1.Generaliti.Omul s-a preocupat dintotdeauna de ameliorarea i selecionarea

acelor specii, vegetale sau animale, pe care le-a socotit a rspunde cel mai bine nevoilor sale de subzisten. Dar numai n ultimele dou decenii, odat cu formidabilul avnt al geneticii, el a reuit s obin, prin manipularea materialului genetic la nivel celular i molecular, mai nti n laborator, apoi i pe terenurile de cultur, organisme cu alte caracteristici dect cele naturale, organisme utile omului i genotipuri noi . Acestea modificate genetic. Organismele modificate genetic au aprut ca o necesitate de conservare a sursei de timp, tehnicile genetice nlocuind cu mare vitez progresele tradiionale de ameliorare a plantelor, de creare de noi soiuri, mai ales pentru situaiile n care unele caractere dorite depind numai de una sau cteva gene. Cu ajutorul tehnicilor de inginerie genetic s-a reuit prelungirea duratei pstrrii i ameliorarea calitilor organoleptice la fructele unor plante. De asemenea, tot prin tehnicile de inginerie genetic, au fost sporite n alimente nivelurile unor minerale, vitamine i antioxidani (carotenoizi, flavonoizi, vitaminele A, E, C). Antioxidanii reduc rata apariiei anumitor forme de cancer sau altor boli cronice, iar vitamina A este esenial pentru prevenirea orbirii. Organismele modificate genetic au aprut i ca o necesitate a creterii produciei de alimente. Creterea populaiei, nclzirea global i diminuarea biodiversitii vor avea un impact dramatic asupra vieii pe Terra. sunt denumite OMG, adic organisme

1

Rezolvarea acestor probleme o reprezint plantele modificate genetic, ale cror producii sunt mai bogate n vitamine, micronutrieni, proteine, minerale etc. Datorit cercetrilor de genetic molecular, a fost posibil

cunoaterea structurii de profunzime a unor gene i genomuri, fapt ce a condus la elaborarea tehnologiei ADN-ului recombinant i la transferul de gene peste barierele de specie. Tehnica recombinrii genetice n vitro include trei etape principale: 1) extragerea sau sinteza chimic a ADN-ului din diferite specii; 2) construirea unei molecule hibride (recombinate) de ADN; 3) reintroducerea moleculei recombinate de ADN ntr-o celul vie pentru reproducerea i expresia ei (fig. 1).

Fig 1. Etapele principale ale ingineriei genice.

Restrictazele reprezint instrumentul de baz al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unic de a tia molecula de ADN n anumite sectoare (loci). Prima restrictaz a fost obinut din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul cartarea lui. i se folosea pentru fragmentarea ADN-ului virusului SV-40 i

2

Nu toate restrictazele se utilizeaz n ingineria genic, ci doar acele care au urmtoarele proprieti: pot tia molecula de ADN n fragmente discrete; posed o specificitate de aciune nalt (taie molecula de ADN ntr-o anumit succesivitate - - "site"-ul de recogniie ); pot forma, n rezultatul restriciei, "margini lipicioase" la capetele fragmentului de ADN (aceast proprietate nu este caracteristic tuturor restrictazelor); pot fi izolate relativ uor n stare pur din mediul incubaional.

2.Modaliti de obinere a organismelor modificate genetic.n teorie, reeta obinerii unui OMG este ct se poate de simpl. Se ia o plant, un animal sau un microb, creia i se grefeaz una sau mai multe gene aparinnd altei plante, care ns posed acele caracteristici sau funcii pe care vrem s i le transmitem cobaiului. Lucrul este posibil deoarece, de la microbi, trecnd prin vegetale, i pn la animale, toate fiinele vii utilizeaz acelai limbaj genetic. n practic ns, un organism transgenic nu se obine chiar att de uor, i implic urmtoarele etape principale: dentificarea i pregtirea(multiplicarea) genei de interes; introducerea ei(prin diveri vectori) n celula gazd; selectarea celulelor gazd care au integrat transgena n genomul lor;

3

obinerea, n cazul organismelor pluricelulare, a unui nou organism pornind de la o singur celul transgenizat; verificarea transmiterii ereditare a caracterului codat de transgen, la descendenii organismului transgenic. Pentru un pepene, de pild, sunt necesare cel puin ase luni de munc. Iar pentru o vac sau orice alt mamifer, n funcie de ritmul de reproducere al animalului, procesul poate dura de la unu la caiva ani. Pe de alt parte, atunci cnd se introduce o gen nou ntr-un organism, aceasta se poate prinde oriunde, chiar i la nivelul unei gene care codific producerea unei proteine vitale pentru respectivul organism, ceea ce nseamn, practic, ratarea tentativei. n medie, pentru o capr, de pild, este nevoie de manipularea a 500-1000 de embrioni, pentru a putea spera c se obine o singur capr viabil, fr anomalii i totodat purttoare a caracterului dorit. Pentru muli dintre susintorii manipulrilor genetice, medicina de mine va fi cu siguran transgenic. Fructe-vaccin, bacterii-dopante, laptemedicament, toate acestea sunt posibile i chiar pe cale s se realizeze. Anumite protein umane, precum insulina (folosit la tratarea diabetului) sau EPO (care stimuleaz producerea de globule roii), sunt fabricate de pe acum de microbi. Ne putem aadar nchipui c, nu peste mult vreme, vor aprea chiar ferme specializate n creterea acelor animale modificate genetic, care, prin laptele lor, vor oferi n acelai timp i un medicament (anume sintetizat de respectivul animal). Datorit cercetrilor n tehnologia ADN-ului recombinat, au fost elaborate metode de transfer de gene n celulele procariote, care pot sintetiza multe proteine utile. Astfel, a devenit posibil producerea i chiar comercializarea pe4

scar larg a unor hormoni (insulina, somatostatina, somatotropina), a interferonului, a preparatelor de diagnosticare etc. a) Obinerea insulinei umane . Din 60 de milioane de diabetici, circa 4 milioane necesit un tratament cu insulin. S-a descoperit c insulina este secretat de celule care alctuiesc insulele Langherhans din pancreas, de unde i denumirea de insulin. n urma unor analize s-a demonstrate aciunea antidiabetic a insulinei, n prezent, pentru a obine circa 100 grame de insulin, este nevoie de 800 kg de pancreas de bou (greutatea medie a unui pancreas de bou este de 200-250 grame). Insulina uman este alcatuit din dou catene polipeptidice A i B, compuse respective din 21 i 30 de aminoacizi, a caror secven a fost stabilit n 1955 de F.Sanger. Noile tehnologii industriale de obinere a insulinei umane au fost posibile odat cu extragerea genei insulinei i crearea moleculelor recombinate de ADN n baza plasmidelor (fig.2).

5

Fig.2. Schema obtinerii insulinei umane

Moleculele recombinate de ADN sunt transferate n colibacili (Escherichia coli), unde are loc realizarea informaiei genetice codificate n molecula de ADN. Paralel cu proteinele specifice bacteriei, se sintetizeaz i insulina. Pentru a proteja insulina uman (ea nu este proprie colibacililor i este distrus de enzimele bacteriene), n molecula recombinat de ADN se ncadreaz, pe lng gena insulinei, i o gen reglatoare care codific o protein specific colibacililor (de exemplu galactozidaza). Ca rezultat al manifestrii informaiei genetice a moleculei recombinate de ADN, se obine o catena polipeptidic hibrid, din care mai apoi se separ insulina.

6

Datorit

utilizrii

tehnologiei

ADN-ului

recombinat,

se obin

aproximativ 200 grame de insulin de pe 1 m3 de mediu de cultur, adic tot atta ct se poate extrage din aproape 1600 kg de pancreas de bou sau porc. Probele clinice efectuate cu insulina uman, produs prin tehnici de inginerie genic, au demonstrat c ea nu are efecte secundare i c poate fi comercializat, adic folosit la tratarea bolnavilor de diabet.

b) Obinerea interferonilor. Interferonii sunt produi de celule specializate pentru lupta mpotriva infeciilor virale. Interferonii reprezint nite substane proteice (din 146-166 de aminoacizi) i sunt produi n cantiti infime de celula animal sau uman, cnd un virus ptrunde n organism. Exist mai multe tipuri de interferoni: interferonul leucocitar (), interferonul fibroblastelor () i interferonul limfocitelor T sau interferonul imun (). Ei pot fi obinui prin tehnici clasice (din celulele sanguine i din fibroblaste) i prin tehnici de recombinare genic. Pentru a obine interferon din celulele sanguine sau din fibroblastele cultivate, acestea sunt infectate cu un virus, iar dup 24 de ore prin centrifugare i purificare se izoleaz din mediul de cultur. Dintr-un litru de snge se poate extrage pn la 1 mkg (10-3 grame) de interferon. Celulele de E. coli nu pot transforma predecesorul interferonului n interferon activ, de aceea, iniial, complexul de ADN, format dintr-o regiune nucleotidic reglatoare i o regiune ce determin structura interferonului, este7

supus aciunii enzimelor de restricie, care taie molecula de ADN aproximativ la frontiera acestor dou catene (genei interferonului nu-i ajunge un triplet ATG). Codonul omis (ATG) este anexat prin sinteza chimic. Gena interferonului se ncadreaza n continuare ntr-un plasmid, care se transfer n E. coli. Astfel, colibacilii sintetizeaz interferonul uman. Dintr-un litru de suspensie de E. coli (circa 1011 celule) se pot extrage pn la 5 mg de interferon (adica de 5000 de ori mai mult dect din 1 litru de snge). Tehnicile de inginerie genic permit obinerea preparatelor hibride de interferon cu un spectru larg de aciune.

3. Metode de transfer genic.Transformarea prin inginerie genetic, numit i transgenez, prezint comparativ cu metodele clasice de ameliorare dou mari avantaje: ofer posibilitatea introducerii unui singur caracter la o varietate, deja evaluat ca performan i gena transferat poate proveni din orice surs, ceea ce extinde, practic, n mod nelimitat, posibilitile de ameliorare. n general putem sesiza apte etape ale procesului de transgenez: 1. Depistarea organismului donator, deci a celui care deine gena de interes, care ne ofer prin exprimare caracterul dorit de noi. Acesta poate fi o plant superioar (Arabidopsis thaliana pentru soia R.) sau o bacterie (Bacillus turingiensis pentru porumbul BT), i multe altele. 2. Se extrage ADN-ul, se identific gena.

8

3. Se reconstruiete secvena genetic activ. Cci gena respectiv nu lucreaz singur, ci cu anumite unelte, denumite promotor i terminator. Toate secvenele genetice care alctuiesc aceast construcie sunt complexe proteice specifice, aranjate dup anumite reguli bine stabilite.

a) Formarea porumbului Bt varianta I. 9

b) Transgenez schema general.

4. Noua construcie genetic este plasat apoi pe un plasmid, printr-o inserie. Plasmidele sunt extrase cel mai adesea din bacterii E. coli. n aceast nou superconstrucie pe medii speciale cu antibiotice sau erbicide gena se multiplic o data cu bacteria i plasmidul nou transferat. Plasmidul mai poart i denumirea de vector sau purttor.

10

5. Noua construcie este transferat apoi prin procedee diverse unei culturi de protoplaste, care la rndul lor sunt inserate unei culturi de Agrobacterium. 6. Acestea sunt inserate celulelor gazd care vor forma noua plant. 7. Aceasta preia caracterele induse de noile gene pe care le conserv de la o generaie la alta. Aa a aprut soia modificat genetic, rezistent la erbicidul Round-up, i tot aa a aparut porumbul Bt, a crui gen exprim toxina BT, care apra porumbul mpotriva unor duntori (Pyrausta). Odat cu dezvoltarea metodologiei de izolare i clonare a genelor, respectiv a metodelor de transfer n celulele vegetale, un numr tot mai mare de plante au fost supuse transgenezei, incluznd plantele cu o mare importan agricol ca cerealele, solanaceele i leguminoasele. Cele mai utilizate metode pentru obinerea plantelor transgenice sunt: transformarea mediat de Agrobacterium; metoda biolistic sau bombardarea cu microproiectile; transformarea protoplatilor. n urma acestor tehnici de transformare genetic s-au obinut plante modificate genetic, rezistente la atacul unor duntori ( Osterinia nubilalis, Diabrotica virgifera ), plante modificate gentic tolerante la glifosat (soia Roundup Ready), plante tolerante la sulfonil uree i imidazoline, plante modificate genetic rezistente la virusuri. Plantele modificate genetic au fost realizate pentru prima dat n China, (tutunul i castravetele rezistent la virusul mozaicului ), iar prima plant modificat11

genetic aflat n culturi comerciale n SUA a fost tomata Flavr Savr, cu procesul de coacere modificat (1994). Transgenez reprezint la ora actual principalul instrument de cercetare din biologia plantelor, dar i un instrument important din punct de vedere practic pentru ameliorarea plantelor de cultur. Pentru transferul de gene la plante sunt utilizate bacteriile

Agrobacterium tumefaciens, care provoac formarea unor tumori cancerogene (crown gall) pe tulpinile unor plante (la speciile din 93 de familii de dicotiledonate). Plasmidul Ti (tumor inducing) descoperit la A.tumefaciens cauzeaz tumori la plante prin transferul unui segment de ADN (ADN-T) din plasmid n celulele vegetale. Strategia pentru transferul genelor cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal include: introducerea segmentului de ADN-T ntr-un plasmid de E. coli; introducerea n plasmidul format a genei necesare i a genei marker (gena pentru rezistena la canamicina); introducerea tumefaciens; infecia cu A.tumefaciens a plantelor respective; selectarea plantelor transformate (fig.3). Pentru realizarea transferului de gene n celula vegetal este utilizat metoda culturilor de celule i esuturi n vitro. plasmidului recombinat n Agrobacterium

12

Se comercializeaz deja plante transgenice (transformate) de cartof, rezistente la gndacul de Colorado.

Fig.3. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal.

O realizare remarcabil n domeniul transferului de gene n celula animal o constituie oarecii transgenici. Gena hormonului de cretere de la obolan a fost transferat prin microinjecii n cele dou nuclee ale ovulului proaspt fecundat de la oarece (n fiecare nucleu cte circa 600 copii ale genei hormonului de cretere). Ovulele fecundate (170) au fost implantate n oviductul unei femelereceptor. n consecin, s-au obinut 21 de oricei. La 6 dintre ei s-a constatat o cantitate mrit a hormonului de cretere (de 100 - 800 de ori). Aceti oricei aveau o cretere mult mai rapid i prezentau greuti corporale superioare animalelor-martor.13

Pentru transferul genelor de la unele organisme la altele sunt utilizai vectorii (moleculele speciale de ADN ce transfer informaia genetic dintr-o celul n alta) reprezentai prin plasmide, virusuri, liposomi, ADN mitocondrial i ADN cloroplastic. Sistemele vectoriale, utilizate pentru transferul informaiei strine n celulele (organismele) - gazd, trebuie s corespund urmatoarelor cerine: inofensivitatea vectorului; multiplicarea rapid n celula-gazd i lipsa posibilitilor de multiplicare n celulele altor organisme; prezena unui numr restrns de situri de recogniie; prezena genelor marker pentru selectarea de clone dup moleculele recombinate de ADN; izolarea relativ uoar, clonarea i expresia n celulele (organismele) strine. n calitate de vectori, plasmidele au cptat o raspndire deosebit. Plasmidele reprezint nite molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot exista autonom i determina unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de conjugare, rezistenta la antibiotice, agresivitatea. Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie s posede un numr restrns de regiuni sensibile la aciunea enzimelor de restricie. n acest caz, se poate realiza ruperea i apoi inseria de ADN exogen n plasmid. Primul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat pSC 101, realizat de S.Cohen (1973).

14

Fig.2. Obtinerea moleculelor recombinate de ADN: A) - metoda ligazica; B) - metoda terminala.

Ca vector plasmidic, la plante se folosete plasmidul Ti (Tumour inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, care condiioneaz

formarea tumorilor pe tulpinile a numeroase specii de plante dicotiledonate.

15

A doua tehnic de introducere a unei gene ntr-o bacterie folosete ca vector un bacteriofag (fagul leambda - ), al carui genom (10-50 gene) integreaz gena strin. Ea se va sintetiza ntocmai ca i celelalte gene ale virusului, dac acesta din urm se va replica n celula bacterian. Pentru celulele eucariote animale, vectorii virali care se folosesc sunt, de regul, virusul tumoral SV-40 i virusul papiloma bovin (BPV). Se crede c vectorii virali vor putea fi utilizai i la plante. Un tip particular de vectori reprezint liposomii, picturi foarte mici de lipide produse artificial, n care pot fi incluse gene, precum i diferite medicamente, enzime etc. Genomul mitocondriilor i cloroplastelor este similar celui bacterian i, ca urmare, se crede c el va putea fi utilizat pentru transferul unor gene la organismele eucariote. Celulelor utilizate n experimentele ingineriei genice le sunt naintate o serie de cerine care au menirea de a asigura securitatea gazd trebuie s satisfac urmtoarele cerine: capacitatea sporit de implicare n investigaiile tiinifice; incapacitatea de sintez a anvelopei protectoare n afara laboratorului; capacitatea lizrii ADN-ului sau n afara laboratorului; imposibilatatea transferului informaiei ereditare altor organisme; imposibilitatea polurii mediului nconjurator n rezultatul transformrii i/sau transfeciei. investigatiilor tiinifice. Conform "Regulilor despre molecule recombinate de ADN" celulele-

16

n prezent, de rnd cu E. coli, n calitate de obiecte de studiu (celule gazd), se utilizeaz bacilul fnului (Bacillus subtilis), celulele de drojdii, culturile de celule i esuturi vegetale i animale, culturile de protoplati. Dup obinerea moleculelor recombinate de ADN, ele trebuie transferate n celulele (organismele) procariote sau eucariote pentru funcionarea lor ulterioar (replicarea i transmiterea informaiei ereditare). De menionat c, n cazul operrii cu genele organismelor eucariote, genele eucariotelor superioare, de regul, nu se manifest n celulele procariote, iar genele eucariotelor inferioare se manifest doar parial. Iat de ce, n aceste experimente se acord o deosebit atenie direciei transferului de informaie ereditar a moleculelor recombinate, adic: de la celula procariot n celulele pro- sau eucariote i invers, de la celula eucariot n eu- sau procariote. Moleculele recombinate ale procariotelor funcioneaz uor n celulele procariote (n calitate de repliconi). Sunt descrise i cazuri de funcionare a genelor procariotelor n celulele eucariotelor. Informaia ereditar strin (a moleculei recombinate), care ptrunde n celula (organismul) gazd, este protejat pe diferite ci: metilarea ADN-ului (virusurile); transferul moleculei liniare de ADN n forma circular (fagul ); blocarea sistemului de restricii al celulei-gazd (fagul T3); aciunea restrictazelor.

17

n acelai timp, celula-gazd i protejeaz informaia ereditar prin diferite mecanisme: aciunea restrictazelor specifice; metilarea ADN; aciunea vecintii epigenetice; aciunea nespecific a nucleazelor celulare; protecia mecanic prin membranele celulare; aciunea proteinelor histonice i nehistonice; aciunea interferonului. Transgeneza este unul din domeniile ingineriei genetice vegetale iar la ora actual cele mai importante strategii i probleme care se pun sunt concentrate asupra nelegerii tiinifice i dezvoltrii tehnice a unor sisteme bine puse la punct pentru transformarea a numeroase specii de plante. Procesele de diversificare i rafinament a tehnicilor de transformare pentru contravenien, eficacitate mare, genotipuri variate i caracteristici moleculare superioare vor continua cu efecte de lung durat, astfel c transferul genelor i regenerarea de plante transgenice sunt factori limitativi ai dezvoltrii i aplicrii sistemelor de transformare practic pentru multe specii de plante. Tehnologiile de transformare prezint numeroase avantaje economice, introducerea pe pia a plantelor transgenice reprezentnd noi varieti, iar comercializarea lor se impune a fi precedat de cercetare i apoi de aprobare prin stabilirea unor reguli stricte de ctre autoritile fiecrui guvern national, care trebuie s se asigure c produsele sunt inofensive, att pentru mediu, ct i pentru consumatori.

18

Orice eveniment de transformare este controlat riguros i de asemenea, trebuie neles c n orice experiment de transformare, gena de interes este transferat mpreun cu o gen marker/raportoare, n general fiind gene care pot fi urmrite uor n condiii de laborator i chiar n vitro. n legislaia din Romnia privind regimul de obinere, testare, utilizare i comercializare a organismelor modificate genetic, acestea sunt definite ca reprezentnd orice organism, cu excepia celui uman, al crui material genetic a fost modificat altfel dect prin ncruciare i/sau recombinare natural sau orice entitate biologic capabil de reproducere sau de transferare de material genetic ( definitie conform Legii nr. 214/2002). In concluzie, fr a fi ignorate implicaiile etice si sociale ale manipulrii genelor, prin tratarea acestor implicaii ntr-o manier deschis, tiinific i responsabil, se estimeaz c n viitorul apropiat biotehnologiile vor deveni pretutindeni o component de rutina a sistemelor agricole din multe tari, iar ceea ce numim revolutia genica va deveni elementul central al dezvoltrii durabile.

19

Bibliografie. 1. http://romania.indymedia.org/ro/2008/03/2464.shtml 2. http://www.referat.ro/referate/Plante_transgenice_2db2d.html 3. http://www.bercamihai.ro/images/Transgeneza%20la%20plante.pdf 4. http://www.scritube.com/biologie/INGINERIA-GENICA2251116415.php 5. http://www.usamv.ro/fisiere/file/teze-doctorat/2106.pdf 6. http://www.referat.ro/ 7. http://www.infoomg.ro/2011/05/organismele-modificate-genetic-elementulcentral-al-dezvoltarii-durabile 8.

20