adn - replicatia

1

Colegiul National “Petru Rares” Suceava Prof. Carmencita Obreja

Functiile materialului genetic

Structura ADN ii permite sa indeplineasca doua functii :

1. Functia autocatalitica: care asigura reproducerea sa fidela;

2. Functia heterocatalitica: consta in biosinteza proteinelor si respective a unor enzime specifice celulelor.

Functia autocatalitica. Functia autocatalitica a ADN-ului consta in procesul de replicare a

materialului genetic; in cazul moleculei de ADN bicatenar de la eucariote , acest proces are loc in timpul fazei S

a ciclului celular.

Studiul ciclului celular a relevat existenta unei anumite constante a dinamicii cantitatii de ADN in celule.

Interfaza are mai multe perioade :

- Perioada G1 – primul gol sintetic, cand cantitatea de ADN din celula ramane constanta; cromozomii sunt

monocromatidici, fiecare este format dintr-o molecula de ADn formata din doua cromoneme (cantitatea de

ADN este de 2C);

- Perioada S – de sinteza, in care are loc replicarea AND care se incheie cu dublarea cantitatii de ADN;

cromozomii devin bicromatidici, formati din doua macromolecule de ADN ce contin patru cromoneme

(cantitatea de ADN este 4C);

- Perioada G2 – al doilea gol sintetic, in care se prezerva cantitatea dubla de ADN(4C).

Diviziunea celulara – a doua etapa a ciclului celular- in timpul diviziunii celulare cantitatea de ADN este variabila

in diferite faze ale procesului. In profaza si metafaza mitozei cromozomii sunt bicromatidici, iar cantitatea de

ADN din celula este aceeasi cu cantitatea de ADN a celulei ce a intrat in diviziune. In anafaza, cromozomii

redevin monocromatidici( prin clivarea longitudinala a cromozomilor bicromatidici) si migreaza spre polii celulei

La sfarsitul telofazei- rezulta doua celule fiice cu acelasi numar de cromozomi ca si celula mama.

2


Modele de replicare:

Replicarea conservativa – molecula parentala ramane intacta iar noua molecula se formeaza “de

novo” ;

Replicarea dispersiva – presupune ca, dupa replicare, fiecare dintre cele patru catene

reprezinta un amestec de ADN parental si de ADN nou sintetizat ;

Replicarea semiconservativa –o catena este intodeauna conservata,ea reprezinta catena

parentala, iar cealalta catena este noua ;

- anticipata de Watson si Crick din 1953;

- demonstrata experimental de M. Meselson si F. Stahl in 1958 prin tehnica ultracentrifugarii

analitice.

Ultracentrifugarea analitica este o tehnica de separare a moleculelor dintr-un amestec prin ultracentrifugare,

adica centrifugare la cateva sute de rotatii pe minut(RPM). La aceasta viteza forta centrifuga devine suficient de

mare pentru a induce un gradient de densitate. Datorita gradientului de densitate se produce ordonarea

componentelor unei solutii in functie de masa lor : cele mai grele spre exteriorul miscarii de rotatie, cele mai

usoare spre interior(intr-o ultracentrifuga se introduc eprubete care contin solutia de analizat, iar in timpul

3


centrifugarii eprubetele sunt dispuse orizontal, astfel ca dupa centrifugare componentele din solutie care au

masa mare se dispun spre baza eprubetei, iar cele cum asa mai mica spre gura eprubetei).

Gradientul de densitate poate duce la separarea moleculelor intr-o solutie in functie si de compozitia lor in

izotopi. Astfel, daca este ultracentrifugata o solutie cu un amestec de molecule de ADN dintre care unele au

incorporat numai forma normala 14N-usor- si altele numai izotopul greu 15N- , cele doua tipuri de molecule de

ADN se vor separa in benzi distincte in eprubetele de ultracentrifugare (cele cu 14N in banda superioara, iar cele

cu 15N intr-o banda inferioara).

In experimentul lor, Meselson si Stahl au cultivat initial bacteria Escherichia coli intr-un mediu cu 15N si datorita

acestui fapt moleculele de ADN au incorporat in radicalii fosfat numai 15N.

Dupa cateva generatii, Meselson si Stahl au schimbat mediul de cultura cu unul care continea numai 14N ;

au luat apoi la diferite intervale de timp probe de cultura, au extras ADN si l-au ultracentrifugat.

Cand se analizeaza ADN sintetizat pentru o generatie , la trecerea bacteriilor de pe mediul cu 15N, pe un mediu

cu 14N, se obtine o singura banda de ADN care are o densitate intre ADN cu 15N si 14N.

Cand se analizeaza ADN de la bacterii crescute pentru doua generatii pe mediu cu 14N, apar doua benzi, una

corespunzator ADN intermediar 15N-14N, alta corespunzand ADN usor cu 14N. acest rezultat confirma realitatea

modelului semiconservativ de replicare si exclude celelalte modele

Interpretarea rezultatelor. Dupa o runda de replicatie fiecare molecula fiica de ADN era hibrida, posedand o

catena grea parentala si o catena usoara nou sintetizata. Cand aceste molecule hibride de ADN se replica,

fiecare dintre ele contribuie cu o catena grea pentru a forma o molecula hibrida si cu o catena usoara pentru a

forma o molecula de ADN cu ambele catene usoare.

4


Acest experiment a confirmat clar predictia emisa de Watson si Crick privind replicatia ADN dupa modelul

semiconservativ.

Modelul semiconservativ de replicare a moleculei de ADN- a fost propus de Watson si Crick.

Conform acestui model , initial are loc ruperea puntilor de hidrogen, rezultand ADN monocatenar. Ulterior ,

fiecare catena originala serveste drept matrita(templat) pentru sinteza unei noi catene. Vor rezulta doua

molecule noi, fiecare avand o catena veche si o catena nou-sintetizata. Deoarece puntile de hidrogen

complementare intre bazele azotate din cele doua catene pot fi numai de tipul A=T, C=G si invers, secventa

nucleotidelor in cele 2 molecule rezultate este identica cu secventa de nucleotide din molecula originala.

5


Replicarea dupa modelul semiconservativ Replicare bidirectionala – un ochi de replicare

Modelul replicarii discontinue propus de Okazaki

Replicarea

La eucariote , replicarea ADN incepe simultan in mai multe regiuni situate in lungul moleculei

de ADN numite repliconi sau ochiuri de replicare ,care functioneaza simultan. Repliconul este- un

fragment de ADN alcatuit din 30.000 – 300.000 perechi de nucleotide , la nivelul caruia are loc

replicarea moleculei de ADN, in doua directii diferite .

La procariote , genomul viral sau genomul bacterian contine un singur replicon ( unitati

replicative) pe cand genomul celulei eucariote contine mai multi repliconi.

Necesitatea existentei mai multor repliconi la eucariote :

Exemplu : Drosophila melanogaster cel mai lung cromozom contine 7 x 107 nucleotide ;

- la o rata de 50 nucleotide / secunda la 250 C replicarea intregii cantitati de ADN din cromozom

ar avea loc in 8 zile ;

- in celulele de Drosophila exista 8.500 repliconi , situatie ce reduce timpul de replicare la

cateva minute . Existenta mai multor repliconi asigura replicarea fiecarui cromozom in 15-30 min.

6


la eucariote timpul total de replicare a cromozomilor este de 5-10 ore, deoarece nu toti

cromozomii se replica simultan..

Una dintre cele mai importante diferente intre desfasurarea replicarii la procariote si eucariote, se refera la

terminarea replicarii, deoarece liniaritatea cromozomilor de la eucariote implica formarea unor structuri

specializate la capetele cromozomilor, structuri cunoscute sub numele de telomere.

Originea replicarii . Initierea replicarii se face intr-un punct de pe macromolecula de ADN numit originea

replicarii. La toate sistemele biologice, regiunea unde se afla acest punct prezinta o bogatie de perechi A-T,

flancate de perechi G-C. la nivelul perechilor A-T are loc initierea separarii celor doua catene, deoarece aceste

perechi, avand doar cate doua punti de hidrogen, sunt mai usor separate.

Bifurcatia de replicare se deplaseaza secvential de-a lungul duplexului ADN, din punctul START, de la nivelul

originii replicarii. La alte sisteme biologice, replicarea poate fi unidirectionala.

In replicarea bidirectionala , la nivelul originii sunt formate doua bifurcatii de replicare(furca de replicatie) care

se deplaseaza in directii diametral opuse, spre punctul terminus – situs terminator- care este situat diametral

opus punctului de origine al replicarii.

Tipuri de enzime care participa in replicatie( E.coli):

ADN topoizomeraza I– taie si apoi leaga catene de ADN, reducand tensiunea din acestea, facand

posibila desfacerea celor doua catene ale molecule prin ruperea unei punti fosfodiesterice , intr-

una dintre catenele parentale, inaintea furcii de replicare. Aceasi enzima reface puntea

fosfodiesterica, dupa ce suprarasucirea a fost inlaturata ;

primaza si primozomul , ce actioneaza la nivelul furcii de replicare, se deplaseaza in directia 5’-3’.

primaza – determina sinteza unui scurt segment de ARN care se numeste ARN- primer ;primaza si

ARN polimeraza actioneaza sinergic in vivo, in initierea catenei leading;

ADN helicaza – desface puntile de H dintre cele doua catene . Regiunea monocatenara rezultata

este complexata cu o proteina tip SSB (singl strand binding protein), care stabilizeaza regiunea cu

ADN monocatenar, impiedicand formarea puntilor de hidrogen;

ADN polimeraza III - adaugarea nucleotidelor in ordine exacta complementara catenei ADN

matrita- numai la capatul liber 3’ liber al moleculei de pentoza ;

ADN polimerazele au nevoie de un primer ARN datorita incapacitatii de a initia sinteza »de

nuovo »a unei catene polinucleotidice ; au capacitatea de a lungi o catena déjà initiata.

7


ADN polimeraza I – ataseaza ultima nucleotida la fragmentul Okazaki;corecteaza greselile din

ADN prin indepartarea nucleotidelor inserate gresit; are activitate exonucleazica si este utilizata in

indepartarea primerilor ARN din sinteza discontinua, pe catena intarziata;

ARN polimeraza – asigura sinteza si dispunerea ARN-ului primer pe baza de complementaritate

pe catena ADN ;

ADN ligaza – leaga intre ele fragmentele Okazaki intr-o catena continua.

Replicarea la procariote :Replicarea ADN incepe la furca de replicare , constituita dintr-o secventa de nucleotide

(circa 300 de perechi de nucleotide). Aceasta constituie o regiune unde are loc o trecere de la duplexul perental

la noile duplexuri fiice replicate.

Desfacerea dublului helix parental fara o rotatie corespunzatoare, creaza superhelice- infasurari superhelicale.

Topoizomeraza I relaxeaza tensiunea acestor infasurari superhelicale. Dupa interventia topoizomerazei , la

nivelul originii de replicare intervin enzime helicaze care realizeaza separarea catenelor prin ruperea puntilor de

hidrogen , folosind energia provenita din ATP.

Proteinele ssb tin catenele complementare ale duplexului ADN in stare separata – monocatene, acestea fiind

intinse si accesibile spre a functiona ca matrite.

Dupa desfacerea structurii bicatenare in monocatene si stabilizarea monocatenelor la nivelul furcii de replicare,

intervine primaza care determina sinteza unui scurt segment de ARN numit primer ARN.

La procariote initierea noilor catene se realizeaza prin activitatea unui complex proteinic numit primosom.

In toate sistemele biologice, replicarea ADN este initiata prin sinteza unui primer ARN care ofera ADNpolimerazei

un capat 3’-OH cu care acesta enzima ataca 5’-P nucleotidul aliniat pe matrita., realizandu-se prima legatura

fosfodiesterica.

Sinteza a doua catene noi are loc diferit pe cele doua catene matrita, originale, deoarece enzima ADN

polimeraza, implicata in polimerizarea nucleotidelor , poate atasa o noua nucleotida numai la capatul 3’ liber al

moleculei de pentoza.

Catena matrita este intotdeauna citita in sensul 3’ 5’

Noua catena de ADN trebuie sa fie sintetizata in sensul 5’3’

- catena conducatoare (leading strand) se sintetizeaza mai timpuriu si continuu;

- catena intarziata (lagging strand) se sintetizeaza mai tarziu si discontinuu, sub forma unor

fragmente mici, monocatenare numite fragmente Okazaki (in cinstea lui Reiji Okazaki descoperitorul lor) .

8


strand = catena

1. Catena veche 3’-5’ serveste ca matrita pentru sinteza unei catene complementare noi, catena 5’-3’,

denumita catena leading (catena directoare au catena principala). Deoarece noua catena prezinta liber capatul

3’-OH, la care pot fi adaugate noi nucleotide, sinteza sa are loc in mod continuu, sub actiunea enzimei

ADNpolimeraza III, pe baza ordinii dictate de catena matrita si a legaturilor de specificitate tip A=T,C=G.

Dupa sinteza, are loc rasucirea catenei nou formate fata de cea originala, formandu-se structura bicatenara.

2. Catena initiala 5’-3’serveste ca matrita pentru sinteza unei catene complementare noi, catena 3’-5’,

denumita catena lagging(catena discontinua, segmentara sau intarziata). Deoarece catena noua nu are liber

capatul 3’-OH, sinteza este discontinua, avand loc dupa un alt mecanism, de la furca de replicare spre capatul

liber al catenei, ducand la formarea de fragmente Okazaki.

Enzima de initiere a sintezei este ARNprimaza, sub actiunea careia este sintetizat un primer ARN alcatuit

din cateva nucleotide. Pornind de la primerul ARN, sub actiunea enzimei ADN polimeraza III , are loc

atasarea de nucleotide noi, de la furca de replicare catre captul liber al catenei lagging, formandu-se un

fragment Okazaki. Cel de-al doilea fragment Okazaki va ajunge in dreptul primerului fragmentului Okazaki

sintetizat anterior.

Fragmentul Okazaki este un fragment de ADN, alcatuit din cateva mii de nucleotide la procariote si 100-200 de

nucleotide la eucariote.

Dupa sinteza unui fragment Okazaki, ADNpolimeraza III este inlaturata. Al doilea fragment Okazaki sintetizat va

ajunge in dreptul primerului primului fragment Okazaki sintetizat anterior. Imediat actioneaza enzima ADN

polimeraza I, avand loc atasarea ultimei nucleotide, care ajunge langa primerul fragmentului Okazaki sintetizat

anterior. Dupa aceasta actiune, sub actiunea unei ADN polimeraza I (exonucleaza) are loc indepartarea

primerului ARN de la fragmentul Okazaki sintetizat anterior, proces urmat de indepartarea ADN polimerazei I.

Cele doua fragmente Okazaki alaturate sunt unite sub actiunea enzimei ADN ligaza, dupa care are loc rasucirea

catenei nou-sintetizata in jurul catenei matrita.

9


Viteza de atasare a noilor nucleotide in timpul replicarii molecule de ADN este mare – circa 1 000 de nucleotide

pe secunda pe genom(L. Gavrila – la bacteria este de 800 pb/s). La aceasta viteza au loc erori de imperechere ,

respective de atasare a unor nucleotide noi, intr-un procent de 1 eroare/100 000 de perechi de nucleotide.

Astfel in cromozomul bacterian alcatuit din 3x106 perechi de baze azotate, se pot produce 30 erori/celula.

ADN-ul din celula umana contine cca.3x109 perechi de baze, numarul de erori fiind de 30000 de

nucleotide/celula.

Majoritatea erorilor sunt inlaturate prin procese specifice. ADN topoizomerazele induc incizii in una din

catenele molecule de AND, proces urmat de eliminarea nucleotidelor incluse gresit, inlocirea acestora cu

nucleotide corespunzatoare structurii initiale si repararea greselilor de replicare.

In celula eucariota, prezenta nucleozomilor determina anumite particularitati ale replicarii ADN:

Fragmentele Okazaki sunt de 100 ori mai scurte fata de cele de la procariote; Primerul ARN este mai scurt (10-20 nucleotide) Viteza de replicare est mai mica (50 de nucleotide pe secunda fata de 500 la procariote) Prezenta unor repliconi multipli reduce timpul total de replicare a intregii molecule de ADN Nucleozomii fibrei de cromatina raman atasati de portiunile catenei matrita conducatoare, pe cealalta

catena fiind structurati nucleozomi noi, pe baza proteinelor histonice componente, sintetizate concomitent cu replicatia ADN.

10


Ultracentrifugarea :

11


Ultracentrifugarea

adn - replicatia

Documents