Moisa George-Vladut

Anul I, Seria E, grupa 30

Premiul Nobel pentru Medicina sau Fiziologie 1962

Crackerii Codului Genetic

“pentru descoperirile lor privitoare la structura moleculara a acizilor nucleici si importanta acestora pentru transmiterea informatiilor in cadrul materiei vi”

Francis Harry Compton Crick James Dewey WatsonMaurice Hugh Frederick

Wilkins1/3 din premiu 1/3 din premiu 1/3 din premiu

Marea Britanie SUAMarea Britanie si Noua Zeelanda

MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, Marea Britanie

Harvard University Cambridge, MA, SUA

London University Londra, Marea Britanie

n. 1916d. 2004

n. 1928n. 1916(in Pongaroa, Noua Zeelanda)d. 2004

James Dewey Watson

Pentru descoperirea structurii acidului dezoxiribonucleic (ADN), James Watson s-a implicat într-o activitate de cercetare care avea, în secolul XX, un caracter internaţional. La Chicago, citind lucrarea lui Erwin Schrodinger “Ce este viaţa?”, el a simţit nevoia să afle secretele biologice ale sistemelor vii. Sub îndrumarea unor savanţi imigranţi, refugiaţi din Germania nazistă, el a început să studieze bacteriofagele, particule virale care nu sunt altceva decât filamente de ADN învăluite într-un înveliş proteic.

Pentru a afla mai multe despre ele, Watson s-a dus la Copenhaga şi cu prilejul unei întruniri desfăşurate în Italia a descoperit cum structura lor cristalină poate fi vizualizată folosind fotografia cu difracţie cu raze X. O dată ajuns în Anglia, a colaborat cu Francis Crick, angajându-se într-o acerbă competiţie cu alţi savanţi pentru descoperirea structurii ADN-ului.

Împreună, ei au ajuns la concluzia că acesta are o structură dublu-helicoidală, asemănătoare unei scări, ideală pentru replicarea informaţiei genetice. Nu este surprinzător faptul că Watson, ca american, s-a împăcat cu celebritatea ceva mai greu decât Crick. El a fost provocat să scrie un memoriu ironic care i-a iritat pe colegii săi şi, în decurs de un deceniu, s-a încheiat cariera sa în cercetarea fundamentală.

A rămas totuşi o forţă redutabilă în biologie, beneficiind de o mare consideraţie pentru integritatea sa şi pentru descoperirea ADN-ului. Sir Lawrence Bragg, directorul laboratorului Cavendish spunea odată: „În acest moment nu cred că Crick ar fi reuşit să facă această descoperire fără Watson".

Născut la Chicago, în statul Illinois, la 6 aprilie 1928, James Dewey Watson a crescut într-un mediu modest sub aspect financiar, dar bogat din punct de vedere intelectual. Tatăl său, James Watson Senior, era perceptor, dar şi un ornitolog pasionat care i-a inoculat fiului său interesul pentru această ştiinţă.

Mama lui, Jean Mitchell Watson, lucra ca funcţionară la biroul de admiteri al Universităţii din Chicago, desfăşura o activitate politică susţinută în Partidul Democrat şi, în această calitate, l-a antrenat pe James în dezbateri referitoare la influenţa eredităţii şi a mediului asupra persoanei. Înzestrat cu o memorie fenomenală, Watson a apărut la Quiz Kids, o populară emisiune de radio, unde erau prezentaţi tineri cu talente ieşite din comun.

In 1943 Watson a beneficiat de o bursă de studii la Universitatea din Chicago, obţinând licenţa în 1947, cu specializarea în zoologie. In ultimul an de facultate a manifestat

interes pentru genetică şi, la fel ca Francis Crick, a fost profund impresionat de cartea lui Erwin Schrodinger - Ce este viaţa?, publicată în 1945. „Interesul meu s-a îndreptat în direcţia descoperirii secretului genelor", spunea Watson mai târziu, chiar cu preţul depăşirii propriei rezistenţe faţă de studiul chimiei organice.

Cercetările ulterioare ale lui Watson l-au pus în contact cu un grup de savanţi realmente ideal. „Am fost pregătit într-un climat favorabil pentru a afla structura ADN-ului aşa cum Prinţul Charles este pregătit să devină rege." La Universitatea Indiana, Watson a studiat cu Hermann Joseph Miller, laureatul Nobel refugiat din Germania nazistă şi din Uniunea Sovietică, descoperitorul mutaţiilor genetice pe care le pot provoca razele X.

Îndrumătorul său pentru teza de doctorat a fost biologul Salvador Luria, unul dintre fondatorii grupului de savanţi care studiau genetica organismelor simple cunoscute sub numele de bacteriofage - o formă de viruşi care se multiplică în interiorul bacteriilor. În plus, pe parcursul studiilor sale postuniversitare, Watson a călătorit la Cold Spring Harbor, în Long Island, şi la California Institute of Technology, unde l-a întâlnit pe Max Delbruck, iniţiatorul studiului bacteriofagelor.

După ce şi-a luat doctoratul la Universitatea Indiana în 1950, Watson a plecat la Copenhaga cu o bursă pentru cercetări postdoctorat, acordată de National Research Council. La o întrunire desfăşurată la Napoli, în Italia, în anul 1951, el a urmărit o conferinţă a lui Maurice Wilkins, un specialist în domeniul fizicii nucleare care se reorientase către biologie şi începuse să utilizeze cristalografia cu raze X pentru a studia molecula complexă de acid dezoxiribonucleic (ADN). „Dintr-o dată am fost entuziasmat de chimie", scria Watson în cartea sa Spirala dublă. „Înainte de comunicarea lui Maurice, mă îngrijora posibilitatea ca gena să aibă o structură fantastic de neregulată.

Acum ştiam însă că genele pot cristaliza; prin urmare, ele trebuia să aibă o structură regulată care să poată fi explicată într-o manieră directă." Această intuiţie a reunit cunoştinţele lui Watson asupra teoriei bacteriofagelor cu o tehnică ce îşi avea originea în fizica atomică. Interesul asupra studiilor lui Wilkins l-a condus pe Watson la Laboratorul Cavendish din Londra, unde l-a întâlnit pe fizicianul şi doctorandul Francis Crick.

Povestea colaborării dintre Watson şi Crick şi a felului cum au ajuns la descoperirea structurii ADN-ului a fost spusă adesea, iar Watson însuşi a relatat-o în cartea sa “Spirala dublă”, publicată în 1968. Experienţa lor profesională era complementară, astfel că în scurt timp au ajuns să împartă acelaşi birou. De-a lungul următorilor doi ani au reuşit să descopere structura ADN-ului. „Dl. Crick avea treizeci şi cinci de ani, iar dr. Watson, douăzeci şi trei", scrie Horace Freeland Judson în volumul A opta zi a Creaţiei.

„Aşa cum se întâmplase anterior cu Luria şi Delbruck, Watson a reuşit şi de astă dată să creeze aproape imediat o atmosferă de încredere intelectuală reciprocă, în raport cu un savant strălucit, mai în vârstă decât el, care s-a simţit astfel eliberat de senzaţia de concurenţă acerbă proprie celor mai mulţi dintre colegii din generaţia sa."

Urmând exemplul marelui chimist Linus Pauling, cu care se aflau în competiţie directă,

Watson şi Crick au realizat modele din carton şi metal ale moleculei de ADN, aşa cum au conceput-o ei în mod ipotetic. ADN-ul, despre care se ştia că există în fiecare celulă şi se presupunea că are rolul de a controla producerea enzimelor, este format din patru baze, o zaharidă şi o moleculă fosfatată.

Deşi structura sa era deosebit de importantă, aceasta putea fi doar bănuită pe baza studiilor realizate prin difracţia cu raze X. Configuraţia bazelor în raport cu nucleul moleculei, numărul de lanţuri care formează nucleul şi tipul legăturilor urmau să fie determinate.

După un prim eşec în 1951, Watson şi Crick au revenit asupra problemei. Apoi, în 1953, în timp ce lucra cu un model de carton, Watson a avut o intuiţie fenomenală, aşa cum a caracterizat-o el. „Brusc, am devenit conştient", scria el, „că perechea adenină-timină unită prin două legături de hidrogen era identică din punct de vedere al formei cu perechea guanină-citozină unită prin minimum două legături de hidrogen.

Erau, într-adevăr, două lanţuri de molecule, unite prin legături de hidrogen, răsucite în jurul unui carbohidrat şi al unei baze fosfatate. În aproximativ o lună, Crick şi Watson au realizat un model conform dovezilor experimentale cunoscute. Acesta prezenta o structură complementară care făcea posibilă replicarea. Un scurt articol publicat în revista Nature pe 25 aprilie 1953 a fost urmat de un altul, cu explicaţii amănunţite, apărut pe 30 mai în acelaşi an.

În timp ce Crick a rămas mulţi ani la Cambridge şi a contribuit la multe descoperiri fundamentale în biologia moleculară, Watson a revenit în Statele Unite şi s-a alăturat lui Delbruck şi colaboratorilor acestuia, la California Institute of Technology.

În 1955 s-a mutat la Universitatea Harvard. Deşi a publicat puţine rezultate de cercetare după primirea Premiului Nobel, pe care l-a împărţit cu Crick şi Maurice Wilkins în 1962, el rămâne o personalitate proeminentă în biologia moleculară. A scris The Molecular Biology of the Gene („Biologia moleculară a genei"), o lucrare cuprinzătoare, folosită ca etalon în domeniu, publicată în 1965, iar în 1983 a publicat lucrarea The Molecular Biology of the Cell („Biologia moleculară a celulei").

În anii '60, influenţa lui Watson s-a făcut simţită pretutindeni în domeniul biologiei moleculare. În 1968 el a acceptat postul de director al laboratorului Cold Spring Harbor. Pe parcursul următorilor opt ani a făcut naveta între laborator şi Harvard, părăsind universitatea în 1976 pentru a-şi dedica tot timpul conducerii laboratorului Cold Spring Harbor.

Sub administraţia sa, cercetările s-au axat pe descoperirea cauzelor genetice ale cancerului, iar în 1981 savanţii din laborator au izolat pentru prima oară aşa-numita ras, „oncogena" răspunzătoare pentru declanşarea acestei boli. Cercetarea biochimică şi genetică a formaţiunilor tumorale, la fel ca şi alte teme de cercetare, au făcut din Cold Spring Harbor una dintre cele mai prestigioase instituţii de cercetare ale ţării.

Atunci când a fost lansat Proiectul Genomului Uman, în 1987, Watson a reprezentat alegerea firească pentru funcţia de conducător al acestuia. Propunându-şi să caracterizeze întregul genom uman prin cartografierea tuturor celor cincizeci până la o sută de mii de gene, proiectul se desfăşura pe baza celor mai avansate tehnologii. O hartă completă a genomului uman ar permite implementarea unor noi modalităţi de a preveni, detecta şi trata bolile şi ar prezenta o mare varietate de aplicaţii industriale.

A fost un efort combinat al Institutului Naţional de Sănătate şi al Departamentului Energiei din Statele Unite, iar complexitatea programului a pretins un conducător cu reputaţia şi ascendentul intelectual al lui Watson. Watson a exercitat funcţia de şef al Biroului de Cercetare pentru Genomul Uman din octombrie 1988 până la demisia sa, în aprilie 1992. Având în vedere francheţea sa, perioada cât a funcţionat în cadrul biroului a stârnit numeroase controverse.

James Watson a rămas director la Cold Spring Harbor până la sfârşitul anului 1993, când a renunţat la funcţie pentru a deveni preşedintele organizaţiei. În 1968 Watson s-a căsătorit cu Elizabeth Lewis, asistenta sa de laborator, cu douăzeci de ani mai tânără decât el. Ei au avut doi fii, Rufus şi Duncan. In 1993, cu ocazia celei de-a patruzecea

aniversări a descoperirii structurii ADN-ului, Watson a invitat 130 de colegi, inclusiv pe Francis Crick, la Cold Spring Harbor.

El a rememorat prima sa vizită la laborator, ca absolvent, care „într-un fel a întregit eliberarea mea totală, pentru că aici am întâlnit toţi aceşti oameni minunaţi a căror unică ambiţie nu era să facă bani, ci...[să răspundă] unei singure întrebări: Ce este gena?... A fost paradisul! "

Francis Harry Compton Crick

În anul 1953, în colaborare cu americanul James Watson, proaspătul absolvent britanic Francis Crick descoperea structura şi funcţionarea ADN-ului, molecula în care este memorat codul genetic. Ipoteza Watson-Crick, dezvoltată de-a lungul următoarelor două decenii, care explică mecanismele fundamentale ale eredităţii şi funcţionării celulare este, poate, cea mai importantă descoperire din orice domeniu al ştiinţei după cel de-al doilea război mondial.

Aceasta a revoluţionat biologia, a remodelat în întregime domeniul cercetării genetice şi a determinat importante progrese în medicină. „Nu doar un singur om a descoperit şi creat biologia moleculară", spunea Jacques Monod acum câţiva ani, „dar numai unul domină intelectual întregul domeniu, pentru că el ştie şi înţelege cel mai mult. Francis Crick." În ultimii ani, Crick s-a orientat către neurobiologie, formulând ipoteze originale asupra naturii conştiinţei.

Născut la 8 iunie 1916 lângă Northampton, un oraş din centrul Angliei, Francis Harry Compton Crick a fost fiul cel mare al lui Harry şi al lui Anne Elizabeth Wilkins Crick. Tatăl său, care conducea un atelier de încălţăminte când a venit pe lume Francis, a traversat o perioadă dificilă după 1929 şi s-a mutat cu familia la Londra. Aici, el a administrat un magazin de încălţăminte în timpul Marii Depresiuni şi şi-a trimis cei doi fii la şcoala publică Mill Hill.

Copil fiind, Francis Crick era fascinat de ştiinţă, deşi la o privire retrospectivă nu-şi poate descoperi vreo calitate ieşită din comun - în afara unei mari curiozităţi în legătură cu natura şi cu universul. Co-descoperitorul ADN-ului şi-a pierdut credinţa religioasă în jurul vârstei de 12 ani, şi acest moment i-a marcat ulterior cariera. Aşa cum scria în scurta sa autobiografie intelectuală, What Mad Pursuit (Ce căutare nebunească), „Cunoaşterea adevăratei vârste a Pământului şi informaţiile furnizate de studiul fosilelor fac imposibilă, pentru orice intelect echilibrat, credinţa în adevărul literal al anumitor părţi din Biblie, în maniera în care o fac fundamentaliştii. Şi dacă o parte din Biblie este greşită, de ce ar trebui ca restul să fie acceptat automat? ... Ce poate fi mai nebunesc decât ca cineva să-şi bazeze întreaga viziune asupra vieţii pe idei cândva plauzibile, dar care acum apar complet greşite?" Ateismul lui Crick a fost una dintre motivaţiile sale în alegerea carierei ştiinţifice.

În 1934, Crick şi-a început studiile de fizică la University College, în Londra, pe care le-a absolvit în 1937, fiind al doilea din promoţie. În acest moment el stăpânea în mică măsură mecanica cuantică, un subiect pe care 1-a aprofundat de unul singur mai târziu. A rămas la University College pentru a urma cursurile postuniversitare pe care aproape că le terminase în momentul izbucnirii celui de-al doilea război mondial. Crick s-a înrolat în Marină, unde a participat la proiectarea minelor acustice şi magnetice „non-contact", continuându-şi o vreme activitatea şi după încheierea războiului, pe lângă serviciile secrete ştiinţifice.

Convins că vrea să lucreze în domeniul cercetării fundamentale şi influenţat de ateismul

său, Crick şi-a restrâns opţiunile la două direcţii: fundamentele vieţii şi creierul. În final s-a decis asupra „frontierei dintre viu şi ne-viu" - fundamentele fizice şi chimice ale vieţii. El a fost influenţat de lucrarea Ce este viaţa? a lui Erwin Schrodinger şi inspirat de Linus Pauling, care vorbea, în 1946, despre perspectivele de viitor ale chimiei structurale.

În 1947 Crick începe să lucreze la laboratorul Strangeways, în Cambridge; doi ani mai târziu se transferă la laboratorul Cavendish. Aici, o echipă condusă de Max Perutz aplica tehnica cristalografiei cu raze X în încercarea de a descoperi structura tridimensională a proteinelor. Crick şi-a ales ca subiect al tezei sale de doctorat difracţia razelor X în proteine.

Până în anii '40 se considera, în general, că materialul genetic din celulă este o proteină. Totuşi, cunoştinţele despre acidul dezoxiribonucleic, o moleculă de mari dimensiuni prezentă în celule, căpătau o amploare tot mai mare. ADN-ul a fost descoperit în 1869 şi denumit astfel în 1899. Până în 1949, Erwin Chargaff determinase compoziţia relativă a celor patru baze ale sale pentru o varietate de specii. De asemenea, Oswald Avery, la Rockefeller University, adusese dovezi în sprijinul afirmaţiei că ADN-ul pur poate fi „factorul transformator" în anumite tipuri de multiplicare bacteriană.

În general, descoperirea structurii ADN-ului reprezenta o extindere a fizicii în biologie prin intermediul chimiei. Mai precis, în 1948 chimistul Linus Pauling a identificat configuraţia helicoidală a lanţurilor de polipeptide care formează proteinele. Aceasta sugera un model fundamental al lumii microscopice; puteau fi descoperite şi alte structuri helicoidale. La începutul anilor '50, „ideea structurilor helicoidale plutea în aer", scria Crick, „şi trebuia să fii sau obtuz sau foarte refractar ca să nu gândeşti de-a lungul liniilor helicoidale".

În 1951 James Watson soseşte la laboratoarele Cavendish şi se împrieteneşte cu Crick. „Jim şi cu mine ne-am potrivit din prima clipă", scria Crick mai târziu, „în parte pentru că interesele noastre erau uimitor de asemănătoare, dar şi pentru că, presupun, aveam amândoi o anumită aroganţă proprie tinereţii, o atitudine intolerantă faţă de gândirea lipsită de rigoare." În plus, cunoştinţele temeinice ale lui Watson privind rezultatele studiilor lui Max Delbruck asupra bacteriofagilor erau complementare celor pe care le poseda Crick cu privire la difracţia cu raze X.

Crick şi Watson nu au efectuat ei înşişi experimente asupra ADN-ului; studiile lor s-au bazat pe câteva repere importante, inclusiv fotografiile cu raze X ale ADN-ului, realizate de specialista în cristalografie Rosalind Franklin. Urmând exemplul lui Linus Pauling, ei au construit modele ale moleculei folosind sârmă, mărgele, metal şi carton. Descoperirea crucială, datorată lui Watson, s-a produs în ziua de 21 februarie 1953, când a identificat configuraţia complementară a perechilor de baze: adenina-timina şi guanina-citozina. În aprilie 1953, Crick şi Watson au publicat în revista Nature articolul „Structura moleculară a acizilor nucleici", unde au remarcat, cu o oarecare ironie, revendicându-şi prioritatea: „Nu a scăpat atenţiei noastre faptul că împerecherea specifică a bazelor pe care am postulat-o sugerează imediat un posibil mecanism de copiere a materialului genetic".

În cursul următorilor 20 de ani, Crick a fost o figură centrală în biologia moleculară şi a jucat rolul principal în lămurirea naturii codului genetic. El a sugerat că o secvenţă de trei baze aminate dispuse într-o anumită ordine conduce la producerea unei proteine specifice în interiorul celulei. Aceasta s-a numit „ipoteza secvenţei", iar în 1958 Crick a prevăzut descoperirea ARN-ului de transfer pentru a descrie modul în care este realizat această proces. Crick este de asemenea cel care a enunţat „dogma centrală" a geneticii moleculare, aşa cum o numeşte el: informaţia, o dată ce a fost codificată în molecula de AND, se înscrie pe o cale cu sens unic. De îndată ce secvenţa de informaţie a fost integrată într-o proteină, ea nu mai poate fi extrasă în detaliu. Dogma centrală a rămas un principiu-cheie de organizare în biologia moleculară.

În 1976 Crick se mută la Institutul de Studii Biologice Salk din La Jolla, în California, unde se îndreaptă spre un nou domeniu de cercetare: studiul conştiinţei şi al creierului. El a abordat acest domeniu într-un moment când behaviorismul era în declin, psihologia cognitivă se afla abia la început, iar neurobiologia era în „tehno-formare". Crick a fost unul dintre cei câţiva laureaţi Nobel -ceilalţi doi fiind Roger Penrose şi Gerald Edelman - căruia îi revine meritul de a fi studiat fiziologia creierului dintr-o perspectivă novatoare.

La fel cum a deschis calea geneticii prin intermediul biochimiei, Crick spera să fie în măsură să demonstreze că gândirea se poate explica în totalitate în termeni fizici, pe baze neurologice. Concentrându-se asupra sistemului vizual, el a publicat în 1994 cartea Uimitoarele ipoteze care exprimă un punct de vedere materialist, în întregime electrofizic, asupra conştiinţei. El afirma că: „bucuriile şi durerile, amintirile şi ambiţiile, simţul identităţii personale şi al voinţei libere nu sunt, de fapt, decât comportarea unui vast ansamblu de celule nervoase şi a moleculelor care le sunt asociate". Crick a vrut să sublinieze că vederile sale sunt în „totală contradicţie cu convingerile religioase ale miliardelor de fiinţe umane

care trăiesc astăzi."

„Este limpede că cea mai importantă contribuţie adusă de Crick în biologie", scrie istoricul ştiinţei Robert Olby, „a fost intuiţia sa fizică şi capacitatea de a pătrunde în esenţa problemelor." Într-adevăr, Crick însuşi a atras atenţia asupra importanţei conceptuale fundamentale a ADN-ului, în contrast cu rezultatele imediate ale acestei descoperiri. În cartea sa Ce căutare nebunească, el scrie: „Descoperirea elicei duble a fost, din punct de vedere ştiinţific, mai degrabă comună. Important nu este felul cum a fost descoperită, ci chiar obiectul descoperirii - structura ADN-ului".

Potrivit relatării lui Watson, în ziua descoperirii elicei duble, Crick a părăsit laboratorul şi s-a dus la Eagle Pub, în apropiere de Cavendish, unde a anunţat cu vocea sa tunătoare că el şi Watson au descoperit „secretul vieţii". Crick îşi aminteşte acest moment puţin diferit. El povesteşte că s-a întors acasă ca să îi spună soţiei sale Odile că a făcut o descoperire importantă. Ea nu 1-a luat în seamă şi, mulţi ani după aceea, i-a mărturisit: „Tu spuneai mereu astfel de lucruri când veneai acasă, aşa că, evident, n-am crezut nimc”.

Sistemul de operare al vietii

In Aprilie 1953,James D.Watson si Francis H.C. Crick socheaza lumea stiintifica cu un model in forma de spirala dubla pentru acidul dezoxiribonucleic,sau ADN.In cei 50 de ani ce au trecut de atunci,modelul lor a evoluat de la o noutate stiintifica la un simbol al biologiei moderne,ADN-ul,substanta ereditatii fiind cea mai cunoscuta molecula a timpurilor noastre.Factorii ereditari ai lui G. Mendel si genele plasate pe cromozomi ale lui T. H. Morgan sunt de fapt compuse din ADN.Din punct de vedere chimic,zestrea genetica a unui organism uman este reprezentata de Adn-ul din cei 46 de cromozomi mosteniti de la parinti.

Dintre toate moleculele din natura,acizii nucleici sunt unici prin abilitatea lor de as-si dirija propria sinteza din monomeri,asemanarea dintre copii si parinti rezultand din replicatia precisa a ADN-ului si transmiterea lui de la o generatie la alta,informatia ereditara fiind codificata prin limbaj chimic in ADN si reprodusa in toate celulele corpului.Acest program al ADN-ului este cel care directioneaza dezvoltarea biochimica,anatomica,fiziologica si chiar comportamentala a unui organism.

In cautarea Materialului Genetic

Odata ce grupul de cercetatori al lui T.H.Morgan a aratat ca genele sunt localizate pe cromozomi,cele doua componente chimice ale cromozomilor-ADN-ul si proteinele au devenit candidate pentru functia de material genetic.Pana in anii 40 varianta proteinelor parea mai probabila,mai ales ca biochimistii le identificasera ca o clasa de macromolecule foarte heterogene si cu specificitate functionala,cerinte esentiale pentru materialul genetic.Despre acizii nucleici se stiau mult prea putine iar proprietatile lor fizice si chimice pareau prea uniforme pentru a explica multitudinea de caractere ce se manifesta de la un organism la altul.Acest punct de vedere s-a schimbat treptat,pe masura ce experimentele au in ceput sa evidentieze rezultate neasteptate.Rolul ADN-ului in ereditate a fost studiat la inceput pe bacterii si virusurile care le infectau.

Demonstrarea rolului ADN-ului in ereditate

Rolul ADN-ului in ereditate a fost stabilit de O.T. Averysi colaboratorii (1944),care au reluat unexperiment efectuat de F. Grifith (1928) pe Streptococcus Pneumoniae.Grifith a experimentat cu doua tulpini de pneumococi:tulpina tip S(smooth) virulenta,care prezinta capsula si formeaza colonii netede(susa SIII) si tulpina tip R(rough) nevirulenta,care nu prezinta capsula si formeaza colonii rugoase(susa RII).Prin mutatie,tulpina SIII poate pierde capsula si se transforma in tulpina acapsulata de tip RII nevirulenta.Experimentele au fost efectuate la soareci,la care s-au injectat intraperitoneal pneumococi vii sau omorati prin soc termic,singuri sau in amestec din alte tulpini.S-a constatat ca soarecii au murit in urma injectiei cu pneumococi virulenti vii,de tipul SIII(situatie normala),insa si in cazul injectarii unui amestec constituit din pneumococi de

tip RII vii si SIII omorati prin soc termic.Grifith nu a putut explica fenomenul de transformare genetica descoperit in acest experiment,respectiv transformarea pneumococilor nevirulenti RII in pneumococi virulenti SIII,care au cauzat moartea soarecilor,pe baza cunostintelor din timpul sau.

O.T. Avery si colaboratorii au reluat experimentul, facand infectii separate cu diferite componente ale bacteriei.Astfel,atunci cand pe mediul de cultura al bacteriilor RII au introdus ADN extras de la bacterii de tip SIII,dupa 24 de ore au constatat prezenta coloniilor de tip SIII.Deci ADN bacterian poseda capacitate infectioasa,el fiind purtatorul informatiei genetice.Rezultatele studiilor lui Avery si ale colegilor sai Maclyn McCarty si Colin MacLeod au fost facute publice in 1944,fiind primite cu interes dar si cu scepticism de o mare parte a oamenilor de stiinta ce vedeau proteinele ca purtatoarele informatiei genetice.

Demonstratia experimentala a faptului ca ADN-ul este materialul genetic.Aceste experimente au avut loc in anii ’40 si au aratat ca,adaugarea de ADN purificat unei bacterii duce la schimbarea proprietatilor acesteia,noile calitati rezultate fiind transmise generatiilor urmatoare.Acest experiment arata ca o substanta prezenta in tulpina SIII poate transforma tulpina RII in tulpina SIII (A) si aceste schimbari sunt mostenite de generatiile descendente de bacterii (B).Acest experiment in care tulpina RII a fost pusa in contact cu diferite parti componente ale tulpinei SIII identifica substanta transformatoare ca ADN.

Crearea modelului structural al ADN-ului

Odata ce majoritatea biologilor s-au convins ca ADN-ul reprezinta materialul genetic,noua provocare consta in incercarea de a determina modul in care structura ADN isi indeplineste rolul ereditar.La inceputul anilor ’50,organizare legaturilor covalente intr-un polimer de acid nucleic era bine stabilita si cercetatorii se concentrau asupra descoperirii structurii tridimensionale a ADN-ului.Printre oamenii de stinta care au tratat aceasta problema s-au numarat:Linus Pauling in California,Maurice Wilkins si Rosalind Franklin in Londra.Totusi,primii care au dat raspunsul corect au fost doi cercetatori relativ necunoscuti la acea vreme-americanul James Watson si englezul Francis Crick.

James D. Watson (dreapta) si Francis H.C. Crick (stanga).

Scurtul dar fructuosul partenerait ce a dus la rezolvarea enigmei structurii ADN-ului a inceput la scurt timp dupa calatoria lui Watson la Universitatea Cambridge,unde Crick studia structuraproteinelor printr-o tehnica numita cristalografie cu raxe X.Vizitand laboratorul lui Maurice Wilkins de la Colegiul Regal din Londra,Watson vede o imagine realizata prin difractie cu raze X realizata de colega lui Wilkins,Rosalind Franklin.Imaginile realizate prin cristalografie cu raze X nu sunt tocmai imagin ale moleculelor ci,prin utilizarea unor ecuatii matematice permit obtinerea de informatii referitoare la formele tridimensionale ale moleculelor.Imaginea obtinuta de Franklin i-a permis lui Watson sa deduca forma de elice a ADN,grosimea helixului.distanta dintre bazele azotate dar si faptul ca ADN-ul este alcatuit din doua lanturi,contrar modelului cu

trei lanturi propus recent de Linus Pauling.Prezenta celor doua lanturi defineste structura ce avea sa se numeasca dublu-helix.

Watson si Crick au inceput sa construiasca modele ale dublului-helix care sa fie conforme cu masuratorile cu raze X si cu cea ce se cunostea despre compozitia ADN-ului la acea ora.Studiand un raport anual ce sumariza studiile lui R.Franklin,au aflat concluzia acesteia,aceea ca scheletul fosfo-glucidic se afla plasat la exteriorul dublului-helix.Acest model era plauzibil deoarece plasa bazele azotate,relativ hidrofobe la interiorul moleculei,ddeparte de mediul apos inconjurator.Watson a construit un model cu bazele azotate privind spre interiorul dublului-helix.A rezultat un model avand forma unei scari in spirala,cu balustradele reprezentate de un schelet glucido-fosforic,iar treptele scarii reprezentate de bazele azotate.Analiza datelor lui Franklin a indicat faptul ca helixul reali]]lizeaza o rotatie completa a celor doua catene in jurul unui ax comun odata la 3.4nm .Deoarece un pas al elicei contine 10 perechi de baze,rezulta ca intre doua perechi alaturate de baze exista o distanta de 0.34nm.Bazele azotate ale dublului- .

-Dublul-helix ADN si bazele azotate ce helix sunt imperecheate in intra in componenta sa. combinatii specifice prin legaturi de ,

hidrogen,de natura electrostatica., dupa cum urmeaza, Adenina (A) cu Timina (T) si Citozina (C) cu Guanina (G).Doar prin incercari si greseli,Watson si Crick au ajuns la aceasta trasatura esentiala a ADN-ului.Initial Watson a imaginat un model in care bazele identice se imperecheau intre ele(A-A, G-G, C-C, T-T),model infirmat de analizele cu raze X ce indicau un diametru constant al moeculei de ADN si nu variabil.Aceasta variatie de diametru este data de faptul ca Adenina si Guanina sunt baze azotate purinice(au in structura doua cicluri condensate,5 atomi de carbon si 4 atomi de azot) iar Citozina si Timina apartin familiei de baze azotate numite pirimidine(contin in structura un singur ciclu cu 4 atomi de carbon si 2 atomi de azot).O pereche purina-purina este prea larga iar o pereche pirimidina-pirimidina este prea ingusta pentru a se potrivii diametrului de 2nm ai dublului-helix ADN.Intotdeauna imperecherea unei purine cu o pirmidina va oferi un

diametru uniform,totusi,Watson si Crick au dedus faptul ca trebuie sa existe si o specificitate aditionala de legare a bazelor azotate intre ele in functie de conformatia lor chimica.Astfel,Adenina realizeaza doua punti de hidrogen cu Timina in cadrul structurii ADN iar Citozina realizeaza trei punti de hidrogen cu Guanina.De aici rezult faptul ca intr-un organism cantitatea de Adenina este egala cu cea de Timina iar cantitatea de Citozina este egala cu cea de Guanina.Desi regulie de imperechere a bazelor azotate dicteaza combinare acestora,ele nu restrictioneaza secventa de nucleotide de-alungul fiecarui lant,secventa liniara a celor patru baze putand varia dupa un numar imens de posibilitati,fiecare gena avand o ordine si o secventa specifica a bazelor azotate.

In aprile 1953 Watson si Crick surprind lumea stiintifica cu o descriere succinta-de o pagina,intitulata: „Structura Moleculara a Acizilor Nucleici:O structura pentru Acizii Dezoxiribonucleici”-publicata in revista britanica Nature.Articolul ilustra modelul lor molecular pentru dublul-helix ADN,model ce a devenit din acel moment simbolul biologiei moleculare.Frumusetea acestei structuri era dat mai ales de modul in care sugera mecanismul de baza al propriei replicari.

Structura si functiile ADN

Molecula de ADN consta in doua lanturi lungi de polinucleotide,fiecare compus din patru tipuri de subunitati,nucleotide.Fiecare dintre aceste doua lanturi este cunoscut ca lant ADN sau catena ADN.Legaturile de hidrogen dintre bazele azotate ale nucleotidelor din fiecare lant mentin cele doua catene legate.Asa cum am vazut inainte,nucleotidele sunt alcatuite dintr-o pentoza (glucid format dintr-un ciclu cu 5 atomi de carbon) la care este atasata o grupare fosfat si o baza azotata.In cazul nucleotidelor din ADN,pentoza este 2’-dexoxiriboza,atasata la o grupare fosfat iar baza azotata poate fi Adenina,Citozina,Guanina sauTimina.Nucleotidele sunt legate intre ele prin legaturi

covalente fosfodiesterice ce se realizeaza intre o pentoza si doua grupari fosfat,rezultand un schelet fosfo-glucidic.Modul in care nucleotidele se inlantuiesc,confera catenei ADN o anumita polaritate chimica.Daca consideram fiecare pentoza ca fiind o „caramida” ce prezinta o proeminenta (fosfatul de la C5’) pe de o parte si un orificiu (hidroxilul de la C3’) pe cealalta,fiecare lant complet format din imbinarea unei proeminente si a unui orificiu,va avea toate nucleotidele orientate in aceeasi directie.Cele doua capete ale catenei vor fi clar diferentiate,unul fiind capatul 3’ terminal iar celalalt capatul 5’ terminal ceea ca da si polaritatea,sensul unui lant ADN.

ADN-ul si subunitatile sale(A) Nucleotidul,format dintr-o pentoza un radical fosfat si o baza azotata (A,G,C

sau T).(B) O singura catena de ADN formata prin polimerizarea nucleotidelor,intre care

se formeaza legaturi fosfodiesterice.Este de retinut ca unitatea formata din pentoza si radicalul fosfat aferent este asimetrica,dand scheletului fosfo-glucidic al lantului o anumita directie sau polaritate.Aceasta directie ghideaza procesele moleculare prin care informatia genetica din ADN este interpretata si copiata in celule:informatia ereditara este „citita” intotdeauna intr-o anumita ordine foarte stricta.

(C) Secventa de nucleotide dintr-o catena de ADN (matrita) va dicta ordinea nucleotidelor din cealalta catena,acestea realizand legaturi de hidrogen cu nucleotidele catenei matrita pe baza de complementaritate a bazelor azotate (A cu T respectiv C cu G),fenomen urmat de polimerizarea nucleotidelor noului lant,rezultand o caten cu structura complementara cu a celeilalte catene a dublului-helix ADN.

(D) In mod normal o molecula de ADN este formata din doua lanturi,nucleotidele din fiecare lant fiind legate fie prin legaturi covalente,fosfodiesterice (in cadrul aceluiasi lant) fie prin legaturi slabe,electrostatice de hidrogen (intre nucleotidele complementare din cele doua lanturi.

(E) Cele doua lanturi se rasucesc unul in jurul celuilalt de-alungul unui ax formand dublul-helix sau elicea dubla-strustura ce poate cuprinde orice secventa de nucleotide fara sa-i fie afectata structura primara.

Structura tridimensionala a ADN-ului-dublul helix- este rezultatul atat al proprietatilor chimice cat si al propietatilor structurale ale celor doua lanturi polinucleotidice din care este formata.Deoarece cele doua lanturi sunt mentinute impreuna prin intermediul legaturilor de hidrogen dintre bazele azotate complementare din catene diferite,toate bazele azotate sunt plasate la interiorul dublului-helix iar scheletul fosfo-glucidic este plasat la exterior.Complementaritatea imperecherii bazelor azotate le permite acestora sa fie impachetate in aranjamentul energetic cel mai favorabil in interiorul dublului-helix.In acest aranjament,fiecare pereche de baze are aceeasi latime,mentinand sceletul fosfo-glucidic la o distanta egal fata de axul helixului de-alungul intregii molecule de ADN.Pentru a maximiza eficienta aranjamentului perechilor de baze,scheletul fosfo-glucidic se rasuceste in jurul axului propriu,formand dublul-helix ce realizeaza o rotatie completa la fiecare 10 perechi de baze.

Fiecare membru al perechii de baze se poate lega cu celalalt si se poate potrivi in cadrul structurii helixului doar daca cele doua catene sunt antiparalele (cu directie diferita de inaintare).

Dublu-helix ADN(A) Model spatial al ADN ce prezinta 1,5 rotatii ale helixului.O rotatie

completa se realizeaza odata la 10,4 perechi de nucleotide iar distanta dintre doua perechi de nucleotide vecine este de 3,4nm.Spiralizarea celor doua catene una in jurul celeilalte duce la formarea a doua scobituri,una mare si una mica,scobiturile reprezentand locul de actiune al agentilor mutageni.

(B) Sectiune prin dublu helix,privit lateral ce prezinta patru perechi de baze.Nucleotidele sunt legate intre ele covalent prin 3’-OH al unei pentoze si 5’-PO4 al urmatoarei.Capatul 3’ terminal prezint o grupare –OH libera atasata in pozitia 3’ al inelului dezoxiribozei iar capatul 5’ terminal prezinta o grupare fosfat libera,atasata in pozitia 5’ a inelului dezoxiribozei.

Aparenta simplitate a structurii dublului-helix ADN este inselatoare.In timp ce arhitectura catenelor sale antiparalele ramane neschimbata,modificari conformationale foarte subtile sunt de ajuns pentru a garanta recunoastere sa de catre alte molecule. Variatiile structurale sunt vitale mai ales pentru recunoasterea dintre ADN si proteine,care este conditio sine qua non in procesele esentiale de replicatie,transcriptie si reglaj genetic.Modificarile conformationale locale,produse de interactiunea cu alte molecule poate,fie sa lase nealterata structura tridimensionala a ADN-ului fie sa induca diverse modificari ca si in cazul complexarii ADN cu proteine histonice.Necesitatea intelegerii variabilitatii ADN a devenit imperios necesara pe masura ce devenea din ce in ce mai improbabil ca regulile generale de autorecunoastere a ADN-ului sa guverneze si recunoasterea dintre secventele specifice de ADN si factorii de transcriptie.

Variabilitatea si plasticitatea locala a structurii ADN precum si abilitatea sa de a recunoaste si de a fi recunoscuta de alte molecule se datoreaza proprietatilor bazelor si aranjamentului lor dependent de secventa de nucleotide.

Tipuri de ADN

Sub aspectul structurii sale tridimensionale,acidul dezoxiribonucleic poate adopta trei forme structurale,acestea sunt:tipul A,tipul B si tipul Z.

Forma clasica de ADN,descrisa de Watson,Crick si Wilkins,caracteristica zonelor cu eucromatina (cromatina decondensata a nucleului interfazic),reprezinta tipul B deADN.In alte conditii duplexul de ADN se poate afla sub alte forme structurale.

Tipul de ADN

Directia de rotatie a moleculei

Perechi baze pe pas elice

Rotatia pe perechi de

baze

Diametrul moleculei

(A)

A Dreapta 11 +34,7 23

B Dreapta 10 +34,0 19

Z Stanga 12 -30 18

Caracteristicile moleculare ale diferitelor tipuri de ADN

Modelul de difractie al ADN se modifica odata cu umiditatea sub care se prepara fiecare mostra.Aceste modele de difractie au fost interpretate drept formele canonice A si

B ale ADN,conformatiile hidrofoba si respectiv hidrofila.Tipul B este un helix subtire,cu pentoze atat in conformatia E cat si in cea S,cu alunecare si inclinatie zero,distanta dintre gruparile fosfat ale acestui tip fiind 6,5A si prezinta o scobitura mare si una mica. Reprezinta structura generala a macromoleculei de ADN in regiunile active metabolic.Diferentele dintre baze sunt,de obicei usor de evidentiat in scobitura mare care reprezinta locul principal de contact pentru proteine care leaga specific secventele de ADN.Pe de alta patre,Tipul A este un helix mai gros,cu pentozele practic blocate in conformatia N,alunecare negativa si un unghi de inclinatie fata de orizontala de 20,distanta dintre gruparile fosfat este de 5,5A,scobitura mica este lata si adanca iar cea mare este ingusta.Este intalnit la concentratii saline mari si in cazul unor deshidratari partiale.Este prezent invivo in duplexurile hibride ADN-ARN. Fiecare dintre aceste doua tipuri de ADN prezinta un model specifc de hidratare.Tipul B poate prezenta fie o coloana hidratata,o pereche de panglici hidratate fie o hidratare independenta a gruparii fosfat.Tipul A prezinta o structura de hidratare mai clara in scobitura mare si grupari succesive de fosfat,plasate de-alungul fiecarei catene de ADN sunt incadrate de molecule de apa ce captusesc marea scobitura.

Existenta tipului Z a fost pentru prima oara sugerata de experimente optice ce aratau ca un polimer compus din alternari de Citozina si Guanina,in solutie de NaCl, 4M,aproape producea o inversie circulara a spectrului dicroic.Tipul Z de ADN se deosebeste de celelalte doua in primul rand prin sensul de rotatie al helixului-levogir (spre stanga).Directia 5’-3’ de inaintare a catenei este relativ inversata fata de tipul B.Este o forma compacta,avand cele mai multe perechi de baze pe o rotatie a moleculei (12).Numele provine de la forma in zig-zag a catenei fosfo-glucidice.Este intalnit in polimerii care au secventa de baze purinice si pirimidince alterate.A fost intalnit in vitro,in unele cazuri neobisnuite,folosind concentratii mari de saruri.Se pare ca este posibila existenta unei tranzitii de la forma B la forma Z.In anumite conditii,o portiune din molecula de ADN,care prezinta dubletele C-G/G-C,poate fi convertita la forma Z pe cand alte regiuni raman in forma clasica B,caracteristica celulelor vii.In vitro,tipul Z este caracterizat prin prezenta unor secvente de baze purinice si pirimidinice alatuarate. Solutiile concentrate saline pot stabiliza tipul Z datorita scaderii puternice a respingerii electrostatice din partea scheletului fosforic.Prezinta o singura scobitura.

In afara de formele A,B si Z,ADN-ul mai poate adopta si alte conformatii tridimensionale,cum ar fi triplu-helix sau quadruplu-helix,structuri incrucisate (cruciforme) sau helixuri paralele.Totusi,oricat de neobisnuite ar fi aceste tipuri,ele sunt in perfecta concordanta cu structura dublu-helix ADN,fiind bazate mai ales pe ansamblarea mai multor helixuri si nu formeaza structuri foarte complexe.

A-ADN B-ADN Z-ADN

Tipuri de ADN

Fenomenul de denaturare-renaturare

Structura tridimensionala a ADN poate fi distrusa prin denaturare.Prin incalzirea unei solutii de ADN la o temperatura de 85-95 C sau prin mentinere la o concentratie ridicata de saruri,legaturile de hidrogen dintre cele doua catene complementare se pot rupe.Procesul este denumit denaturare,rezultand ADN denaturat monocatenar.Temperatura de denaturare (punctul de topire al ADN),difera de la o specie la alta,fiind dependenta de procentul de legaturi triple de hidrogen (C-G) si proportionala cu procentul acestora in molecula de ADN.

Daca solutia de ADN monocatenar este racita brusc,cele doua catene nu se mai reunesc (nu se mai refac puntile de hidrogen),rezultand ADN monocatenar.

Renaturarea reprezinta capacitatea catenelor complementare de a reface dublul helix.Procesul are loc printr-o racire treptata,lenta,care permite refacerea puntilor de hidrogen si reasocierea catenelor,rezultand ADN renaturat.Procesul de renaturare se produce in doua etape.In prima etapa,o catena de ADN din solutie se imperecheaza la intamplare cu o alta,formandu-se scurte regiuni bicatenare.Ulterior,in etapa urmatoare,regiunea de baze imperecheate se extinde de-a lungul moleculei,intreaga molecula devenind bicatenara.

Bibliografie

1. „DNA conformations and their sequence preferences”-Daniel Svozil,Jan Kalina,Marek Omelka,Bohdan Schneider,,Nucleic Acids Research,2008,Vol.36,No 11,Publicat online pe 13 mai 2008.

2. „The Streched Intermediate Model of B-Z DNA Transition”-Wilber Lim,Yuan Ping Feng,Department of Physics,Faculty of Sience,National Univesity of Singapore;Biophysical Journal,Volume 88,Martie 2005.

3. „The B-to A-DNA Transition and the Reorganization of Solvent at the DNA Surface”-Nina Pastor;Cuernavaca,Morelos,Mexic;Biophysical Jouarnal,Volume 88,Mai 2005.

4. „The Structure and Function of DNA”-Alberts,Johnson,Lewis,Raff,Roberts, Walter;”Molecular Biology of The Cell”4th edition;

© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=DNA&rid=mboc4.section.596

5.”The DNA double helix”2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=DNA&rid=mboc4.figgrp.600

6.”DNA and its building blocks”© 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=DNA&rid=mboc4.figgrp.8

7.”Experimental demonstration that DNA is the genetic material” © 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?highlight=DNA&rid=mboc4.figgrp.594

8.”Biology”7th edition-Neil A.Campbell,Jane B.Reece,Ed.Pearson,Benjamin Cummings;Unit 3 Genetics,16.The Molecular Basis of Inheritance,pag.293-299.

9.James Watson, www.sanatatea.com/baza/2008/03/28/james-watson.html

10.Francis Crick, http://www.sanatatea.com/baza/2008/05/09/francis-crick.html

11.”Biologie”,Gabriel Corneanu,Aurel Ardelean,Gheorghe Mohan,Ed.Corint,2007,I.Genetica Moleculara,2.Acizii Nucleici.

12.www.nobel.se.