MICROORGANISMELE EXTREMOFILE. GRUPE, CARACTERIZARE, IZOLARE N

CULTUR PUR

Cuprins

1.Utilizarea microorganismelor extremofile n biotehnologii. No iuni introductive.. 3

2.Clasificarea microorganismelor extremofile....7

3. Microoganisme termofile i hipertermofile.7

4. Microoganisme psichrofile. 11

5. Microoganisme alcalofile.12

6. Microoganisme acidofile..13

7. Microoganisme halofile............................................................................................................14

8. Microoganisme barofile...........................................................................................................15

9. Microorganisme rezistente la radiaii....................................................................................15

10. Microoganisme oligotrofe.....................................................................................................15

1. Utilizarea microorganismelor extremofile n biotehnologii. No iuni introductive

n lumea vie, exist o serie de microorganisme care pot popula medii extreme. Aceste microorganisme au dezvoltat de-a lungul timpului o serie de adaptri, de ordin structural i chimic, ce le permit dezvoltarea i supravieuirea n medii extreme.

Mediile extreme includ mediile cu temperaturi, pH, presiuni, concentraii de sare ridicate i pe cele cu temperaturi, pH, concentraii de nutrieni i disponibilitatea apei sczute. Deasemenea, n categoria mediilor extreme sunt incluse i cele cu nivele ridicate de radiaii, metale grele i compui toxici.

n ultima perioad, biotehnologia a demarat o intens cercetare asupra microorganismelor extremofile, datorit numeroaselor aplicabiliti din industrie. Unul dintre cele mai bune exemple l constituie extremoenzimele, care sunt deja folosite pe pia. Cele mai cunoscute extremoenzime sunt proteazele alcaline din detergeni. Acestea au o pia de desfacere foarte mare, lund n considerare piaa mondial de detergeni. O alt aplicabilitate important o constituie obinerea de AND polimeraze, cu aplicabilitate n tehnica PCR (obinute de la tulpini de Thermococcus littoralis, Thermus aquaticus, Thermotoga maritime, Pyrococcus woesii i P. furiosus ). O inovaie important o constituie deasemenea enzimele termostabile, care conduc hidroliza amidonului, precum -amilaze care nu necesit ionul de Ca2+, amilopululanaze, glucoamilaze i glucozo-izomeraze, care sunt active la pH-ul la care are loc hidroliza amidonului. Xilanazele termostabile i alcaline sunt folosite n tratamentul de prenalbire a cojilor, pentru a reduce cantitatea de clor necesar etapei de nalbire. Bergquist et al au reuit s introduc i s exprime dou xilanaze din Dictyoglomus thermophilum, n Kluyveromyces lactis i Trichoderma reesei. Dunaliella bardawii, o alga verde extremofil, este folosit la obinerea de beta-caroten; Marinobacter hydrocarbonoclasticus, o halotolerant, este capabil s degradeze o varietate de hidrocarburi alifatice i aromatice. Nicholson si Fathepure au pus la punct o cultur halofilic capabil s degradeze n 1-2 sptmni un amestec de benzen, toluen, etilbenzen i xileni. n acest fel se poate pune la punct o metod cu cost redus cu aplicabilitate n amelioarea solurilor i protejarea acviferelor.

n tabelul 1 sunt prezentate potenialele aplicabiliti ale extremofilelor.

Tabelul 1. Aplicaii ale microorganismelor extremofile

Sursa UtilizareaTermofile

ADN-polimeraze PCRAND-ligaze LCRFosfataza-alcalin DiagnosticProteaze i lipaze Produse lactateLipaze, pululanaze, amilopululanaze i proteaze Panificaie, producerea berii -amilaze, glucoamilaze, -glucozidaze, Procesarea amidonului, folosirea amilopululanaze, izomeraze glucozei i fructozei ca ndulcitoriAlcool dehidrogenaz Sinteze chimiceXilanaze nlbirea hrtieiAntibiotice FarmaceuticMicroorganisme ce degradeaz petrolul Surfactani

2

Microorganisme sulf-oxidante Desulfurizri

PsichrofileFosfataza alcalin Biologie molecularProteaze, lipaze, celulaze i amilaze DetergeniLipaze i proteaze Producerea brnzeturilorProteaze Soluii pentru curarea lentilelor de

contactAcizi grai polinesaturai Aditivi i suplimente alimentare

-galactozidaz Hidroliza lactozei din produse lactate Dehidrogenaze Biotransformri

Oxidaze Bioremedieri, biosenzoriMicroorganisme ice minus Protectia plantelor sensibile mpotriva

nghe uluiHalofile

Bacteriorhodopsina Generatori de curent n bioelectronicPolihidoxialcanoa i Plastic de uz medicalPolimeri reologici Recuperarea petroluluiLipide Lipozomi pentru medicamente i

cosmeticeLipide nclzirea uleiuluiSolu i compatibili Protectori ai proteinelor i celulelor n

diferite procese (nclzire, nghe are)Diferite enzime Diferite utilizri (agen i de arom)Acid -linoleic, -caroten i extracte celulare Suplimente alimentare, hran dietetic,

coloran iMicroorganisme Modificatori ai aromei i texturii

produselor alimentare i fermentarea sosurilor de pe te

Microorganisme Degradarea i transformarea de eurilor Membrane Surfactan i pentru produse farmaceutice

AlcalofileProteaze, celulaze, xilanaze, lipaze i pululanaze Detergen i

Elastaze, keratinize ndeprtarea pielii/pruluiCiclodextrine Utilizri n farmaceutic, industria

chimic i alimetarXilanaze i proteaze nlbirePectinaze Industria hrtiei, degomare i tratarea

de eurilorMicroorganisme alcalofile Producere de antibiotice

AcidofileMicroorganisme sulf-oxidante Recuperare de metale i desulfurarea

crbuneluiMicroorganisme acidofile Acizi organici i solven i

3

Microorganisme tolerante la solven i organici Bioconversia compu ilor insolubili n ap (exemplu steroli), bioremediere, biosurfactan i

Microorganisme rezistente la radia ii Degradarea puluan ilor organici din mediile poluate cu de euri radioactive

Barofile mbunta irea procesului de recuperare a petrolului

(Cavicchioli, R., 2000)

Microorganismele care sunt capabile s supravieuiasc n mediile extreme poart denumirea de microorganisme extremofile. Aceste microorganisme, nu numai c tolereaz aceste medii, dar in mod normal aceste condiii de medii sunt eseniale pentru supravieuirea i dezvoltarea lor. Condiiile normale de cretere sunt considerate: pH apropiat de neutru, temperatura ntre 20 i 40oC, presiunea aerului aproximativ 1 atm i nivele corespunztoare de nutrieni, sruri i ap. Orice mediu care este n afara acestor parametrii este considerat extrem (Satyanarayana, 2005) .

n Tabelul 2 sunt prezentate recordurile microorganismelor extremofile. Datele sunt adaptate dupa Ferreira et al. (1997), Madigan (2000) i Seckbach i Oren (2004).

Tabelul 2. Recorduri ale microorganismelor extremofile

Factor de mediu Organism Habitat Tolerana la factorul de stres

Temperatura ridicat Pyrolobus Crpturi oceanice Maxim 113OC fumarii hidrotermale Optim 106 OC

Minim 90 OC

sczut Polaromonas ap de mare Minim 0OCvacuolata nghetat Optim 4 OC

Maxim 12 OC

pH sczut Picrophilus izvoare acide pH minim 0.06oshimae pH optim 0.7

pH maxim 4

ridicat Natronobacterium lacuri bazice pH maxim 12gregoryii pH optim 10

pH minim 8.5

Presiune hidrostatic Tulpina MT41 Groapa Marianelor Maxim >100 MPa Optim 70 MPa Minim 50 MPa

Concentraia de sare Halobacterium lacuri sarate, Maxim:NaCl la saturaiesalinarum saraturi, Optim: 250 g sare/l

peste sarat Minim: 150 g sare/l

Ultraviolete i radiaii Deinococcus carne tocat, Rezistent la 1.5 kGy

4

ionizante radiodurans secretii nazale, radiaii gamma i la deeuri radioactive 1500 J/m2 UV

(Rainey, F., 2006)

Deasemenea, exist i microorganisme poliextremofile, capabile s supravie uiasc n condi ii limitate de mai mul i factori (combina i). n tabelul 3 sunt prezentate o serie de microorganisme adaptate la combina ii de medii extreme.

Tabelul 3. Microorganisme poliextremofile

Factorii de mediu Organism Habitat Tolerana la factorul de stres

pH sczut, Picrophilus Izvoare termale pH minim 0.06temperatur ridicat oshimae acide temperatura max. 65OC

Sulfurisphaera Izvoare termale pH minim 1acide temperatura max. 92OC

Cyanidium Izvoare termale pH minim 0.2caldarium acide temperatura max. 57OC

pH ridicat, Natronobacterium Lacuri bazice pH maxim 12concentra ie de gregoryi NaCl la satura iesruri mare

Temperatur ridicat, Thermococcus Izvoare hidrotemale temperatura max. 90OCpH ridicat alcaliphilus marine pH maxim 10.5

Temperatur ridicat, Thermococcus Curen i termali, temperatura max. 100OCpresiune ridicat barophilus lan ul muntos presiunea 15-17.5 MPa

al Atlanticului

Temperatur ridicat, Deinococcus Izvoare termale temperatura max. 100OCradia ii nalte geothermalis rezist la radia ii gamma

de peste 10kGy(Rainey, F., 2006)

Existena vieii n condiii extreme este intens studiat, concentrndu-se pe diversitate i pe mecanismele moleculare i de reglare implicate. Proteinele, enzimele sau alte substane biocompatibile produse de extremofile prezint un interes foarte mare pentru biotehnologie. Deasemenea, studiul extremofilelor ale aplicaii i n astronomie, urmrindu-se existena vieii pe alte planete.

5

2. Clasificarea microorganismelor extremofile

n funcie de parametrii care variaz n mediu, microorganismele extremofile se clasific n: Acidofile: microorganisme care au un pH-ul optim sub valoarea 3; Alcalofile: microorganisme care au un pH-ul optim peste valoarea 9; Barofile: microorganisme capabile s supravieuiasc n medii cu presiune

hidrostatic ridicat; Halofile: microorganisme ce necesit concentraii de sare de cel puin 0.2M; Hipertermofile: microorganisme care se dezvolt la temperaturi ridicate 80-122 oC; Hipolite: microorganisme care se dezvolt sub rocile deerturilor reci; Litoautotrofe: microorganisme a cror surs de carbon este CO2; Metalotolerante: microorganisme capabile s tolereze concentraii ridicate de metale

precum cuprul, cadmiu, zinc sau arsenic; Oligotrofe: microorganisme capabile s se dezvolte n medii limitative; Osmofile: microorganisme capabile s se dezvolte n medii cu concentraii ridicate

de zaharuri; Poliextremofile; Psichrofile: microorganisme care sunt capabile s se dezvolte, s supravieuiasc i

s se nmuleasc la temperaturi sczute (-15 oC) ; Rezistente la radiaii; Termofile: microorganisme care sunt capabile s se dezvolte, s supravieuiasc, s

se dezvolte i s se nmuleasc la temperaturi cuprinse ntre 60-80oC; Termoacidofile: se dezvolt la temperaturi ntre 60-70 oC i pH ntre 2 i 3; Xerofile: microorganisme care se pot dezvolta n condiii cu umiditate foarte sczut.

(http://en.wikipedia.org/wiki/Extremophile)

3. Microoganisme termofile i hipertermofile

Termofilele sunt microorganisme care sunt capabile s se dezvolte, s supravieuiasc, s se dezvolte i s se nmuleasc la temperaturi cuprinse ntre 60-80 oC.

Hipertermofilele sunt microorganisme capabile s se dezvolte la temperaturi superioare celei de 80 OC. Marea majoritate a hipertermofilelor a fost identificat n zonele vulcanice continentale i oceanice i n sol.

n afara interesului ecologic i evolu ionist pe care l au, microorganismele termofile prezint un interes deosebit datorit faptului c sunt surse excelente de biomolecule utile cu aplica ii biotehnologice (Rainey, F., 2006).

Microorganismele termofile aparin att procariotelor, ct i eucariotelor. n sol, compost, rumegu sau n cuiburile psrilor au fost identificai fungi termofili, care aparin Zygomycetes (Rhizomucor miehei, R. pusillus), Ascomycetes (Chaetomium thermophile, Thermoascus aurantiacus, Dactylomyces thermophilus, Melanocarpus albomyces, Talaromyces thermophilus, T. emersonii, Thielavia terrestris), Basidiomycetes (Phanerochaete chrysosporium) i Hyphomycetes(Acremonium alabamensis, A. thermophilum, Myceliophthora thermophila, Thermomyces lanuginosus, Scytalidium thermophilum, Malbranchea cinnamomea). Dintre algele care se dezvolt la temperaturi ridicate putem aminti: Achanthes exigua, Mougeotia sp. i Cyanidium caldarium, iar ca protozoare: Cothuria sp., Oxytricha falla, Cercosulcifer hamathensis, Tetrahymena pyriformis, Cyclidium citrullu i Naegleria fowleri.

6

n funcie de temperatura optim de dezvoltare, bacteriile i arhebacteriile au fost clasificate n termofile moderate (Bacillus caldolyticus, Geobacillus stearothermophilus, Thermoactinomyces vulgaris, Clostridium thermohydrosulfuricum, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoplasma acidophilum), extreme (Thermus aquaticus, T. thermophilus, Thermodesulfobacterium commune, Sulfolobus acidocaldarius, Thermomicrobium roseum, Dictyoglomus thermophilum, Methanococcus vulcanicus, Sulfurococcus mirabilis, Thermotoga mritima) i hipertermofile (Methanoccus jannaschii, Acidianus infernos, Archaeoglobus profundus, Methanopyrus kandleri, Pyrobaculum islandicum, Pyrococcus furiosus, Pyrodictium occultum, Pyrolobus fumarii, Thermococcus littoralis, Ignicoccus islandicum, Nannoarchaeum equitans). Acestea au fost izolate din surse ca: composturi, soluri expuse la radiaii solare, izvoare termale terestre, crpturi submarine hidrotermale sau rezerve geotermale de petrol. Tulpini extremotermofile de Geobacillus thermooleovorans au fost izolate din izvoare fierbinti; deasemenea, Kasheri i Lovely au izolat o tulpin ce reduce Fe(III) la Fe(II) din crptura izotermal Mothra (Pacificul de Nord), care poate rezista la 121OC, aceasta fiind temepratura cea mai ridicat la care poate supravieui un microorganism (Satyanarayana, 2005).

n mod normal proteinele, acizii nucleici sau lipidele din structura microorganismelor se deterioreaz la temperaturi nalte; dar nu este i cazul termofilelor. Lipidele membranare ale termofilelor conin o cantitate mai mare de acizi grai nesaturai i cu catena neramificat dect cele ale mezofilelor. Acest lucru permite termofilelor s se dezvolte la temperaturi ridicate, asigurnd gradul de fluiditate necesar bunei funcionri a membranei. Multe specii de termofile prezint un strat paracristalin la suprafa, alctuit din proteine sau glicoproteine i care functioneaz ca o barier protectiv.

Dintre hipertermofile, cel mai intens au fost studiate speciile de termoacidofile apar innd ordinului Sulfolobales, metanogenele i cteva specii apar innd ordinului Thermococcales. Principala limitare n studiul acestor microorganisme o constituie cantitatea mic de biomas care poate fi ob inut. Thermococcalele au fost izolate din ecosisteme marine, excep ie fcnd Thermococcus sibiricus, izolat dint-un zcmnt de petrol cu temperatur ridicat i Thermococcus zilligii i Thermococcus waiotapuensis, ambele izolate din izvoare geotermale continentale. Ordinul cuprinde trei genuri: Thermococcus, Pyrococcus i Palaeococcus, care sunt anaerobe, utilizeaz peptidele ca surs de carbon i majoritatea lor se dezvolt foarte bine n prezen a sulfului, producnd o cantitate mare de hidrogen sulfurat. Pentru cultivarea acestor microorganisme se prefer utilizarea bioreactoarelor din sticl, cu bule de gaz. n figura 1 este prezentat un bioreactor utilizant pentru cultura termofilelor.

7

Figura1. Bioreactor cu bule de gaz utilizat pentru cultura hipertermofilelor. A-schema bioreactorului, B-imagine lateral, C-imagine a pr ii superioare

(Godfroy, A., 2006).

Recoltarea probelor pentru termofilele marine se face n general folosind sonde care sunt ac ionate de la suprafa , procedeul fiind destul de anevoios. Pentru colectarea diferitelor probe din izvoare termale de adncime sunt necesare aparate speciale pentru colectare- DSV (Deep Submergence Vehicles) i ROV (Remotely Operative Vehicles). Probele con in fie lichide, fie por iuni solide (structuri ale co urilor vulcanice, roci, sedimente, vie uitoare, etc.). Probele lichide sunt colectate in floacoane Niskin, seringi de titan sau tuburi ORI. Probele solide sunt colectate cu echipamentele DSV sau ROV, care au in componen un compartiment steril de colectare a probelor. Dup colectare, probele trebuiesc procesate imediat, datorit faptului c majoritatea termofilelor sunt anaerobe sau facultativ anaerobe (excep ie fcnd Marinithermus hydrothermalis, Aeropyrum Camini i cteva tulpini de Thermus ) . n mod normal probele sunt pstrate n sticle cu dop de cauciuc impermeabil la gaze, n atmosfer de azot. Mediile de cultur folosite difer n func ie de necesit ile nutritive ale microorganismului. Termofilele marine pot fi clasificate n: microorganisme fermentative, metanogene, heterotrofe aerobe, reductoare autotrofice sau heterotrofice de nitat, sulfat, sulf sau fier. n tabelul 4 sunt prezentate principalele tipuri de termofile marine, n func ie de metabolism.

8

Tabel 4. Microorganismele termofile n func ie de metabolism.

Tipul metabolic Ordinul (Genul) Substrat sau Aceptor de e- donor de e-

Fermentative Thermococcales (Thermococcus, Materie organic - (H+) Pyrococcus, Palaeococcus), Thermotogales (Thermosipho i Marinitoga), Clostridiales (Tepidibacter, Caminicella, Caloranaerobacter) i Desulfurococcales (Staphylothermus) Thermoanaerobacterales (Caldanaerobacter) H2O, materie organic CO,-

Metanogene Methanococcales (Methanocaldococcus, H2(format)CO2

Methanotorris, Methanothermococcus)i Methanopyrales (Methanopyrus) H2CO2

Heterotrofe aerobe Desulfurococcales (Aeropyrum) Materie organic O2

Thermales (Marinithermus) Materie organic O2Thermales (Vulcanithermus i Materie organicO2, NO3-Oceanithermus)

Chemolitoautotrofe Desulfurococcales (Ignicoccus), H2 S0 (NO3-,obligate Desulfurobacterium S2O32- , SO32-)

group (Desulfurobacterium, Balnearium,Thermovibrio) i Nautiliales (Lebetimonas)Thermodesulfobacterales H2 SO42-(Thermodesulfobacterium iThermodesulfatator)Aquificales (Persephonella i Aquifex) H2 (S0, S2O32- ) O2,NO3-,(S0)Nautiliales (Caminibacter) H2

NO3-,S0, O2Facultativ chemolitoautotrofe Archaeoglobales (Archaeoglobus H2 , Materie organic SO42-, FeIII

i Geoglobus) S2O32- ,SO32-

Deferribacterales (Deferribacter) H2, Materie organic NO3-,FeIII

S0, arsenat

Nautiliales (Caminibacter and Nautilia) H2, Materie organic NO3-,S0,

SO32-Thiotrichales (Thiomicrospira) S0, S2O32- , S2-

O2Heterotrofe obligat Desulfurococcales (Pyrodictium) H2, Materie organic S0, S2O32-

9

anaerobe Desulfuromonadales (Geothermobacter) Materie organicNO3-,FeIII

(Nakagawa,S., 2006)

Majoritatea termofilelor necesit cultivarea n condi ii anaerobe. Culturile se realizeaz n mod normal n tuburi Hungate sau n baloane de 100-250 ml, nchise cu dopuri de cauciuc. Volumul mediului de cultur trebuie s fie cel mult 20% din volumul baloanelor sau tuburilor. Volumul liber de gaz trebuie s fie H2, H2/CO2 (80:20), N2 sau N2/CO2. Cel mai folosit mediu de cultur este mediul salin bazal (ap de mare sintetic), care are urmatoarea compozi ie, raportat la un litru de ap deionizat i distilat:

NaCl 25 g MgCl2 x 6H2O 4.2g MgSO4 x 7H2O 3.4g KCl 0.5 g NH4Cl 0.25 g K2HPO4 0.14 g CaCl2 x 2H2O 0.7g FeSO4 x 7H2O 0.02g Solu ie mineral 10 ml .

Solu ia mineral are urmtoarea compozi ie (per litru de ap distilat i deionozat) : Acid nitrilotriacetic (NTA) 1.5g MgSO4 x 7H2O 3 g MnSO4 x 5H2O 0.5 g NaCl 1.0 g FeSO4 x 7H2O 0.1 g CoSO4 x 7H2O 0.18 g CaCl2 x 2H2O 0.1 g ZnSO4 x 7H2O 0.18 g CuSO4 x 5H2O 0.01 g KAl (SO4)2 x12H2O 0.02 g H3BO3 0.01 g Na2MoO4 x 2H2O 0.01 g NiCl2 x 6H2O 0.075 g Na2SeO3 x 5H2O 0.05 g

Acest mediu este adaptat n func ie de necesit ile speciale ale microorganismului de interes. Incubarea se face fie n incubatoare, fie n baie de ulei, care pot atinge temperaturi de peste 130 oC i presiune de 400kPa. Izolarea n culturi pure se face folosind tehnica dilu iilor repetate. Primul pas l reprezint determinarea densit ii celulare din cultura ce va urma s fie supus dilu iilor. n continuare se realizeaz dilu ii seriale 1 :10 pn cnd densitatea celular ajunge la aproximativ 102-103 celule/ml. Din ultima dilu ie se fac dilu ii de 1:2 pn cnd factorul total de dilu ie dep e te densitatea celular ini ial cu cel pu in dou ordine de mrime. ntreaga opera ie de dilu ie este necesar s fie repetat de 3-5 ori (Nakagawa, S., 2006).

10

4. Microoganisme psichrofile

Pn la ora actual, s-au raportat numeroase specii de microorganisme psichrofile (peste 100), att Gram pozitive, ct i Gram negative. Acestea au fost identificate n sol, nisip, ape dulci, ape marine sau n ghearele mrilor i oceanelor. Psichrofilele aparin genurilor Alcaligenes, Alteromonas, Aquaspirillum, Arthobacter, Bacillus, Bacteroides, Brevibacterium, Gelidibacter, Methanococcoides, Methanogenium, Methanosarcina, Microbacterium, Micrococcus, Moritella, Octandecabacter, Phormidium, Photobacterium, Polaribacter, Polaromonas, Psychroserpens, Shewanella i Vibrio. Genul Morritella este compus n totalitate din psichrofile. Primele psichrofile identificate n Antarctica au fost Leifsonia aurea, Sporosarcina macmurdoensis i Kocuria polaris. Astfel n orice mediu cu temperaturi sczute, cea mai mare parte a microorganismelor izolate sunt psichrofile. Deasemenea, au fost identificate numeroase psichrofile n peterile reci din Pirinei, Alpi, Carpai, Lapland sau Arctic. Cea mai mare parte a lor aparine genurilor Arthrobacter, Pseudomonas si Flavobacterium, predominnd genul Arthrobacter. Cele mai multe microorganisme izolate din solurile acestor peteri sunt similare Arthrobacter glacialis. n locurile unde zpada se topete sau unde suprafaa zpezii este colorat n rou, verde sau galben, se gsesc alge. Majoritatea acestora sunt psichrofile; speciile reprezentative sunt: Chloromonas brevispina, C. pichinchae, C. rubroleosa, C. polyptera i Chlamydomonas nivali (Satyanarayana, 2005).

Dintre toate componentele celulare ale psichrofilelor, cele mai importante sunt proteinele. n tabelul 5 sunt prezentate principalele proteine ob inute folosind psichrofilele.

Tabelul 5. Microorganisme psichrofile productoare de proteine utile

Proteina Microorganismul productor Referin e-amilaz Pseudoalteromonas haloplanktis Aghajari et al. (1996, 1998)Proteaz alcalin Pseudomonas aeruginosa Aghajari et al. (2003)Triozo-fosfatizomeraz Moritella marina Alvarez et al. (1998)Citrat-sintaz Tulpina bacterian DS2-3R (Antartica) Russell et al. (1998)Malat-dehidrogenaz Aquaspirillium arcticum Kim et al .(1999)Xilanaz Pseudoalteromonas haloplanktis Van Petegem et al. (2002, 2003)Adenilat-kinaz Sporosarcina globispora Bae i Phillips (2004)Protein-tirozin-fosfataz Shewanella sp. Tsuruta et al. (2002, 2005)

(Cavicchioli, R., 2006)

Supravieuirea psichrofilelor la temperaturi sczute servete ca model excelent pentru studierea adaptrii organismelor la temperaturi sczute.

Cultivarea acestor extremofile se face n incubatoare la care se seteaz temperatura minim. n general aceasta este de 5 oC, dar poate fi sczut prin plasarea incubatorului n camere cu temperaturi sczute sau prin ajustarea incubatorului prin adugarea de rcitoare cu recircularea apei. n general, extremofilele nu au necesitti nutritive ridicate, datorit condiiilor naturale din care sunt recoltate, excepie fcnd cele care se dezvolt n fecalele pinguinilor. O atenie sporit n alegerea mediului de cultur pentru speciile de psichrofile trebuie acordat salinitii mediului (n special pentru speciile recoltate din ap marin sau din solul Antarticii). Pentru speciile recoltate din zpad sau gheat se poate folosi ca mediu zapada sau ghea a topit i sterilizat, la care se adaug agar pentru a obine un mediu solid, far a se adauga surs de carbon. Pot fi folosite i medii comerciale

11

diluate 1 la 2 sau 1 la 10, precum tripton- soia- agar sau Luria-Bertani agar, la care se adaug canti mici de extract de drojdii (0.01-0.001%). nsmnarea se face pe mediul rcit n prealabil la temperatura optim fiecarui microorganism. Pentru izolarea psichrofilelor marine, cel mai frecvent se utilizeaz mediul comercial Marine 2219 agar, dar se poate folosi i mediu pe baz de ap de mare sterilizat (preferabil prin filtrare) (Russell , N., 2006).

5. Microoganisme alcalofile

Descoperirea alcalofilelor s-a fcut relativ recent. Ulilizarea acestor microorganisme are o istorie lung in Japonia, fiind folosite nc din antichitate n industria indigoului; astfel, indigoul, provenit din frunzele de indigo este redus n procesul de fermentaie al indigoului, care are loc n condiii puternic alcaline (http://mmbr.asm.org). Alcalofilele se mpart n dou mari grupuri fiziologice: alcalofile si haloalcalofile. Alcalofilele necesit un pH mai mare de 9 pentru cretere, optimul fiind de 10; haloalcalofilele necesit n afara pH-ului peste 9 i o salinitate crescut (33% NaCl). Prima grup are cerine minime de NaCl n mediu de cretere. Acestea se gsesc n sol, sedimente marine sau n apele cu coninut ridicat de Ca2+ . Haloalcalofilele sunt prezente n mod frecvent n lacurile bazice sau n deerturile bazice. Majoritatea haloalcalofilelor izolate din aceste medii aparin grupului Archaea.

Dintre genurile care cuprind alcalobacterii pot fi amintite: Pseudomonas, Paracoccus, Micrococcus, Aeromonas, Corynebacterium, Actinopolyspora , Bacillus, Vibrio, Flavobacterium, Cyanospira, Chlorococcum, Pleurocapsa, Spirulina, Ectothiorhodospira si Methanohalophilus.

Cele mai cunoscute haloalcalofile sunt: Natronobacterium pharaonis, N. gregoryi, Natronococcus occultus, Methylobacter alcaliphilus, Methylomicrobium alcaliphilum, Spirochaeta alcalica, S. asiatica, Desulfonatronovibrio hydrogenovorans, Clostridium, Thermoanerobacter sp., i Thermopallium natronophilum (Satyanarayana, 2005).

Izolarea alcalofilelor se face folosind metode conven ionale, cea mai important problem luat n considerare fiind mediul de cultur. Cea mai folosit tehinc este cea a dilu iilor repetitive, pe plci cu mediu solid (Mesbah, N., 2006).

n mod normal, pentru cultivarea alcalofilelor se folose te mediu pe baz de NaHCO 3-Na2CO3, ajustnd pH-ul n jurul valorii de 10.5 prin adugare de Na2CO3 1%.

Se folosesc n principal dou medii: mediul Horikoshi (1971), dezvoltat ini ial pentru izolarea alcalofilelor din sol, i mediul Tindall et al. (1984).

Compozi ia mediului Horikoshi (1971) este urmtoarea (grame per litru): Glucoz 10.0 Pepton 5.0 Extract de drojdii 5.0 KH2PO4 1.0 MgSO4 x 7H2O 0.2 Na2CO3 10.0.

Compozi ia mediului Tindall et al. (1984), exprimat n grame per litru: Extract de drojdii 10.0 Acizi casaminici 7.5 Citrat trisodic 3.0 KCl 2.0 MgSO4 x 7H2O 1.0 MnCl2 x 4H2O 0.00036 FeSO4 x 7H2O 0.05

12

NaCl 200 Na2CO3 10.0

La preparare, mediul poate prezenta precipita i i are pH-ul cuprins ntre 10.5 i 11, dar dup turnarea n plci, pH-ul scade la 9.5-10, datorit absor iei de CO 2 (Grant,W., 2006).

6.Microoganisme acidofile

Acidofilele sunt microorganisme capabile s supravie uiasc n medii cu pH sczut. Din aceste medii au fost izolate bacterii chemoautolitotrofe, care oxideaz mineralele ce con in fier i sulf. Cele mai studiate sunt: Acidithiobacillus ferrooxidans, Leptospirillum spp., Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus caldus, Sulfobacillus spp. i Ferroplasmaceae spp. Deasemenea au fost izolate microorganisme heterotrofe acidofile ce aparin genului Acidiphilium i heterotrofe facultative, ca Acidimicrobium spp., Desulfosporosinus spp. i Ferrimicrobium spp.. O parte important a microorganismelor acidofile apar ine domeniului Archaea. Acestea pot fi mpr ite n dou ordine filogenetice: Sulfolobales i Thermoplasmatales. Dintre reprezentan ii Sulfolobales pot fi amintite: Acidianus ambivalens, Acidianus brierleyi, Metallosphaera spp., Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus solfataricus i Sulfolobus metallicus. Ordinul Thermoplasmatales are n componen a reprezentan i ai Thermoplasma spp., Picrophilus spp. i Ferroplasma spp. ( Gonzalez-Toril, E., 2006).

7. Microoganisme halofile

Microorganismele halofile au capacitatea de a se dezvolta la concentra ii ridicate de sare, de la 10% NaCl, pn la satura ie, iar unele microorganisme pot supravie ui chiar i n cristale de sare (Litchfield, C., 2006).

Majoritatea microorganismelor halotolerante a fost izolat din apa srat, marin sau din lacuri. n Marea Moart au fost identificai fungi halotolerani, ce aparin genurilor Zygomycotina (Absidia glauca), Ascomycotina (Chaetomium aureum, C. flavigenum, Emericella nidulans, Eurotium amstelodami, Gymnoascella marismortui, Thielavia terricola) i fungi mitosporici (Acremonium persicinum, Stachybotrys chartarum, Ulocladium chlamydosporum). Din lacurile cu salinitate ridicat au fost izolate cianobacterii halofile, ca Aphanothece halophytica, Microcoleus chthonoplastes, Phormidium ambiguum, Oscillatoria neglecta, O. limnetica O. salina i Dactylococcopsis salina. Dintre bacteriile organotrofe Gram negative halofile pot fi amintite: Acinetobacter, Alteromonas, Deleya, Flavobacterium, Marinomonas, Pseudomonas i Vibrio. Din solurile srturate i saline au fost izolate specii halofile apar innd genurilor Marinococcus, Sporosarcina, Salinococcus i Bacillus. n apa de mare sunt rspndite numeroase halobacterii apar innd genului Archaea: Haloarcula, Halobacterium, Haloferax, Halorubrum, Halococcus, Halobaculum, Haloterrigena i Halorubrum. O alt categorie a halofilelor este reprezentat de halofilele metanogene; astfel, din lacurile srate i oceane au fost izolate Methanohalophilus mahii, M. evestigatum i M. Halophilus (Satyanarayana, T., 2005).

Izolarea i cultivarea halofilelor la nivel de laborator prezint anumite dificult i, derivate din compozi ia n sare a mediului de cultur. Temperatura de incubare i salinitatea ridicat pot determina formarea de precipita i ai srii i limiteaz utilizarea anumitor aditivi precum agen ii de gelificare (gelan sau Gelrite ) sau indicatori (laptele praf degresat folosit pentru detectarea activit ii proteolitice, care coaguleaz n mediu cu salinitate ridicat). n cazul microorganismelor care necesit perioade lungi de incubare, trebuie s se aib n vedere faptul c salinitatea se modific n timp i acest lucru poate diminua cre terea microbian. Izolarea n culturi pure este un factor

13

esen ial n studiul microorganismelor. Cultivarea halofilelor izolate din ap se face pe medii ce au la baz o solu ie salin, asemnatoare apei de mare concentrate. n plus, trebuie s se in cont de necesit ile specifice ale fiecrei bacterii, n func ie de mediul din care a fost izolat. Spre exemplu, bacteriile izolate din Marea Moart, precum Halorubrum sodomense i Halobaculum gomorrense necesit o concentra ie mare de ioni de Mg 2+ n mediu. Astfel, se recomand ca mediul de cultur s imite ct mai bine condi iile naturale de unde au fost prelevate microorganismele. Se recomand chiar, dac se poate, s se foloseasc chiar apa din mediul de unde au fost izolate microorganismele, sterilizat n prealabil.

Principalul mediu pe care se cultiv halofilele la nivel de laborator este mediul MGM (Modified Growth Medium), care are n compoziie soluie de ap srat i o alt surs nutritiv bogat (5 g per l de pepton i 1 g per l extract de drojdii). nsmnarea mediului se face dup realizarea unei serii de diluii, astfel nct numrul de colonii s fie cuprins ntre 30 i 300. Incubarea se face la n general la 37oC, la ntuneric. Totui, temperatura optim pentru multe halofile este mai ridicat; spre exemplu Haloferax volcanii are o rat de cretere mult mai mare la 45oC dect la 37oC (Burns, D., 2006).

8. Microoganisme barofile

Barofilele sunt microorganisme capabile s supravieuiasc n medii cu presiune hidrostatic ridicat. Aceste tipuri de microorganisme se gsesc n general n mri i oceane adnci, unde sunt ntalnite condiii de nalt presiune hidrostatic. Cele mai multe dintre bacteriile barofilice i barotolerante fac parte din categoria -Proteobacterii. Dintre acestea putem aminti: Photobacterium, Shewanella, Colwellia i Motiella. n cazul barofilelor a fost studiat efectul presiunii asupra membranei celulare, a proteinelor i a expresiei genelor. Ca rspuns al presiunii ridicate, cantitatea relativ de acizi monounsatura i i poliunsatura i cresc n membran. O Alteromonas sp. barotolerant a artat propor ii ridicate de acizi grai nesaturai n membrana celular. Cantitatea mai mare de acid nesaturat produce mai mult fluid membranar i contracareaz efectul cre terii vscozitii cauzat de presiunea ridicat. Barofilele sunt extrem de sensibile la lumina UV i a adar, pentru dezvoltare, au nevoie de un mediu ntunecat sau cu lumin redus, ca cele din mediul maritim adnc. Presiunea poate stabiliza proteinele i ntrzia denaturarea termic (Satyanarayana, T., 2005).

9. Microorganisme rezistente la radiaii

Capacitatea de supravieuire a microorganismelor la doze ridicate de radiaii este n general redus. Exist totui anumite microorganisme care s-au adaptat i sunt capabile de supravieuire n astfel de condiii. Rezistena la doze ridicate de radiaii este o trstur ce a fost dobandit accidental de microorganisme, n condiii naturale dozele de radiaii fiind destul de sczute. Doar o mic parte a microorganismelor poate supravieui acestor condiii. Cele mai cunoscute sunt: Methylobacterium radiotolerans, Kocuria rosea, Acinetobacter radioresistens, Kineococcus radiotolerans, Hymenobacter actinosclerus, Chroococcidiopsis spp., Rubrobacter xylanophilus, Deinococcus radiodurans, Deinococcus proteolyticus, Deinococcus radiophilus, Deinococcus radiopugnans, Deinococcus grandis, Deinococcus geothemalis, Deinococcus murrayi, Deinococcus hohokamensis, Deinococcus navajonensis, Deinococcus hopiensis, Deinococcus apachensis, Deinococcus maricopensis, Deinococcus pimensis, Deinococcus yavapaiensis, Deinococcus papagonensis, Deinococcus sonorensis, Truepera radiovictrix, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus, Thermococcus gammtolerans i Thermococcus radiotolerans (Zimmerman, J, 2006).

14

10. Microoganisme oligotrofe

Microorganismele oligotrofe sunt acele microorganisme capabile s se dezvolte i s supravie uiasc ntr-un mediu ce con ine o cantitate de 0.2-16.8 mg de carbon organic per litru. Cea mai important caracteristic a oligotrofelor este aceea c de in un sistem de preluare al nutrien ilor din mediul ncojurtor dezvoltat, care le favorizeaz supravie uirea. Astfel, oligotrofele au un raport suprafa /volum mare, sisteme de preluare a nutrien ilor foarte dezvoltate i rezisten natural la factorii de stres din mediu (temperatur, peroxid de hidrogen sau etanol). Reprezentan i : Caulobacter, Hyphomicrobium, Prosthecomicrobium, Ancalomicrobium, Labrys i Stella (Satyanarayana, T., 2005).

Bibliografie

1. Burns, D. & Dyall-Smith, M.. Cultivation of Haloarchaea. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.536-542;

2. Cavicchioli, R. & Thomas, T.. Extremophiles. In: J. Lederberg. (ed.) Encyclopedia of Microbiology, Second Edition, Vol. 2, Academic Press, San Diego, 2000, pp. 317337;

3. Cavicchioli, R., Curmi, P., Siddiqui, K.& Torsten, T.. Proteins from Psychrophiles In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 406-407;

4. Godfroy, A., Postec, A. & Raven, N., Growth of Hyperthermophilic Microorganisms for Physiological and Nutritional Studies. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 93-97;

5. Gonzalez-Toril, E., Gomez, F., Malki, M. & Amils, R.. The Isolation and Study of Acidophilic Microorganisms, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 471;

6. Grant, W.. Cultivation of Aerobic Alkaliphiles. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 443-444;

7. Litchfield, C., Sikaroodi, M. & Gillevet, P.. Characterization of Natural Communities of Halophilic Microorganisms, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 513;

8. Mesbah, N. & Wiegel, J.. Isolation, Cultivation and Characterization of Alkalithermophiles. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 452-461;

9. Nakagawa,S. & Takai, K.. The Isolation of Thermophiles from Deep-sea Hydrothermal Environments, In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.55-78

10. Rainey, F. & Oren, A.. Extremophile Microorganisms and the Methods to Handle Them In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 5-10;

11. Russell , N. & Cowan, D.. Handling of psychrophilic Microorganisms. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp. 371-388;

15

12. Satyanarayana, T., Raghukumar, C. & Shivaji, S.. Extremophilic microbes: Diversity and perspectives, Current Science, VOL. 89, NO. 1, 10 July 2005, pp.78-88;

13. Zimmerman, J. & Battista, J.. Measuring Survival in Microbial Populations Following Exposure to Ionizing Radiation. In:Rainey, F. & Oren, A (ed.) Methods in Microbiology, Volume 35, Extremophiles, Academic Press, 2006, pp.746-747;

14. http://mmbr.asm.org/cgi/content/full/63/4/735#SEC1;15. http://en.wikipedia.org/wiki/Extremophile.

16