plasmide Și vectori de clonaj

7/26/2019 Plasmide i Vectori de Clonaj

1/13

Proiect

PLASMIDE I VECTORI DE CLONAJ

1

Studenta: Ilie Oana

Facultatea de: Bioogie

Seciali!area: Biote"nologii #icro$iene i

celulare


2/13

Curin%

IntroducereI& Proriet' ile generale ale la%#idelor 1. Clasificarea plasmidelor 2. Principalele cate gorii de gene codificate de plasmide 3. Structura molecular a plasmidelor 4. Propriet ile fundamentale ale plasmidelorII& Proriet' ile generale ale (e"iculelor de clona) %c*+* i $r,-- 1. Propriet ile generale ale vectorului de clonaj pbr322 2. Propriet ile generale ale vectorului de clonaj psc101

Conclu!ii

Introducere

2


3/13

n preent! plasmidele sunt definite ca fiind repliconi neesen iali! capabili s se

replice fiic independent de cromoom i transmi i "n form e#tracromosomal! pe

vertical $de la o genera ie de indivii la alta% sau pe oriontal $de la un individ la altul "n

cadrul aceleia i genera ii%. n general! plasmidele repreint un fenomen al lumii procariote.

Cu toate acestea! au fost descrise structuri genetice plasmidiale i la unele grupuri de

eucariote inferioare $drojdii! fungi! mucegaiuri% i c&iar i la eucariote superioare

$plasmidele din mitocondrii i cloroplaste la unele specii vegetale% $'assu (atiana i colab.!

2001%.

)#ist cercettori care "ncadrea plasmidele "n categoria organismelor acelulare.

n contrast cu aceast teorie! al i cercettori consider plasmidele ca nefiind organisme! ci

alturi de virusuri! transposoni i secven e de inser ie! aceasta apar ine unor specii

moleculare speciale! de elemente genetice mobile $P. S*+ora! 1,,2 citat de 'assu (atiana i

colab.! 2001%.

I& Proriet' ile generale ale la%#idelor

*& Cla%i.icarea la%#idelor

3


4/13

-up efectul plasmidelor asupra celulelor gad! acestea au fost denumite i

clasificate astfel

/ Plasmide $factori de fertilitate%/ Plasmide $de reisten la antibiotice%

/ Plasmide Col$colicinogene%.Pe baa criteriului de /inco#ati$ilitate/ $capacitatea plasmidelor de a e#clude

alte plasmide de acela i tip de la coe#isten "n aceea i bacterie%! plasmidele au fost

"mpr ite "n grupuri de incompatibilitate. a bacteriile ram/negative au fost descrise peste

30 de grupuri de incompatibilitate $5oldoveanu -umitru i colab.! 2001%.

-up capacitatea lor de a media transferul de material genetic! prin conjugarea

celulelor bacteriene plasmidele pot fi

a& Pla%#ide con)ugati(e $conjugoni! factori de fertilitate! transferoni! factori dese#%.

Sunt transmisibile! infec ioase i controlea stabilirea "n celula gad a strii de

donator de material genetic i apari ia pililor de se#! care permit transferul de material

genetic de la celula purttoare de plasmid $donator% la celule fr plasmid $receptor%. 6u

"n structura lor gene de replicare autonom i gene care stimulea formarea cuplurilor de

"ncruci are "ntre bacterii. Plasmidele conjugative sunt

/ la%#ide de %e0$! 7fr! 8%/ la%#ideEnt/ unele la%#ide Col i R$5oldoveanu -umitru i colab.! 2001%.

$& Pla%#ide necon)ugati(e&

-in acest grup fac parte unele plasmide Col i R. 9u sunt autotransmisibile i deci

neinfec ioase. 9u confer starea de donator de material genetic. Sunt lipsite de genele tra

$care asigur transferul prin conjugare a materialului genetic%. (ransferul lor se realiea

prin intermediul unui fag transductor! sau datorit preen ei concomitente "n celulabacterian a unei plasmide de se#.

o n func ie de capacitatea lor de integrare "n cromosomul bacterian

plasmidele se "mpart "n dou categorii Pla%#ide cu .unc ii ei%o#ale $eng. :episom: ; corp adugat%.

6ceste plasmide pot e#ista alternativ "n stare autonom $libere "n citoplasm %! sau

integrate $"ncorporate "n cromosom%. -e e#emplu! plasmidele de se#F i plasmida Col E1.

Pla%#ide incaa$ile de integrare 1n cro#o%o#ul celulei ga!d' .

4


5/13

-e e#empli! factorul Col i factorul F$un derivate al plasmidei integrate! care a

"ncorporat un fragment de cromosom bacterian% $5oldoveanu -umitru i colab.! 2001%.

-& Princialele categorii de gene codi.icate de la%#ideiind repliconi fiic independen i! toate plasmidele poart gene implicate "n

propria relicare2 %ta$ilitate i arti ie& n afar de acestea! majoritatea genelor codificate

de plasmide confer caractere adaptative! avantajoase gadelor bacteriene. Cele mai

frecvente categorii de gene purtate de plasmide sunt

/ gene de rezisten la antibiotice

Plasmidele de reisten au fost descoperite "n


6/13

3 gene ce codific transferul plasmidelor pe orizontal prin proces de con!ugare

bacterian .

-eci "n afar de genele implicate "n propria replicare! stabilitate i parti ie! plasmidele

mai pot purta i gene ce codific caractere @ unele esen iale! altele neesen iale pentru

bacteria gad.

Caracterele e%en iale repreint ci metabolice centrale ale celulei bacteriene!

plasmidele purttoare fiind preente la marea majoritate a iolatelor naturale ale unor

tulpini bacteriene $de e#emplu! unele plasmide mari de la Agrobacterium tumeaciens!

Rhizobium leguminosarum%.

Anele caractere nee%en iale confer avantaje selective gadelor purttoare!

permi ?nd supravie uirea acestora "n anumite condi ii de mediu. n aceast categorie intr

genele plasmidiale ce codific reisten a la antibiotice i toleran a la metale grele

$asemenea gene sunt preente la multe tulpini de bacterii patogene%. n absen a

antibioticelor sau a metalelor grele ca factori de presiune selectiv! procesele de replicare!

men inere i parti ie a plasmidelor repreint un efort metabolic suplimentar pentru celulele

bacteriene. Ca urmare! "n doar c?teva pasaje! aceste plasmide sunt eliminate din popula ia

bacterian prin subreplicare. )le se men in doar "ntr/o propor ie scut a popula iei

bacteriene! fapt ce ar putea fi considerat o :economie: metabolic la nivelul "ntregii

popula ii bacteriene.

)#ist i a a/numite la%#ide /critice/2 care nu par s ofere gadei nici un

caracter avantajos! interesant este faptul c de i pot fi "ncadrate "n categoria :selfis& -96:

$:6-9 egoist:%! totu i i aceste plasmide sunt men inute "ntr/o anumit propor ie din

popula iile bacterienene $'assu (atiana i colab.! 2001%.

n ansamblu! genomul bacterian se caracteriea printr/o inten%' circula ie e

ori!ontal' a genelor! "ntre diver i indivii bacterieni $7. (sc&ape! 1,,4 citat de 'assu

(atiana i colab.! 2001%.

6ceast circula ie se desf oar prin trei procese centrale @ con)ugare2

tran%.or#are i tran%duc ie 4 dintre care plasmidele sunt implicate "n primele dou.

6cest flu# continuu de gene pare s fie o caracteristic definitorie a lumii

bacteriene i s fi contribuit esen ial la e#trema versatilitate metabolic a bacteriilor "n

aproape toate mediile naturale $'assu (atiana i colab.! 2001%.

,& Structura #olecular' a la%#idelor

6


7/13

Plasmidele sunt molecule de 6-9 circulare! "nc&ise covalent. Circularitatea este o

condi ie esen ial pentru suptavie uirea lor "n celul. -imensiunea plasmidelor este de

apro#imativ 1/2 B din mrimea cromosomului i au un con inut "n bae $C% diferit de

cromosom! datorit informa iei genetice diferite i accesorie. reutatea molecular a

plasmidelor varia "ntre 1!=/1=0 D 10Edal. Plasmidele pot fi gsite "n celulele bacteriene "n

trei forme

1. "orma #$CCC ; eng. :covalentl* closed circular:% corespunde unei molecule

dublu catenare circulare! "nc&is covalent! dar care preint torsiuni ce dau

moleculei aspectul de super&elice. Sub influen a unor agen i c&imici $bromura

de etidiu%! forma de super&elice poate s treac "n forma F inelar rela#at.2. "orma ## $eng. :open circular duple#: sau :nic+ed circular duple#:%

corespunde formei circulare desc&ise! av?nd o caten "nc&is i una desc&is.3. "orma ### $plasmide multimere sau oligomere%. Plasmidele au "n structura lor

mai mult dec?t un genom. C?nd moleculele plasmidiale sunt formate din

genomuri identice legate cap la cap! ele formea structuri numite concatenare

$oligomere concatenate%. C?nd moleculele plasmidiale circulare "nc&ise

super&elicale! sau cele circulare desc&ise! sunt "nln uite ca alele unui lan !

formea structuri numite catenani$oligomere catenate%.

Figura *. Structura molecular a plasmidelor

$5oldoveanu -umitru i colab.! 2001%

7


8/13

9oile te&nici! cum ar fi electroforea "n c?mp pulsatoriu! au permis detectarea

plasmidelor lineare! precum i a celor de dimensiuni mari. Conforma iile moleculare ale

6-9 plasmidial pot fi eviden iate prin ultracentrifugare "n gradient de clorur de cesiu sau

prin electrofore "n gel de agaro! ele preent?nd mobilit i diferite cel mai rapid

migrea forma linear i ultima forma circular desc&is $5oldoveanu -umitru i colab.!

2001%.

5& Proriet' ile .unda#entale ale la%#idelor

Eli#inarea la%#idelor&Plasmidele pot fi eliminate spontan sau prin tratare cu anumite substan e ca

acriflavina! rifampicina! bromura de etidiu! ionii de cobalt! etc. 6ceast proprietate nu

afectea viabilitatea celulei gad.

In"i$area .ertilit' ii 6.i 78&

Anele plasmide ! c?nd coe#ist cu plasmide "n aceea i celul donatoare de E.

Coli!nu modific activitatea de transfer a plasmidelor . 6lte plasmide reduc func ia de

fertilitate a plasmidei cu care coe#ist. 6ceste plasmide preint func ia de in&ibare a

fertilit ii. ertilitatea plasmidelor se e#prim prin faptul c ele sunt mutante spontane in

"! deci nu pot produce unul din componentele represorului.

E0cluderea de %ura.a '&

G plasmid preent "ntr/o bacterie produce anumite modificri ale suprafe ei

celulare! ceea ce creea o barier fiic fa de ptrunderea unei plasmide identice.

Harierea este specific. -e e#emplu! "n caul bacteriilor ! modificare "mpiedic

ptrunderea unei plasmide identice.

Feno#enul de inco#ati$ilitate a la%#idelor&

Fncompatibilitatea corespunde situa iei c?nd dou plasmide omologe! dup

ptrunderea lor "n celul! nu pot fi men inute stabil "n aceea i bacterie! deoarece una o

e#clude pe cealalt indiferent care este reident i care este de suprainfec ie. enomenul se

preint ca un proces polariat. n caul c?nd plasmide diferite ca structur pot coe#ista "n

8


9/13

aceea i bacterie! ele sunt compatibile $Collins! 1,II citat de 5oldoveanu -umitru i colab.!

2001%.

Pe baa acestui criteriu plasmidele au fost grupate "n grupuri de incompatibilitate!

deoarece e#ist o mare omologie "ntre plasmidele din acela i grup de incompatibilitate i o

foarte mic asemnare "ntre plasmidele compatibile. Fncompatibilitatea repreint cel mai

adecvat criteriu de clasificare a plasmidelor. An membru al unui grup de incompatibilitate

nu poate coe#ista "ntr/o celul cu alt membru al aceluia i grup! dar poate coe#ista cu oricare

membru al unui grup de incompatibilitate $5oldoveanu -umitru i colab.! 2001%.

II& Proriet' ile generale ale (e"iculelor de clona) %c*+* i

$r,--

*& Proriet' ile generale ale (ectorului de clona) $r,--

Plasmidul pbr322 a fost unul dintre primii vectori )J2 de clonare multifunc ional

proiecta i $acum 10 ani "n urm% pentru clonarea eficient i selectarea moleculelor de 6-9

recombinant dinEscherichia coli.6ceast molecul de 6-9 a fost folosit pe scar larg ca un ve&icul de clonare

datorit simplit ii i a disponibilit ii secven ei sale de nucleotide. Atiliarea pe scar larg

a vectorului de clonare pbr322 a determinat numeroase studii asupra structurii moleculare i

a func iilor sale.

6ceste studii au relevat dou caracteristici care au afectat eficacitatea plasmidelor

ca vectori de clonare instabilitatea plasmidelor "n absen a selec iei i lipsa unui sistem de

selec ie direct pentru moleculele de 6-9 recombinant.

5ai mul i vectori care se baea pe vectorul pbr322 au fost construi i pentru a

dep i aceste limitri i pentru a e#tinde versatilitatea vectorului de a gdui "n scopuri

speciale clonarea $Halbas P. i colab.! 1,KE%.

-& Proriet' ile generale ale (ectorului de clona) %c*+*

n ultimii ani! a e#istat un interes e#perimental considerabil pentru plasmida

psc101! care a fost folosit ca un ve&icul de clonaj al 6-9/ului! ca un model de replicon

9


10/13

pentru a investiga replicarea plasmidului 6-9! sau ca un donator al genomului "n studiul

reisten ei antibioticelor. nainte de transformare! acest plasmid a fost iolat de la

Escherichia Coli $Stanle* 9. Co&en i 6nnie C. L. C&ang! 1,II%.

6ceast plasmid preint un numr mediu de copii $E/I% per ec&ivalent

cromosomal i are o gen de reisten la tetraciclin. ntreaga plasmid $,2E3 pb% a fost

secven iat.

Prin analie de dele ii s/a constatat c regiunea replicativ a acestei plasmide

repreint un fragment de 2!2 +pb ce este cuprins "ntre situsurile a dou enime de restric ie

@ 7inc FF i sa F.

6ceast regiune replicativ are 3 one majore

1. regiunea par @ foarte important pentru stabilitate i afectea i numrul de

copii

2. regiunea ori @ de la care porne te replicarea unidirec ional i care confer

majoritatea situsurilor necesare pentru replicare i pentru incompatibilitate

3. gena rep$ @ care este o gen specific plasmidial i codific o protein de

replicare.

Plasmidul pSc101! "mpreun cu fagul P1 i cu o serie de alte plasmide apar in unei

clase de repliconi a cror replicare nu este realiat de 6-9 polimeraa. 6ce ti repliconi

codific o protein autoreglat $ReA% esen ial pentru replicare i posed copii repetate

direct ale unei secven e ce este specific pentru fiecare plasmid i la care se ata ea

proteina ep6.

Proteina ep6 este alctuit din 31E aminoacii i func ionea ca dimer.

Promotorul genei rep6 con ine o secven par ial omoloag cu repetri directe. 6stfel!

ep6 are specificitate de ata are i la propriul promotor autoregl?ndu/ i propria e#primare.

n procesul prin care aceast protein controlea replicarea plasmidei! ep6 se ata ea la

cele 3 secven e particip?nd la ini ierea replicrii. )ficien a de legare a lui ep6 la cele 3

secven e S pare s modulee numrul de copii plasmidiale.

5en inerea stabil a plasmidului pSC101 "n celula bacterian presupune

interven ia mai multor clase de proteine -na6! -naH! F7! -naC! -na! precum i

diverse componente proteice ale &oloenimei 6-9 polimeraa FFF $'assu (atiana i colab.!

2001%.

10


11/13

Conclu!ii

1. (oate plasmidele poart gene implicate "n propria relicare2

%ta$ilitate i arti ie&

2. Plasmidul $r,-- a fost unul dintre primii vectori de clonare

multifunc ional proiecta i pentru clonarea eficient i selectarea moleculelor

de 6-9 recombinant dinEscherichia coli.

3. Plasmida %c*+*! care a fost folosit ca un ve&icul de clonaj al

6-9/ului! ca un model de replicon pentru a investiga replicarea plasmidului6-9! sau ca un donator al genomului "n studiul reisten ei antibioticelor.

11


12/13

Bi$liogra.ie

1. Bal$9% P2 So$ern ;2 Merino E2 ?@ # Plasmid $ector pBR%&& and its special#purpose deri$ati$es##a re$ie' . ene!

+6*3,8: 3/40.

2. Moldo(eanu Du#itru2 Militaru Co%tin2 Moldo(eanu Iulia2 -++*@ (icrobiologie i

inginerie genetic). )ditura F6( AM! Hucure ti! p. 12=/1=I.

3. Stanle N& Co"en i Annie C& & C"ang2 *> 4 Re$ised interpretation o the origin o

the pSC1*1 plasmid. < Hacteriol.! *,-6-8 I34@I3I.

4. Va%%u Tatiana2 Stoica Ileana2 C%uta Ortan%a2 Mu at Florin2 -++* @ +enetica

microorganismelor i inginerie genetic) microbian). ,ote de curs i tehnici de

laborator. )ditura Petrion! Hucure ti! p.23/4=.

12


13/13

13

plasmide Și vectori de clonaj

Documents