c1_metode de izolare

7/21/2019 C1_Metode de Izolare

1/39

Procedee chimice, microbiologicei toxicolo ice avansatede control i analiz

. . . .

[email protected]


2/39


3/39

METODE MICROBIOLOGICE CLASICE VS. METODE RAPIDE

I AUTOMATIZATE.


4/39

IZOLAREA MICROORGANISMELOR N CULTURI

Tehnicile de izolare presupun o serie de operatii:

prelevare probe biologice din medii naturale

inoculare in medii de cultura specifice

studiul coloniilor izolate

repicare pentru obtinerea culturilor pure


5/39

Culturi pure de microorganismeCulturi pure de microorganisme

Cultur: populaie de microorganisme

cultivatn condi ii predefinite Culturpur culturalctuitdintr-un

singur tip e microorganism

Culturmixt culturformatdin maimu e un s ngur p e m croorgan sm

zo are a m croorgan sme ordin culturi mixte


6/39

Culturmixt Culturpur


7/39

Culturmixt


8/39

Cultura pura:

Biomasa de celule rezultata rin re roducerea unei sin ure celuleaflata ntr-unmediu nutritiv sterilcuvolum limitat.

O cultura ura contine celule a artinand unei sin ure s ecii

respectiv unei singure tulpini.

M t d l i

etode clasice:

I. Metode bazate pe separarea fizico chimica a celulelor

II. Metode biologice


9/39

I Procedee fizice de izolare

1. Metode prin raspandire

a. Metoda Koch specifica izolarii drojdiilor

Recoltarea microorganismelor din mediinaturale

Fixarea distantat a celulelor, prin

raspandire, in mediu nutritiv

Obtinerea coloniilor izolate prin

mu p carea ce u e or


10/39

a. Metoda Koch specifica izolarii drojdiilor


11/39

b. Metode scarificate


12/39

Tehnica striurilor


13/39


14/39

c. Metoda Drigalski

Metoda de raspandire

in placi


15/39

2. Metode de diluare

tehnica dilutiilor decimale


16/39

a Metoda Lindner

Izolarea drojdiilor

Metoda precisa Sub control microscopic

Se realizeaza dilutii cores unzatoare

Se plaseaz 9 picaturi pe o lamela sterila care se plaseaz cu picaturile in jospe o lama cu excavatie

Se identific pictura care conine o singura celula

Se absoarbe cu o hartie de filtru steril i se introduce ntr-o eprubeta cu

mediu steril; termostatare; cultura pura


17/39

a Metoda Naumov

Izolarea culturilor pure de mucegai

eto a spec c ;

e reco teaz o cantitate re usa e su strat io ogic; se rea izeaza i utiicorespunzatoare

Se plaseaz picaturi pe capacul interior al unei placi Petri; se adauga

mediu fluidificat si temperat; se termostateaz;

Se identific pictura de mediu care conine colonia dorit


18/39

II Metode biologice

a. Metoda Burri

e separa m croorgan sme e n unc e e necesaru e ox genSe inoculeazmicroorganismele n mediu cu agar(fluidificat i temperat)Mediul se transfern tub dre t si se solidificn ozi ie vertical

Medii recomandate: carne-ficat agar

Tripticaz- glucoz-extract de drojdie

Citirea rezultatelor

MO aerobe la suprafata mediului drept

MO facultativ aerobe pe toatnalimea tubului

MO microaerofile- pe ultima 1/3 din nalimea tubului

MO strict anaerobe pe 2/3 din inaltimea tubului


19/39

b. Folosirea mediilor selective

Favorizeaza dezvoltarea unui grup restrans

de microorganisme ce apartinSubstane cu efect antifungic: (actidiona,

aceleeasi speciinistatin), sau antibacterian ( polimixin,penicilin)

Se pot utiliza o serie de substante

chimice cu efect inhibitor fatde

celelalte microorganisme

Ex. pentru izolarea

sterptomicetelor: medii cu amidon

i licerol sursa de carbon i

argininsau azotati (sursa de azot)


20/39

MediMediii dede culturcultur selectivselectivee

Staphylococcus aureus


21/39

MediMediii dede culturcultur selectivselectiveePrezenta/Absenta E.coli si coliformilor inprobe de 100mL apa

AquaCHROM ECC


22/39

MediMediii dede culturcultur pentrupentru diferentiereadiferentierea tulpinilortulpinilor

ChromA ar


23/39

MediMediii dede culturcultur selectivselective si diferentialee si diferentiale

EMB - Eosin meth lene blue a ar

Coloranti- eozina si albastru de metil, ce inhiba dezvoltarea

bacteriilor G(+)

La tulpinile care pot fermenta lactoza se observo

modificare a culorii coloniilor


24/39


25/39

Verificarea purittii culturilor izolate

Studiul caracterelor macroscopice

Studiul caracterelor microscopice

Probleme la aplicarea tehnicii striurilor

Neomo enizarea e rubetei cu biomasa inainte de recoltare nu este

prelevata biomasa

Utilizarea ansei neracite la prelevarea biomasei sunt omorate

microorganisme e

Nesterilizarea ansei intre etapele de efectuare a striilor nu se vor forma

colonii

Efectuarea unui numar mic de striuri nu se vor forma colonii


26/39

Probleme de izolare manual

Contaminarea placiiprin scoaterea completa a capacului, apropierea fetei

e p aca pentru a ve ea cum au ost rea izate striuri e

coloniicontaminarea culturii

Tehnica de recoltare deficitara din partea operatorului contaminarea

culturii

Expunerea biomasei la mediul inconjurator contaminarea culturii


27/39

PrelevatorPrelevator dede coloniicolonii Colony PickierColony Pickier

PMPM--1s1s MicrotecMicrotec Sistem de banc compact

s em comp e au oma za eprelevare a coloniilor

Sistem automat de schimbare a acului(ANCS)

de pixeli)

Sistem automat de trasabilitate pentrucolonii (transfer in format Excel)

Transfer automat de colonii lipsit decontaminare

Imbunatateste eficienta in laborator

Reduce cheltuielile de munca pentrusarcini de rutina si stress-ul de efectuare aunei munci repetitive


28/39

SetariSetari inin programulprogramul dede prelevareprelevare aa

coloniilorcoloniilor

Numar de godeuri

utilizate (96, 384) Numar de oscilatii ale

acului

Conditii de prelevare

Stabilirea pozitiei de

start si a godeurilorcu pro e oar e(blank wells)

Parametrii desterilizare a acului

Adancimea depatrundere a acului


29/39

Sistem de schimbare automata a aculuiSistem de schimbare automata a acului

- periere

- c at re cu etano

- incalzire la 400C


30/39

SistemulSistemul PickoloPickolo dede prelevareprelevare

. -

http://www.youtube.com/watch?v=iK65vJyvmJc2. Robot Bacteria Colony Picking

http://www.youtube.com/watch?v=WJ-qVBjVDB8

.

http://www.youtube.com/watch?v=udx6eQKdJHk&feature=related

4. SciRobotics Pickolo: Colony-picker for Tecan robots by Robiotec Ltd.http://www.youtube.com/watch?v=oI5ws2xP6ig&feature=related


31/39

Se ia in considerare:

-forma coloniilor,- marimea coloniilor

- distanta dintre colonii


32/39

SistemulSistemul PickoloPickolo de prelevare automata ade prelevare automata a

coloniilorcoloniilor -- Analiza imaginiiAnaliza imaginii


33/39

Tehnici indirecte de evaluare a numarului de microorganisme


34/39

Numararea cu citometre


35/39

Metode directe de numarare a bacteriilor

Se calculeaza :


36/39

Diluare/numarare prin intermediul inoculatorului spiralDiluare/numarare prin intermediul inoculatorului spiral

Inoculator Spiral

(Interscience)


37/39

DiluareDiluare clasicaclasica vs.vs. diluarediluare automataautomata


38/39


39/39

NumarareaNumararea microorganismelormicroorganismelor cucu inoculatorulinoculatorul spiralspiral

Aplicatiregula lui 20.

Numarati coloniile din sectoare situate diametral

opuspentru a minimiza erorile de numarare.

Calculati numarul de microorganisme cuformula:

VCCN :)21( +=

c1_metode de izolare

Documents