Biosinteza ADN (replicarea)Mutatii Reverstranscriere

Replicarea Reprezint modalitatea specific de biosintez a ADN Const n desfacerea duplexului de ADN parental i construirea pe fiecare dintre cele dou catene a cte unei catene fiice complementare-replica celor dinti Ca urmare rezult dou molecule de ADN fiice identice cu parentala, n fiecare dintre moleculele nou formate conservndu-se o caten veche, parental; sinteza ADN se numete de aceea, replicare semiconservativ Sinteza semiconservativ asigur astfel transferul de informaie genetic de la ADN parental la ADN nou sintetizat

Replicarea la procariote n E.Coli exist o molecul unic de ADN circular , de mari dimensiuni ce alctuiete un cromozom Iniierea replicrii se produce n regiuni origine Ori C care conin secvene foarte bine conservate de-a lungul timpului, bogate n perechi A-T Regiunea activ n replicare la un moment dat se numete bifurcaia de replicare; pe cromozomul bacterian exist 2 bifurcaii de replicare, una n sens orar i alta n sens antiorar Duplexul se replic simultan n ambele direcii; n timpul replicrii cromozomul bacterian are forma literei greceti theta (Q) Cnd cele 2 bifurcaii de replicare ajung n regiunea opus lui Ori C, replicarea este terminat Replicarea este bidirecional la bacterii i virusuri

Replicarea la procariote

Elementele necesare replicrii la procariote Substraturi dATP, dGTP, dCTP, dTTP i ATP, GTP, CTP, UTP Matria (template) cele dou catene de ADN Enzime: Helicaze enzime care desfac ADN dublu catenar cu etalarea celor 2 catene complementare, permind citirea secvenei de ctre ADN polimeraze; desfacerea catenelor se face treptat pe msur ce replicarea avanseaz; catenele individuale sunt mpiedicate s se reasocieze de proteine de stabilizare a ADN monocatenar; procesul necesit energie sub form de ATP

Elementele necesare replicrii la procariote Enzime: Topoizomeraze I i II (ADN giraza) relaxeaz suprarsucirile pozitive aprute ca urmare a aciunii helicazei, fr consum de ATP -topoizomeraza I sau cu consum de ATP - ADN giraza ADN primaza (ARN polimeraz-ADN dependent) sintetizeaz fragmente scurte de ARN avnd 4-12 nucleotide (ARN primer); pentru sinteza catenei leading este nevoie de un singur ARN primer, n cazul catenei lagging fiind nevoie de cte un ARN primer pentru fiecare fragment Okazaki

Elementele necesare replicrii la procariote Enzime: 3 ADN polimeraze-ADN dependente: Caracteristici comune: Nu iniiaz catene ADN, necesitnd un ARN primer cu o grupare OH 3 liber Necesit o caten de ADN matri (template) Direcia de sintez a catenelor este 53 Catalizeaz adugarea dNTP n timpul elongrii catenelor n formare; dNTP se adaug unul cte unul, la captul 3 al catenei n cretere, n ordinea dictat de matri Au activitate exonucleazic 35

Elementele necesare replicrii la procariote Enzime: 3 ADN polimeraze-ADN dependente: Caracteristici specifice: ADN polimeraza I - are activitate polimerazic redus; prin activitatea exonucleazic 35 hidrolizeaz nucleotidul nemperecheat corespunztor; prezint i activitate exonucleazic 5 3prin care ndeprteaz ARN primer i l nlocuiete cu ADN prin activitatea sa polimerazic ADN polimeraza II nu este necesar la replicare; are rol n repararea ADN prin activitatea exonucleazic 35 ADN polimeraza III rol central n procesul de replicare; are structur de dimer simetric, permind replicarea n acelai timp i acelai loc a ambelor catene parentale de ADN

Elementele necesare replicrii la procariote ADN polimeraza III : rol central n procesul de replicare; are structur de dimer simetric, permind replicarea n acelai timp i acelai loc a ambelor catene parentale de ADN Are procesivitate mare adic leag strns i elibereaz catena matri numai dup replicarea complet a acesteia Are eficien catalitic foarte mare 1000 nucleotide pe secund Are rol de corector prin activitatea exonucleazic 35; ca urmare, frecvena erorilor n procesul de replicare este de 106-107 perechi de nucleotide (la E.Coli exist i un sistem enzimatic corector postreplicare a.. frecvena final a erorilor este de 109 perechi de baze) Stabilete o legtur fosfat diesteric ntre captul 3-OH al catenei n cretere i nucleotidul urmtor, numai dac la captul 3-OH se gsete un nucleotid corect mperecheat cu catena matri

Elementele necesare replicrii la procariote Enzime: ADN ligaza unete fragmentele de ADN din catena lagging (sintetizat discontinuu), rezultate n urma replicrii. ADN polimeraza I cu rol de exonucleaz 5 3, elimin ribonucleotidele din ARN primer, din captul 5 al fragmentelor Okazaki i le nlocuiete cu deoziribonucleotidele corespunztoare;

Replicarea Catenele ADN sunt citite n direcia 3 5 Replicarea este continu pe catena leading i este semidiscontinu pe catena lagging Enzima catalizeaz sinteza unor fragmente de 150-200 nucleotide, numite fragmente Okazaki, n direcia 5 3; sinteza fiecrui fragment Okazaki necesit un ARN primer In vivo replicarea se desfoar cu viteze egale pentru ambele catene; complexul enzimatic necesar replicrii este ataat membranei nucleare iar molecula de ADN l strbate; Formarea unei bucle de ctre catena matri cu direcia 5 3 precum i structura dimeric a ADN polimerazei III, permite catenei lagging s fie sintetizat n acelai timp i n aceeai direcie cu catena leading

Replicarea la eucariote Se desfoar dup un mecanism asemntor Are loc n faza S a ciclului celular; ADN nuclear este replicat o singur dat i n intregime per ciclu celular Este semiconservativ, ncepe n mai multe origini de replicare i se produce bidirecional din fiecare origine ARN primer are 8-10 nucleotide Sunt 5 ADN polimeraze-ADN dependente; viteza reaciei este mai mic dect la procariote (500-5000 nucleotide pe minut); procesivitatea este relativ mic

ADN polimeraze-ADN dependenteADNpolimeraza a e b Excluderea ARN primeri i completarea cu ADN, sinteza catenei lagging Aciune corectoare, reparare ADN Repararea ADN Funcie

gd

Sinteza ADN mitocondrialSinteza catenei leading

Replicarea la eucariote Cromozomii eucariotelor conin la ambele capete, structuri speciale numite telomere secvene de cca.100 nucleotide bogate n G, sintetizate i meninute de o telomeraz Cromozomii fr telomere sunt instabili, fie fuzioneaz cu ali cromozomi, fie sunt degradai Telomeraza are rolul de a lungi catena lagging, care prin eliminarea primerului de la captul 5 i degradarea ADN monocatenar se scurteaz la fiecare rund de replicare; n felul acesta cromozomul va rmne aprox. cu aceiai lungime

Replicarea la eucariote Telomeraza exist numai n anumite celule (seminale, limfocite, canceroase) Absena telomerazei permite scurtarea gradual a cromozomilor la fiecare rund de replicare; astfel, exist un numr limitat de diviziuni, dup care, celula nu se mai divide (intr n procesul de moarte programat sau apoptoz); lipsa telomerazei contribuie la senescena normal a celulelor Creterea activitii telomerazei poate permite replicarea i creterea celular necontrolat, proces care se produce n cancer

Replicarea la eucariote Medicamente care afecteaz replicarea Antimetaboliti 5-fluorouracil, metotrexat, 6mercaptopurine - reduc sau inhib producerea de dNTP pentru replicare Substrate analoage azidotimidina, citozin arabinozidul - pot fi ncorporate de ADN polimeraze n structura ADN inhibnd viitoarea replicare Inhibitori ai ADN girazei acid nalidixic, fluorochinolone

Reverstranscrierea n virusurile oncogene (conin material genetic ARN) exist o reverstranscriptaz = ADN polimeraz ARN dependent care se activez numai la ptrunderea virusului n celul Primerul folosit de enzim este un ARNt, nglobat n particula viral Dup ce se sintetizeaz o caten de ADN pe matri de ARN, ARN viral este degradat (prin activitatea sa ribonucleazic) Catena ADN rmas se autoreplic formnd un duplex ADN ce conine informaia prezent n ARN viral ADN format se inser n genomul gazdei, putndu-se n anumite condiii, exprima n proteine, care pot duce la malignizarea celulei Reverstranscriptaza nu are activitate exonucleazic 3 5 putnd face greeli la replicare, ceea ce explic numrul mare de tulpini virale Reverstranscriptaza poate utiliza orice ARN ca matri, aceast posibilitate fiind utilizat la obinerea unor gene sintetice

Reverstranscrierea

Mutaii Sunt modificri permanente ale secvenei de ADN Pot afecta o singur pereche de baze (mutaii punctiforme) sau mai multe perechi de baze Mutaiile punctiforme: Tranziia o purin este nlocuit cu alt purin sau o pirimidin cu alt pirimidin; aceasta poate fi determinat de prezena unei baze azotate n timpul mpeerecherii ntr-o form tautomer rar ( de ex. forma tautomer imino a A poate forma o pereche cu C, rezultnd un ADN n care perechea AT este nlocuit cu GC)

Mutaii Mutaiile punctiforme: Transversia o purin este nlocuit cu o pirimidin sau invers Deleia va determina citirea incorect a ntregii secvene ce succede deleia (deleii se produc la variaii de pH sau temperatur) Inseria - va determina citirea incorect a ntregii secvene ce succede inseria; acridina (colorant) se poate intercala ntre 2 baze azotate (pt. c are molecul plan), urmnd ca la replicare, corespunztor acridinei, pe catena complementar s se insereze o baz complementar nou care se leag covalent

Mutaii Cauzele care determin apariia mutaiilor: Erori n procesul de replicare adugarea unei baze care nu este complementar celeia din matri sau mperecherea greit a bazelor, necorectat de ADN polimeraza III sau de sistemele de corectare post-replicare Substane chimice ageni nealchilani formaldehida (reacioneaz cu gruprile amino), hidroxilamina (reacioneaz specific cu citozina), acidul azotos (dezamineaz oxidativ A, G, C transformndu-le n cetone, ceea ce va determina mperecherea lor greit) Ageni alchilani etilmetansulfonat (adaug o grupare metil la N unei purine, ceea ce va determina labilizarea legturii N-glicozidice prin a crei hidroliz apare un loc depurinat), nitrozoguanidina (determin mutaii prin tranziie i transversie)

Mutaii Cauzele care determin apariia mutaiilor: Analogi structurali ai bazelor azotate 5bromouracilul, 2-amino purina Radiaiile UV (determin formarea de dimeri de T), X i g (determin deschiderea nucleului purinic, depurinarea i ruperea legturilor fosfat diesterice) Repararea ADN se face prin excizia dimerilor de timin sau a bazelor obinute prin dezaminri ( prin dezaminarea C U, a A hipoxantin i a G xantin) sau prin fotoreactivare (clivarea legturii covalente din dimerii de T de ctre o ADN fotoliaz, activat de radiaiile din domeniul vizibil)

Dimeri de timin