Metode generale de izolare a toxicilor În ziua de astazi, toxicologia analitică esta înarmată cu un număr uimitor de unelte pentru

determinarea şi cuantificarea compuşilor cu potenţial toxic la concentraţii considerate imposibil de

detectat cu 10 ani în urmă. Persoanele implicate în analiza probelor conţinând, de exemplu, agenți

cancerigeni în probe de ţesut, reziduuri de pesticide din soluri şi hidrocarburi aromatice policiclice

(HAP) din aer, trebuie să aibă o bună înțelegere a tuturor aspectelor procedurale referitoare la probele

pe care le analizează pentru a se asigura că datele generate sunt corecte şi complete.

Toxicii se pot clasifica în toxici gazoși

toxici lichizi

toxici solizi

Functie de provenienta (origine, natura):

toxici minerali

toxici organici naturali

vegetali

animali

toxici organici de semisinteza si sinteza

Ogier si Kohn-Abrest au clasificat toxicii functie de criteriul analitic, adica de modul in care

sunt izolati din aer si/sau material biologic in vederea identificarii si dozarii lor :

a)toxici gazosi, care se izoleaza in general prin recoltare din aer, mai rar din material biologic

(ex:CO, H2S, AsH3) ; marea majoritate sun anorganici.

b)toxici volatili

- care se izoleaza prin distilare (au p.f.≤100˚C) din mediu acid sau bazic. In aceasta grupa

se incadreaza cea mai mare parte a toxicilor volatili;

- care se izoleaza prin antrenare cu vapori de apa (au p.f. ≥100˚C) ex : fenol, nitrobenzen,

anilina.

Marea majoritate a toxiclor volatili sunt organici.

c)toxici minerali ficsi

- care se izoleaza prin mineralizarea (distrugerea) materiei organice

- care se izoleaza prin extractie apoasa, hidroalcoolica sau dializa (metode “blande” pentru

a nu-i denatura); exemple : nitriti, nitrati, cloruri, acizi corozivi, baze caustice ; ei se izoleaza in

portiunea C de organe (10% din proba pentru expertiza)

d)toxici organici ficsi (nevolatili)

- care se izolaza din mediu acid (cei cu caracter slab acid sau neutru)

- care se izoleaza din mediu bazic (cei cu caracter slab bazic)

In ambele cazuri extractia se face cu solventi organici nepolari (cloroform, eter) si mai rar

cu solventi organici slab polari.

Metodele de extractie folosite sunt :

- extractia prin echilibrare (cu palnia de separare)

- extractia exhaustiva (cu aparatul soxhlet)

Analiza toxicologica: Totalul probelor recoltate pentru analiza se imparte in doua parti egale : o jumatate este

utilizata pentru analiza, cealalta jumatate este destinata contraanalizei sau a unor cercetari

suplimentare.

Prima jumatate (destinata analizei) dupa maruntire este impartita in trei portiuni :

►portiunea A (aprox.45%) se utilizeaza pentru cerectarea toxiclor volatili, iar reziduul

ramas dupa izolarea acestora prin distilare sau antrenare cu vapori de apa, se cerceteaza toxicii

minerali (izolati prin mineralizare)

►portiunea B (aprox.45%) se utilizeaza pentru cercetarea toxicilor organici ficsi (care se

izoleaza prin extractie cu solventi organici)

►portiunea C (aprox.10%) se utilizeaza pentru cercetari speciale, la randul ei imartindu-se

in doua portiuni: ►una pentru cercetarea cloroformului si a tiocianatilor

►cealalta pentru cercetarea unor toxici minerali care pot scapa mersului analizei

generale (argint, plumb, bariu, zinc) si pentru cercetarea sarurilor minerale (clorati, nitriti, nitrati).

Analiza toxicologica comporta 4 etape :

1.analiza preliminara

2.izolarea substantelor toxice

3.identificarea si determinarea cantitativa

4.corelarea si interpretarea rezulatelor.

1.ANALIZA PRELIMINARA : precede analiza toxicologica propriu-zisa, nu are caracter

de certitudine. Foloseste hartii indicatoare, tuburi indicatoare, reactii chimice pe hartie de filtru sau

chiar in eprubeta.

2.METODE DE IZOLARE :

2.1.Izolarea toxicilor gazosi

Se realizeaza de obicei in atmosfera (prelevarea unui volum de atmosfera viciata sau

barbotarea unui volum de aer printr-o solutie absorbanta sau trecerea peste un material absorbant)

dar pentru unii toxici gazosi (CO, H2S, AsH3) este necesara cercetarea prezentei lor in sange si

urina.

Toxicii din aer pot fi detectaţi direct din atmosfera poluată sau determinaţi după recoltarea

de aer.

Detecţia se realizează cu ajutorul hârtiilor, creioanelor, sau tuburilor indicatoare

hârtia indicatoare: se impregnează benzi sau rondele de hârtie de filtru cu un reactiv

adecvat şi se expun în atmosfera poluată sau se aspiră aerul prin ele. Toxicul este detectat ca prin

modificarea culorii (rezultată din reacţia dintre toxic şi reactiv)

Recoltarea probelor de aer se realizează prin mai multe procedee:

2.1.1. Recoltarea în recipiente închise

Procedeul este indicat pentru recoltarea toxicilor în concentraţie mare. Se utilizează

recipiente care au un folum cunoscut, şi anume:

flacoane din sticla – flacoane cu dop străbătut de un tub lung (sifon) şi altul scurt,

prevăzute cu robinete, prin care se poate face vid…

Pipete de gaz (tonometre)

Camere, saci baloane de cauciuc etc

2.1.1.1. Recoltarea prin dislocuire de lichid

Se umple complet flaconul cu apă, şi se goleşte la locul de recoltare

2.1.1.2. Recoltarea prin dislocuire de aer

Se trece prin tubul lung al flaconului, adaptat la un dispozitiv de aspirare, aer de

cercetat, în timp ce aerul iniţial iese prin tubul scurt. Se introduce un volum de aer de 10 ori mai

mare decat volumul flaconului.

2.1.2. Recoltarea prin aspirare

Procedeul este indicat pentru recoltarea toxicilor în concentraţie mică, deoarece prin

aspirarea, în curent continuu a unui volum de aer printr-un mediu absorbant, toxicul se acumulează

în acesta, ceea ce permite determinarea concentraţiilor mici

2.1.2.1. Dispozitivie de aspirare

a) aspiratoare hidraulice (vase comunicante, trompe de apa)

b)aspiratoare mecanice (aspiratoare de praf)

2.1.2.2. Dispozitive de măsurare a volumului de aer:

a) Gazometre

b) Debitmetre

2.2.2.3.Dispozitive de reţinere

a) Absorbitoarele (barbotoarele)

b) Pâlnia Palmer

c) Impingerele

2.2.Izolarea toxicilor volatili

Tehnicile de izolare sunt aceleasi ca la toxicii gazosi ; se folosesc : distilarea sau antrenarea

cu vapori de apa (pentru toxicii volatili cu puncte de fierbere mai mari de 100 grade celsius ex.fenol,

anilina, benzen)

2.3.Izolarea toxicilor minerali

Toxicii minerali se gasesc in diverse combinatii in materialul de analizat, de aceea se

deosebesc doua tipuri de operatii in analiza lor toxicologica :

izolarea toxicilor minerali din combinatii nedisociabile (combinatii intre toxicii

minerali si constituentii normali ai organismului) se poate realiza numai dupa distrugerea

(mineralizarea) prealabila a materiei organice;

izolarea toxicilor minerali din combinatii disociabile (in cazul sarurilor minerale de

genul nitritilor, nitratilor, cloratilor, acizii minerali tari, bazele caustice si se folosesc metode ca

extractia apoasa sau hidroalcoolica, macerarea, dializa).

Izolarea toxicilor minerali din combinatii nedisociabile

Deoarece toxicii minerali contracteaza combinatii cu constituentii normali ai organismului

(de regula proteinele ), caz in care proprietatile lor analitice sunt disimulate, pentru punerea in

liberatate a toxicului sub forma ionica, in vederea caracterizarii lui ulterioare prin metodele chimiei

analitice, se recurge la operatia de mineralizare (distrugere). Prin distrugereea partii organice a

materialului, metalele trec sub forma ionica, ceea ce justifica termenul de mineralizare. Operatia se

executa pe reziduul ramas din portiunea A de organe dupa izolarea toxiclor volatili.

Mineralizarea materiei organice poate fi realizata :

- pe cale uscata (prin calcinare, directa sau cu adaos de oxidanti, cu carbonat si azoatat de

sodiu, in curent de oxigen);

- pe cale umeda (cu clor nascand sau cu acizi oxigenati – acid azotic, acid sulfuric).

A.mineralizarea cu clor nascand :

A.1.metoda Fresenius-Babo

Principiul metodei : distrugerea suportului organic de care este legat toxicul mineral se face

sub actiunea clorului, rezultat in reactia dintre clorat de potasiu si acid clorhidric, la cald (70 °C).

A.2.metoda Ogier

Modificarea consta intr-un curent de acid clorhidric gazos peste materialul de analizat

amestecat cu clorat de potasiu (KClO3).Metoda are avantajul ca reduce considerabil timpul de

analiza.

A.3. Metoda Stepanov :

Principiul metodei consta de asemenea in mineralizarea cu clor nascand. Organele maruntite

se aduc intr-un balon Kjeldhal, inchis cu dop de pluta sau de cauciuc, prin care trece un tub in forma

de spirala, cu rol de refrigerent. Peste organele din balon se adauga acid clorhidric, apoi mici cantitati

de clorat de potasiu.

B.Mineralizarea prin metoda sulfonitrica

B.1.Metoda Deniges

Principiul metodei : distrugerea suportului organic de care este legat toxicul mineral se face

sub actiunea unui amestec de acid azotic si acid sulfuric concentrat. Acidul sulfuric concentrat are

actiune deshidratanta si oxidanta (prin continutul de trioxid de sulf liber). Acidul azotic concentrat

are actiune oxidanta, ca o consecinta a descompunerii progresive cu eliberare de oxigen.

B.2.Metoda Deniges modificata de Ioanid si Bors

Materia organica este dezagregata in prealabil cu acid azotic concentrat si apoi lichidul

rezultat se adauga picatura cu picatura intr-un amestec de acid sulfuric concentrat si acid azotic

concentrat, adus la fierbere.

B.3.Metoda Stepanov este tot o metoda sulfonitrica de distrugere, sub actiunea acidului

sulfuric si a azotatului de amoniu.

2.4.Izolarea toxicilor organici nevolatili (ficsi)

Sunt cercetati de obicei in mediu biologic si se izoleaza prin extractie cu solventi organici

nemiscibili cu apa. Extractia se realizeaza in mediu acid pentru toxicii cu caracter acid (acidularea

se face cu acizi minerali-acid clorhidric, sulfuric, acizi organici-acid acetic, acid tartric, acid citric

sau cu solutii tampon cu pH acid) sau in mediu bazic pentru toxicii cu caracter bazic (alcalinizarea

se face cu hidroxizi alcalini, carbonati alcalini, solutii tampon de pH bazic).

Extracţia este operaţia prin care unul sau mai mulţi componenţi ai unei faze (lichide sau

solide) sunt transferaţi într-o altă fază (lichidă), nemiscibilă sau parţial miscibilă, adusă în contact

cu prima.

In funcţie de starea de agregare a produsului din care se face extracţia, se

deosebeşte:

1. extracţia solid – lichid

2. extracţia lichid – lichid;

3. extracţia gaz – lichid.

Repartiţia unei substanţe dizolvate în doua faze este dată de legea de distribuţie a lui Nernst

ce constă în raportul concentraţiilor la echilibru a substanţei în cele două faze lichide (a şi b)

nemiscibile ce este constantă la o temperatură dată.

unde K este coeficientul de repartitie.

Extracţia solid – lichid

Extracţia solid-lichid urmăreşte separarea unei substanţe organice într-un anumit

solvent în care componentul este solubil.

K = Ca/Cb

Fig.1 : Extractoare Soxhlet.

Pe scară largă se aplică extracţia continuă în aparatură specială (extractoare Soxhlet) în care,

de obicei, solventul proaspăt este furnizat prin fierberea extractului.

Extractorul Soxhlet se compune dintr-un balon, un corp de extracţie şi un refrigerent

ascendent, legate între ele. Materialul solid, mărunţit în prealabil pentru ca solventul să vină în

contact cu o suprafaţă cât mai mare, se aşează în spaţiul de extracţie, fie introdus într-un cartuş

special de hârtie de filtru, fie vărsat direct în spaţiul de extracţie prevăzut cu un fund de sticlă

poroasă. Faza extractoare (solventul) din balonul de fierbere distilă printr-un tub lateral, prevăzut

eventual cu o izolaţie termica, iar vaporii condensaţi în refrigerentul de reflux picură peste materialul

din cartuş. Când spaţiul de extracţie se umple până la înălţimea stratului de preaplin, soluţia cu

extract trece prin sifonare în balonul de fierbere şi procesul se repetă.

Principalii factori care influenţează o extracţie solid – lichid sunt:

- solubilitatea solidului în solvent;

- viteza de transfer a solidului în fază lichidă.

Extracţia lichid – lichid

Această operaţie are la bază diferenţa de solubilitate a componentului extras în unul sau mai

mulţi solvenţi nemiscibili sau parţial miscibili între ei.

În laboratoare, extracţiile se efectuează prin agitarea soluţiei

cu solventul de extracţie în pâlnii de separare, care datorită formei

specifice oferă o suprafaţă de separaţie mare se fac prin agitarea

soluţiei cu solventul de extracţie. Este recomandat ca umplerea cu

lichid a pâlniei de separare să nu se facă mai mult de ¾ din volumul

său. Pentru o extracţie

eficientă este necesară asigurarea unui contact optim între

cele două faze este necesară agitarea intensă a pâlniei timp de 3-5

minute, după care aceasta se lasă în repaus până la separarea

completă a celor două faze. În cazul apariţiei de emulsii nu mai este

recomandată agitarea, ci în acest caz este suficientă efectuarea unor

mişcări circulare în plan orizontal.

Palnia de separare.

Din timp în timp este necesară efectuarea aerisirii, prin inversarea poziţiei pâlniei şi

deschiderea temporară a robinetului. Această operaţie este absolut necesară mai ales în cazul

solvenţilor extrem de volatili (eter etilic, eter de petrol etc.).

După separarea completă a celor două faze, se scoate dopul de la partea superioară a pâlniei

şi faza inferioară este separată cu grijă într-un flacon Erlenmeyer.

Faza apoasă poate fi uşor deosebită de faza organică nemiscibilă pe baza densităţilor celor

două faze (faza cu densitatea cea mai mare va constitui faza inferioară). Atunci când limita de

separaţie dintre cele două faze se apropie de robinet, se reduce mult viteza de separaţie.

La final, pentru a se evita o eventuală impurificare, faza superioară se toarnă prin gura

pâlniei într-un alt flacon, faza organică se usucă utilizând un agent de deshidratare convenabil

(Na2SO4 anh., CaCl2 anh., MgSO4 anh. etc.), iar ulterior se îndepărtează solventul prin distilare.

Metode de izolare a toxicilor organici nevolatili

1.Metoda Stas-Otto-Ogier

Etape : ►digestia metrialului biologic cu alcool in mediu acid (pH 4-5 creat cu acid tartric)

►filtrare si indepartarea alcoolului prin distilare in vid, la 50 °C ;

►purificarea reziduului apos prin extractie cu eter de petrol ; eterul de petrol extrage

grasimi, unele substante volatile (ex. fenol, camfor), unele insecticide (ex. organoclorurate) sau

unele medicamente (ex. glutetimida) ;

►extractia lichidului cu eter etlic : in extractul organic sunt separate substante cu caracter

acid sau neutru (ex. acid salicilic, acid oxalic, acid picric, derivati barbiturici, glicozizi cardiotonici,

meprobamat, colchicina)

► alcalinizarea fazei apoase la pH 8-9 urmata de extractia cu eter etilic sau cloroform, cand

se separa substante cu caracter bazic (alcaloizi si alte substante organice de sinteza cu caracter bazic).

2. Metoda Dragendorff se bazeaza pe solubilizarea substantelor toxice in apa acidulata cu

acid sulfuric si precipitarea proteinelor cu alcool, urmata de extractia selectiva cu solventi organici

la pH optim (se epuizeaza intai lichidul R acid apoi lichidul R alcalin).

3. Metoda Florance – acidularea se face cu acid tricloracetic, la cald conditii in care se

asegura si deproteinizarea. Filtratul acid si apon alcalin se epuizeaza cu solventi organici, ca in

metoda clasica.

4. Metoda Fabre (proteolizei) – organele sunt intai supuse deproteinizarii enzimatice cu

tripsina. Filtratul acid si apoi cel alcalin se epuizeaza cu solventi organici ca in metoda clasica.

5. Metoda Griffon – presupune extractia cu aparatul Soxhlet. Materialul de analizat se

amesteca cu sulfat de sodiu anhidru, se adauga acid tartric sau oxid de magneziu (in functie de

caracterul acido-bazic al toxicului urmarit a fi extras), iar pulberea obtinuta se aduce in cartas de

hartie de filtru si se supune extractiei cu solventi in aparatul Soxhlet.

Pentru usurarea procesului de extractie a unui toxic in material biologic exista acum sisteme

de unica folosinta care simplifica procesal de extractie : cartusele de extractie tip lichid – lichid sau

solid – lichid.

Cartusele pentru extractie lichid-lichid sunt tuburi mici de polipropilena umplute cu

diatomita calcinata, de inalta puritate ce contin un filtru de separare a fazelor, pentru a evita

contaminarea solventilor organici cu faza apoasa. Extractia se face gravitational (nu sunt necesare

sisteme de vid) si are urmatorii pasi :

● se pipeteaza solutia apoasa care contine analitul in cartusul de filtrare

●se asteapta 3-5 minute

●se adauga solventul organic si se colecteaza analitul purificat.

Exista o mare varietate de umpluturi pentru cartusele de extractie lichid-lichid, adaptate

necesitatilor analitice, dintre care trebuie mentionate cartusele pre-tamponate, care simplifica

procesal de extractie si un necesita ajustarea pH-ului probei inainte de separare.

Cartusele de extractie solid-lichid sunt prevazute cu umplutura pe baza de silice, carbune

activ si rasini. Analitii sunt retinuti la nivelul sorbentului printr-o combinatie de mecanisme

permitand obtinerea unor probe concentrate, care pot fi analizate ulterior in mod optim prin metode

CSS, HPLC sau GC.

O varianta a extractiei in faza solida o constituie micro-extractia in faza solida, care se

realizeaza cu ajutorul unui sistem care are drept componenta principala o fibra de silice topita,

acoperita cu un strat polimeric, strat care contine si un material adsorbant solid (de exemplu, un

polimer de divinilbenzen sau carbune poros); fibra este fixata pe un piston si protejata prin

intermediul unui ac adaptabil la injectorul HPLC sau GC.

3. IDENTIFICAREA SI DETERMINAREA CANTITATIVA In general, pentru dozare se utilizeaza metode :

- spectrofotometrice (in UV si vizibil)

- cromatografice (HPLC, GC).

Metode cromatografice - privire de ansamblu Analiza chimică cromatografică este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care

include mai multe metode de separare şi totodată de analiză a componenţilor amestecului din probă.

În toate variantele, separarea precede analiza şi se realizează prin repetarea, de un număr mare de

ori, a echilibrului de distribuţie între două faze. Una dintre faze este imobilă şi poartă denumirea de

fază staţionară (aflată de regulă într-un tub numit coloană) iar cealaltă faza mobilă - aflată în mişcare,

se deplasează prin golurile primei faze. Separarea se petrece în coloana cromatografică. Faza mobilă,

denumită şi eluent - scurgându-se continuu (deci cu viteză constantă) prin interstiţiile fazei

staţionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componenţi ai

amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separării se introduce sub formă de

soluţie la începutul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o

microseringă), şi se află iniţial fixat într-o zonă îngustă de la începutul coloanei. Spălaţi de eluent, o

parte din componenţii probei migrează apoi prin coloană cu viteze diferite. Acest lucru se datorează

interacţiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei şi faza staţionară (desigur, nu orice moleculă

poate migra pe orice fază staţionară). Efectul, este numit retenţie şi aceasta provoacă o aşa-numită

migrare diferenţiată. Aceasta face posibilă sesizarea componenţilor, pe rând, la părăsirea coloanei,

de către un instrument, analizor fizico-chimic, sensibil la mai mulţi (în mod ideal la oricare) dintre

componenţi ce ies din coloană şi care este plasat în eluent, imediat după ieşirea din coloană. Acest

analizor, denumit detector este capabil să dea un semnal proporţional cu masa sau cu concentraţia

soluţiei de component în faza mobilă. Reprezentarea grafică a semnalului detectorului în funcţie de

timp poartă numele de cromatogramă.

Clasificarea tehnicilor cromatografice

Functie de natura fazei mobile şi a celei staţionare

● cromatografia de lichide (LC) când faza mobilă este un lichid

● cromatografia de gaze (GC) când aceasta este un gaz

● cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobilă este un lichid aflat peste

temperatura critică.

În cadrul cromatografiei de lichide se mai face distincţie între cromatografia pe coloană

deschisă şi cea pe coloană închisă Pe de altă parte, în cadrul fiecăreia dintre acestea, distingem mai

multe variante.

În cadrul LC se disting, în funcţie de mecanismele de separare:

÷ Cromatografia de adsorbţie, una dintre primele tehnici utilizate, veche de mai bine un

secol, utilizată pentru separarea substanţelor organice cu molecule de dimensiuni mici şi medii pe

adsorbenţi, ca silicagel şi alumină, folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solvenţi

organici.

÷ Cromatografia ionică (de schimb ionic), care se petrece pe o fază staţionară solidă,

poroasă, formată din materiale specifice - schimbătorii de ioni - substanţe cu o reţea solidă afânată,

de natură organică sau anorganică, pe care se găsesc grefate, prin procesul de obţinere, nişte centre

de schimb ionic. Cele mai răspândite sunt răşinile schimbătoare de ioni - organice - la care scheletul-

suport este unul organic - un polimer poros. Pe aceste centre are loc o reacţie ionică sau o interacţiune

între substanţa din soluţie (electrolit sau neelectrolit) şi funcţiunea legată chimic de suportul solid,

numită reacţie de schimb ionic.

÷ Cromatografia de excluziune sterică se desfăşoară pe faze staţionare poroase dar cu

porozitatea selecţionată astfel încât să corespundă dimensiunilor moleculelor supuse separării. O

parte dintre molecule intră prin pori, reuşind să interacţioneze cu suportul solid, prin forţe de

adsorbţie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasându-se practic nereţinute odată cu faza mobilă.

Se obţine astfel un soi de sită la scară moleculară separarea moleculelor făcându-se în funcţie de

dimensiune. Tehnica se mai întâlneşte şi sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeaţie prin

geluri în funcţie de natura apoasă sau organică a fazei mobile.

÷ Cromatografia lichid-lichid (LLC), în care faza staţionară este o fază lichidă, nemiscibilă

cu cea mobilă şi imobilizată pe un suport solid, într-o coloană. Aici suportul solid este, cel puţin

principial, inert faţă de componentele din probă. Întrucât simpla impregnare a unui suport poros cu

un lichid permitea spălarea acestuia în timp, s-a recurs la legarea pe cale chimică a acestora de

suport, obţinându-se nişte faze cu totul specifice - faze staţionare legate chimic. Molecule organice

de dimensiuni mici sunt, prin sinteză, legate de suportul poros, fenomenul de pierdere prin spălare

de către faza mobilă, fiind practic anulat. Acestă tehnică este cea mai răspândită devenind aproape

sinonimă cu cromatografia de lichide.

÷ Cromatografia pe coloană deschisă sau cromatografia planară (PC), se referă la un grup

de tehnici înrudite cu cele din LC, care au toate în comun faptul că faza mobilă circulă printr-un

material poros dispus într-un plan şi formând un strat relativ subţire, dar de compoziţie asemănătoare

cu cele menţionate la cromatografia pe coloană. Se disting:

■ Cromatogafia pe hârtie, tehnică în care faza staţionară este o hârtie poroasă din celuloză

(iniţial o hârtie de filtru) care este irigată de solvent prin forţe capilare.

■ Cromatografia pe strat subţire (TLC), în care faza staţionară pulverulentă este fixată de

suportul plan (sticlă, aluminiu, material plastic) cu un liant, formând un strat subţire (0.1-0.5mm) de

asemenea irigată prin capilaritate.

■ Cromatografia pe strat subţire de înaltă performanţă (HPTLC), în care faza staţionară are

granulaţie extrem de fină ridicându-se astfel eficienţa separărilor dar şi viteza acestora.

Toate acestea se caracterizează prin simplitate, accesibilitate şi preţ de cost coborât, dar

totodată prin performanţe ceva mai slabe decât cromatografia de lichide pe coloană sub presiune

ridicată (HPLC) varianta modernă a LC.

În mod analog, în cazul cromatografiei de gaze, denumită prescurtat GC se disting

următoarele tehnici:

÷ Cromatografia gaz-lichid în care faza staţionară este un lichid nevolatil imobilizat pe un

suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat într-o coloană în aşa-numita

cromatografie de gaze convenţională sau chiar pe pereţii coloanei, confecţionată de dimensiuni

capilare, în cromatografia pe coloană capilară.

÷ Cromatografia gaz-solid este analogă cu cele discutate la cromatografia de adsorbţie şi la

cea de excluziune sterică cu deosebirea că schimbarea gazului nu modifică selectivitatea.

Faza staţionară o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv “sitele moleculare” (nişte

silicaţi naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de importantă

pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)

FR.X. defineste cromatografia ca fiind o „metoda fizico-chimica de separare a unor

substante dintr-un amestec, intr-un sistem constituit dintr-o faza stationara si o faza mobila care se

deplaseaza intr-o directie data. Metoda se bazeaza pe migrarea dinamica diferentiata a substantelor

din amestecul respectiv ca urmare a unor diferente in adsorbtie, repartitie, solubilitate, presiune de

vapori, marimea moleculei etc.”

Metodele cromatografice oficializate :

-cromatografia pe hartie

- cromatografia pe strat subtire

- gaz-cromatografia

- cromatografia de lichide sub presiune.

CROMATOGRAFIA PE HARTIE :

Cromatografia pe hartie este o metoda fizico-chimica de separare si identificare a unor

amestecuri de substante bazata pe repartitia lor diferita intre faza stationara constituita din hartia si

lichidul impregnat pe ea si faza mobila formata dintr-un solvent sau un amestec de solventi organici

si anorganici. Pentru o mai buna separare hartia se poate impregna cu solutii tampon, acizi, baze,

saruri, agenti de complexare, agenti de precipitare, shimbatori de ioni lichizi sau solizi.

Aplicatii :

-separarea si identificarea substantelor medicamentoase

-identificarea si separarea principiilor active din forme farmaceutice

Exemplu : solutia ce contine codeina, benzoat de sodiu, tinctura de aconit si tinctura

belladonna se preteaza separarii si identificarii cromatografice in cadrul sistemului H1 (hartie

Whatman 1 sistem se solventi specifici). Codeina se identifica prin Rf specific (UV), iar atropina si

aconitina prin vizualizare cu reactiv Dragendorff (amestec de subnitrat de bismut, acid clorhidric

concentrat, iodura de potasiu).

F.R.X prevede urmatoarele :

„Aparatura : ■ vase cromatografice din sticla, cu posibilitatea de inchidere etansa, cu

dimensiuni si forme diferite, corespunzatoare benzilor de hartie prevazute cu un dispozitiv de fixare

a hartiilor cromatografice si cu o cuva, care in cazul tehnicii ascendente se aseaza la baza vasilui

cromatografic, iar in cazul tehnicii descendente se fixeaza la partea superioara a vasului.

■ benzi de hartie cromatografica prevazute la fiecare monografie in parte

■ micropipete, microseringi sau alte dispozitive.

Tehnica de lucru : linia pe care se aplica solutiile (linia de start) trebuie sa fie situata la o

distanta de 5-6 cm de marginea benzii de hartie pentru tehnica de developare ascendenta si de 10-

12 cm, pentru tehnica de developare descendenta. Distanta dintre doua puncte de aplicare a solutiilor

trebuie sa fie de 3-4 cm ; distanta dintre punctele marginale si latura hartiei trebuie sa fie de cel putin

2.5 cm. Solutiile se aplica pe hartia cromatografica, daca nu se prevede altfel, in pete circulare cu

diametrul de cel mult 6 mm.

Tehnica cromatografica (ascendenta, descendenta), pregatirea benzilor de hartie

cromatografica, developantul, modul de preparare a solutiilor de aplicat (probe, etalon), volumele

aplicate pe hartia cromatografica si distanta parcursa de developant sunt prevazute in monografia

respectiva.”

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE

Este o metoda de separare in care mediul adsorbant este dispus intr-un strat subtire (0.1-0.5

mm) care poate fi format dintr-o pelicula de lichid depusa pe un suport poros, suprafata unui

adsorbant sau o sita moleculara. Adsorbanti utilizati : alimina, silicagel, kieselgur, pulberea de

celuloza, silicatul de magneziu etc.

F.R.X prevede :

„ Apratura : ♦ placi cromatografice din sticla sau din alte materiale, de dimensiuni diferite,

cu lungimea de obicei, de 20 cm si latime variabila, pe care se aplica un strat subtire de adsorbant

de puritate cromatografica (silicagel, kieselgur, celuloza microcristalina, oxid de aluminiu etc) la

care se pot adauga lianti (sulfat de calciu, amidon, carboximetilceluloza) sau agenti fluorescenti.

♦ vase cromatografice din sticla

♦ pipete, micropipete sau alte dispozitive.

Tehnica de lucru : linia de start trebuie situata la o distanta de 2 cm de marginea placii.

Distanta dintre doua puncte de aplicare a solutiilor trebuie sa fie de cel putin 1.5 cm, distanta dintre

punctele marginale si laturile placii trebuie sa fie de cel putin 2 cm.

Solutiile se aplica pe placa cromatografica in pete circulare, cu diametrul de 2-6 mm sau in

benzi, conform prevederilor din monografia respectiva. Daca este cazul, solutia se aplica in fractiuni,

asteptand de fiecare data evaporarea solventului, eventual cu ajutorul unui curent moderat de aer.

Dupa evaporarea solventului, placa cromatografica se introduce in vasul cromatografic cu

developant, pe cat posibil in pozitie verticala. Petele de pe linia de start nu trebuie sa atinga suprafata

stratului de developant. Dupa ce developantul a parcurs distanta prevazuta, de obicei 10-15 cm,

placa cromatografica se scoate din vasul cromatografic, se usuca si se pun in evidenta petele,

conform prevederilor din monografia respectiva.

De obicei, punerea in evidenta a petelor de pe cromatograma se efectueaza prin examinarea

acestora ca atare sau dupa tratare cu reactivi potriviti, in lumina vizibila sau ultraviolet.

Pentru identificarea substantelor se compara pe aceeasi cromatograma valoarea Rf si cularea

sau fluorescenta petei obtinute cu solutia proba cu valoarea Rf si culoarea sau fluorescenta petei

obtinute cu solutia etalon : cele doua pete trebuie sa fie asemanatoare.

Valoarea Rf a unei substante este :

in care : a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicare al solutiri pana la centrul

petei (in centimetri);

b = distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiri pana la frontul

developantului, trecand prin centrul petei (in centimetri).

Identificarea unei substante se realizeaza in anumite cazuri, fata de o substanta de referinta

cu ajutorul Rr.

Valoarea Rr a unei substante este :

Rf = a/b

in care : a = distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicare a solutiei pana la centrul

petei (in centimetri).

b = distanta parcursa de substanta de referinta de la punctul de aplicare al solutiei pana la

centrul petei (in centimetri).

Dozarea substantelor separate pe cromatograma se efectueaza, dupa razuirea petelor

respective si eluarea substantelor de pe adsorbant cu un solvent potrivit, prin spectofotometrie sau

direct pe placa, de obicei prin densitometrie.”

GAZ-CROMATOGRAFIA

F.R.X prevede :

„Cromatografia de gaze este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care

faza mobila este un gaz (gaz-purtator), iar faza stationara este un solid sau un lichid cu care este

impregnat un suport solid inert sau un lichid repartizat uniform pe peretii unei coloane capilare. Faza

stationara se afla intr- coloana cromatografica, confectionata, de obicei din sticla sau din otel

inoxidabil. Faza mobila se deplaseaza continuu prin coloana, iar la iesire, gazul-purtator trece prin

detector.

Cromatograful de gaze este compus din urmatoarele parti principale : sursa de gaz, camera

de evaporare, coloana cromatografica, termostatul, detectorul si sistemul de inregistrare.

Gazul purtator se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare, preia proba de

analizat si o introduce in coloana cromatografica, unde se realizeaza separarea componentelor. La

iesirea din coloana cromatografica, gazul purtator trece impreuna cu componentele separate prin

detector, care emite un semnal electric proportional cu concentratia componentei din faza gazoasa.

Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare. Rezultatele se prezinta sub forma unui grafic

semnal-timp. Deoarece probele de analizat dizolvate intr-un solvent trebuie sa fie aduse in stare de

vapori, camera de evaporare este incalzita la o temperatura suficient de ridicata pentru a asigura o

evaporare rapida, fara a produce o degradare termica a probelor.

In timpul determinarii, temepratura coloanei cromatografice trebuie sa ramana constanta

sau, daca este necesar, trebuie sa creasca dupa un anumit program.”

Detectorii sunt instrumentele analitice propriu zise din gaz cromatografe, având rolul de a

sesiza în mod continuu, rapid şi cu o mare sensibilitate, componentele din proba supusă analizei. În

corpul detectorului zonele cromatografice care ies separate din coloană, conţinând de preferinţă

moleculele unei singure substanţe, se transformă în semnale electrice (picuri).

Pentru a se putea compara, ca performanţe, fiecare detector este caracterizat de nişte mărimi

fizice: specificitate, sensibilitate, zgomot de fond, drift, limită de detecţie, constantă de timp,

reactivitate, efect asupra probei şi altele, comune multor metode analitice. În orice gaz cromatograf

trebuie să existe cel puţin un detector universal care să permită înregistrarea sigură a tuturor

componenţilor. În afară de acesta mai pot exista şi alţi detectori specifici, care măresc siguranţa

analizei componenţilor de interes practic, deoarece răspund doar la anumite tipuri de molecule.

Gaz cromatografia este potrivita pentru separarea si identificarea unor compusi bazici -

alcalozi (cafeina, nicotina, papaverina, atropina, morfina, teofilina), fenotiazine, benzodiazepine

(diazepam, nitrazepam, clordiazepoxid), compusi acizi – barbiturice, compusi neutri – steroizi.

CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă acoperă azi, în proporţie aproximativ 80%,

analiza substanţelor moleculare: organice, organo-metalice şi anorganice inclusiv compuşii foarte

polari sau labili termic precum şi compuşii cu masă moleculară ridicată (naturali sau sintetici). De

aceea, împreună cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important în analizele

chimice moderne.

Rr = a/c

Rezervoarele conţinând unul sau mai mulţi solvenţi pompa (sau pompele), alimentează

coloana cu eluent (de regulă un amestec de doi sau mai mulţi solvenţi). În imediata vecinătate

a coloanei se introduce proba, automat. În coloana aflată într-o etuvă termostat, are loc

separarea propriu-zisă. Efluentul coloanei intră într-un detector de unde componentul, dacă este

separat complet, poate fi colectat şi izolat, cu ajutorul unui colector de fracţiuni. Semnalul este

înregistrat fie cu un înregistrator, fie direct în memoria unui calculator.

F.R.X prevede :

„Cromatografia de lichide sub presiune este o metoda fizico-chimica de separare

cromatografica in care faza mobila este un lichid, iar faza stationara, continuta intr-o coloana, este

constituita dintr-un solid cu granulatie fina sau un solid impregnat cu un lichid sau un solid pe care

sunt grefate grupari organice.

Cromatograful de lichide sub presiune se compune din urmatoarele parti principale :

sistemul de pompare, sistemul de injectie, coloana cromatografica, detectorul si sistemul de

inregistrare.

Faza mobila, furnizata de unul sau mai multe rezervoare, circula prin coloana

cromatografica cu un debit constant, sub efectul unei presiuni si apoi trece prin detector.

Temperatura coloanei cromatografice se mentine constanta in timpul determinarii si in

majoritatea cazurilor este temperatura camerei.

Sistemul de detectare folosit trebuie sa permita determinarea contitatilor de componente

prezente in eluent si se bazeaza pe spectofotometrie de absorbtie, refractometrie diferentiala,

fluometrie, combustie sau metode electro-chimice.”

SPECTROFOTOMETRIA F.R.X prevede : “proprietatea substantelor de a absorbi selectiv radiatiile electromagnetice

sta la baza spectrofotometriei de absorbtie si este folosita pentru identificare, determinarea puritatii

si dozare.

Spectrele de absorbtie se obtin la trecerea unui fascicul de radiatii continue prin substanta

de analizat care poate absorbi o parte din energia acestuia.

Functie de domeniile spectrale in care are loc absorbtia luminii se deosebesc :

-spectrofotometria in ultraviolet (185-400 nm)

-spectrofotometria in vizibil (400-800 nm)

-spectrofotometria in infrarosu (peste 800 nm)

Spectrele de absorbtie in domeniul ultraviolet si vizibil, numite si spectre electronice, se

datoresc tranzitiilor dintre nivelele energetice ale starii electronice ale moleculelor.

Spectrele de absorbtie in infrarosu se datoresc tranzitiilor de rotatie, de vibratie si de rotatie-

vibratie ale moleculelor.

Spectrele de absorbtie in ultraviolet si vizibil se obtin grafic prin reprezentarea absorbantei

sau a transmitantei in functie de lungimea de unda.

Absorbanta (A) (densitatea optica, extinctia) unei solutii este logaritmul zecimal al

inversului transmitantei (T) (transimisiei) respectiv logaritmul zecimal al raportului dintre

intensitatea luminii incidente (Io) si intensitatea luminii transmise (I) si este proportionala cu

concentratia in substanta de analizat a solutiei (c) si cu grosimea stratului de absorbtie (l):

Transmitanta (T) (transmisia) este raportul dintre intensitatea luminii transmise (I) si

A=log 1/T = log Io/I = ε ∙c∙l

intensitatea luminii incidente (Io) :

Dozarile spectrofotometrice un domeniul ultraviolet si vizibil se bazeaza pe masurarea

luminii absorbite atunci cand este respectata legea Bouguer – Lambert – Beer, care stabileste relatia

dintre lumina absorbita, structura si concentratia in substanta de analizat a solutiei si grosimea

stratului absorbant, pentru o anumita lungime de unda exprimata in nanometri.

I = intensitatea luminii transmise;

Io = intensitatea luminii incidente ;

ε = constanta caracteristica fiecarei substante;

c = concentratia in substanta de analizat a solutiei (%m/V)

l = grosimea stratului absorbant (in centimetri)

Spectrofotometrul de absorbtie in ultraviolet si vizibil se compune din urmatoarele parti

principale : sursa de radiatii, monocromatorul, suportul pentru cuve, detectorul, amplificatorul si

inregistratorul.

Sursa de radiatii este constituita de obicei dintr-un bec cu filament de wolfram, pentru

domeniul vizibil si dintr-o lampa de hidrogen sau deuteriu pentru domeniul ultraviolet.

Monocromatorul si cuvele sunt confectionate din sticla, pentru domeniul vizibil si din cuart

pentru domeniul ultraviolet.

Pentru detreminarile spectrofotometrice se folosesc odua cuve identice : o cuva in care se

introduce solutia substantei de analizat (solutia-proba) si o cuva in care se introduce lichidul de

compensare constituit din solventul sau amestecul de solventi si reactivi folositi la prepararea

solutiei proba.”

Cauzele producerii spectrelor : energia luminoasa se absoarbe pe seama promovarii

electronilor implicati in tranzitii dintr-un orbital de legatura σ sau π ocupati cu electroni in starea

fundamentala intr-un orbital de antilegatura σ* sau π* neocupat in starea fundamentala, capabil de

a fi ocupat in starea excitata.

In spectroscopia UV si VIS sunt caracteristice urmatoarele patru tipuri de tranzitii :

-tranzitii σ-σ*

-tranzitii π-π*

-tranzitii n-σ*

-tranzitii n-π*.

Aplicatii ale spectrofotometriei : spectrele UV-VIS ofera informatii in legatura cu structura

globala a electronilor substantei analizate. Se obtin date suplimentare in legatura cu natura

cromoforilor existenti, pozitia lor fata de alte elemente structurale, stereochimia moleculei, existenta

legaturilor de hidrogen etc.

Astfel : ● hidrocarburile saturate au legaturi covalente, legaturi puternice. Sunt substante

transparente (nu absorb) si de aceea au o larga utilizare ca solventi in spectroscopia UV-VIS.

● substante care contin heteroatomi : O, S, N – in acesti compusi au loc tranzactilor π-π*.

● substante nesaturate : toate substantele cu duble si triple legaturi ; tranzitiile electronice

sunt π-π*.

● substante cu caracter acid si derivati functionali

T = I/Io

I = I0 ∙ 10

-εcl

● poliene conjugate

● compusi aromatici.