Studente: • Luca Irina•Pantea Victorita•Terenteac Andreea•Vlasceanu Nona

BMC Anul I

Cuprins1.Introducere

2.Sistemele de expresie virale ale plantelor

2.1. sistemele de prezentare epitope

2.2.Sistemele de prezentare polipeptidice

3. ADN-ul virusurilor la plante ca vectori de expresie

4. Strategii noi de dezvoltare a vectorilor virali

5. Vaccinurile si proteinele terapeutice

6.Concluzii

7.Bibliografie

Introducere Transformarea stabila a plantelor a fost

utilizata în mod curent ca o metodă de exprimare a vaccinurilor şi proteinelor terapeutice.

Vectorii de expresie din plante au fost

cuprinsi de virusi recombinanti care au fost construiti cu gena străină de interes prin înlocuirea genelor capsidei proteice (CP).

Transformarea genetica a plantelor a cunoscut un progres spectaculos, de la obtinerea primelor gene himere, in anii saptezeci ai secolului trecut, la regenerarea primelor plante transformate genetic purtand gene straine (Gasser si Fraley, 1989).

In ultimul deceniu, s-a ajuns la eliberarea in camp si cultivarea pe scara larga a plantelor transgenice, de la 1,7 ha in anul 1996 la 39,9 milioane ha in anul 1999 .

Sisteme de expresie a virusurilor ARN din plante

Există 2 sisteme:

Siteme epitop (peptide antigenice scurte, fuzionate la CP care sunt afişate pe suprafaţa particulelor virale asamblate);

Sisteme polipeptidice (aceste sisteme exprimă întreaga proteină recombinant necondensată care se acumulează în plante).

1.Sistemele de prezentare epitope

La plante mijloacele de apãrare specificã, aparent sunt absente, dar existã o gamã largã de modalitãţi de apãrare nespecificã:

- continuitatea şi integritatea ţesuturilor epidermice, acoperite sau impregnate cu substanţe impermeabile pentru virusuri şi microorganisme;

- rezistenţa fiziologicã conferitã de conţinutul înalt de zaharuri reducãtoare, prezenţa taninurilor, a diferiţilor acizi organici, a pseudoanticorpilor cu activitate hemaglutinantã în sucurile vegetale.

Fig.1 Organizarea genomului virusurilor plantelor folosite pentru a exprima peptide heteroloage/ proteine din plante. Poziţiile în care epitopii au fost introdusi în capsida proteica, din fiecare virus sunt indicate prin săgeţi. Pozitii în cazul în care o genă străină de interes a fost introdusa în genomul virusului este indicat de cutii. eclozate Proc: cofactorul proteinazei; Hel: helicaze; VPg: genomeul virus ului legat de proteine ; Pro: protează; Pol: polimeraza;

MP: proteine de circulaţie; LCP: capsidă;proteica mare SCP: capsidă proteica mici; TGB: bloc de gene triple; CPMV: Virusul mozaicului cowpea; TMV: virusul mozaicului tutunului; PVX: virus X. al cartofului (Adaptate la Canizares et al. (2005). Immunol. Cell Biol. 83: 263-270).

A) Virusul mozaic Cowpea (CPMV)

virus ARN bipartit; primul virus dezvoltat ca

un sistem de prezentare epitop;

format din 60 de copii pentru fiecare din cele două mari (L) şi mici (S) subunităţi proteice de înveliş (aranjate pentru a forma o capsida icosahedrică ce înconjoară genomul ARN-ului bipartit); Fig.2 Structura CPMV constructe ARN-1 si

ARN-2

B) Virusul mozaicului tutunului(TMV)

Virusul X al cartofului (PVX)

membru al genului Tobamovirus şi codifică patru polipeptide.

formă de tijă; dispune de un ARN-

genomic=6.5kb; utilizat ca antigenul de

prezentare. TMV conţine 2130 de copii ale

capsidei proteine , ceea ce o face o platformă atractivă pentru afişarea peptidelor.

se transmite prin sol, prin contact între plante;

Fig3 .Structura moleculara de ADN (stânga). ADN-ul supercoiling (centru). Auto-asamblarea TMV (fără ARN)(dreapta).(http://www.chem.wisc.edu/courses/801/)

C) Virusul X al cartofului(PVX) membru al genului Potexvirus; formă de tijă care conţine un

genom monopartit; PVX este o particulă filament

serpuitoare; informaţiile structurale pentru

PVX este mai puţin completă decât este pentru TMV şi CPMV;

In celulele cartofului, virusul X produce incluziuni sub formă de benzi (particule virale) şi incluziuni proteice lamelare la care proteina nu este înrudită cu capsida virionului. Fig.4 Vectorul PVX201

(http://www.emidioalbertini.com/vectors.html

2.Sistemele de prezentare polipeptidice

I)TMV-genele vaccinurilor în integritatea lor sunt exprimate prin expresia vectorului TMV-30B printr-o copie suplimentară a promotorului Cp subgenomice;

o prin inginerie o încetare a permeabilităţii codonului la C-terminal al genei virale CP, TMV- bazat pe vector ar putea fi dezvoltat, rezultând capacitatea de virus modificat pentru a sintetiza ambele forme: nativă şi recombinantă a CP din acelaşi ARNi –viral;

α-Tricosantina - prima proteină terapeutică produsă în centrale, folosind un vector viral TMV.

II) Sunt 2 tipuri de PVX pe bază de vectori virali care au fost generate pentru producerea de proteine , - una dintre acestea implică dublarea CP-ului subgenomic promotor ;

Exemple de proteine produse cu ajutorul PVX-ului:

-E7 de tip papiloma-virusul uman 16;

-VP6 de rotavirus murine;

-diversi anticorpi umani ScFv;

III)Virusul mozaic cowpea (CPMV) Specia tip a genului

Comovirus A fost folosită pentru a

exprima protine full-lenght Proteinele heterologe sunt

exprimatate fie ca proteine de înveliș sau proteine de fuziune în mișcare cu un situs al clivajului proteolitic pentru a permite proteinei țintă să fie lansată sau să fuzioneze cu proteina C-terminal cu proteina S, care încorporează FMDV peptida 2A.

Fig.5 Structura virusului mozaic cowpea

IV) Virusul variolă la prun (Plum pox virus - PPV)

Specie a genului Potyvirus; Genomul monopartit codifică o

singură poliproteină de la care toate proteinele individuale ale virusului sun eliberate prin clivajul proteolitic;

Strategia generală de a exprima toate proteinele folosind PPV a fost, prin urmare aceea de a suporta situsurile de recunoaștere pentru proteinaza VPg.

Proteina VP60 de la virusul bolii hemoragice (RHDV) la iepuri a fost introdusă între regiunile de codare ale polimerazei și proteinei de înveliș.

Fig.6 Fructe de prun atacate de virusul variolă

V) Virusul mozaic la castravete Cucumber mosaic virus – CMV

Specie a genului Cucumovirus; Conține un genom de

ARNtripartit; O tulpină pseudorecombinantă a

virusului , cuprinde ARNs 1 și 2 din tulpina CMVD (Natilla);

Epitopul R9 sintetic al proteinei virusului E al hepatitei C (VHC), a fost introdus în trei situsuri separate în gene proteinei de înveliș al CMV. Fig.7 Structura virusului mozaic la

castravete

Virusul mozaic la castraveteCucumber mosaic virus – CMV

Caulimovirușii și geminivirușii

Este dificil a lucra ca Caulimovirușii din cauza:

o genomului său polycistronic;

o modului de replicare a ARN-ului;

Germinivirușii dispun :o de o organizare genomică

simplă;o o gamă largă de gazde,o pot acumula un număr

extrem de ridicat de copii în celulele inoculate.

ADN-ul virusurilor la plante ca vectori de expresie

Caulimovirus (CaMV)

Geminivirusul Caulimovirus (CaMV)

Strategii noi de dezvoltare a vectorilor virali

Acestea urmăresc construirea de expresii ale vectorilor virali la plante care posedaă modificări capabile să exprime secvențe heterolog care codifică o genă sau epitop, dar se comportă ca virusurile de tip sălbatic.

Aceste virusuri funcționale au posibilitatea de a se muta sistemic prin gazda lor, rețin infecțiozitatea șei produc particule virale infecțioase.

O strategie este de a plasa gene ce sunt esențiale dintr-un vector de expresie a virusului în genomul unei plante transgenice.

Vaccinurile si proteinele terapeutice Vaccinarea este o metodă de

imunizare activă, profilactică, împotriva unor boli, prin inocularea unui vaccin.

Vaccinurile sunt preparate biologice dotate cu proprietăți antigenice, care declanșează apariția răspunsului imun la organismele supuse vaccinării.

Vaccinarea și termenul de vaccin au fost introduse în medicină de medicul generalist englez Edward Jenner, în anul 1796, cu ocazia descoperirii primului vaccin, împotriva variolei

Clasificare A)După mecanismul de

acțiune Vaccinuri care acționează prin

activarea mecanismelor imunității umorale (producerea activă de anticorpi specifici de către organismul vaccinat).

Din această categorie fac parte majoritatea vaccinurilor.

Vaccinuri care acționează prin activarea mecanismelor imunității celulare: vaccinul BCG (împotriva tuberculozei).

B)După specia țintă Vaccinuri de uz uman Vaccinuri de uz veterinar

C)După conținutul biologic Vaccinuri care conțin

microorganisme vii atenuate Vaccinuri care conțin

microorganisme inactivate Vaccinuri care conțin

componente microbiene purificate, proteice sau polizaharidice conjugate proteic

Vaccinuri care conțin proteine recombinate

Exemple selectate de vaccinuri şi proteine terapeutice, exprimate în plante, folosind vectorii de exprimare virală a plantelor

Virus Vaccine/Therapeutic Protein Reference

TMV HIV-1 peptide Yusibov et al., 1997TMV Malarial peptide Turpen et al., 1995PVX Major birch antigen bet v 1 Wagner et al., 2004PPV VP2 peptide from canine parvovirus Fernandez-Fernandez et al., 1998CPMV HIV-1 peptide Porta et al., 1994CPMV Human rhinovirus 14 CP peptide Porta et al., 1996CPMV FMDV VP1 epitope Wu et al., 2003CPMV Canine parvovirus VP2 epitope Porta et al., 1996AlMV Rabies virus Yusibov et al., 2002TMV α-Trichosanthin Kumagai et al., 1993TMV SvFv-CP McCormick et al., 1999TMV BHV-1 Kumagai et al., 1993TMV hGH Gils et al., 2005TMV Bovine rotavirus VP8 Perez-Filgueira et al., 2004BeYDV SEB Hefferon and Fan, 2004

Vaccinurile produse de plante oferă mijloace sigure şi ieftine cu ajutorul cărora animalele pot fi imunizaţi împotriva patogenilor virali.

Vectorul de expresie TMV poate fi utilizat pentru a produce  peptide străine, expuse la suprafaţa virusului. Peptidele epitop exprimate sunt considerate a fi extrem de imunogenice deoarece acestea sunt expuse la suprafaţa particulelor virusului în timpul de asamblare al virusului.

Deoarece epitopii conţin doar un mic fragment de peptidă  antigenică, ei prezintă mai puţin un pericol biologic şi astfel  nu pot crea nici o boală.

TMV-30B ar putea fi utilizat pentru a

produce fragmente de VP8 proteinele structural ale bovinelor

Această plantă VP8 purificată şi derivată a fost capabilă să creeze un răspuns anticorp viral specific la femelele vaccinate. În plus, ar putea induce protecţie pasivă la progeniturile lor.

planta derivată VP-8, generată de un vector viral bazat pe TMV poate prezenta mijloace foarte economice şi facile pentru a produce antigene virale ieftine şi sigure în plante.

Fig.8 Dezvoltarea virusului pe frunze de tutun

PVX PVX a fost dezvoltat de

asemenea ca un sistem de expresie a producţiei antigenilor cu scopuri imunogenice.

a fost folosit cu succes ca un vector de exprimare a antigenului tuberculoză ESAT-6, sub forma unei fuziuni proteine cu peptide clivaj FMDV 2A şi proteine strat de PVX.

Fig.9 Plante infectate cu PVX(http://www.biologyimagelibrary.com/fullI)

Virusul mozaicul lucernei (AlMV)

  Virusul mozaicul lucernei (AlMV) şi TMV au fost examinate ca un set combinat de două plante pe bază de virus vectori de expresie pentru producerea antigenului străin.

Clona de lungime maximă

infecţioasă ADNc de AlMV ARN3 (AlMV este un virus ARN tripartit) a fost folosită pentru prima expresie a vectorului.

Fig.10 Virusul dezvoltat pe frunze de lucerna

VIGS (Virus induced gene silencing) VIGS se refera la reducerea la tacere a genelor

plantelor endogene folosind vectori ai virusurilor recombinante.

Fig.11 Virus-induced gene silencing of PDS. A) Seed-geminated S. bulbocastanum. B) Tuber-generated S. bulbocastanum. C) Close up of PDS-silenced region of tuber-generated S. bulbocastanum.

Exemple de virusuri care induc tacerea genelor folosind vectorilor plantelor virale

Target Silencyng

Gene Virus Host Phenotype Reference

NbPDS TMV N.benthamiana Photobleaching Lacomme et al,2003

NbCesA PVX N.benthamiana Dwarf plant Burton et al,2000

NbCDPK2 PVX N.benthamiana Wilting/HR Romeis et al,2001

NbCDPK1 PVX N.benthamiana Cell death Lee et al,2003

NbWIPK PVX N.benthamiana HR Sharma et al,2003

Concluzii Acest capitol s-a ocupat de cele mai recente evoluţii în

proiectarea de vectori ai virusurilor din plante şi bazate pe

aplicaţiile lor într-o varietate de utilizări, inclusiv

dezvoltarea vaccinurilor şi descoperirea funcţiilor genelor.

Exprimarea de proteine a vaccinurilor la un nivel

ridicat de plante folosind vectori ai virusurilor vor servi

drept alternative atractive pentru un mijloc rapid de

generare, cost-eficiente, sigure şi dezvoltarea vaccinurilor

pentru ţările în curs de dezvoltare.

În cazul biofarmaceuticii plantmade, mai multe eforturi ar trebui să fie făcute pentru a dezvolta sisteme de expresie ale virusurilor care infecteaza plantele gazdă potrivite pentru livrare pe cale orală, cum ar fi legumele şi cerealele.

Tehnici, cum ar fi acestea, pot fi folosite pentru a oferi o multitudine de informaţii cu privire la funcţia genelor plantelor, care pot fi apoi aplicate pentru multe scopuri, cum ar fi cercetarea de bază, precum şi dezvoltarea agriculturii.

Tehnologiile bazate pe vectorii de expresie ale virusurilor plantelor au capacitatea de a oferi o multitudine de servicii atât în biologia cat şi medicina plantelor pentru mulţi ani de acum încolo.

Bibliografie Belanger, H., Fleysh, N., Cox, S. et al. (2000). Human

respiratory syncytial virus vaccine antigen produced in plants. FASEB J. 14: 2323–2328.

Yusibov, V., Shivprasad, S., Turpen, T.H., Dawson, W., and Koprowski, H. (1999).Plant viral vectors based on tobacco mosaic viruses. Curr. Top. Microbiol.immunol. 240: 81–94.

KATHLEEN LAURA HEFFERON. Biopharmaceuticals in Plants,ed.CRC PRESS, London,pag:77-92

http://www.referat.ro/referate/Plante_transgenice_2db2d.html

VA MULTUMIM PENTRU ATENTIE!