Vectori virali de clonare ADN

Vectori virali – virusi defectivi, obtinuti in baza genomurilor unor virusuri in interiorul carora se introduc fragmente de ADN studiat pentru livrarea acestor fragmente in celulele tinta.

Tipurile de virusuri folositi ca vectori

Retrovirusurile - lentivirusurile - Mo-MLU (Murine Leukemia Virus) Adenovirusurile - herpes virusurile - adenovirusuri asociate -fagi filamentosi (M13, f1, fd, Pf1) - bacteriofagul λ.

Virusul Celulele tinta Proprietati NeajunsuriRetrovirusul Fibroblastele, mioblastele,

celulele musculare netede,hepatocite, celule hematopoietice,celule stem.

Nepatogene.Se integrează în genom. Relativ simplu de manipulat.Biologia este bine studiată.

Capacitate limitată pentru punerea în aplicare a transgenei (10 KB).Nu infectează celulele ce nu se divid.Expresia transgenei poate fi de scurtă durata.Nu este foarte util pentru terapia în vivo.

Adenovirusurile Hepatociteleepiteliul tractului respirator superior,celule limfoide si hematopoietice

Sunt disponibile linii mutante non-patogene.Oamenii - gazda naturală.Eficacitatea înaltă în infecţia în vivo.Infectează celulele ce se divid si ce nu se divid, neinfectate de retrovirusuri.Biologia este bine studiată.Sunt linii celulare de inpachetare.

Nu se integreze în genom.Construcţia vectorului este mai complicată decât cea a retrovirusurilor.Se poate recombina cu un adenovirus natural.

Adenovirusurile asociate Celule hematopoieticefibroblaste,celulele epiteliale.

Nepatogene, nu este citotoxic..Oamenii - gazda naturală.Site-ul preferat de integrare este pe cromozomul 19.Poate stabili o stare latentă. Relativ simplu de construit a vectorului.

Titruri relativ scăzut.Capacitate mica (4KB).Infectarea este relativ scăzută.Necesită un adenovirus ca un ajutor pentru infecţie.Biologia nu este bine studiata.

Vectorii retroviraliVectori retrovirali pot fi capabili de replicare sau de replicare defect.

Vectorii de replicare defect sunt virusurile ce au regiunile de codare pentru genele necesare pentru replicare a virionului şi ambalare înlocuite cu alte gene, sau şterse. Aceste virusuri sunt capabile să infecteze celulele ţintă şi sa furnizeze gena utilă, dar nu reuşesc să-şi continue calea tipic litica.

Vectori capabili de replicare virală conţin toate genele necesare pentru sinteza virionului, şi continuă să se propage odată cu infectarea. Deoarece genomul viral pentru acesti vectori este mult mai lung, lungimea genei de interes este limitată.

În funcţie de vectorul viral, lungimea maximă a unui fragment ADN inserat este de obicei aproximativ 8-10 kB.

Genomul retrovirusului ARN-ul viral:

- Conţine aşa-numitele repetari scurte terminale - STR (short terminal repeats). Cifra acestea sunt notate cu R;

- Codifică trei polipeptide lungi: GAG, polipeptida combinata GAG-POL, şi ENV, care este precursor ale proteinelor virale - ca capsida (GAG) , anvelopa (ENV), şi de reglare (GAG-POL);

- Conţine la capatul 5' cap ARN-ul, iar la capatul 3' poli (A) "coada";

- conţine două site-uri splicing - donator SD şi acceptor SA;

- Conţine o secţiune specială, care indică faptul că ARN-ul poate fi ambalat în interiorul proteinelor virale, care formează ca urmare o particulă virală, virionul. Acest semnal de ambalare y (psi). Acest site este situat între două site-uri de lipire.

Principiul de creare a vectorului retroviral.

Din ADN-ul proviral se elimina o parte din gene, lăsând doar LTR şi y-site-ul. În locul genelor eliminate se inserează fragmentul de ADN de interes.

Transferul genelor virale intr-o linie celulara ce v-a produce proteinele de incapsidare.

Transferul retrovirusului intr-o linie celulara care il va multiplica.

1

Vectorii adenovirali Vectorii adenovirali sunt virusuri ADN la

care sa indepartat din genom cea mai mare parte din regiunea E1 esentiala replicarii virale si s-a introdus gena de interes.

De asemenea se indeparteaza regiunea E3, care poate declansa raspunsul imunitar , dar nu influenteaza replicarea virala.

Genomul virusului ADN Regiunea C – genele ce codifica proteinele

capsidei Regiunile E1, E2, si NS1- genele ce

codifica proteinele anvelopei. Regiunile NS2, NS3, NS4- genele ce

codifica enzime ca helicazele, proteazele etc.

Regiunea NS5- genele ce codifica ARNpol.

Principiul de creare a vectorului adenoviral Subtituirea regiunilor E1A si E1B cu o

gena de interes. Transfectia unei linii de celule (293) de

origine embrionara ce contine regiunile E1a si E1B virale integrate in genomul acestora si producerea proteinelor respective.

Incapsidarea moleculelor de AND viral recombinat .

VECTORI DERIVAŢI DIN GENOMUL BACTERIOFAGULUI λ Genomul fagului , λ prezentînd dimensiuni mari, nu poate fi utilizat

ca atare ca vector de clonare. Cu atât mai mult cu cât ADN-ul său conţine multe situsuri pentru enzime de restricţie în gene esenţiale pentru ciclul litic al fagului. Pe de alta parte, particulele fagice nu pot prelua o cantitate mult mai mare de ADN decât propriul genom. Totuşi, toate aceste impedimente au fost depăşite :

1. regiunea centrală a genomului viral (ce reprezintă aproximativ 1/3 din genom) nu este esenţială pentru creşterea litică şi, ca atare, poate fi înlocuită de ADN heterolog; această regiune a fost denumită ″stuffer″

2. prin manipulare genetică situsurile de restricţie au fost eliminate din regiunile esenţiale

3. mai mult decât atât, folosind oligonucleotide sintetice, situsurile de restricţie au fost plasate exact în poziţiile cele mai favorabile

BACTERIOFAGUL λ EMBL 4

VECTORI DERIVAŢI DIN FAGI FILAMENTOŞI Fagii filamentoşi (M13, f1, fd, Pf1) au genomul

format dintr-o moleculă ADN m.c. circular închis, cu greutate moleculară medie de 2 x 106 Da. După pătrunderea în celula bacteriană, ADN fagic iniţiază ciclul de replicare cu ajutorul unei forme intermediare de replicare dublu catenare. Replicarea se face dupa modelul cercului rotativ şi are ca rezultat formarea unui mare numar de catene ADN. Aceste catene− vor servi ca matriţa în transcrierea genelor fagice.  

FAGUL FILAMENTOS M13

Utilizarea vectorilor virali Obtinerea OMG Terapia genica Biotehnologii moderne Clonarea genelor etc.

Multumesc pentru atentie.