MICROORGANISMELE EXTREMOFILE. GRUPE, CARACTERIZARE, IZOLARE ÎN

CULTURĂ PURĂ

Cuprins

1.Utilizarea microorganismelor extremofile în biotehnologii. Noțiuni introductive……….. 3

2.Clasificarea microorganismelor extremofile………………………………………………....7

3. Microoganisme termofile și hipertermofile………………………………………………….7

4. Microoganisme psichrofile…………………………………………………………………. 11

5. Microoganisme alcalofile…………………………………………………………………….12

6. Microoganisme acidofile……………………………………………………………………..13

7. Microoganisme halofile............................................................................................................14

8. Microoganisme barofile...........................................................................................................15

9. Microorganisme rezistente la radiaţii....................................................................................15

10. Microoganisme oligotrofe.....................................................................................................15

1. Utilizarea microorganismelor extremofile în biotehnologii. Noțiuni introductive

În lumea vie, există o serie de microorganisme care pot popula medii extreme. Aceste microorganisme au dezvoltat de-a lungul timpului o serie de adaptări, de ordin structural şi chimic, ce le permit dezvoltarea şi supravieţuirea în medii extreme.

Mediile extreme includ mediile cu temperaturi, pH, presiuni, concentraţii de sare ridicate şi pe cele cu temperaturi, pH, concentraţii de nutrienţi şi disponibilitatea apei scăzute. Deasemenea, în categoria mediilor extreme sunt incluse şi cele cu nivele ridicate de radiaţii, metale grele şi compuşi toxici.

În ultima perioadă, biotehnologia a demarat o intensă cercetare asupra microorganismelor extremofile, datorită numeroaselor aplicabilităţi din industrie. Unul dintre cele mai bune exemple îl constituie extremoenzimele, care sunt deja folosite pe piaţă. Cele mai cunoscute extremoenzime sunt proteazele alcaline din detergenţi. Acestea au o piaţă de desfacere foarte mare, luând în considerare piaţa mondială de detergenţi. O altă aplicabilitate importantă o constituie obţinerea de AND polimeraze, cu aplicabilitate în tehnica PCR (obţinute de la tulpini de Thermococcus littoralis, Thermus aquaticus, Thermotoga maritime, Pyrococcus woesii şi P. furiosus ). O inovaţie importantă o constituie deasemenea enzimele termostabile, care conduc hidroliza amidonului, precum α-amilaze care nu necesită ionul de Ca2+, amilopululanaze, glucoamilaze şi glucozo-izomeraze, care sunt active la pH-ul la care are loc hidroliza amidonului. Xilanazele termostabile şi alcaline sunt folosite în tratamentul de preînalbire a cojilor, pentru a reduce cantitatea de clor necesară etapei de înalbire. Bergquist et al au reuşit să introducă şi să exprime două xilanaze din Dictyoglomus thermophilum, în Kluyveromyces lactis şi Trichoderma reesei. Dunaliella bardawii, o alga verde extremofilă, este folosită la obţinerea de beta-caroten; Marinobacter hydrocarbonoclasticus, o halotolerantă, este capabilă să degradeze o varietate de hidrocarburi alifatice şi aromatice. Nicholson si Fathepure au pus la punct o cultură halofilică capabilă să degradeze în 1-2 săptămâni un amestec de benzen, toluen, etilbenzen și xileni. În acest fel se poate pune la punct o metodă cu cost redus cu aplicabilitate în amelioarea solurilor şi protejarea acviferelor.

În tabelul 1 sunt prezentate potenţialele aplicabilităţi ale extremofilelor.

Tabelul 1. Aplicaţii ale microorganismelor extremofile

Sursa UtilizareaTermofile

ADN-polimeraze PCRAND-ligaze LCRFosfataza-alcalină DiagnosticProteaze şi lipaze Produse lactateLipaze, pululanaze, amilopululanaze şi proteaze Panificaţie, producerea berii α-amilaze, glucoamilaze, α-glucozidaze, Procesarea amidonului, folosirea amilopululanaze, izomeraze glucozei şi fructozei ca îndulcitoriAlcool dehidrogenază Sinteze chimiceXilanaze Înălbirea hârtieiAntibiotice FarmaceuticMicroorganisme ce degradează petrolul SurfactanţiMicroorganisme sulf-oxidante Desulfurizări

2

PsichrofileFosfataza alcalină Biologie molecularăProteaze, lipaze, celulaze şi amilaze DetergenţiLipaze şi proteaze Producerea brânzeturilorProteaze Soluţii pentru curăţarea lentilelor de

contactAcizi graşi polinesaturaţi Aditivi şi suplimente alimentare

β-galactozidază Hidroliza lactozei din produse lactate Dehidrogenaze Biotransformări

Oxidaze Bioremedieri, biosenzoriMicroorganisme “ice minus” Protectia plantelor sensibile împotriva

înghețuluiHalofile

Bacteriorhodopsina Generatori de curent în bioelectronicăPolihidoxialcanoați Plastic de uz medicalPolimeri reologici Recuperarea petroluluiLipide Lipozomi pentru medicamente și

cosmeticeLipide Încălzirea uleiuluiSoluți compatibili Protectori ai proteinelor și celulelor în

diferite procese (încălzire, înghețare)Diferite enzime Diferite utilizări (agenți de aromă)Acid γ-linoleic, β-caroten și extracte celulare Suplimente alimentare, hrană dietetică,

coloranțiMicroorganisme Modificatori ai aromei și texturii

produselor alimentare și fermentarea sosurilor de pește

Microorganisme Degradarea și transformarea deșeurilorMembrane Surfactanți pentru produse farmaceutice

AlcalofileProteaze, celulaze, xilanaze, lipaze și pululanaze DetergențiElastaze, keratinize Îndepărtarea pielii/păruluiCiclodextrine Utilizări în farmaceutică, industria

chimică și alimetarăXilanaze și proteaze ÎnălbirePectinaze Industria hârtiei, degomare și tratarea

deșeurilorMicroorganisme alcalofile Producere de antibiotice

AcidofileMicroorganisme sulf-oxidante Recuperare de metale și desulfurarea

cărbuneluiMicroorganisme acidofile Acizi organici și solvenți

3

Microorganisme tolerante la solvenți organici Bioconversia compușilor insolubili în apă (exemplu steroli), bioremediere, biosurfactanți

Microorganisme rezistente la radiații Degradarea puluanților organici din mediile poluate cu deșeuri radioactive

Barofile Îmbunătațirea procesului de recuperare a petrolului

(Cavicchioli, R., 2000)

Microorganismele care sunt capabile să supravieţuiască în mediile extreme poartă denumirea de microorganisme extremofile. Aceste microorganisme, nu numai că tolerează aceste medii, dar in mod normal aceste condiţii de medii sunt esenţiale pentru supravieţuirea şi dezvoltarea lor. Condiţiile normale de creştere sunt considerate: pH apropiat de neutru, temperatura între 20 şi 40oC, presiunea aerului aproximativ 1 atm şi nivele corespunzătoare de nutrienţi, săruri şi apă. Orice mediu care este în afara acestor parametrii este considerat extrem (Satyanarayana, 2005) .

În Tabelul 2 sunt prezentate “recordurile” microorganismelor extremofile. Datele sunt adaptate dupa Ferreira et al. (1997), Madigan (2000) şi Seckbach şi Oren (2004).

Tabelul 2. “Recorduri” ale microorganismelor extremofile

Factor de mediu Organism Habitat Toleranţa la factorul de stres

Temperatura ridicată Pyrolobus Crăpături oceanice Maxim 113OC fumarii hidrotermale Optim 106 OC

Minim 90 OC

scăzută Polaromonas apă de mare Minim 0OCvacuolata înghetată Optim 4 OC

Maxim 12 OC

pH scăzut Picrophilus izvoare acide pH minim 0.06oshimae pH optim 0.7

pH maxim 4

ridicat Natronobacterium lacuri bazice pH maxim 12gregoryii pH optim 10

pH minim 8.5

Presiune hidrostatică Tulpina MT41 Groapa Marianelor Maxim >100 MPa Optim 70 MPa Minim 50 MPa

Concentraţia de sare Halobacterium lacuri sarate, Maxim:NaCl la saturaţiesalinarum saraturi, Optim: 250 g sare/l

peste sarat Minim: 150 g sare/l

Ultraviolete şi radiaţii Deinococcus carne tocată, Rezistent la 1.5 kGy

4

ionizante radiodurans secretii nazale, radiaţii gamma şi la deşeuri radioactive 1500 J/m2 UV

(Rainey, F., 2006)

Deasemenea, există și microorganisme poliextremofile, capabile să supraviețuiască în condiții limitate de mai mulți factori (combinați). În tabelul 3 sunt prezentate o serie de microorganisme adaptate la combinații de medii extreme.

Tabelul 3. Microorganisme poliextremofile

Factorii de mediu Organism Habitat Toleranţa la factorul de stres

pH scăzut, Picrophilus Izvoare termale pH minim – 0.06temperatură ridicată oshimae acide temperatura max. 65OC

Sulfurisphaera Izvoare termale pH minim – 1acide temperatura max. 92OC

Cyanidium Izvoare termale pH minim – 0.2caldarium acide temperatura max. 57OC

pH ridicat, Natronobacterium Lacuri bazice pH maxim 12concentrație de gregoryi NaCl la saturațiesăruri mare

Temperatură ridicată, Thermococcus Izvoare hidrotemale temperatura max. 90OCpH ridicat alcaliphilus marine pH maxim 10.5

Temperatură ridicată, Thermococcus Curenți termali, temperatura max. 100OCpresiune ridicată barophilus lanțul muntos presiunea 15-17.5 MPa

al Atlanticului

Temperatură ridicată, Deinococcus Izvoare termale temperatura max. 100OCradiații înalte geothermalis rezistă la radiații gamma

de peste 10kGy(Rainey, F., 2006)

Existenţa vieţii în condiţii extreme este intens studiată, concentrându-se pe diversitate şi pe mecanismele moleculare şi de reglare implicate. Proteinele, enzimele sau alte substanţe biocompatibile produse de extremofile prezintă un interes foarte mare pentru biotehnologie. Deasemenea, studiul extremofilelor ale aplicaţii şi în astronomie, urmărindu-se existenţa vieţii pe alte planete.

5

2. Clasificarea microorganismelor extremofile

În funcţie de parametrii care variază în mediu, microorganismele extremofile se clasifică în: Acidofile: microorganisme care au un pH-ul optim sub valoarea 3; Alcalofile: microorganisme care au un pH-ul optim peste valoarea 9; Barofile: microorganisme capabile să supravieţuiască în medii cu presiune

hidrostatică ridicată; Halofile: microorganisme ce necesită concentraţii de sare de cel puţin 0.2M; Hipertermofile: microorganisme care se dezvoltă la temperaturi ridicate 80-122 oC; Hipolite: microorganisme care se dezvoltă sub rocile deşerturilor reci; Litoautotrofe: microorganisme a căror sursă de carbon este CO2; Metalotolerante: microorganisme capabile să tolereze concentraţii ridicate de metale

precum cuprul, cadmiu, zinc sau arsenic; Oligotrofe: microorganisme capabile să se dezvolte în medii limitative; Osmofile: microorganisme capabile să se dezvolte în medii cu concentraţii ridicate

de zaharuri; Poliextremofile; Psichrofile: microorganisme care sunt capabile să se dezvolte, să supravieţuiască şi

să se înmulţească la temperaturi scăzute (-15 oC) ; Rezistente la radiaţii; Termofile: microorganisme care sunt capabile să se dezvolte, să supravieţuiască, să

se dezvolte şi să se înmulţească la temperaturi cuprinse între 60-80oC; Termoacidofile: se dezvoltă la temperaturi între 60-70 oC şi pH între 2 şi 3; Xerofile: microorganisme care se pot dezvolta în condiţii cu umiditate foarte scăzută.

(http://en.wikipedia.org/wiki/Extremophile)

3. Microoganisme termofile și hipertermofile

Termofilele sunt microorganisme care sunt capabile să se dezvolte, să supravieţuiască, să se dezvolte şi să se înmulţească la temperaturi cuprinse între 60-80 oC.

Hipertermofilele sunt microorganisme capabile să se dezvolte la temperaturi superioare celei de 80 OC. Marea majoritate a hipertermofilelor a fost identificată în zonele vulcanice continentale și oceanice și în sol.

În afara interesului ecologic și evoluționist pe care îl au, microorganismele termofile prezintă un interes deosebit datorită faptului că sunt surse excelente de biomolecule utile cu aplicații biotehnologice (Rainey, F., 2006).

Microorganismele termofile aparţin atât procariotelor, cât şi eucariotelor. În sol, compost, rumeguş sau în cuiburile păsărilor au fost identificaţi fungi termofili, care aparţin Zygomycetes (Rhizomucor miehei, R. pusillus), Ascomycetes (Chaetomium thermophile, Thermoascus aurantiacus, Dactylomyces thermophilus, Melanocarpus albomyces, Talaromyces thermophilus, T. emersonii, Thielavia terrestris), Basidiomycetes (Phanerochaete chrysosporium) şi Hyphomycetes(Acremonium alabamensis, A. thermophilum, Myceliophthora thermophila, Thermomyces lanuginosus, Scytalidium thermophilum, Malbranchea cinnamomea). Dintre algele care se dezvoltă la temperaturi ridicate putem aminti: Achanthes exigua, Mougeotia sp. şi Cyanidium caldarium, iar ca protozoare: Cothuria sp., Oxytricha falla, Cercosulcifer hamathensis, Tetrahymena pyriformis, Cyclidium citrullu şi Naegleria fowleri.

În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare, bacteriile şi arhebacteriile au fost clasificate în termofile moderate (Bacillus caldolyticus, Geobacillus stearothermophilus, Thermoactinomyces

6

vulgaris, Clostridium thermohydrosulfuricum, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoplasma acidophilum), extreme (Thermus aquaticus, T. thermophilus, Thermodesulfobacterium commune, Sulfolobus acidocaldarius, Thermomicrobium roseum, Dictyoglomus thermophilum, Methanococcus vulcanicus, Sulfurococcus mirabilis, Thermotoga mritima) şi hipertermofile (Methanoccus jannaschii, Acidianus infernos, Archaeoglobus profundus, Methanopyrus kandleri, Pyrobaculum islandicum, Pyrococcus furiosus, Pyrodictium occultum, Pyrolobus fumarii, Thermococcus littoralis, Ignicoccus islandicum, Nannoarchaeum equitans). Acestea au fost izolate din surse ca: composturi, soluri expuse la radiaţii solare, izvoare termale terestre, crăpături submarine hidrotermale sau rezerve geotermale de petrol. Tulpini extremotermofile de Geobacillus thermooleovorans au fost izolate din izvoare fierbinti; deasemenea, Kasheri și Lovely au izolat o tulpină ce reduce Fe(III) la Fe(II) din crăpătura izotermală Mothra (Pacificul de Nord), care poate rezista la 121OC, aceasta fiind temepratura cea mai ridicată la care poate supravieţui un microorganism (Satyanarayana, 2005).

În mod normal proteinele, acizii nucleici sau lipidele din structura microorganismelor se deteriorează la temperaturi înalte; dar nu este şi cazul termofilelor. Lipidele membranare ale termofilelor conţin o cantitate mai mare de acizi graşi nesaturaţi şi cu catena neramificată decât cele ale mezofilelor. Acest lucru permite termofilelor să se dezvolte la temperaturi ridicate, asigurând gradul de fluiditate necesar bunei funcţionări a membranei. Multe specii de termofile prezintă un strat paracristalin la suprafaţă, alcătuit din proteine sau glicoproteine şi care functionează ca o barieră protectivă.

Dintre hipertermofile, cel mai intens au fost studiate speciile de termoacidofile aparținând ordinului Sulfolobales, metanogenele și câteva specii aparținând ordinului Thermococcales. Principala limitare în studiul acestor microorganisme o constituie cantitatea mică de biomasă care poate fi obținută. Thermococcalele au fost izolate din ecosisteme marine, excepție făcând Thermococcus sibiricus, izolat dint-un zăcământ de petrol cu temperatură ridicată și Thermococcus zilligii și Thermococcus waiotapuensis, ambele izolate din izvoare geotermale continentale. Ordinul cuprinde trei genuri: Thermococcus, Pyrococcus și Palaeococcus, care sunt anaerobe, utilizează peptidele ca sursă de carbon și majoritatea lor se dezvoltă foarte bine în prezența sulfului, producând o cantitate mare de hidrogen sulfurat. Pentru cultivarea acestor microorganisme se preferă utilizarea bioreactoarelor din sticlă, cu bule de gaz. În figura 1 este prezentat un bioreactor utilizant pentru cultura termofilelor.

7

Figura1. Bioreactor cu bule de gaz utilizat pentru cultura hipertermofilelor. A-schema bioreactorului, B-imagine laterală, C-imagine a părții superioare

(Godfroy, A., 2006).

Recoltarea probelor pentru termofilele marine se face în general folosind sonde care sunt acționate de la suprafață, procedeul fiind destul de anevoios. Pentru colectarea diferitelor probe din izvoare termale de adâncime sunt necesare aparate speciale pentru colectare- DSV (“Deep Submergence Vehicles”) și ROV („Remotely Operative Vehicles”). Probele conțin fie lichide, fie porțiuni solide (structuri ale coșurilor vulcanice, roci, sedimente, viețuitoare, etc.). Probele lichide sunt colectate in floacoane Niskin, seringi de titan sau tuburi ORI. Probele solide sunt colectate cu echipamentele DSV sau ROV, care au in componență un compartiment steril de colectare a probelor. După colectare, probele trebuiesc procesate imediat, datorită faptului că majoritatea termofilelor sunt anaerobe sau facultativ anaerobe (excepție făcând Marinithermus hydrothermalis, Aeropyrum Camini și câteva tulpini de Thermus ) . În mod normal probele sunt păstrate în sticle cu dop de cauciuc impermeabil la gaze, în atmosferă de azot. Mediile de cultură folosite diferă în funcție de necesitățile nutritive ale microorganismului. Termofilele marine pot fi clasificate în: microorganisme fermentative, metanogene, heterotrofe aerobe, reducătoare autotrofice sau heterotrofice de nitat, sulfat, sulf sau fier. În tabelul 4 sunt prezentate principalele tipuri de termofile marine, în funcție de metabolism.

8

Tabel 4. Microorganismele termofile în funcție de metabolism.

Tipul metabolic Ordinul (Genul) Substrat sau Aceptor de e-

donor de e-

Fermentative Thermococcales (Thermococcus, Materie organică - (H+) Pyrococcus, Palaeococcus), Thermotogales (Thermosipho și Marinitoga), Clostridiales (Tepidibacter, Caminicella, Caloranaerobacter) și Desulfurococcales (Staphylothermus) Thermoanaerobacterales (Caldanaerobacter) H2O, materie organică CO,-

Metanogene Methanococcales (Methanocaldococcus, H2(format)CO2

Methanotorris, Methanothermococcus)și Methanopyrales (Methanopyrus) H2

CO2

Heterotrofe aerobe Desulfurococcales (Aeropyrum) Materie organică O2

Thermales (Marinithermus) Materie organică O2

Thermales (Vulcanithermus și Materie organicăO2, NO3

-

Oceanithermus)Chemolitoautotrofe Desulfurococcales (Ignicoccus), H2 S0 (NO3

-,obligate Desulfurobacterium S2O3

2- , SO32-)

group (Desulfurobacterium, Balnearium,Thermovibrio) şi Nautiliales (Lebetimonas)Thermodesulfobacterales H2 SO4

2-

(Thermodesulfobacterium şiThermodesulfatator)Aquificales (Persephonella şi Aquifex) H2 (S0, S2O3

2- ) O2,NO3

-,(S0)Nautiliales (Caminibacter) H2

NO3-,S0, O2

Facultativ chemolitoautotrofe Archaeoglobales (Archaeoglobus H2 , Materie organică SO4

2-, FeIIIşi Geoglobus) S2O3

2- ,SO32-

Deferribacterales (Deferribacter) H2, Materie organică

NO3-,FeIII

S0, arsenat

Nautiliales (Caminibacter and Nautilia) H2, Materie organică NO3-,S0,

SO3

2-

Thiotrichales (Thiomicrospira) S0, S2O32- , S2-

O2

Heterotrofe obligat Desulfurococcales (Pyrodictium) H2, Materie organică S0, S2O32-

9

anaerobe Desulfuromonadales (Geothermobacter) Materie organicăNO3

-,FeIII(Nakagawa,S., 2006)

Majoritatea termofilelor necesită cultivarea în condiții anaerobe. Culturile se realizează în mod normal în tuburi Hungate sau în baloane de 100-250 ml, închise cu dopuri de cauciuc. Volumul mediului de cultură trebuie să fie cel mult 20% din volumul baloanelor sau tuburilor. Volumul liber de gaz trebuie să fie H2, H2/CO2 (80:20), N2 sau N2/CO2. Cel mai folosit mediu de cultură este mediul salin bazal (apă de mare sintetică), care are urmatoarea compoziție, raportată la un litru de apă deionizată și distilată:

NaCl 25 g MgCl2 x 6H2O 4.2g MgSO4 x 7H2O 3.4g KCl 0.5 g NH4Cl 0.25 g K2HPO4 0.14 g CaCl2 x 2H2O 0.7g FeSO4 x 7H2O 0.02g Soluție minerală 10 ml.

Soluția minerală are următoarea compoziție (per litru de apă distilată și deionozată): Acid nitrilotriacetic (NTA) 1.5g MgSO4 x 7H2O 3 g MnSO4 x 5H2O 0.5 g NaCl 1.0 g FeSO4 x 7H2O 0.1 g CoSO4 x 7H2O 0.18 g CaCl2 x 2H2O 0.1 g ZnSO4 x 7H2O 0.18 g CuSO4 x 5H2O 0.01 g KAl (SO4)2 x12H2O 0.02 g H3BO3 0.01 g Na2MoO4 x 2H2O 0.01 g NiCl2 x 6H2O 0.075 g Na2SeO3 x 5H2O 0.05 g

Acest mediu este adaptat în funcție de necesitățile speciale ale microorganismului de interes. Incubarea se face fie în incubatoare, fie în baie de ulei, care pot atinge temperaturi de peste 130 oC și presiune de 400kPa. Izolarea în culturi pure se face folosind tehnica diluțiilor repetate. Primul pas îl reprezintă determinarea densității celulare din cultura ce va urma să fie supusă diluțiilor. În continuare se realizează diluții seriale 1:10 până când densitatea celulară ajunge la aproximativ 102-103 celule/ml. Din ultima diluție se fac diluții de 1:2 până când factorul total de diluție depășește densitatea celulară inițială cu cel puțin două ordine de mărime. Întreaga operație de diluție este necesar să fie repetată de 3-5 ori (Nakagawa, S., 2006).

4. Microoganisme psichrofile

10

Până la ora actuală, s-au raportat numeroase specii de microorganisme psichrofile (peste 100), atât Gram pozitive, cât şi Gram negative. Acestea au fost identificate în sol, nisip, ape dulci, ape marine sau în gheţarele mărilor şi oceanelor. Psichrofilele aparţin genurilor Alcaligenes, Alteromonas, Aquaspirillum, Arthobacter, Bacillus, Bacteroides, Brevibacterium, Gelidibacter, Methanococcoides, Methanogenium, Methanosarcina, Microbacterium, Micrococcus, Moritella, Octandecabacter, Phormidium, Photobacterium, Polaribacter, Polaromonas, Psychroserpens, Shewanella şi Vibrio. Genul Morritella este compus în totalitate din psichrofile. Primele psichrofile identificate în Antarctica au fost Leifsonia aurea, Sporosarcina macmurdoensis şi Kocuria polaris. Astfel în orice mediu cu temperaturi scăzute, cea mai mare parte a microorganismelor izolate sunt psichrofile. Deasemenea, au fost identificate numeroase psichrofile în peşterile reci din Pirinei, Alpi, Carpaţi, Lapland sau Arctic. Cea mai mare parte a lor aparţine genurilor Arthrobacter, Pseudomonas si Flavobacterium, predominând genul Arthrobacter. Cele mai multe microorganisme izolate din solurile acestor peşteri sunt similare Arthrobacter glacialis. În locurile unde zăpada se topeşte sau unde suprafaţa zăpezii este colorată în roşu, verde sau galben, se găsesc alge. Majoritatea acestora sunt psichrofile; speciile reprezentative sunt: Chloromonas brevispina, C. pichinchae, C. rubroleosa, C. polyptera şi Chlamydomonas nivali (Satyanarayana, 2005).

Dintre toate componentele celulare ale psichrofilelor, cele mai importante sunt proteinele. În tabelul 5 sunt prezentate principalele proteine obținute folosind psichrofilele.

Tabelul 5. Microorganisme psichrofile producătoare de proteine utile

Proteina Microorganismul producător Referințeα-amilază Pseudoalteromonas haloplanktis Aghajari et al. (1996, 1998)Protează alcalină Pseudomonas aeruginosa Aghajari et al. (2003)Triozo-fosfatizomerază Moritella marina Alvarez et al. (1998)Citrat-sintază Tulpina bacteriană DS2-3R (Antartica) Russell et al. (1998)Malat-dehidrogenază Aquaspirillium arcticum Kim et al .(1999)Xilanază Pseudoalteromonas haloplanktis Van Petegem et al. (2002, 2003)Adenilat-kinază Sporosarcina globispora Bae și Phillips (2004)Protein-tirozin-fosfatază Shewanella sp. Tsuruta et al. (2002, 2005)

(Cavicchioli, R., 2006)

Supravieţuirea psichrofilelor la temperaturi scăzute serveşte ca model excelent pentru studierea adaptării organismelor la temperaturi scăzute.

Cultivarea acestor extremofile se face în incubatoare la care se setează temperatura minimă. În general aceasta este de 5 oC, dar poate fi scăzută prin plasarea incubatorului în camere cu temperaturi scăzute sau prin ajustarea incubatorului prin adăugarea de răcitoare cu recircularea apei. În general, extremofilele nu au necesităti nutritive ridicate, datorită condiţiilor naturale din care sunt recoltate, excepţie făcând cele care se dezvoltă în fecalele pinguinilor. O atenţie sporită în alegerea mediului de cultură pentru speciile de psichrofile trebuie acordată salinităţii mediului (în special pentru speciile recoltate din apă marină sau din solul Antarticii). Pentru speciile recoltate din zăpadă sau gheată se poate folosi ca mediu zapada sau gheața topită şi sterilizată, la care se adaugă agar pentru a obţine un mediu solid, fară a se adauga sursă de carbon. Pot fi folosite şi medii comerciale diluate 1 la 2 sau 1 la 10, precum triptonă- soia- agar sau Luria-Bertani agar, la care se adaugă cantăţi mici de extract de drojdii (0.01-0.001%). Însămânţarea se face pe mediul răcit în prealabil la

11

temperatura optimă fiecarui microorganism. Pentru izolarea psichrofilelor marine, cel mai frecvent se utilizează mediul comercial Marine 2219 agar, dar se poate folosi şi mediu pe bază de apă de mare sterilizată (preferabil prin filtrare) (Russell , N., 2006).

5. Microoganisme alcalofile

Descoperirea alcalofilelor s-a făcut relativ recent. Ulilizarea acestor microorganisme are o istorie lungă in Japonia, fiind folosite încă din antichitate în industria indigoului; astfel, indigoul, provenit din frunzele de indigo este redus în procesul de fermentaţie al indigoului, care are loc în condiţii puternic alcaline (http://mmbr.asm.org). Alcalofilele se împart în două mari grupuri fiziologice: alcalofile si haloalcalofile. Alcalofilele necesită un pH mai mare de 9 pentru creştere, optimul fiind de 10; haloalcalofilele necesită în afara pH-ului peste 9 şi o salinitate crescută (33% NaCl). Prima grupă are cerinţe minime de NaCl în mediu de creştere. Acestea se găsesc în sol, sedimente marine sau în apele cu conţinut ridicat de Ca2+ . Haloalcalofilele sunt prezente în mod frecvent în lacurile bazice sau în deşerturile bazice. Majoritatea haloalcalofilelor izolate din aceste medii aparţin grupului Archaea.

Dintre genurile care cuprind alcalobacterii pot fi amintite: Pseudomonas, Paracoccus, Micrococcus, Aeromonas, Corynebacterium, Actinopolyspora , Bacillus, Vibrio, Flavobacterium, Cyanospira, Chlorococcum, Pleurocapsa, Spirulina, Ectothiorhodospira si Methanohalophilus.

Cele mai cunoscute haloalcalofile sunt: Natronobacterium pharaonis, N. gregoryi, Natronococcus occultus, Methylobacter alcaliphilus, Methylomicrobium alcaliphilum, Spirochaeta alcalica, S. asiatica, Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, Clostridium, Thermoanerobacter sp., și Thermopallium natronophilum (Satyanarayana, 2005).

Izolarea alcalofilelor se face folosind metode convenționale, cea mai importantă problemă luată în considerare fiind mediul de cultură. Cea mai folosită tehincă este cea a diluțiilor repetitive,

pe plăci cu mediu solid (Mesbah, N., 2006).

În mod normal, pentru cultivarea alcalofilelor se folosește mediu pe bază de NaHCO 3-Na2CO3, ajustând pH-ul în jurul valorii de 10.5 prin adăugare de Na2CO3 1%.

Se folosesc în principal două medii: mediul Horikoshi (1971), dezvoltat inițial pentru izolarea alcalofilelor din sol, și mediul Tindall et al. (1984).

Compoziția mediului Horikoshi (1971) este următoarea (grame per litru): Glucoză 10.0 Peptonă 5.0 Extract de drojdii 5.0 KH2PO4 1.0 MgSO4 x 7H2O 0.2 Na2CO3 10.0.

Compoziția mediului Tindall et al. (1984), exprimat în grame per litru: Extract de drojdii 10.0 Acizi casaminici 7.5 Citrat trisodic 3.0 KCl 2.0 MgSO4 x 7H2O 1.0 MnCl2 x 4H2O 0.00036 FeSO4 x 7H2O 0.05 NaCl 200 Na2CO3 10.0

12

La preparare, mediul poate prezenta precipitați și are pH-ul cuprins între 10.5 și 11, dar după turnarea în plăci, pH-ul scade la 9.5-10, datorită absorției de CO2 (Grant,W., 2006).

6.Microoganisme acidofile

Acidofilele sunt microorganisme capabile să supraviețuiască în medii cu pH scăzut. Din aceste medii au fost izolate bacterii chemoautolitotrofe, care oxidează mineralele ce conțin fier și sulf. Cele mai studiate sunt: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum spp., Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus caldus, Sulfobacillus spp. și Ferroplasmaceae spp. Deasemenea au fost izolate microorganisme heterotrofe acidofile ce aparțin genului Acidiphilium și heterotrofe facultative, ca Acidimicrobium spp., Desulfosporosinus spp. și Ferrimicrobium spp.. O parte importantă a microorganismelor acidofile aparține domeniului Archaea. Acestea pot fi împărțite în două ordine filogenetice: Sulfolobales și Thermoplasmatales. Dintre reprezentanții Sulfolobales pot fi amintite: Acidianus ambivalens, Acidianus brierleyi, Metallosphaera spp., Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus și Sulfolobus metallicus. Ordinul Thermoplasmatales are în componența reprezentanți ai Thermoplasma spp., Picrophilus spp. și Ferroplasma spp. ( Gonzalez-Toril, E., 2006).

7. Microoganisme halofile

Microorganismele halofile au capacitatea de a se dezvolta la concentrații ridicate de sare, de la 10% NaCl, până la saturație, iar unele microorganisme pot supraviețui chiar și în cristale de sare (Litchfield, C., 2006).

Majoritatea microorganismelor halotolerante a fost izolată din apa sărată, marină sau din lacuri. În Marea Moartă au fost identificați fungi halotoleranți, ce aparțin genurilor Zygomycotina (Absidia glauca), Ascomycotina (Chaetomium aureum, C. flavigenum, Emericella nidulans, Eurotium amstelodami, Gymnoascella marismortui, Thielavia terricola) și fungi mitosporici (Acremonium persicinum, Stachybotrys chartarum, Ulocladium chlamydosporum). Din lacurile cu salinitate ridicată au fost izolate cianobacterii halofile, ca Aphanothece halophytica, Microcoleus chthonoplastes, Phormidium ambiguum, Oscillatoria neglecta, O. limnetica O. salina și Dactylococcopsis salina. Dintre bacteriile organotrofe Gram negative halofile pot fi amintite: Acinetobacter, Alteromonas, Deleya, Flavobacterium, Marinomonas, Pseudomonas și Vibrio. Din solurile sărăturate și saline au fost izolate specii halofile aparținând genurilor Marinococcus, Sporosarcina, Salinococcus și Bacillus. În apa de mare sunt răspândite numeroase halobacterii aparținând genului Archaea: Haloarcula, Halobacterium, Haloferax, Halorubrum, Halococcus, Halobaculum, Haloterrigena și Halorubrum. O altă categorie a halofilelor este reprezentată de halofilele metanogene; astfel, din lacurile sărate și oceane au fost izolate Methanohalophilus mahii, M. evestigatum și M. Halophilus (Satyanarayana, T., 2005).

Izolarea și cultivarea halofilelor la nivel de laborator prezintă anumite dificultăți, derivate din compoziția în sare a mediului de cultură. Temperatura de incubare și salinitatea ridicată pot determina formarea de precipitați ai sării și limitează utilizarea anumitor aditivi precum agenții de gelificare (gelan sau Gelrite® ) sau indicatori (laptele praf degresat folosit pentru detectarea activității proteolitice, care coagulează în mediu cu salinitate ridicată). În cazul microorganismelor care necesită perioade lungi de incubare, trebuie să se aibă în vedere faptul că salinitatea se modifică în timp și acest lucru poate diminua creșterea microbiană. Izolarea în culturi pure este un factor esențial în studiul microorganismelor. Cultivarea halofilelor izolate din apă se face pe medii ce au la bază o soluție salină, asemănatoare apei de mare concentrate. În plus, trebuie să se țină cont de

13

necesitățile specifice ale fiecărei bacterii, în funcție de mediul din care a fost izolată. Spre exemplu, bacteriile izolate din Marea Moartă, precum Halorubrum sodomense și Halobaculum gomorrense necesită o concentrație mare de ioni de Mg 2+ în mediu. Astfel, se recomandă ca mediul de cultură să imite cât mai bine condițiile naturale de unde au fost prelevate microorganismele. Se recomandă chiar, dacă se poate, să se folosească chiar apa din mediul de unde au fost izolate microorganismele, sterilizată în prealabil.

Principalul mediu pe care se cultivă halofilele la nivel de laborator este mediul MGM (Modified Growth Medium), care are în compoziţie soluţie de apă sărată şi o altă sursă nutritivă bogată (5 g per l de peptonă şi 1 g per l extract de drojdii). Însămânţarea mediului se face după realizarea unei serii de diluţii, astfel încât numărul de colonii să fie cuprins între 30 şi 300. Incubarea se face la în general la 37oC, la întuneric. Totuşi, temperatura optimă pentru multe halofile este mai

ridicată; spre exemplu Haloferax volcanii are o rată de creştere mult mai mare la 45oC decât la 37oC

(Burns, D., 2006).

8. Microoganisme barofile

Barofilele sunt microorganisme capabile să supravieţuiască în medii cu presiune hidrostatică ridicată. Aceste tipuri de microorganisme se găsesc în general în mări şi oceane adânci, unde sunt întalnite condiţii de înaltă presiune hidrostatică. Cele mai multe dintre bacteriile barofilice și barotolerante fac parte din categoria γ-Proteobacterii. Dintre acestea putem aminti: Photobacterium, Shewanella, Colwellia și Motiella. În cazul barofilelor a fost studiat efectul presiunii asupra membranei celulare, a proteinelor și a expresiei genelor. Ca răspuns al presiunii ridicate, cantitatea relativă de acizi monounsaturați și poliunsaturați cresc în membrană. O Alteromonas sp. barotolerantă a arătat proporții ridicate de acizi graşi nesaturaţi în membrana celulară. Cantitatea mai mare de acid nesaturat produce mai mult fluid membranar și contracarează efectul creșterii vâscozităţii cauzată de presiunea ridicată. Barofilele sunt extrem de sensibile la lumina UV și așadar, pentru dezvoltare, au nevoie de un mediu întunecat sau cu lumină redusă, ca cele din mediul maritim adânc. Presiunea poate stabiliza proteinele și întârzia denaturarea termică (Satyanarayana, T., 2005).

9. Microorganisme rezistente la radiaţii

Capacitatea de supravieţuire a microorganismelor la doze ridicate de radiaţii este în general redusă. Există totuşi anumite microorganisme care s-au adaptat şi sunt capabile de supravieţuire în astfel de condiţii. Rezistenţa la doze ridicate de radiaţii este o trăsătură ce a fost dobandită accidental de microorganisme, în condiţii naturale dozele de radiaţii fiind destul de scăzute. Doar o mică parte a microorganismelor poate supravieţui acestor condiţii. Cele mai cunoscute sunt: Methylobacterium radiotolerans, Kocuria rosea, Acinetobacter radioresistens, Kineococcus radiotolerans, Hymenobacter actinosclerus, Chroococcidiopsis spp., Rubrobacter xylanophilus, Deinococcus radiodurans, Deinococcus proteolyticus, Deinococcus radiophilus, Deinococcus radiopugnans, Deinococcus grandis, Deinococcus geothemalis, Deinococcus murrayi, Deinococcus hohokamensis, Deinococcus navajonensis, Deinococcus hopiensis, Deinococcus apachensis, Deinococcus maricopensis, Deinococcus pimensis, Deinococcus yavapaiensis, Deinococcus papagonensis, Deinococcus sonorensis, Truepera radiovictrix, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Thermococcus gammtolerans şi Thermococcus radiotolerans (Zimmerman, J, 2006).

14

10. Microoganisme oligotrofe

Microorganismele oligotrofe sunt acele microorganisme capabile să se dezvolte și să supraviețuiască într-un mediu ce conține o cantitate de 0.2-16.8 mg de carbon organic per litru. Cea mai importantă caracteristică a oligotrofelor este aceea că dețin un sistem de preluare al nutrienților din mediul încojurător dezvoltat, care le favorizează supraviețuirea. Astfel, oligotrofele au un raport suprafață/volum mare, sisteme de preluare a nutrienților foarte dezvoltate și rezistență naturală la factorii de stres din mediu (temperatură, peroxid de hidrogen sau etanol). Reprezentanți: Caulobacter, Hyphomicrobium, Prosthecomicrobium, Ancalomicrobium, Labrys și Stella (Satyanarayana, T., 2005).

Bibliografie

1. Burns, D. & Dyall-Smith, M.. Cultivation of Haloarchaea. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.536-542;

2. Cavicchioli, R. & Thomas, T.. Extremophiles. In: J. Lederberg. (ed.) Encyclopedia of Microbiology, Second Edition, Vol. 2, Academic Press, San Diego, 2000, pp. 317–337;

3. Cavicchioli, R., Curmi, P., Siddiqui, K.& Torsten, T.. Proteins from Psychrophiles In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 406-407;

4. Godfroy, A., Postec, A. & Raven, N., Growth of Hyperthermophilic Microorganisms for Physiological and Nutritional Studies. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 93-97;

5. Gonzalez-Toril, E., Gomez, F., Malki, M. & Amils, R.. The Isolation and Study of Acidophilic Microorganisms, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 471;

6. Grant, W.. Cultivation of Aerobic Alkaliphiles. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 443-444;

7. Litchfield, C., Sikaroodi, M. & Gillevet, P.. Characterization of Natural Communities of Halophilic Microorganisms, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 513;

8. Mesbah, N. & Wiegel, J.. Isolation, Cultivation and Characterization of Alkalithermophiles. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in

Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 452-461; 9. Nakagawa,S. & Takai, K.. The Isolation of Thermophiles from

Deep-sea Hydrothermal Environments, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.55-78

10. Rainey, F. & Oren, A.. Extremophile Microorganisms and the Methods to Handle Them In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 5-10;

15

11. Russell , N. & Cowan, D.. Handling of psychrophilic Microorganisms. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 371-388;

12. Satyanarayana, T., Raghukumar, C. & Shivaji, S.. Extremophilic microbes: Diversity and perspectives, Current Science, VOL. 89, NO. 1, 10 July 2005, pp.78-88;

13. Zimmerman, J. & Battista, J.. Measuring Survival in Microbial Populations Following Exposure to Ionizing Radiation. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.746-747;

14. http://mmbr.asm.org/cgi/content/full/63/4/735#SEC1;15. http://en.wikipedia.org/wiki/Extremophile.

16