Introducere

În situaţia politică şi economică actuală ne confruntăm cu creşteri necontrolate ale preţului ţiţeiului şi a altor resurse energetice naturale. Criza de energie mondială, accentuată de modificările climatice, au reprezentat un semnal de alarmă şi au generat în rândul comunităţilor ştiinţifice internaţionale dezbateri care au avut drept scop identificarea de noi tehnologii pentru obţinerea biocombustibililor pe cale naturală.

Energia din biomasă poate fi extrasă prin incinerare directă (în special biomasa forestieră), însă nu orice fel de biomasă este combustibilă. Biomasa proaspăt recoltată are un grad de umiditate ridicat și calități de combustie foarte scăzute. Astfel de biomasă poate fi fermentată, obținându-se produși de fermentație combustibili (etanol, metan), care se mai numesc și biocombustibili, datorită provenienței lor. Printre avantajele conversiei biomasei la biocombustibili se numără faptul că spre deosebire de incinerare, în urma cărui proces se poate obține doar energie termică și/sau electrică (care se poate stoca foarte greu până la momentul utilizării), biocombustibilii se pot stoca, teoretic, timp nelimitat și pot fi utilizați în echipamente variate, atât în transporturi, cât și pentru producerea de energie termică sau electrică, sau ca materii prime în industria chimică (biorafinărie).

În prezent, în lume, numeroși cercetători au activităţi de cercetare – dezvoltare în domeniul folosirii biomasei microbiene, vegetale şi animale pentru a produce energie. Ei au demonstrat că din biomasă se pot obţine biocombustibili. Nu din biomasă valoroasă (care poate servi ca furaje sau alimente), ci din biomasă nevaloroasă, subproduse din agricultură sau industrie, dejecţii sau deşeuri, care constituie o povară pentru mediul înconjurător. În acest mod, astfel de tehnologii nu numai că produc biocombustibili, care pot înlocui combustibilii fosili, ci protejează şi mediul, dar mai mult, nu concurează consumatorul uman în ceea ce priveşte materiile prime. Din aceste cauze se promovează cercetările în ceea ce priveşte obţinerea de biocombustibili din biomasă lignocelulozică (paie, coceni, plante nefurajere şi nealimentare etc) sau din dejecţii şi deşeuri (gunoi de grajd, ape uzate, gunoaie orăşeneşti, deşeuri industriale etc). Aceşti biocombustibili au fost denumiţi biocombustibili de generaţia a doua.

În cadrul cercetărilor doctorale am abordat biotehnologia obţinerii biocombustibililor din biomasă lignocelulozică (BLC). Ca sursă de BLC am folosit culturi energetice ca Miscanthus giganteus sau Sorghum bicolor, care conțin substanțe direct fermentescibile, sau care conțin biopolimeri (celuloză) ce pot fi hidrolizați la molecule mai simple (glucoză), direct fermentescibile cu ajutorul diferitelor microorganisme la etanol sau metan. Obiectivul central al cercetărilor constă în aplicarea integrată a diferitelor biotehnologii, în scopul obținerii de biocombustibili de generația a doua din biomasă lignocelulozică.

1

Cap.1. Biomasa lignocelulozică – materie primă pentru producerea de enzime celulozolitice şi zaharuri fermentescibile

Mare parte din biocombustibilii produşi în ziua de azi provin din culturi alimentare sau furajere, care ridică o serie de probleme, cum ar fi periclitarea securităţii alimentare. Biocombustibilii de generaţia a II-a, lignocelulozici, ar putea evita astfel de probleme. Biomasa lignocelulozică poate fi obţinută prin cultivarea plantelor energetice pe terenuri de slabă calitate, sau pe substrat poluat, impropriu pentru cultivarea plantelor alimentare. O plantă capabilă să utilizeze astfel de substraturi și să furnizeze o cantitate ridicată de biomasă este Miscanthus giganteus.

În România, sute de mii de hectare nu sunt cultivate sau sunt poluate şi nu se pretează pentru culturi convenţionale. Aceste terenuri pot fi folosite pentru a cultiva acest tip de plante energetice, ca materie primă pentru producerea de combustibili.

Biomasa lignocelulozică agricolă se pretează mai bine la procesul biotehnologic de zaharificare decât biomasa lemnoasă, datorită structurii mai moi, conţinutului scăzut de lignină şi cristalinităţii scăzute a celulozei. Glucoza şi xiloza sunt principalele monozaharide eliberate prin hidroliza biomasei lignocelulozice. Aceste monozaharide pot fi fermentate la etanol, metan, sau alți biocompuși cu ajutorul microorganismelor (Lange 2007, Lynd 1996).

Hidroliza lignocelulozei la glucide fermentescibile pare a fi principala etapă din procesul de conversie al biomasei, care ridică costul de producție al etanolului lignocelulozic. Datele din literatură indică faptul că, costul celulazelor reprezintă aproximativ 20% din costul total de producţie al etanolului lignocelulozic (Wingrem 2003, Sassner 2007). Din această cauză, eforturile majore se îndreaptă spre reducerea costurilor legate de enzimele necesare hidrolizei biomasei.

Una dintre variantele mai fezabile, din punct de vedere economic, a folosirii enzimelor celulozolitice pentru hidroliza biomasei lignocelulozice este folosirea întregului mediu de fermentaţie, brut, obținut din culturi de fungi celulozolitici, fără a mai aplica procese de separare, concentrare sau altele, care ridică costul de producție al celulazelor.

Studiile arată că, spre deosebire de procedeul clasic, în care celulazele purificate și stabilizate sunt achiziționate de la un producător la prețuri ridicate, producerea celulazelor in–situ (ca etapă distinctă în procesul de producție al etanolului lignocelulozic) poate reduce cu mult costurile, care ar putea ajunge la aproximativ 8% din totalul costurilor de producere a bioetanolului (Sanchez 2007, Merino 2007, Barta 2010).

2

Figura.1.1. Procesul de producere a bioetanolului cu etapa de producere de celulazelor (Vintilă T., 2013)

La nivel industrial, cele mai folosite microorganisme pentru producerea enzimelor celulozolitice sunt Trichoderma şi Aspergillus. Parte din biomasa care este folosită pentru producerea de etanol, poate fi folosită pentru producerea de celulaze, utilizate în hidroliza enzimatică in–situ. În acest context, studierea parametrilor de fermentaţie, pentru a obţine o producţie cât mai mare de celulaze, este un pas esenţial în dezvoltarea unui sistem industrial de producere a celulazelor.

Pentru a putea evalua posibilitatea de a produce celulaze in-situ, au fost derulate o serie de experimente în care au fost studiaţi parametrii de fermentaţie în bioprocese unde s-a folosit Miscanthus giganteus ca substrat pentru producerea de enzime celulozolitice.

1.1. Stabilirea parametrilor de biosinteză a celulazelor fungice având ca substrat biomasă de Miscanthus giganteus

1.1.1. Materiale și metode

În prima etapă a cercetărilor am studiat parametrii optimi de bioproces necesari pentru producerea enzimelor celulozolitice, cu ajutorul tulpinii Trichoderma longibrachiatum CMIT36, din colecția de microorganisme industriale a universității.

Parametrii studiaţi, pentru culturile în mediu lichid sunt:1. Concentraţia substratului, 0,5 – 4%.2. Concentraţia inoculului, suspensii de spori cu densităţi optice între 0,33 şi 0,96.3. Viteza de agitare, 120 – 180rpm.4. pH, 4 – 6.5. Umiditatea, între 60 şi 80%, pentru culturile în mediu solid.

Pentru prepararea inocului au fost utilizate culturi sporulate în plăci cu mediu PDA. Suspensile de spori a fost obţinută prin spălarea culturii cu mediu Mandels și raclare gentilă, folosind anse de însămânţare de unică folosinţă. Suspensia a fost diluată corespunzător şi folosită ca inocul.

3

Mediul Mandels are următoarea compoziție: KH2PO4 0.2%, (NH4)2SO4 0.14%, MgSO4

x 7H2O 0.03%, CaCl2 x 2H2O 0.04%, uree 0.03%, peptonă 0.03%, tween 80 0.05%, FeSO4 x 7 H2O sol. 5 mg % 1 ml, ZnSO4 x 7 H2O sol. 1.4 mg % 1ml, MnSO4 x 7 H2O sol 1.56 mg % 1 ml, CoCl2 sol 2 mg % 1 ml. Sterilizarea se face la 121°C timp de 20 minute.

Pretratarea biomaseiBiomasa măcinată a fost introdusă în pahare Erlenmeyer, umectată cu soluţie NaOH

2%, în proporţie de 6:1 lichid – solid, şi autoclavată la 120°C timp de 30 minute. Biomasa astfel pretratată a fost ulterior spălată şi neutralizată pâna la un pH de 5 – 5,5. Volumul de apă folosit pentru spălare este de aproximativ 12 ori mai mare decât cantitatea iniţială de biomasă.

Producerea celulazelor în sistem submers (SLC)În flacoane Erlenmeyer de 300 ml s-au introdus 50 ml mediu Mandels şi 2% biomasă

măcinată de Miscanthus, ca sursă de carbon şi substrat pentru producerea de celulaze. Acest amestec a fost inoculat cu 10% suspensie de spori. Ca probă martor s-a folosit mediu Mandels cu celuloză Avicel PH101, ca sursă de carbon şi substrat pentru obţinerea de celulaze. Mediile inoculate au fost incubate într-un incubator cu agitare. În timpul fermentării s-au prelevat probe pentru a determina activitatea enzimatică, prin metodele FPU şi CMC.

Producerea de celulaze prin fermentaţie în substrat solid (SSC)Substratul celulozic, biomasa de miscantus pretratat, a fost introdus în flacoane

Erlenmeyer de 300 ml, în straturi de 1cm grosime(50 ml sau 13 g). Flacoanele au fost autoclavate la 121°C timp de 30 minute, pentru a asigura sterilitatea mediului de fermentaţie. Mediul Mandels a fost adăugat în mod aseptic peste biomasa sterilă şi s-a făcut inocularea cu suspensie de spori. În cazul fermentaţiei în substrat solid singurul parametru de bioproces studiat este umiditatea, ceilalţi parametrii au fost studiaţi anterior de către echipa noastră (Vintilă, 2009).

Metode de analizăMetoda FPU se aplică pentru determinarea cantitivă a celulazelor folosind ca substrat

hârtia de filtru. Într-o eprubetă se pipetează 1ml tampon citrat 0,05M, pH 4,8. Se adaugă 0,5ml enzimă (diluată în tampon citrat). Se recomandă folosirea mai multor diluţii, pentru o acuratețe mai bună a rezultatelor. Se încălzeşte la 50°C, se adaugă fâșii de hârtie de filtru Whatman No.1 (1x6 cm). Se incubează 60 min la 50°C. Se adaugă 3 ml DNS (acid dinitrosalicilic) şi se agită. Eprubetele se introduc într-o baie de apă la fierbere 5 minute. Se adaugă 20ml apă distilată şi se omogenizează. După 20 minute, soluția din eprubete se transferă în cuve de spectrofotometru și se măsoară absorbanța la 540nm.

Calculul activității enzimatice se face după următorii pași. Se construiește o curbă de etalonare cu o soluție stoc de glucoză (2 mg / ml glucoză anhidră), în 5 diluții diferite:

1 ml +0.5 ml tampon citrat = 1:1,5 = 6,7 mg / ml (3,35 mg / 0,5 ml)1 ml +1.0 ml tampon citrat = 1:2 = 5 mg / ml (2,5 mg / 0,5 ml)1 ml +2.0 ml tampon citrat = 1:3 = 3,3 mg / ml (1,65 mg / 0,5 ml)1 ml +4.0 ml tampon citrat = 1:4 = 2 mg / ml (1 mg / 0,5 ml)

Se construiește curba de etalonare folosind cantitățile absolute de glucoză (mg / 0,5

ml) raportate la A540.

4

Cu ajutorul acestei curbe se transformă absorbanța obținută în eprubetele cu reacție enzimatică în glucoză.

Se transformă diluțiile folosite în concentrație enzimatică. După care se aplică formula de calcul

FPU = mg glucoză eliberată x 0,185. unde,

1 mg glucoză = 1 / 0,18 x 0,5 x 60 micromoli-1 ml-1 substrat hidrolizat = 0,185 unități ml -1.

O unitate internațională (UI) de enzimă este definită ca și cantitatea de enzimă ce eliberează 1 micromol de glucide reducătoare / minut, în condițiile de reacție standard.

Metoda CMC se aplică pentru determinarea activității endoglucanazice a enzimelor. Substratul folosit este carboximetil celuloză CMC 7L2 în tampon citrat 0,05M, pH 4,8.

Într-o eprubetă se pipetează 0,5ml enzimă, diluată în tampon citrat. Se recomandă folosirea mai multor diluţii. Se încălzeşte la 50°C. Se adaugă 0,5ml soluţie substrat (CMC în tampon citrat), se amestecă bine şi se incubează timp de 30 minute la 50°C. Eprubetele se introduc într-o baie de apă la fierbere 5 minute. Se adaugă 20ml apă distilată şi se omogenizează. După 20 minute, soluția din eprubete se transferă în cuve de spectrofotometru și se măsoară absorbanța la 540nm.

Calculul activității enzimatice se face după următorii pași. Se construiește o curbă de etalonare cu o soluție stoc de glucoză (2 mg/ml), în 5 diluții diferite:

Nediluat = 2 mg/ml (1 mg/ 0,5 ml)1 ml +0.5 ml tampon citrat = 1:1,5 = 1,33 mg/ml (0,67 mg/ 0,5 ml)1 ml + 1 ml tampon citrat = 1:2 = 1,0 mg/ml (0,5 mg/ 0,5 ml)1 ml + 2 ml tampon citrat = 1:3 = 3,3 mg/ml (1,65 mg/ 0,5 ml)1 ml + 3 ml tampon citrat = 1:4 = 0,5 mg/ml (0,25mg/0,5 ml)

Se construiește curba de etalonare folosind cantitățile absolute de glucoză (mg / 0,5

ml) raportate la A540.

Cu ajutorul acestei curbe se transformă absorbanța obținută în eprubetele cu reacție enzimatică în glucoză.

Se transformă diluțiile folosite în concentrație enzimatică. După care se aplică formula de calcul

CMC = mg glucoză eliberată x 0,37unde,

1 mg glucoză = 1 / 0,18 x 0,5 x 30 micromoli-1 ml-1 substrat hidrolizat = 0,37 unități ml -1.

Tamponul citrat 0,05M are următoarea compoziţie, pentru 100ml: 20,5ml soluţie acid citric 0,1M; 29,5 soluţie citrat de sodiu 0,1M; 50ml apă distilată. Pentru a-l aduce la un pH de 4,8 se adaugă, fie citrat de sodiu, fie acid citric, în funcţie de pHul iniţial.

1.1.2. Rezultate și discuții

În ceea ce privește biosinteza enzimelor celulozolitice în sistem SLC rezultatele obținute arată că concentrația de substrat are o influenţă directă asupra producerii de enzime de către tulpina T. longi. Cea mai bună activitate enzimatică, exprimată în FPU, s-a obţinut în

5

mediul de cultură conținând 4% biomasă, ca substrat celulozic (fig.1.2). Concentraţia de substrat nu a putut fi crescută mai mult de 4% pentru a evita creşterea vâscozității mediului de cultură.

Fig.1.2. Cinetica activității enzimatice a tulpinii T.longi cultivată în sistem SLC în medii cu diferite concentrații de substrat

Raportul de inoculare este un paramentru important care are un efect direct asupra procesului de producere a celulazelor de către fungi din genul Trichoderma. În cazul tulpinii T. longibrachiatum CMIT36 un raport de inoculare de 5%, cu o suspensie de spori cu densitatea optică de 0,5, este cel potrivit pentru inițierea unui bioproces cu productivitae ridicată de enzime celulozolitice. (fig.1.3).

6

Fig.1.3. Cinetica activității enzimatice a tulpinii T.longi cultivată în sistem SLC în medii cu diferite concentraţii ale inoculului

Fungi din genul Tricoderma sunt organisme producătoare de micelii,aerobe, astfel, concentraţia de oxigen dizolvat în mediul de cultură poate avea un impact direct asupra cineticii producerii de enzime. În cazul fermentațiilor de laborator, în flacoane de sticlă, concentraţia poate fi sporită prin creşterea vitezei de agitare. Însă, aceste microorganisme au tendinţa să se adune şi să formeze aglomerări, la turbulenţe mari a mediului de cultură. Acest fenomen reduce suprafaţa de contact dintre hife, nutrienţi şi oxigen, scăzându-le astfel productivitatea. Aeraţia este influenţată şi de cantitatea de miceliu din cultură. Luând aceşti factori în considerare am studiat productivitatea fungilor la diferite viteze de agitare împreună cu două rate de inoculare diferite. După cum se poate vedea în fig.1.4., rezultatele cele mai bune s-au obţinut la o rată de inoculare de 5% şi o viteză de agitare de 180 rpm.

7

Fig.1.4. Efectele vitezei de agitare şi a ratei de inoculare asupra cineticii producerii enzimelor

În ceea ce orivelte efectul pH-ului mediului de cultură asupra producerii de enzime celulozolitice, rezultatele din figura 1.5. indică faptul cp la pH 5,5, tulpina testată are acticitatea celulozolitică maximă.

Fig.1.5.Efectele pHului mediului de cultură asupra cineticii producerii enzimelor

8

În ceea ce priveşte culturile în substrat solid, datele din fig.1.6. arată activitatea enzimatică celulozolitică detectată per gram de substrat cultivat cu T. Longibrahiatum CMIT36.

Figura 1.6. Efectul umidității asupra producerii de enzime celulozolitice din culturi fungice, în substrat solid

Cinetica producerii enzimelor arată că producţia de endoglucanaze este mai mare în culturile în substrat solid constând din miscantus umectat cu suspensie de spori cu o umiditate de 60%. De asemenea, datele arată că, cantitatea cea mai mare de endoglucanaze este produsă în prima parte a procesului de incubare. Se observă că, în cazul procesului desfăşurat în condiţiile descrise mai sus, T. longibrahiatum produce un titru mai mare de endoglucanaze decât de celulaze. În ambele cazuri, o umiditate de 60% a mediului solid duce la cea mai mare activitate enzimatică. Cea mai mare concentraţie de celulaze, 2FPU/g substrat, a fost obţinută prin incubarea acestei tulpini timp de 10 zile în sistem SSC.

O comparaţie a titrului de enzime produs în sistem SSC și SLC, folosind miscantus ca substrat, arată că în sistem SSC se obține un titru mai mare de enzime decât în sistemelele SLC, dar, după extracţia enzimelor din substratul solid cu lichid de spălare, concentraţia acestora în lichidul de spălare este comparabilă cu concentrația enzimelor din mediul lichid obținut în sistem SLC.

1.2. Evaluarea capacității de hidroliză a biomasei cu ajutorul celulazelor

1.2.1. Materiale şi metode

Ca substrat pentru cultivarea fungilor celulozolitici şi producerea de enzime am folosit biomasă lignocelulozică provenită din întreaga plantă Miscanthus sinesis giganteus. Acest hibrid triploid, steril a fost cultivat în zona Copşa Mică, Sibiu, o zonă poluată chimic, cu pământ bogat în cadmiu şi plumb. Concentraţia de metale grele din partea aeriană a plantei a fost raportată anterior (Pavel, 2009, Barbu, 2009).

9

Tabelul.1.1. Carcateristicile principale ale pământului poluat, folosit pentru cultivarea miscantusului (Pavel, 2009)

Adâncime (cm)

pH P2O5

mg/kgK2O

mg/kgPb

mg/kgCd

mg/kg0-20 5,2 110 460 682,5 13,4720-40 5,3 73 361 492,5 10,2340-60 6,2 88 301 67,5 4,67

Tabelul.1.2. Concentraţia de metale grele în diferite părti ale plantei(Pavel, 2009, Barbu, 2009)

Sectiunea plantei Pb mg/kg Cd mg/kgFrunze 6,48 3,73Tulpină 5,03 2,98Rizom 483,3 7,54

Compziţia biomasei, folosită ca materie primă, este detaliată în tabelul 1.3. Aceste valori au fost prezentate în studii anterioare.

Tabelul.1.3. Compoziţia biomasei (Vintilă, 2010)Tipul de biomasă

Celuloză (%) Hemiceluloză (%)

Lignină (%) Proteină brută (%)

Cenuşă (%)

Paie de grâu 37,6 28,8 15,8 3,7 6,1Coceni de porumb

37,5 26,4 18,5 4,8 6,0

Miscanthus 43,5 25,8 15,4 3,5 2,4

Biomasa a fost uscată în aer liber şi măcinată cu o moară cu ciocane, la dimensiunea teoretică de 2 mm. Ca celuloză standard am folosit Avicel PH101.

Microorganisme şi propagareSporii micotici sunt păstraţi în Colecţia de Microorganisme Industriale din Timişoara

(CMIT), aparţinând Facultăţii de Zootehnie şi Biotehnologii, prin criogenare la -70°C în soluţie de glicerol 16%, ca agent crioprotector. Microorganismele folosite sunt:

a.) Trichoderma longibrachiatum CMIT36, obţinută de la D.S.M.Z. Germany, unde este păstrată ca T. longibrachiatum DSM 769 (altă denumire: T. reesei ATCC26921, numită iniţial T. reesei Simons), este un mutant al T. viride Persoon, sau QM 9123 (ATCC24449), cunoscut şi ca QM 9124.

b.) Trichoderma viride ATCC- 13.631;c.) Trichoderma viride CMGB1, obţinută de la Universitatea din Bucureşti, Facultatea de

Biologie;d.) Aspergillus niger CMIT3.8, izolat din rumeguş de pin mucegăit;e.) Aspergillus oryzae CMIT3.12, obţinută de la Universitatea din Bucureşti, Facultatea

de BiologiePlăci cu mediu agarizat PDA au fost inoculate cu suspensii de spori şi au fost incubate

timp de 5 zile la 30°C.

10

Evaluarea activităţii enzimatice a celulazelorAu fost evaluate activităţiile câtorva enzime celulozolitice comerciale şi a enzimelor

produse in-situ. Biomasa hidrolizată a fost miscanthus, paie de grâu şi coceni de porumb. Toate cele trei tipuri de biomasă au fost pretratate conform procedurii amintite anterior, în subcapitolul 1.1. Enzimele comerciale sunt provenite de la Novozyme şi sunt notate astfel: 22086, 22119, 22118, 22083. Cantitatea folosită este cea recomandată de producător.

Hidroliza s-a făcut în condiţii sterile la temperatura de 50°C timp de 60 de ore, la o valoare a pHului de 5. Probe au fost recoltate la fiecare 12 ore pentru a putea determina valoarea glucidelor reducătoare prin metoda DNS. Scopul este de a compara producţia de glucide care se poate obţine din biomasă pretratată şi hidrolizată provenită din miscanthus (mai puţin studiat) cu producţii obţinute la plante mai studiate, paie şi coceni.

Metode de analizăS-au folosit două metode de determinare (Chose, 1987, Sohail, 2009) folosind ca

substrat CMC pentru endoglucanaze şi hârtie de filtru pentru celulazele de zaharificare. Metoda FPU determină activitatea celulazelor prin intermediul hârtiei de filtru. Într-o

eprubetă se pipetează 1ml tampon citrat 0,05M, pH 4,8. Se adaugă 0,5ml enzimă (diluată în tampon citrat). Se recomandă folosirea mai multor diluţii, pentru o exactitate mai mare a rezultatelor. Se încălzeşte la 50°C, se adaugă hârtia de filtru Whatman No.1 (1x6 cm). Se incubează 60 min la 50°C. Se adaugă 3 ml DNS (acid dinitrosalicilic) şi se agită. Se fierbe eprubeta exact 5 minute. Se adaugă 20ml apă distilată şi se omogenizează. După 20 de minute soluţia din eprubetă se măsoară la 540nm cu spectrofotometru.

Metoda CMC determină activitatea carboximetil celulatelazelor pentru endoglucanaze. Substratul folosit este carboximetil celuloză CMC 7L2 în tampon citrat 0,05M, pH 4,8.

Într-o eprubetă se pipetează 0,5ml enzimă, diluată în tampon citrat. Se recomandă folosirea mai multor diluţii. Se încălzeşte la 50°C. Se adaugă 0,5ml soluţie substrat, se amestecă bine şi se incubează timp de 30 minute la temperatura dată. Se fierbe eprubeta timp de 5 minute după care se adaugă 20 ml apă distilată, se omogenizează şi se lasă la răcit. Soluţia se măsoară cu spectrofotometru la 540nm.

Tamponul citrat 0,05M are următoarea compoziţie, pentru 100ml: 20,5ml soluţie acid citric 0,1M; 29,5 soluţie citrat de sodiu 0,1M; 50ml apă distilată. Pentru a-l aduce la un pH de 4,8 se adaugă, fie citrat de sodiu, fie acid citric, în funcţie de pHul iniţial.

Cantitatea de glucide reducătoare a fost determinată prin metoda DNS. O unitate internaţională (UI) de enzimă este definită ca şi cantitatea de enzimă ce eliberează 1µmol de glucide reducătoare/ minut, în condiţii standard.

Metoda DNS determină cantitatea de glucide simple din mediul de hidroliză. Într-o eprubetă se pipetează 0,5ml probă de determinat, se adaugă 1ml DNS şi se agită. Se fierbe timp de 5 minute după care se aduce la 10ml cu apă distilată, se adaugă 8,5 ml. Soluţia este măsurată la spectrofotometru la 540nm. Denstităţiile optice astfel citite se transformă în mg glucide/ ml mediu cu ajutorul unei curbe de etalonare în 6 puncte între 0 – 1000 micrograme/ml.

11

1.2.2. Rezultate şi discuţii

În prima parte a experimentului am studiat capacitatea fungilor de a produce celulaze prin fermentaţie în mediu lichid. S-a determinat activitatea enzimatică prin metodata CMC, FPU. Activitatea celulazelor este exprimată diferit, în funcţie de substratul folosit. Pentru metoda FPU activitatea este exprimată în unităţi de hârtie de filtru aceasta denotă activitatea celulazelor de zaharificare. Dacă CMC (carboxymetilceluloză) este substratul, activitatea este exprimată în endoglucanaze.

Activitatea enzimatică determinată prin metoda CMC este redată în tabelul 1.4. şi figura 1.6. Datele arată că tulpinile T. longibrachiatum, cocultura T. longibrachiatum şi A. niger, şi cocultura T. viride ATCC şi A. niger au cea mai mare activitate. Cât despre substrat se observă că biomasa lignocelulozică agricolă, ce nu presupune costuri foarte ridicate, poate servi pentru producţia de enzime la nivel înalt. Cantitatea de enzime produsă este mai mare în mediile de fermentaţie unde s-a folosit Miscanthus giganteus ca substrat decât în mediile unde s-a folosit celuloză pură, scumpă, pentru a induce biosinteza enzimelor celulozolitice. Ba chiar mai mult, coculturile de Trichoderma longibrachiatum şi Aspergillus niger au produs endoglucanaze doar în mediile cu Miscanthus giganteus ca substrat, nu şi în cele unde s-a folosit celuloză pură.

Tabelul.1.4.Activitea enzimatică (endoglucanaze) a fungilor testaţiCod CMC,

Ziua 2CMC, Ziua 4

CMC, Ziua 6

CMC, Ziua 8

CMC, Ziua 10

T.longibrahiatum + Miscanthus 1 0 1,52 2,80 2,87 2,87T.longibrahiatum + Avicel 2 0 0,56 2,25 2,51 2,69

T.longibrahiatum + A.oryzae + Mischantus

3 0 0 0,09 0,16 0,31

T.longibrahiatum + A.oryzae + Avicel

4 0 0 0 0 0,16

T.longibrahiatum + A.niger + Mischantus

5 1,15 2,47 2,32 2,29 2,29

T.longibrahiatum + A.niger + Avicel 6 0 0 0 0 0,05T. viride ATCC + Miscanthus 7 0 0 0 0 0,20T. viride ATCC + A.oryzae +

Miscanthus8 0 0 0 0 0,01

T. viride ATCC + A. niger + Miscanthus

9 1,00 3,13 2,36 2,36 2,36

T.viride CMGB + Mischantus 10 0,38 1,63 1,33 1,33 1,33T.viride CMGB + A.oryzae +

Mischantus11 0,27 1,48 1,22 1,22 1,22

T.viride CMGB + A.niger + Mischantus

12 0 1,15 1,15 1,19 1,19

A.oryzae + Miscanthus 13 0 0,60 2,51 1,04 0,82A.niger + Miscanthus 14 1,26 2,87 1,59 1,48 1,48

12

Fig.1.7. Activitatea endoglucanazică a fungilor testate (unităţi/ml lichid de cultură)

Tabelul.1.5. Activitatea FPU a fungilor testaţi (valorile reprezintă FPU/ml mediu de cultură)Cod FPU,

Ziua 2FPU, Ziua 4

FPU, Ziua 6

FPU, Ziua 8

FPU, Ziua 10

T.longibrahiatum + Miscanthus 1 0 0,01 0,67 0,78 0,82T.longibrahiatum + Avicel 2 0 0 1,30 2,14 3,35

T.longibrahiatum + A.oryzae + Mischantus

3 0 0 0,01 0,06 0,09

T.longibrahiatum + A.oryzae + Avicel

4 0 0 0 0 0

T.longibrahiatum + A.niger + Mischantus

5 0,27 0,56 0,56 0,78 0,78

T.longibrahiatum + A.niger + Avicel 6 0 0 0 0 0T. viride ATCC + Miscanthus 7 0 0 0 0 0,09T. viride ATCC + A.oryzae +

Miscanthus8 0 0 0 0 0

T. viride ATCC + A. niger + Miscanthus

9 0,49 0,56 0,56 0,75 0,78

T.viride CMGB + Mischantus 10 0 0 0 0,01 0,01T.viride CMGB + A.oryzae +

Mischantus11 0 0 0 0 0,01

T.viride CMGB + A.niger + Mischantus

12 0 0 0 0 0,01

A.oryzae + Miscanthus 13 0 0 0 0 0A.niger + Miscanthus 14 0 0,53 0,56 0,60 0,75

13

Fig.1.8. Activitatea FPU a fungilor testate (FPU/ml lichid de cultură)

Datele din fig.1.8. reprezintă activitatea FPU a tulpinilor testate. Rezultatele arată că tulpinile cu activitatea endoglucanazică cea mai ridicată prezintă, de asemenea, şi productivitatea cea mai mare de celulaze. Pe lângă variantele experimentale amintite mai sus, şi varianta cu Aspergillus niger cultivat pe Miscanthus giganteus ca substrat, poate fi trecută în grupa celor cu un bioproces cu randament ridicat.

Pentru a evalua productivitatea celulazelor, culturile lichide cu cea mai mare activitate enzimatică şi enzimele celulozolitice comerciale au fost folosite pentru a hidroliza cele trei tipuri de biomasă: miscanthus, coceni de porumb şi paie de grâu.

În urma hidrolizei s-a constant că celulazele produse in-situ, cu ajutorul fungilor, pot produce mai multe glucide fermentescibile decât unele din enzimele comerciale. Tabelul şi graficul de mai jos evidenţiează acest lucru.

Tabelul.1.6. Producţia de glucide după hidroliza biomaseiNr. Probă Glucidele produse mg/ml

12 ore 24 ore 36 ore 42 ore 60 ore1 Misc. + enz 1 5,38 7,77 8,97 9,92 10,162 Misc + enz 2 4,43 7,29 8,97 8,97 8,973 Misc + enz 9 3,71 6,82 6,34 6,10 6,104 Misc + enz 14 3,71 4,90 5,62 5,62 5,625 Misc + 22086 8,49 15,66 16,13 17,09 17,096 Misc + 22119 2,28 2,75 3,23 3,7 3,717 Misc + 22118 2,28 2,75 2,99 3,23 2,478 Paie + 22086 2,99 8,49 12,31 15,18 15,189 Paie + 22119 6,10 2,28 2,75 2,75 2,75

14

10 Paie + 22118 2,75 2,75 2,99 3,23 3,7111 Paie + enz 2 3,71 7,05 9,44 13,27 13,2712 Paie + enz 5 3,71 4,90 8,49 8,49 8,4913 Paie + 22119 +

220837,77 15,42 15,66 15,66 15,66

14 Coceni + 22086 6,82 14,70 15,66 17,09 17,0915 Coceni + 22119 2,51 5,99 3,23 3,71 3,7116 Coceni + 22118 3,23 3,23 3,71 3,71 3,7117 Coceni + 22119 +

2208310,64 10,88 11,36 15,66 18,5

Misc. +

enz 1

Misc +

enz 2

Misc +

enz 9

Misc +

enz 1

4

Misc +

22086

Misc +

22119

Misc +

22118

Paie +

22086

Paie +

22119

Paie +

22118

Paie +

enz 2

Paie +

enz 5

Paie +

22119 + 22083

Coceni +

22086

Coceni +

22119

Coceni +

22118

Coceni +

22119 + 22083

02468

101214161820

12 h36 h

60 h

12 h24 h36 h 48 h 60 h

Fig.1.9. Hidroliza enzimatică a biomasei lignocelulozice agricole

1.3Concluzii.

Datele ne sugerează că biomasa lignocelulozică, Miscanthus sinesis giganteus, întreaga plantă, cultivată pe terenuri poluate, poate fi folosită ca substrat pentru creşterea fungilor celulozolitici şi pentru a induce producţia de celulaze în speciile Trichoderma şi Aspergillus.

Mai mult, o tulpină foarte productivă, Trichoderma longibrahiatum CMIT36, a fost selectată pentru a se putea stabili un set de valori pentru parametrii bioprocesului, astfel încât să se obţină o concentraţie cât mai mare de celulaze în mediu de cultură.

Comparând cinetica enzimelor în mediu de cultură lichid şi solid, au fost stabiliţi parametrii optimi pentru a produce enzime celulozolitice (concentraţia substratului, concentraţia inoculului, pHul, viteza de agitare, durata de cultivare, şi umiditatea).

Există o gamă largă de celulaze disponibile în comerţ care pot fi folosite în procesul de hidroliză enzimatică. Preţul, activitatea enzimatică, stabilitatea şi disponibilitatea sunt cei mai

15

importanţi factori care trebuie luaţi în considerare în selecţia preparatelor celulozolitice care se vor folosi la scală mare pentru hidroliza lignocelulozei.

Au fost descoperite diferenţe mari în cantitatea de glucide obţinute, folosind diferite celulaze. Iar datele ne lasă să concluzionăm că enzimele produse in-situ pot fi integrate în procesul unei biorafinării.

Productivitatea enzimelor obţinute în aceste fermentaţii, împreună cu alte considerente, precum costul scăzut şi disponibilitatea largă, recomanda Miscanthus s. giganteus ca substrat ideal pentru biosinteza celulazelor cu ajutorul fungilor.

16

Cap.2. Conservarea biomasei prin însilozare

Datorită conţinutului ridicat în zaharuri, după recoltare sorgul este atacat rapid de către microorganisme, care consumă glucidele și eliberează produse de fermentație (acizi organici, alcooli, CO2 etc). Pentru a evita pierderea glucidelor, după recoltare, au fost dezvoltate o serie de metode de conservare a biomasei.

Una dintre aceste metode este extragerea sucului dulce din plante, iar resturile, rămase în urma stoarcerii, sunt fie uscate, fie însilozate în prezenţa bacterilor lactice. Altă metodă este însilozarea materialului proaspăt, în prezenţa acidului formic sau propionic (Rohowsky, 2011, Mills, 2002) sau cu ajutorul enzimelor (Schmidt, 1997).

Dacă materialul este destinat producerii de biogaz, cea mai bună metodă de însilozare este cea prin fermentaţie lactică. Studiile arată că producerea biogazului din biomasă însilozată se face cu un randament mai mare decât din biomasă proaspătă (Weiland 2010, Herrman, 2011). Folosirea aditivilor conținând bacterii lactice la însilozare influenţează procesul de metanogeneză, dependent de compoziţia chimică a materialului organic folosit (Amon, 2007).

În vederea obţinerii de bioetanol, nu este recomandată însilozarea cu bacterii lactice, pentru că fermentaţia lactică va consuma o mare parte din glucidele din biomasă, astfel că acestea nu vor mai fi disponibile pentru fermentația alcoolică. Ca aditiv pentru conservarea biomsei se poate folosi acoolul etilic. Etanolul, produs în urma procesării sorgului, poate fi folosit pentru a conserva biomasa până la momentul procesării. Acesta poate fi recuperat în timpul procesării, deci, doar o mică parte din produsul finit va fi consumată de-a lungul unui ciclu complet de producere a bioetanolului.

Pentru a putea observa mai bine efectele acestor aditivi de însilozare asupra biomasei au fost efectuate o serie de experimente cu silozuri din sorg zaharat, bagasă, şi amestecuri de sorg cu coceni de porumb tratate cu diferiţi aditivi de însilozare.

2.1.Materiale şi metode

Ca materie primă s-a folosit biomasă de sorg (Sorghum bicolor) şi porumb (Zea Mays) obţinute în două loturi experimentale diferite din judeţul Timiş.

Ştiuleţii de porumb au fost recoltaţi separat iar resturile, alcătuite din tulpini şi frunze, au fost tăiate la lungimea teoretică de 1cm, cu ajutorul unei combine de recoltat furaje.

Sorgul a fost recoltat ca plantă întreagă, în perioada de lapte, după care a fost tăiat la lungimea teoretică de 1cm, cu ajutorul combinei de recoltat furaje. Din materialul tăiat s-a extras sucul dulce cu o presă de ulei, Pellet Mills cu capacitatea de 500 kg materie primă/oră, bagasa obţinută fiind folosită în acest experiment.

Silozurile au fost pregătite în flacoane de plastic, 1L volum, aerul a fost extras cu o pompă de vid după care au fost etanşate. Acestea au fost păstrate la 20°C până la deschidere. Biomasa a fost tratată cu aditivi de însilozare, cu excepţia martorilor.

Inocularea cu bacterii lactice (Lactobacillus plantarum şi Lactobacillus acidophilus) s-a făcut într-o concentraţie de 2 - 5 x 105 UFC (unităţi formatoare de colonii) g-1 material

17

proaspăt. S-au folosit tulpini de bacterii lactice provenite din colecţia universității, acestea fiind testate înainte în silozuri la scară de laborator şi industrială (Vintila, 2006, 2010).

Inocularea cu etanol, 8g soluţie etanol 95% / 100g material proaspăt, s-a facut doar în silozurile ce conţin sorg, plantă întreagă, şi bagasă obţinută în urma extragerii sucului, deoarece acestea se pot folosi ca materie primă în industria etanolului. Sucul dulce pentru bioetanolul de generaţia I şi bagasa pentru bioetanolul de generaţia a II-a, lignocelulozic.

Astfel au fost obţinute 12 tipuri de silozuri, după cum urmează:1. Sorg fără aditivi2. Sorg cu LAB3. Sorg cu etanol4. Bagasă fără aditivi5. Bagasă cu LAB6. Bagasă cu etanol7. Sorg şi coceni de porumb fără aditivi8. Sorg şi coceni de porumb cu LAB9. Bagasă şi coceni de porumb fără aditivi10. Bagasă şi coceni de porumb cu LAB11. Coceni de porumb fără aditivi12. Coceni de porumb cu LAB

Pentru a determina valoarea nutritivă a biomasei folosite, s-au făcut următoarele determinări standard, conform schemei WEENDE:- Substanţa uscată (SU%) – prin uscarea în etuvă la 105°C.- Proteina brută (PB%) – prin metoda Kjeldahl.- Grăsime brută (GB) – prin metoda Soxhlet- Celuloza brută (CB%) – prin metoda Van Soest.- Cenuşa (%) – prin uscarea în sobe, la 600°C.

O serie de alte analize au fost efectuate, împreună, cu cele menţionate mai sus, atât pe biomasa proaspătă cât şi pe biomasa însilozată. S-au determinat următorii parametrii.

pH-ul a fost măsurat cu pH-metrul Consort C932. Probele au fost pregătite prin amestecarea a 5g biomasă în 45ml apă distilată timp de 30 minute.

Unităţile formatoare de colonii (UFC). S-au analizat pentru a determina numărul de microorganisme prezente în silozuri. Suspensii lichide ale biomasei au fost diluate şi însămânţate în plăci cu nutrient agar şi incubate timp de 2 zile la 37°C.

Aciditatea de titrare este definită ca miligrame echivalent de soluţie bazică, 0,1M NaOH, necesară pentru a titra pH-ul probelor din siloz la valoarea de 6,5. Aceasta indică concentraţia acizilor prezenţi în siloz. Aciditatea de titrare poate fi corelată cu aciditatea totală a silozurilor la plante precum sorgul zaharat, care au o capacitate de tamponare redusă. Valorile mari indică o fermentaţie avansată, o cantitate de acid mai mare cu o stabilitate ridicată a silozurilor. Totuşi, o valoare prea mare pune probleme datorită conversiei substratului organic în acizi, în cantităţi prea mari, şi dificultatea de a menţine o valoare optimă a pH-ului în timpul digestiei anaerobe la producerea de biogaz.

Glucidele solubile (GS). Au fost determinate prin amestecarea a 10 g siloz în 100ml apă distilată timp de 30 minute. Probele au fost ulterior centrifugate pentru a separa partea

18

lichidă de cea solidă, după care partea lichidă a fost analizată pentru a determinat concentraţia de glucide reducătoare în extractul apos, prin metoda DNS (Warwick, 1982).

2.2. Rezultate şi discuţii

Caracteristicile biomasei înainte de însilozare sunt prezentate, mai jos, în tabelul 2.1. După 100 zile de păstrare, silozurile au fost deschise şi au fost analizaţi parametrii nutriţionali şi igienici. Caracteristicile senzoriale sunt un factor foarte important pentru determinarea integrităţii şi calităţii silozurilor, aşa că, îmediat după deschidere, silozurile au fost analizate din punct de vedere al culorii, texturii şi mirosului.

Tabelul 2.1. Caracteristicile biomasei înainte de însilozare

Biomasă

Indicatori nutriţionali şi de calitatepH log10

ufc g-1GSmg*g-

1

SU%

PB%

GB%

CB%

Cenuşă%

Sorg zaharat 6.9 1.35 65.5 23.5 2.58 2.78 9.05 3.35Bagasă 6.2 1.45 50.3 27.7 3.54 2.38 10.48 2.52Coceni de porumb 6.4 1.60 38.2 81.7 3.10 1.89 42.65 5.54

Toate variantele experimentale şi-au păstrat textura iniţială, bucăţile de plante nu s-au înmuiat (înmuierea este efectul hidrolizei biomasei de către microorganisme străine). Mirosul a fost diferit de la un lot la altul, de exemplu în loturile de sorg fără aditivi şi sorg cu LAB mirosul a fost unul acru, asemănător cu castraveţii muraţi. În lotul de sorg cu etanol, mirosul a fost unul mai plăcut, dulce acrişor, aromat, iar loturile care conţineau bagasă aveau cel mai plăcut miros, de pâine proaspătă. Mirosul acesta, plăcut a fost găsit şi în loturile care conţineau coceni de porumb. Culoarea silozurilor s-a schimbat şi ea. Loturile cu sorg şi bagasă fără aditivi au trecut de la o culoare verde viu, la una verde închis, măsliniu iar loturile cu sorg şi bagasă cu aditivi au trecut la o culoare verde deschis. Cele cu coceni de porumb şi-au păstrat culoarea iniţială.

19

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

1

2

3

4

5

6

7

pHaciditylog10 cfu*g-1

Codul lotului

Fig.2.1. Caracteristicile de păstrare a biomasei însilozate

Parametrii prezentaţi mai sus, în figura 2.1, pH, aciditate şi unităţile formatoare de colonii sunt principalele caracteristici care indică calitatea păstrării silozurilor.

Valorile ridicate ale pH-ului, găsite la cocenii de porumb, variantele 11 şi 12, arată că fermentaţia nu a avut loc în aceste silozuri, chiar şi după adăugarea bacterilor lactice, varianta 12. Inocularea cocenilor cu culturi de bacterii lactice se pare că are chiar un efect invers, ajutând formarea de microorganisme contaminante, probabil datorită umezelii şi nutrienţilor adăugaţi în acelaşi timp cu bacterile lactice.

Adăugarea de bacterii lactice în silozurile cu sorg şi bagasă, variantele experimentale 2 şi 5, îmbunătăţeşte calitatea de păstrare a biomasei (pH mai scăzut, aciditate ridicată, număr mic de microorganisme contaminante).

Adăugarea etanolului ca aditiv de păstrare în silozurile cu sorg şi bagasă, 3 şi 6, are efecte asemănătoare cu adăugarea bacterilor lactice, din punct de vedere al pHului, acidităţii şi microorganismelor contaminante. Diferenţa apare însă când ne uităm la numărul de glucide solublile rămase în urma însilozării.

Concentraţia iniţială de glucide solubile în apă a sorgului este de 65.5 mg·g -1. În silozul cu sorg inoculat cu etanol s-au găsit 91,25% din concentraţia iniţială de glucide solubile după 100 zile de păstrare. În cazul silozurilor cu sorg inoculat cu bacterii lactice şi neinoculat s-au găsit 56,64%, respectiv 65,02% din cantitatea iniţială de glucide.

În silozurile cu bagasă, datele arată acelaşi efect. 97,15% din cantitatea iniţială de glucide au fost găsite în silozul inoculat cu etanol iar în silozurile inoculate cu bacterii lactice şi neinoculate s-au găsit 78,42%, respectiv 87,79%.

Tabelul 2.2.Caracteristicile silozurilor după 100 zile de păstrare

20

Lot Conţinut

Parametrii nutriţionali şi calitativipH acidita

telog10

ufc g-

1

GSmg*g-1

SU%

PB%

GB%

CB%

Cenuşă%

1 Sorg 3.8 4,4 3.20 42.59 23.1 2.05 2.62 11.56 3.542 Sorg + LAB 3.7 5,4 1.5 37.10 22.5 2.54 2.93 10.91 3.413 Sorg + etanol 3.6 5 1.9 59.86 23.8 2.60 2.05 9.20 3.474 Bagasă 3.3 5,2 4.65 44.16 27.5 3.06 2.32 10.82 2.555 Bagasă + LAB 3.5 4,6 3.45 39.45 28.4 2.90 2.47 14.14 3.546 Bagasă + etanol 3.3 4,6 3.25 48.87 26.8 3.53 2.30 13.64 2.77

7Sorg + coceni de porumb

4.64,4

4.75 46.52 39.6 3.13 2.30 15.00 6.10

8

Sorg + coceni de porumb + LAB

3.9

5,4

3.9 32.39 38.4 3.51 2.44 15.33 3.91

9bagasă + coceni de porumb

3.64,7

2.45 33.18 35.9 2.80 1.92 19.58 4.21

10

bagasă + coceni de porumb+ LAB

3.5

5,7

3.20 34.75 38.1 3.05 2.11 15.72 4.05

11 Coceni de porumb

61

3.30 36.22 82.5 3.08 1.82 44.81 6.10

12Coceni de porumb + LAB

6.31,2

3.65 33.39 76.8 3.49 1.97 40.75 5.54

Datorită umidităţii scăzute a cocenilor de porumb, însilozarea acestui tip de biomasă este destul de dificilă. Acest tip de biomasă reziduală poate fi folosită ca materie primă pentru producerea de biocombustibili. Potenţialul de producere de biogaz a cocenilor de porumb este de 380 – 460 litri biogaz/ kg substanţă uscată organică (Nikolic 2009).

Un alt ţel al acestor experimente a fost să creştem umiditatea şi concentraţia de glucide solubile ale silozurilor de coceni de porumb prin adăugarea de sorg şi bagasă, variantele experimentale 7,8,9 şi 10. Datele din tabelul de mai sus arată că un amestec de 1:1 a cocenilor de porumb cu celelalte două tipuri de biomasă duc la fermentaţie lactică şi însilozarea biomasei.

Valorile acidităţii, pHului şi UFC arată că în toate cele 4 loturi a avut loc fermentaţia şi biomasa a fost bine păstrată. Rezultatele recomandă adăugarea de bacterii lactice pentru silozurile ce conţin sorg şi coceni de porumb.

Analiza celorlalţi parametrii, proteină brută, grăsime brută, celuloză brută şi cenuşă, arată că toate cele 12 loturi s-au păstrat bine, din punct de vedere nutriţional, diferenţele între biomasa neînsilozată şi cea însilozată sunt foarte mici.

Cele mai importante constatări în urma analizei datelor este că silozurile inoculate cu etanol păstrează mai bine atât conţinutul de glucide solubile cât şi cel de proteină brută. Este recomandat astfel ca pentru biomasa folosită ca materie primă pentru producţia de biocombustibil, ce trebuie însilozată, să se folosească etanolul ca aditiv.

21

2.3. Concluzii

Adăugarea bacterilor lactice în silozurile de sorg şi cele amestecate ameliorează parametrii de păstrare, dar duce la o pierdere mai mare a glucidelor solubile.

Concentraţii mari de glucide au fost păstrare în silozurile cu etanol ca aditiv. Acesta împiedică epuizarea proteinei din siloz cât şi multiplicarea microorganismelor contaminante. Folosirea etanolului ca aditiv păstrează biomasa calitativ, reduce pierderea de proteine şi glucide solubile.

Diferenţă în substanţă uscată, proteină, grasime brută, celuloză nu este semnificativă la nici o formă de însilozare.

O parte mică din etanolul produs într-o biorafinărie poate fi folosit, aşadar, pentru a păstra materia primă necesară biorafinăriei pentru mai mult timp.

Parametrii de păstrare a cocenilor de porumb pot fi îmbunătăţiti dacă aceştia sunt amestecaţi cu sorg sau bagasă.

22

Cap.3. Sorgul zarahat ca materie primă pentru producerea de bioetanol

În zonele tropicale, subtropicale şi aride din Statele Unite, Mexico, China, India, Africa şi alte ţări în curs de dezvoltare, unde condiţiile agricole vitrege domină, una dintre cele mai promiţătoare plante, pentru producerea de combustibil este sorgul zaharat (Sorghum bicolor). (Reddy, 2005; Zhang, 2010).

Aceasta este o plantă foarte eficientă care a atins o producţie globală de 56 milioane tone boabe în 2009 (FAOSTAT 2011).

Sorgul este o plantă din grupa C4, foarte rezistentă la factorii biotici şi abiotici cum ar fi insecte, secetă, salinitatea sau alcalinitatea solului. Aceasta are una dintre cele mai bune rate de asimilare a carbonului, 50g/m²/zi, care permite o creştere rapidă şi o mai bună utilizare a dioxidului de carbon (Prasad, 2007). Sorgul are nevoie de o treime din cantitatea de apă comparativ cu trestia de zahăr şi 80 – 90% comparativ cu porumbul, fiind astfel una din cele mai rezistente la secetă. Mai mult decât atât, ea are nevoie de o cantitate mult mai mică de îngrăşăminte, 1/3 comparativ cu trestia de zahăr şi ciclul ei de creştere este între 3 şi 5 luni, permiţând astfel 2 sau 3 cicluri de creştere anual.

Pe lângă avantajele ecologice, sorgul este o plantă foarte maleabilă din punct de vedere genetic, ceea ce permite creerea de soiuri adaptabile mai multor regiuni de pe glob cu uşurinţă.

Produsul principal obţinut din sorg este sucul, bogat în glucide fermentescibile. Acest suc este compus în principal din glucoză, zaharoză şi fructoză, deci poate fi fermentat şi transformat în etanol cu o eficienţă de peste 90% (Wu, 2010).

Sorgul zaharat are randament mai bun din punct de vedere al inputului şi outputului energetic decât multe dintre plantele folosite în momentul actual, cum ar fi trestia de zahăr, sfecla de zahăr, porumbul, etc. (Almodares, 2009).

Pe lângă sucul obţinut, bagasa rezultată în urma extragerii poate fi folosită ca materie primă pentru producerea de etanol.

Conversia biomasei lignocelulozice la etanol este un proces împărţit în trei etape. În prima etapă polimerii glucidici sunt eliberaţi din lignoceluloză, în a 2-a etapă aceştia sunt hidrolizaţi în glucide fermentescibile iar ultima etapă presupune fermentarea glucidelor la etanol (Lange 2007).

3.1. Determinarea activităţii entimatice

În vederea procesării sorgului pentru obţinerea de etanol primul pas a fost determinarea activităţii enzimelor celulozolitice disponibile.

3.1.1. Materiale şi metode

Ca substrat pentru determinarea activităţii enzimatice s-a folosit sorg zaharat (Sorghum bicolor), acesta a fost cultivat în Timişoara, România, pe terenurile aparţinând

23

Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară a Banatului „Regele Mihai I al României”. După recoltare, paniculii au fost îndepărtaţi, restul plantei a fost uscat la aer liber şi mărunţit cu o moară Retsch SM 100, la dimensiunea de 2 cm.

Enzimele testate sunt enzime celulozolitice comerciale provenite de la Novozyme. S-au pregătit diferite cocktailuri enzimatice pentru a determina care variantă este cea mai bună pentru a fi folosită în procesul de producere a etanolului din sorg. Amestecurile au fost făcute în funcţie de caracteristicile enzimelor.

Astfel am obţinut patru preparate enzimatice, şi anume:a. NS22086b. NS22086 + NS22118 + NS22119 + NS22035c. NS22086 + NS22083 + NS22002d. NS22086 + NS22083 + NS22002 + NS22118 + NS22119 + NS22035

Tabelul.3.1. Enzimele comerciale NOVOZYMECod enzimă Tipul enzimei DescriereNS22086 Complex

celulazic- Principala enzimă pentru hidroliza biomasei

hidrocelulozice- Catalizează desfacerea materialului celulozic în glucoză,

celobioză şi polimeri de glucoză- Principalii produşi de reacţie sunt celobioza şi glucoza

NS22083 Xylanaze - Endoxylanaze de puritate înaltă cu specificitate către pentozele solubile

- Capabilă să elibereze pentozele din hemiceluloza biomasei

NS22118 β – glucozidaze - Cunoscute şi ca celobiaze, transformă celobioza în glucoză

NS22119 Complex enzimatic

- Conţine o gamă largă de carbohzdraze, incluzând arabinase, β – glucanaze, celulaze, hemicelulaze, pectinaze şi xylanaze

NS22002 β – glucanazexylanaze

- Conţine un amestec de β – glucanaze şi xylanaze- Are şi activiăţi secundare, inclusiv celulaze,

hemicelulazeNS22035 Glucoamilaze - Folosită pentru medile de hidroliză ce conţin amidon

S-au pregătit mai multe diluţii ale preparatelor enzimatice, cu tampon citrat 0,05M, pH4,8, pentru a putea urmării mai exact activitatea enzimatică şi concentraţia optimă necesară pentru hidroliza biomasei.

Testul de activitate s-a făcut prin două metode şi anume, determinarea activităţii enzimatice prin metoda FPU şi prin hidroliza enzimatică a sorgului zaharat.

Pretratarea biomaseiPentru hidroliza ezimatică s-au folosit două tipuri de pretratare a biomasei, pentru a

determina în acelaşi timp şi metoda optimă de pretratare ce va fi folosită în procesul de conversie a biomasei la bioetanol.

24

Pretratarea mecanică a biomasei care presupune mărunţirea la o dimensiune de 0,25mm. Pretratarea alcalină (fizico – chimică) a biomasei implică umectarea sorgului mărunţit (2cm lungime teoretică) cu soluţie NaOH 2%, în raport de 10:1 lichid – solid şi autoclavarea acestuia la 120°C timp de 30 minute (Silverstein, 2007; Ming, 2009) . După autoclavare, biomasa umedă rezultată a fost spălată cu apă, un volum aproximativ de 12 ori mai are decăt cantitatea de biomasă, şi neutralizată cu sol. H2SO4 2% până a atins pHul de 5,3.

Hidroliza enzimaticăBiomasa pretratată mecanic şi fizico – chimic a fost introdusă în flacoane Erlenmeyer

de 300ml. S-a introdus echivalentul în biomasă a 1g celuloză, adică 2,5g sorg substanţă uscată. Sorgul conţine aproximativ 33 – 44% celuloză/ gram biomasă (Sarna-Saldivar, 2009).Astfel, în flacoane s-au introdus 2,679g sorg pretratat mecanic şi 13,469g sorg pretratat fizico – chimic.

Tabelul.3.2. Substanţa uscată sorg Tip biomasă Substanţă uscată (%)

Sorg pretratat mecanic 93,3Sorg pretratat fizico-chimic 18,56

La acestea, s-au adăugat 50ml tampon citrat 0,05M, pH 4,8 şi Tween80, 5g/l pentru a îmbunătăţii hidroliza enzimatică (Ming, 2008). Flacoanele astfel pregătite au fost autoclavate la 121°C timp de 20 minute, pentru a asigura sterilitatea mediului. În flacoane au fost introduse preparatele enzimatice descrise anterior. Doar din preparatele b şi d a fost exclusă enzima NS22035. Cantitativ, s-au introdus 15 micolitri din enzima NS22086 şi 50 microlitri din celelalte enzime.

Hidroliza s-a făcut timp de 72h la temperatura de 50°C, cu agitare de 150rpm. La fiecare 24 de ore şi la momentul iniţial s-au prelevat probe pentru a determina glucidele reducătoare cu medota DNS şi glucoza.

S-a determinat substanţa uscată după pretratare şi după hidroliză prin uscarea într-o etuvă la 105°C timp de 24 ore. Toate probele şi analizele s-au realizat în triplicate.

Metode de analizăMetoda FPU determină activitatea celulazelor prin intermediul hârtiei de filtru. Într-o

eprubetă se pipetează 1ml tampon citrat 0,05M, pH 4,8. Se adaugă 0,5ml enzimă (diluată în tampon citrat). Se recomandă folosirea mai multor diluţii, pentru o exactitate mai mare a rezultatelor. Se încălzeşte la 50°C, se adaugă hârtia de filtru Whatman No.1 (1x6 cm). Se incubează 60 min la 50°C. Se adaugă 3 ml DNS (acid dinitrosalicilic) şi se agită. Se fierbe eprubeta exact 5 minute. Se adaugă 20ml apă distilată şi se omogenizează. După 20 de minute soluţia din eprubetă se măsoară la 540nm cu spectrofotometru.

Pentru determinarea analitică a concentrației de glucoză din mediile de hidroliză s-a aplicat metoda enzimatica cu glucozoxidaza si dozare spectrofotometrica la 510 nm, cuva de 1 cm. Etalonare in 5 puncte in intervalul 90-700 mg/1oo mL; R2 pentru curba de etalonare: 0.9701,Ecuatia de etalonare: Y (Ext)= 0.0026 X (mg/100 mL)

25

Principiul metodei: glucoza este oxidata de catre glucozoxidaza la acid gluconic si peroxid de hydrogen. Acesta in prezenta enzimei reactioneaza cu fenolul si 4-aminoantipirina formind un colorant iminochinonic de culoare roz, cu maximum de absorbtie la 510 nm. Intensitatea roza a solutiei este proportional cu continutul in glucoza. Masuratorile au fost executate cu Spectrofotometrul Specord 205, Analytik Jena, Germania in Cadrul Laboratorului de Spectrometrie atomica si moleculara a USAMVB Timisoara. Metoda prezinta specificitate pentru glucoza.

Metoda DNS determină cantitatea de glucide simple din mediul de hidroliză. Într-o eprubetă se pipetează 0,5ml probă de determinat se adaugă 1ml DNS şi se agită- Se fierbe timp de 5 minute după care se aduce la 10ml cu apă distilată, se adaugă 8,5 ml. Soluţia este măsurată la spectrofotometru la 540nm faţă de spectrul zero. Denstităţiile optice astfel citite se transformă în mg glucide/ ml mediu cu ajutorul unei curbe de etalonare în 6 puncte între 0 – 1000 micrograme/ml.

3.1.2. Rezultate şi discuţii

În prima parte s-a determinat activitatea enzimatică a preparatelor Novozyme prin metoda FPU. În tabelul 3.3. sunt redate datele obţinute în urma testării enzimelor.

Tabelul.3.3. Activitatea preparatelor enzimatice (exprimată în FPU)

Notatie Cocktail enzimatic Dilutie glucoza eliberata (mg) FPU/ microlitru preparat enzimatic

a NS22086

x20 1,497 1,108x50 0,854 1,581

x100 0,391 1,448x200 0,254 1,883

b NS22086 + NS22118 + NS22119 + NS22035

x20 1,398 0,259x50 0,849 0,393

x100 0,446 0,413x200 0,350 0,647

c NS22086 + NS22083 + NS22002

x20 1,959 0,483x50 1,154 0,712

x100 0,514 0,634x200 0,374 0,922

dNS22086 + NS22118 + NS22119 + NS22035 + NS22083 + NS22002

x20 1,593 0,196x50 0,947 0,292

x100 0,462 0,285x200 0,415 0,512

26

NS22086 NS22086 + NS22118 + NS22119 + NS22035

NS22086 + NS22083 + NS22002

NS22086 + NS22118 + NS22119 + NS22035 + NS22083 + NS22002

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2

FPU/ microlitru preparat enzimatic

FPU/ microlitru preparat enzimatic

Fig.3.1. Activitatea preparatelor enzimatice (FPU)

Datele prezentate mai sus arată că preparatul enzimatic cel mai potrivit este NS22086, acesta prezentând cea mai mare activitate enzimatică, deşi toate preparatele conţin complexul enzimatic NS22086, în aceiaşi cantităţi. O explicaţie poate fi, că deşi cantitatea de enzimă NS22086 este în aceiaşi cantitate în toate amestecurile, faptul că în amestecurile b,c şi d aceasta este diluată cu alte enzime, produsul final care acţionează asupra substratului să conţină mai puţină enzimă.

Pentru a avea o imagine mai clară a activităţii, în a 2-a parte a experimentului s-a efectuat o hidroliză enzimatică a sorgului zaharat, după metoda enunţată mai sus. În urma hidrolizei s-au analizat cantitatea de glucoză eliberată şi cantitatea de glucide reducătoare.

Tabelul.3.4.Glucidele reducătoare eliberate în urma hidrolizeiVariantă

experimentală

Glucide obţinute (mg/ml)T0 (0h) T1(24h) T2(48h) T3(72h)

Na 1,816 4,842 5,679 6,156Nb 1,766 5,415 6,557 6,818Nc 1,808 5,553 6,539 7,110Nd 1,784 6,335 7,430 7,688Pa 0,236 18,66 10,59 19,90Pb 0,252 16,290 20,684 22,389Pc 0,244 21,443 21,79 20,160Pd 0,244 22,702 24,531 26,705

unde: N – sorg pretratat mecanicP – sorg pretratat fizico – chimica,b,c,d – preparatele enzimatice

27

Rezultatele arată că, pentru orice preparat enzimatic, randamentul este mai mare în cazul pretratării biomasei fizico – chimic. În timp ce hidroliza biomasei pretratate mecanic produce o cantitate maximă de 7,6 mg/ml glucide (Nd), în cazul pretratării fizico – chimice acelaşi preparat enzimatic produce 26,7 mg/ml glucide (Pd), având un randament 4 ori mai mare.

T0 (0h) T1(24h) T2(48h) T3(72h)0

5

10

15

20

25

30

NaNbNcNdPaPbPcPd

Fig.3.2. Glucidele eliberate în timpul hidrolizei

Ca şi productivitate, preparatul enzimatic d este cel mai bun, eliberând 26,7 mg/ml glucide urmat de preparatul b cu o producţie de 22,3 mg/ml glucide şi preparatul c, cu o producţie de 20,1 mg/ml, cel mai putin productiv fiind preparatul a, 19,9 mg/ml.

Tabelul.3.5. Glucoza eliberată în timpul hidrolizei enzimaticeVariantă

experimentală

Glucoza (mg/ml)T0 (0h) T1(24h) T2(48h) T3(72h)

Na 0,577 3,398 4,094 4,387Nb 0,631 4,058 4,473 4,913Nc 0,529 2,965 4,357 5,656Nd 0,631 4,479 3,342 5,113Pa 0,110 6,395 6,298 6,176Pb 0,049 6,177 6,501 6,015Pc 0,092 5,896 5,239 5,761Pd 0,082 6,036 5,973 5,618

unde: N – sorg pretratat mecanicP – sorg pretratat fizico – chimica,b,c,d – preparatele enzimatice

Deşi cantitatea cea mai mare de glucide este eliberată din biomasă de preparatul d, în urma determinării glucozei eliberate în urma hidrolizei se observă că, din acest punct de

28

vedere, cel mai performant cocktail este a, care eliberează o cantitate de 6,175 mg/ml hidrolizat, cu 0,5557 mg/ml mai mult decât amestecul d (5,618mg/ml). Preparatul a este urmat, ca performanţă de preparatul b, cu o producţie de 6,015 mg/ml, apoi de preparatul c (5,761mg/ml), cel mai putin productiv devenind astfel preparatul d.

Luând în considerare că interesul nostru este direcţionat spre obţinerea unei cantitâţi cât mai mari de glucoză, putem afirma că preparatul optim pentru procesele defăşurate în continuare este complexul a.

0 24 48 720.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

7.000

NaNbNcNdPaPbPcPd

Timp (h)

glucoza (mg/ml)

Fig.3.3. Glucoza eliberată în timpul hidrolizei (mg/ml)

Analizând mai amanunţit datele obţinute, putem vedea că hidroliza are activitatea cea mai intensă în primele 24 ore, ba mai mult, în cele mai multe cazuri, după primele 24 ore de proces, cantitatea de glucoză începe să scadă. Chiar dacă pentru varianta Pb, cantitatea de glucoză continuă să crească până la 48 ore, diferenţa, de doar 0,324mg/ml glucoză nu justifică prelungirea procesului cu încă 24 ore.

Tabelul.3.6. Biomasa hidrolizată (substanţă uscată)Probă Biomasă supusă

hidrolizei (g, S.U.)Cantitatea de

biomasă hidrolizată (g, S.U.)

Raport de hidroliză (g %)

Na 2,5 0,185 7,389Nb 2,5 0,206 8,233Nc 2,5 0,229 9,171Nd 2,5 0,187 7,472Pa 2,5 1,705 68,210Pb 2,5 1,365 54,581Pc 2,5 1,642 65,692Pd 2,5 1,366 54,627

29

În tabelul de mai sus sunt afişate cantităţile de biomasă care au fost hidrolizate de enzime. Din nou, se observă o diferenţă clară de eficienţă între pretratarea mecanică şi cea fizico – chimică. Pe când pretratarea mecanică facilitează accesul enzimelor la maxim 9,1% din biomasă (Nc), pretratarea fizico – chimică desface structura biomasei în aşa măsură, încât enzimele pot hidroliza până la 68,2% din biomasa disponibilă (Pa), o diferenţă de randament de aproximativ 60%.

3.1.3. Concluzii

Pretratarea biomasei este un aspect foarte important în procesul de conversie a biomasei la biocombustibil. Alegând metoda de pretratare adecvată, randamentul hidrolizei poate creşte cu până la 60% din biomasa procesată.

Pretratarea fizico – chimică pregăteşte biomasa pentru procesul de hidroliză enzimatică mult mai bine decât pretratarea mecanică.

Din toate preparatele enzimatice testate, NS22086, folosit pur, neamestecat cu alte complexe enzimatice arată activitatea cea mai mare.

Deşi, din punct de vedere al glucidelor eliberate, amestecuri dintre NS22086 şi alte enzime, au un randament mai mare, din punct de vedere al glucozei, NS22086 folosit in stare pură oferă o eficienţă mai ridicată.

Hidroliza enzimatică are activitatea cea mai intensă în primele 24 ore de la start, ulterior, în cele mai multe cazuri, glucoza din hidrolizat începe să se piardă.

Chiar dacă există cazuri în care hidroliza continuă să desfacă biomasa şi să elibereze glucide, cantitatea eliberată nu justifică continuarea procesului după primele 24 ore.

3.2. Conversia sorgului zaharat la bioetanol

3.2.1. Materiale şi metode

Ca substrat pentru conversie s-au folosit trei hibrizi de sorg (Sorgum bicolor), şi anume Jumbo, Fundulea FT132 şi Sugar Graze II. Aceştia au fost cultivati în Timişoara, România, pe terenurile aparţinând Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară a Banatului „Regele Mihai I al României”. După recoltare, paniculii au fost îndepărtaţi iar plantele au fost lăsate să se usuce la aer. După uscare plantele au fost mărunţite cu o moară tăietoare Retsch SM 100, la dimensiunea de 2 cm.

Pretratarea biomaseiBiomasa astfel mărunţită a fost introdusă în flacoane Erlenmeyer de 2000 ml, umectată

cu sol. NaOH 2% în raport de 6:1 lichid – solid şi autoclavată la 120°C timp de 30 minute.(Silverstein, 2007; Xuebing, 2008; Ming, 2009). Pentru a evita refularea conținutului, datorită presiunii ridicate din timpul autoclavării, în flacoane au fost introduse doar 100 g biomasă și 600 ml soluție NaOH 2%.

30

După autoclavare, biomasa pretratată a fost spălată cu apă şi neutralizată cu sol. H2SO4 2% până la pH 5. Volumul de apă folosită la spălare fost aproximativ de 12 ori mai mare decât cantitatea de biomasă.

Tabelul.3.7. Valoarea pHului sorgului pretratatTip biomasă (sorg) pH

Sugar Graze II 4,9Jumbo 5,2

Fundulea 4,8

Valoarea pHului trebuie să fie între 5 şi 5,5 deoarece activitatea enzimelor folosite este cea mai mare între aceste valori ale mediului de hidroliză.

S-a determinat substanţa uscată prin uscarea într-o etuvă la 105°C timp de 24 ore.

Hidroliza enzimaticăÎn urma determinării activităţii enzimatice a celulazelor disponibile, complexul

enzimatic NS22086 a fost selectat pentru etapa hidrolizei biomasei. În flacoane de 1000 ml s-au introdus biomasă pretratată, 5% substanţă uscată din

totalul volumul mediul de hidroliză şi s-a adus la 500 ml cu tampon citrat 0,05M, pH 5. În tamponul citrat, pe lângă Tween 80, 5g/l (Ming, 2008), s-a mai introdus 2% peptonă şi 1% extract de drojdie, nutrienţi necesari în etapa următoare a procesului, fermentaţia alcoolică.

Tabelul.3.8. Cantitatea de biomasă supusă hidrolizăTip biomasă Substanţă

uscată (%)Substanţa

uscată a biomasei după pretratare (%)

Biomasă supusă

hidrolizei (g)

Sugar Graze II

92,47 19,59 127,5

Fundulea 92,26 18,24 137,06Jumbo 88,92 18,85 132,6

Datele din tabelul.3.8. indică modul în care umiditatea biomasei supuse pretratării crește în această etapă tehnologică. Pentru a avea aceleași condiții experimentale în etapa de hidroliză a celor trei tipuri de sorg, cantitatea de biomasă supusă hidrolizei s-a calculat în funcție de conținutul în substanță uscată a biomasei umede, după pretratare. Astfel, cantitatea de biomasă pretratată supusă hidrolizei corespunde a 25 g substanţă uscată. Am estimat că această cantitate de biomasă conține aproximativ 10 g celuloză (conform compoziției medii în celuloză a sorgului din datele de literatură). Cantitatea de 25 g (S.U.) biomasă a fost introdusă în 500 ml mediu de hidroliză, astfel că am obținut un mediu de hiroliză cu o concentrație de 5% substrat brut (biomasă lignocelulozică, S.U.).

Flacoanele astfel pregătite au fost autoclavate la 121°C timp de 20 minute, pentru a asigura asepsia procesului.

31

La mediul de hidroliză s-a adăugat complexul enzimatic NS22086, în cantitate de 50 microlitri pentru fiecare gram teoretic de celuloză (2,5 g substanţă uscată), adică 500 microlitri enzimă în fiecare flacon. (cantitate recomandată de producător).

Flacoanele au fost incubate timp de 24h la 50°C într-un incubator cu agitare, la 150rpm. Au fost luate probe din mediul de hidroliză, înainte de introducerea enzimelor, la 6, 12 şi 24 de ore pentru a determina glucidele reducătoare şi glucoza.

Fermentaţia alcoolicăDupă 24 ore de hidroliză, flacoanele au fost răcite la temperatura camerei după care au

fost introduse într-o baie de apă la 35°C şi inoculate cu o cultură de drojdie Saccharomyces cerevisiae în proporţie de 1g drojdie / 100 g mediu de fermentație. Toate variantele experimentale s-au realizat în triplicat.

Fig.3.4.Instalarea etapei de fermentare

32

Fig.3.5. Instalarea etapei de fermentare (2)

Flacoanele conținând mediul de fermentație astfel pregătit au fost instalate (vezi figurile 3.4, 3.5) după cum urmează:

La câte un flacon din fiecare triplicat au fost conectați senzori NIR de EtOH și CO 2

(BlueSens®) în vederea monitorizării în timp real a concentraţiei de etanol şi CO2 în timpul fermentaţiei. Datele sunt înregistrate de senzori la fiecare două minute și sunt reprezentate grafic în timp real cu ajutorul programului BACVis într-un computer la care sunt atașați senzorii.

Fermentaţia a fost oprită când s-a constatat că, concentraţia de etanol rămâne la un nivel constant. Lichidul fermentat a fost separat de faza solidă în vederea determinării glucidelor reziduale și a substanței uscate ca indice a raportului de hidroliză a biomasei.

Toate analizele s-au realizat în triplicat.

Metode de analizăPentru determinarea analitică a concentrației de glucoză din mediile de hidroliză s-a

aplicat metoda enzimatica cu glucozoxidaza si dozare spectrofotometrica la 510 nm, cuva de 1 cm. Etalonare in 5 puncte in intervalul 90-700 mg/1oo mL; R2 pentru curba de etalonare: 0.9701,Ecuatia de etalonare: Y (Ext)= 0.0026 X (mg/100 mL)

Principiul metodei: glucoza este oxidata de catre glucozoxidaza la acid gluconic si peroxid de hydrogen. Acesta in prezenta enzimei reactioneaza cu fenolul si 4-aminoantipirina formind un colorant iminochinonic de culoare roz, cu maximum de absorbtie la 510 nm.

33

Intensitatea roza a solutiei este proportional cu continutul in glucoza. Masuratorile au fost executate cu Spectrofotometrul Specord 205, Analytik Jena, Germania in Cadrul Laboratorului de Spectrometrie atomica si moleculara a USAMVB Timisoara. Metoda prezinta specificitate pentru glucoza.

Metoda DNS determină cantitatea de glucide simple din mediul de hidroliză. Într-o eprubetă se pipetează 0,5ml probă de determinat se adaugă 1ml DNS şi se agită- Se fierbe timp de 5 minute după care se aduce la 10ml cu apă distilată, se adaugă 8,5 ml. Soluţia este măsurată la spectrofotometru la 540nm faţă de spectrul zero. Denstităţiile optice astfel citite se transformă în mg glucide/ ml mediu cu ajutorul unei curbe de etalonare în 6 puncte între 0 – 1000 micrograme/ml.

3.2.2. Rezultate şi discuţii

După cum se poate vedea în tabelul 3.9, în urma hidrolizei enzimatice a biomasei s-au hidrolizat 8, resprectiv 10 grame substanţă uscată din cele 25 supuse procesului. Randamentul hidrolizei este de 32% pentru Sugar Graze II şi 40% pentru variantele Jumbo şi Fundulea.

Tabelul.3.9. Cantitatea de biomasă fermentată (substanţă uscată)Probă Cantitatea de

biomasă iniţială (g)

Biomasă hidrolizată (g)

Raport de hidroliză (%)

Sugar Graze II 25 8 32Jumbo 25 10 40Fundulea 25 10 40

În timpul hidrolizei enzimatice au fost eliberate 11,011, 17,050 şi 15,755 mg/ml pentru Sugar Graze II, respectiv Jumbo şi Fundulea. După fermentaţia alcoolică au mai rămas 1,034, 0,433 şi 0,818mg/ml glucide în lichidul de ferementaţie. Ceea ce înseamnă că, în timpul fermentaţiei s-au consumat 9,997mg/ml glucide pentru varianta Sugar Graze II, 15,617 mg/ml şi 14,973mg/ml glucide pentru variantele Jumbo, respctiv Fundulea. Randamenzul cel mai bun se observă la soiul Jumbo.

Tabelul.3.10. glucidele eliberată în timpul hidrolizeiProbă Glucide eliberate (mg/ml) Glucide

reziduale (mg/ml)

T0 (0h) T1(12h) T2(24h)

Sugar graze II 0,789 9,674 11,011 1,034

Jumbo 0,372 3,302 17,050 1,433

Fundulea 0,525 8,583 15,755 0,818

34

T0 (0h) T1 (12h) T2 (24h) Glucide reziduale0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Sugar Graze IIJumboFundulea

Fig.3.6. Curba de producere a glucidelor în timpul hidrolizei şi glucidele reziduale (mg/ml)

În tabelul 3.11. şi figura 3.6. se observă cantitatea de glucoză eliberată în timpul hidrolizei, cea procesată în timpul fermentaţiei şi curba producerii de glucoză în timpul hidrolizei. Pe sorgul Jumbo ca substrat hidroliza a fost cea mai productivă, eliberând 4,539 mg/ml glucoză, în 24 ore. O cantitate cu 0,439mg/ml mai mare decât varianta Fundulea (4,1mg/ml) şi cu 0,84mg/ml mai mare decât în cazul variantei experimentale cu Sugar Graze II.

Şi eficienţa fermentaţiei a fost cea mai ridicată în cazul Jumbo, glucoza reziduală are o valoare de 0,005mg/ml lichid de fermentaţie. Urmată de varianta Fundulea cu 0,098mg/ml şi variuanta Sugar Graze II cu 0,242 mg/ml lichid de fermentaţie, glucoză reziduală.

Tabelul.3.11. Glucoza eliberată în timpul hidrolizeiProbă Glucoză eliberată (mg/ml) Glucoză

rezidualăT0 (0h) T1(12h) T2(24h)Sugar graze II 0,046 2,927 3,699 0,242

Jumbo 0,039 4,461 4,539 0,005Fundulea 0,031 4,652 4,1 0,098

În cazul variantei Fundulea se observă o uşoară depreciere a valorii glucozei în mediul de hidroliză între 12 şi 24 ore.

35

T0 (0h) T1 (12h) T2 (24h) Glucoza reziduala0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

Sugar Graze IIJumboFundulea

Fig.3.7. Curba de producere a glucozei în timpul hidrolizei şi glucoza reziduală (mg/ml)

Figurile 3.8 şi 3.9 arată evoluţia concentraţiei de etanol şi dioxid de carbon în timpul fermentaţiei. După cum era de astepat, concentraţia de dioxid de carbon (fig.3.9.) creşte foarte repede în primele ore ale fermentaţiei, cand drojdia este foarte activă, atingând o concentraţie de 95,82% în cazul variantei Jumbo, 92,02% Sugar Graze şi 68,02% Fundulea în primele 5 ore ale fermentaţiei. După acest punct, valorile încep să se stabilizeze atingând o concentraţie maximă de 99,03% în cazul Jumbo, 97,69% şi 68,78% în cazurile Sugar Graze II, respectiv Fundulea.

0 1 2 3 4 5 6 12 24 480

0.5

1

1.5

2

2.5

0.05

0.74

1.28

1.46 1.52 1.49 1.52 1.52 1.571.65

0.02

0.49

0.87

1.3

1.591.72

1.791.96

1.811.92

0.01

0.63

1.191.36 1.37 1.41 1.4 1.43 1.49

1.74

JumboSugar Graze IIFundulea

Fig.3.8. Evoluţia concentraţiei de alcool în timpul fermentaţiei

36

Concentraţia de alcool produsă de-a lungul fermentaţiei creşte într-un ritm constant de-a lungul procesului şi atinge maximul după 48 ore de proces, moment în care incepe să se stabilizeze. Concentraţia cea mai mare de etanol se găseşte în varianta experimentală ce conţine Sugar Graze II ca substrat, 1,92% etanol, urmată de varianta Fundulea cu 1,74% şi varianta Jumbo cu 1,65% etanol. Diferenţele nu sunt foarte mari, 0,16% între Sugar Graze II şi Fundulea şi 0,27% între varianta Sugar Graze II şi Jumbo.

0 1 2 3 4 5 6 12 24 480

20

40

60

80

100

120

0

59.53

92.31 90.7894.71 95.82 94.46 96.56 98.54 99.03

0

68.69

85.9589.98 90.38 92.02 90.97 93.05

96.44 97.69

0

44.28

66.63 67.69 67.76 68.02 67.85 68.49 68.76 68.78 JumboSugar Graze IIFundulea

Fig.3.9.Evoluţia concentraţiei de dioxid de carbon în timpul fermentării

Concret, în urma procesului de conversie, se pot obţine 1,92ml etanol din 5g substanţă uscată sorg Sugar Graze II, 1,74ml etanol din 5g substanţă uscată sorg Fundulea şi 1,65ml etanol din 5g substanţă uscată sorg Jumbo.

Comparativ cu cantitatea de glucide eliberate în timpul hidrolizei, concentraţia de alcool este mai mare. Acest lucru se poate întampla be baza activităţii şi inhibiţiei enzimelor. În timpul hidrolizei acestea eliberează glucide din biomasă până acestea ating o anumită concentraţie, după care activitatea enzimatică este inhibată. În timpul procesului de fermentaţie glucidele sunt transformate în etanol iar enzimele îşi pot relua activitatea de desfacere a structurii a biomasei.

3.2.3. Concluzii

Hidroliza enzimatică a biomasei de sorg, pretratată fizico – chimic, cu sol. NaOH 2%, cu enzima NS22086 de la Novozyme are un randament de 32% până la 40%.

În timpul fermentaţiei se consumă peste 90% din glucidele eliberate în timpul hidrolizei enzimatice.

Procesul de fermentaţie este cel mai intens în primele 6 ore, atunci când activitatea drojdiei este mare iar acesta se stabilizează şi poate fi oprit după 48 ore.

37

La o încărcătură enzimatică de 50 microlitri/ gram de celuloză teoretic se poate obţine o concentraţie maximă de 1,92% etanol în urma procesului.

Dintre toate variantele experimentale, soiul Sugar Graze II este cel mai productiv din punct de vedere al conversiei la etanol.

38

Bibliografie

1. Alive, L.A., Filipe M.G.A., Silva J.B.A.E., Silva S.S., Prata A.M.R., Applied Biochemistry and Biotechnology, 70-72, 89-98, 1998.

2. Almodares A, Hadi M.R., Production of bioethanol from sweet sorghum: A review, African Journal of Agricultural Research, Vol.5, No.9, pp.772 – 780, ISSN 1991-637X, September 2009.

3. Amon T., Amon B., Kryvoruchko V., Zollitsch W., Mayer K., Gruber L., Biogas production from maize and dairy cattle manure - influence of biomass composition on the methane yield. Agriculture, Ecology & Environ., 118, 173-182, 2007.

4. Antonopoulou, G., Gavala H. N., Skiadas I.V., Angelopoulos K., Lyberatos G. Bioresce Technology, 99, 110-119. Doi: 10.1016/j.biortech.2006.11.048, 2008.

5. Antonopoulou G., Gavala H.N., Skidias I.V., Lyberatos G., Effect of substrate concentration on fermentative hydrogen production from sweet sorghum extract, International Journal of Hydrogen Energy, 36, 4843-4851, 2011.

6. Barta, Z., Kovacs K., Reczey K., Zacchi G., Process design and economics of on-site cellulase production on various carbon sources in a softwood-based ethanol plant, Enzyme Research, article ID 734182, 2010.

7. Bernal M.P., Navarro A.F., Roig A, Cegarra J, Garcia D., Carbon and nitrogen transformation during composting of sweet sorghum bagasse, Biology and Fertility of Soils, 22, 141-148, 1996.

8. Ghose, T.K. - International union of pure and applied chemistry – Applied chemistry division – Commission on biotechnology, Measurement of cellulase activities, in Pure and Applied Chem., vol. 59, No.2, 257-268, 1987.

9. Gnansounou E., Dauriat A., Wyman C.E., Refining sweet sorghum to ethanol and sugar: economic trade-offs in the context of North China, Bioresource Technology, 96, 985-1002, 2005.

10. Herrman C., Heiermann M., Idler C., Effect of ensiling, silage additives and storage period on methane formation of biogas crops, Bioresource Technology 102, 5153-5161, 2011.

11. Lange, J.P., Lignocellulose conversion: an introduction to chemistry, process and economics. Biofuels Bioproducts & Biorefining, Vol. 1, No 1, 39-48, 2007.

12. Lynd, L.R., Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosic biomass: technology, economics, the environment, and policy, Ann. Rev. Energy Environ., 21 403–465, 1996.

13. Merino, S.T., Cherry J., Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization, in Biofuels, vol. 108 of Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, pp. 95-120, 2007.

14. Mills J, Kung L Jr., The effect of delayed ensiling and application of a propionic acid-based additive on the fermentation of barley silage, J Dairy Sci., 85 (8), 1969-75, 2002.

15. Ming C., Jing Z., Liming X., Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility, Biomass and Bioenergy, 33, pp.1381 – 1385, 2009.

16. Ming C., Jing Z., Liming X., Enzymatic hydrolysis of maize straw polysaccharides for the production of reducing sugars, Carbohydrate Polymers, 71, pp.411 – 415, 2008.

39

17. Nikolik V., Vintilă T., Producerea și utilizarea biogazului pentru obținerea de energie, Editura Mirton Timișoara, 2009.

18. Parasad S., Singh A., Jain N., Joshi H.C. – Ethanol production from sweet sorghum syrup for utilization as automotive fuel in India – Energy & Fuels, Vol.21, No.4, pp.2415 -2420, ISSN 0887 – 0624, 2007.

19. Pavel, B.P., Barbu C.H., Sand C., Pop M.R., Direct determination of heavy metals in plant samples using HR-CS-AAS, Metal in Environment, Medicine and Biology, Cluj University Press, Romania, IX, 49-52, 2009.

20. Picco D., Pin M., Vecchiet A., Alibardi L., Sandon A., Milgliardi D., Biogas Production from By-Products of the Sweet Sorghum Bioethanol Chain, European Biomass Conference and Exhibition (EU BC&E) Proceedings Volume, 2012.

21. Reddy N., Yang Y., Biofibers from agricultural by products for industrial applications, Trends in Biotechnology Vol.23, No.1, 22-27, ISSN 0167-7799, January 2005.

22. Sassner, P., Zacchi G., Integration option for high energy efficiency and improved economics in a wood-to-ethanol process, Biotechnology for Biofuels, vol. 1, article 4, 2008.

23. Silverstein R. et al. - A comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks – Bioresource Technology, 98, pp.3000 – 301, 2007.

24. Sohail, M., Siddiqi, R., Ahmad A., Shakeel A.K., Cellulase production from Aspergillus niger MS82: effect of temperature and pH, New Biotechnology, 25 (6) 437–441, 2009.

25. Sanchez, O.J., Cardona C.A., Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks, Bioresource Technology, xxx 1 – 26, 2007.

26. Sassner, P., Galbe M., Zacchi G., Techno-economic evaluation of bioethanol production from three different lignocellulosic materials, Biomass and Bioenergy, vol. 32, no. 5, 422-430, 2008.

27. Schmidt J., Siopcz J., Kaszas I., Szakacs G., Gyepes A., Tengerdy R. P., Preservation of sugar content in ensiled sweet sorghum, Bioresource Technology, 60 (1), p. 9-13, 1997.

28. Rohowsky B., Witzelsperger J., Remmele E., Faulstich M., Preservation of sweet sorghum under anaerobic conditions by using forming acid as an additive. Proc. 19th European Biomass Conference and Exhibition, Berlin, 191–194, 2011.

29. Vintila, T., Dragomirescu M., Vintila D., Croitoriu V., Hydrolysis of three types of lignocelluloses from agriculture using commercial enzymes and culture filtrate of Trichoderma viride, Journal of Biotechnology, vol. 150S. 2010.

30. Vintila, T., Dragomirescu, M., Jurcoane, S., Vintila, D., Caprita, R., Maniu, M. Production of cellulase by submerged and solid-state cultures and yeasts selection for conversion of lignocellulose to ethanol, Romanian Biotechnological Letters, Vol. 14, Nr.2, 4275-4281, 2009.

31. Vintilă T., Researches to elaborate a cheap and easy method for silage inoculation applicable in small farms. Proceedings volume of 57th Annual Meeting of the European Association for Animal Production 17-20, 252, Sept 2006.

32. Vintilă T., Vintilă D., Nica D., Dragomirescu M.. New Inoculants Containing Lactic Bacteria Applied in Forage Ensiling. Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies Vol. 43 (1), Editura AGROPRINT Timisoara, p. 341-345, 2010.

33. Vintilă T., - Biofeuls and Renewable Resources – Ed. Mirton, 201334. Warwick L.M., Peter P.G., Greg J.N., Mark R.Q. Evaluation of the DNS method for

analysing lignocellulosic hydrolysates, Chemical Technology and Biotechnology, 32, Issue 7-12, 1016-1022, 1982.

40

35. Weiland P., Biogas production: current state and perspectives. Appl. Microbiol. Biotechnol., 85, 849-860, 2010.

36. Wingren, A., Galbe M., Zacchi G., Techno-economic evaluation of production ethanol from softwood: comparison of SSF and SHF and identification of bottlenecks, Biotechnology Progress, vol. 19, no.4, 1109-1117, 2003.

37. Xilin L.; Simmonds S.H.; BelayachiI L.; Delmas M., Sweet sorghum bagasse: A raw material for the production of chemical paper pulp. - Effect of depithing, Industrial Crops and Products, 6, 229-232, 1997.

38. Wu X., Jampala B., Robbins A., Hays D., Yan S., Xu F., Rooney W., Peterson G., Shi Y., Wang D., Ethanol fermentation performance of grain sorghum (Sorghum Bicolor) with modified endosperm matrices, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.58, No.17, pp.9556 – 9562, ISSN 0021-8561, September 2010.

39. Xuebing Z., Lihua Z., Dehua L., Comparative study of chemical pretreatment methods for improving enzymatic digestibility of crofton weed stem, Bioresource Technology, 99, pp.3729 – 3736, 2008,.

40. Zhang C., Xie G., Li S., Ge L., He T., The productive potential of sweet sorghum ethanol in China, Applied Energy, Vol.87, No.7, , pp.2360 – 2368, ISSN 0306-2619, July 2010.

41