Ellis IO, Elston CW, Locker A, Pearson D, Blamey RW. Cytological grading of breast carcinoma- a feasible

proposition ? Cytopathology 1990; 1(9): 287-295.

Johnston SRD. New strategies in estrogen receptor–positive breast cancer. Clin Cancer Res 2010; 16(7): 1979˗1987.

Kalhan S, Dubey S, Sharma S, Dudani S, Preeti, Dixit M. Significance of nuclear morphometry in cytological aspirates

of breast masses. J Cytol 2010 ; 27 (1): 16-21.

Kontron Electronik GmbH. Imaging System Zeiss KS400. Munchen, http: //www.kontron.com, 2002

Koss LG, Melamed MR. Diagnostic Cytology: Its Origins and Principles. In: Koss Diagnostic Cytology and Its

Histopathologic Bases. 5th. ed. Philadelphia: Lippincott, 2006, 1085-1088.

Kronqvist P, Collan Y, Kuopio T, Kujari H. Nuclear morphometry in breast cancer: The influence of sampling rules and

freezing of samples. Mod Pathol 1995; 8: 187–192

Kronqvist P, Kuopio T, Collan Y, Horvath C, Tamm U. The reproducibility of nuclear morphometrical measurements

in invasive breast carcinoma. Anal Cell Pathol 1997; 15: 47 – 59.

Kronqvist P, Kuopio T, Collan Y. Morphometric grading of invasive ductal breast cancer. I. Thresholds for nuclear

grade. Br J Cancer 1998b; 78: 800–805.

Kronqvist P, Kuopio T, Collan Y. Morphometrical grading in breast cancer: Thresholds for mitotic counts. Hum Pathol

1998a; 29: 1462 – 1468.

Kronqvist P, Kuopio T, Collan Y. Morphometrical grading of breast cancer. Thresholds for tubular differentiation. Br J

Cancer 2000a; 82: 1656 – 1661

Kronqvist P, Kuopio T, Collan Y. Quantitative thresholds for mitotic counts in histological grading: confirmation in

non-frozen samples of invasive ductal breast cancer. Ann Diagn Path 2000b; 4: 65–70

Kronqvist P, Kuopio T, Jalava P, Collan Y. Morphometrical malignancy grading is a valuable prognostic factor in

invasive ductal breast cancer. Brit J Cancer 2002; 87: 1275 – 1280.

Ku NNK, Mela NJ, Fiorica J et al. Role of fine needle aspiration after lumpectomy. Acta Cytol 1994; 38: 927-932.

Kuopio T, Collan Y. Mitotic counts in breast cancer. The influence of training on performance. Pathol Res Pract 1996;

192: 1095 – 1099.

Malberger E, Gutterman E, Bartfeld E, Zajicek G. Cellular changes in the mammary gland epithelium during the menstrual

cycle. A computer image analysis study. Acta Cytol 1987; 31(3):305-308.

Marinca MV. Aportul examenului morfopatologic în monitorizarea şi tratamentul tumorilor testiculare. Teză de

doctorat, U.M.F. “Grigore T. Popa” Iaşi, 2011.

Masood S, Frykberg ER, McLellan GL, Dee S, Bullard JB. Cytologic differentiation between proliferative and

nonproliferative breast disease in mammographically guided fine-needle aspirates. Diagn Cytopathol 1991; 7:

581-590.

McCarty KS, Jr, Nath M. Breast. In: Sternberg SS (ed.). Histology for Pathologists. 2th ed. Philadelphia: Lippincott

Williams and Wilkins, 1997; 71-84.

Meena SP, Hemrajani DK, Joshi N. A comparative and evaluative study of cytological and histological grading system

profile in malignant neoplasm of breast – an important prognostic factor. IJPM, 2005; 49: 199-202.


22

Mills SE. Histology for Pathologists. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, 2012.

Mogoanta L, Popescu CF, Georgescu CV, Comanescu V, Pirici D. Tehnici de citologie. In Ghid de Tehnici de

Histologie, Citologie si Imunohistochimie. Craiova: Editura Medicală Universitară, 2007, 155-299.

Mouriquand J, Gozlin-Fior M, Villemain D et al. Value of cytoprognostic classification in breast cancer. J Clin Pathol

1986; 39: 489-496.

Mouriquand J, Pasquier D. Fine needle aspiration of breast carcinoma: a preliminary cytoprognostic study. Acta Cytol

1980; 24: 153-159.

National Breast Cancer Centre. Breast Fine Needle Aspiration Cytology and Core Biopsy: A Guide for Practice. 1st ed.,

www.nbcc.org.au, 2004.

Ohri S, Dey P, Nijhawan R. Fractal dimension in aspiration cytology smears of breast and cervical lesions. Anal Quant

Cytol Histol 2004; 26(2): 109-112.

Petersen OW, Polyak K. Stem cells in the human breast. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 1-15.

Polyak K. Breast cancer: origins and evolution. J Clin Invest 2007; 117(11): 3155-3163.

Pratt WK. Digital Image Processing, 3rd. ed. John Riley & Sons, 2001.

Rajesh L, Dey P, Joshi K. Automated image morphometry of lobular breast carcinoma. Anal Quant Cytol Histol 2002;

24(2):81-84.

Rakha EA, Reis-Filho JS, Baehner F et al. Breast cancer prognostic classification in the molecular era: the role of

histological grade. Breast Cancer Res 2010; 12(4): 207.

Rekha TS, Nandini NM, Dhar M, Validity of different cytological grading systems of breast carcinoma - a hospital-

based study in South India. Asian Pacific J Cancer Prev 2011; 12: 3013-3016.

Rosai J. Rosai and Ackemman’s Surgical Pathology, 9th ed., New York: Mosby, 2004, 1764-1767.

Saha K, Raychaudhuri G, Chattopadhyay BK, Das I. Comparative evaluation of six cytological grading systems in

breast carcinoma. J Cytol 2013; 30(2): 87-93.

Scutariu MM. Valoarea metodelor de diagnostic precoce în cancerul mucoasei orale la vârsta a III-a. Teză de doctorat,

U.M.F. “Grigore T. Popa” Iaşi, 2003.

Serrano D, Gandini S, Mariani L et al. Computer-assisted image analysis of breast fine needle aspiration in a randomized

chemoprevention trial of fenretinide vs. placebo in HRT users. Breast 2008; 17(1): 91-97.

Shang Y, Brown M. Molecular determinants for the tissue specificity of SERMs. Science 2002; 295(5564): 2465–8.

Shapiro LG, Stockman GC. Computer Vision, Prentice Hall, 2001.

Sinha SK, Sinha N, Bandyopadhyay R, Mondal SK . Robinson’s cytological grading on aspirates of breast carcinoma:

Correlation with Bloom Richardson’s histological grading. J Cytol 2009; 26: 140-143.

Sneige N, Lagios M, Schwarting R et al. Interobserver reproducibility of the Lagios nuclear grading system for ductal

carcinoma in situ. Hum Pathol 1999; 30: 257–262.

Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, Aas T. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses

with clinical implications.Proc Natl Acad Sci USA2001; 98(19): 10869-10874.

Sorlie T, Tibshirani R, Parker J et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression

data sets. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100(14): 8418-8423.

Stancu M. Colecistitele cronice – studii morfologice complexe privind dinamica leziunilor displazice, metaplazice si

hiperplazice şi transformarea malignă. Teză de doctorat, U.M.F. “Grigore T. Popa” Iaşi, 2007

Stingl J, Caldas C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer

2007; 7(10): 791-799.

Susnik B, Worth A, LeRiche J, Palcic B. Malignancy-associated in the breast. Changes in chromatin distribution in

epithelial cells in normal-appearing tissue adjacent to carcinoma. Anal Quant Cytol Histol 1995; 17:62–68.

Taniguchi E, Yang Q, Tang W et al. Cytologic grading of invasive breast carcinoma. Correlation with clinopathologic

variables and predictive value of nodal metastasis. Acta Cytol, 2000; 44: 587-591.

Vasudev V, Rangaswamy R, Geethamani V. The Cytological grading of malignant neoplasms of the breast and its

correlation with the histological grading. J Clin Diagn Res 2013; 7(6): 1035-1039.

Vişan C. Efecte ale radiaţiilor asupra celulelor tumorale ale colului uterin. Teză de doctorat, U.M.F. “Grigore T. Popa”

Iaşi, 2004.


criterii semi-cantitative şi cantitative în patologia tumorală mamară

Documents