Identification, analyse et squenage de dADN recombinant

Squenage dADNLa caractrisation fine dun gne passe par son squenage la connaissance de la composition et de lordre des nuclotides qui le composent.Techniques de squenage:

Maxam et Gilbert squenage chimique;

Sanger squenage enzymatique par incorporation de didoxinuclotides (ddNTPs);

Le squenage sur puces technique davenir pour la biologie clinique.

Hybridation molculaireLhybridation molculaire permet de reprer ou de rechercher une molcule dADN ou dARN spcifiques dans une population htrogne. Les techniques dhybridation reposent sur: le proprits physico-chimiques des acides nucliques comme la complmentarit des bases constitutives de lADN et de lARN; la rversibilit du processus de sparation des deux brins dune molcule dADN (dnaturation) et de r-association (renaturation).

Dnaturation thermique de lADN

Courbe de dnaturation thermique de lADNLa fusion de lADN se droule pour une gamme troite detempratures. La temprature correspondant la moitie de laugmentation de labsorbance est reprsente par Tm.

Mthode Maxam et Gilbert squenage chimique (a)

Principe mthode Sanger - la raction chimique

squenage enzymatique par incorporation de dsoxyribonucliques (ddNTPs)

Mthode Sanger squenage enzymatique par incorporation de dsoxyribonucliques (ddNTPs)Sont ralises quatre ractions de polymrisation

Principe de la mthodeSanger

Mthode Sanger

Autoradiographie

Principe du squenage automatique

Diffrents types de polymresutilises en squenage automatique

Comparaison entre les ractions de squenage sans/avec marquage par un fluorophore

Squeneur ABI Prism 310

Types danalyses

Figure 1.23x Two examples of DNA technology

Figure 1.23x1 Biotechnology laboratory

Figure 1.23x2 Analyzing DNA

Secvenierea ADNr 16S o modalitate de identificare fiabilPrincipiul identificrii prin secvenierea ADNr-16SToate microorganismele posed cel puin o copie a genelor care codific pentru ARNr. Regiunea numit ADNr-16S este majoritar folosit pentru determinarea genului i speciei prin PCR

Secvenierea ADNr-16S bacterian :modalitate de identificare fiabilMetoda permite :Identificarea oricrui tip de germenSpre deosebire de tehnicile clasice, aceast metodologie nu necesit cunoaterea caracteristicilor germenilor studiai, sufucient-izolarea unei simple colonii Identificarea de germeni "stresai sau leniGraie PCR-tehnic care poate fi aplicat pe microcolonii bacteriene.Identification genului i speciei germenilor "dificili "Anumii germeni pun probleme de identificare prin tecnicile clasice (ex:Pseudomonas spp.,Legionella ). Secvenierea ADNr-16S permite depirea acestei dificulti.Identificarea de germeni "atipici"Numeroi germeni din mediu evolueaz i sunt "atipici".Tehnicile clasice nu permit identificarea, secvenierea ADNr-16S devine metoda preferat pentru analiza acestor tulpini

Studiul speciilor genului PseudomonasSecvenierea unei colonii isolat de Pseudomonas spp.Comparaie (BLAST) ntre secvena obinut cu ansamblul secvenelor ADNr-16S stocate n bancile de date

Figure 20.9 Using restriction fragment patterns to distinguish DNA from different alleles

Figure 20.10 Restriction fragment analysis by Southern blotting

Figure 20.11 Chromosome walking

Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 1)

Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 2)

Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 3)

Figure 20.12 Sequencing of DNA by the Sanger method (Layer 4)

Figure 20.13 Alternative strategies for sequencing an entire genome

Table 20.1 Genome Sizes and Numbers of Genes

Figure 20.14a DNA microarray assay for gene expression

Figure 20.14b DNA microarray assay for gene expression

*L identification des bactries par les mthodes molculaires reprsente un complment indispensable aux mthodes traditionnelles d analyse des caractristiques morphologiques et physiologiques.Parmi ces nouvelles techniques,celle base sur le squenage direct apparat comme la plus efficace : elle consiste squencer ("lire")une rgion spcifique du chromosome bactrien (appele ADNr-16S)et comparer cette squence avec les squences connues et stockes en banques de donnes.Ceci permet de dterminer avec certitude le genre et l espce de la souche tudie.

Tous les micro-organismes possdent au moins une copie des gnes codant pour les ARN ribosomaux (ARNr),molcules indispensables toute cellule pour la biosynthse des protines.Parmi ces gnes (ADNr),la rgiondite "ADNr-16S"est principalement utilise pour la dtermination du genre et de l espce :Aprs lyse des cellules d une colonie isole,l ADN bactrien extrait est purifi.La rgion "ADNr-16S"estspcifiquement amplifie par une mthode enzymatique (mthode dite de PCR ,pour "Polymerase ChainReaction").La squence de l ADN amplifi est alors lue l aide d un automate.L identification est ralise par comparaison de cette squence avec les bases de donnes des squencesconnues (plus de 3500 squences dans EMBL et GenBank).Le Principe de l identification par le squenage de l ADNr-16S