Slide 1

Masterat: METODE DE ANALIZ

PROIECT Metode ElectroforeticeMETODE ANALITICE DIN CHIMIA ALIMENTAR

Studenta:DEZSI (CHI) EVELYNMASTERAT ANUL I

Identificarea soiurilor de ciree dulci prin electroforez capilar cu zon liberIntroducereCireele dulci Cereza del Jerte este un fruct de calitate nalt ce provine din Prunus avium L., soi din regiunea Valea Jertei, situat n centrul de vest al Spaniei.Aceste soiuri autohtone sunt culese cu mna fr tulpini i sunt comrcializate sub denumirea de Origine protejat Cereza del Jerte (Valdastillas, Cceres, Spania).

Falsificrile acestui produs cu soiuri strine de ciree de calitate inferioar, se face n mod special pentru creterea marjelor de profit, iar pentru industrie a devenit o preocupare de muli ani. Falsificrile acestu produs sa putut descoperii prin metode tradiionale cum ar fii metodele morfologice i senzoriale, precum parametrii de culoare, form i arom. Totui aceste metode subiective depind de stadiul de coacere a fructului.Proteinele sunt nite componente subtile pentru o asemenea propunere, dar au fost luate ca probe n detectare falsificrilor alimentelor.Analiza proteinelor prezint o performan n aceast matrice complex, de aceea a fost luat o metod alternativ Electroforeza capilar.Aceast metod de analiz este mai rapid, deteiea este mai eficient i are o rezoluie mai bun dect SDS-PAGE. Aceast metod implic o simpl extracie a proteinelor folosind cantiti mici de solveni organici. Grupul de electroforez capilar denumit electroforez capilar cu zon liber a fost aplicat n analize complexe de proteine. Numeroasele rapoarte au pus n eviden potenialul acestei metode prin care se poate face distincie ntre amprente i alte alimente precum diverse soiuri de piper i creterea speciei Vicia. Obiectivul prezentei lucrri este bazat pe procedura de developare a proteinelor analizate cu FZCE i identificarea soiurilor de PICOTA, fa de alte soiuri de ciree. 2. Materiale i metode

2.1.Colectarea probelorProbe de cirese (Prunus avium L) folosite in acest studiu au fost obtinute dintr-un centru de cercetare din Spania.Doua soiuri autohtone de cirese Ambrunes si Pico Negro si soiuri straine Sweet-heart, au fost recoltate i grupate n 3 diferite etape de coacere(maturare), n concordan cu omogenitate n mrimea i culoarea pieliei.Parametrii de culori ale soiurilor de cire n diferite etape de maturare au fost specificate n tabelul 1.Pentru fiecare etap de maturare, 25 de fructe au fost omogenizate i analizate pentru coninutul de solide solubile, aciditate de titrare i pH-ul. Restul probelor de ciree au fost ngheate n N2 lichid i depozitate n congelator.

2.2. Coninutul de solide solubile, aciditatea titrabil, pH-ul i indicele de maturare

Coninutul de solide a fost determinat de dou ori pe omogenizat cu o compensare de temperatur automata DR101 refractometru digital, precum i rezultatele au fost exprimate n grade Brix. Aciditate de titrare i pH-ul s-au determinat de dou ori pe omogenizat n 5 g de prob diluat n 50 ml cu ap deionizat obinut cu un sistem de purificare a apei Milli-Q, cu ajutorul unui 716 DMS titrare automat. Probele au fost titrate cu 0,1 N NaOH pn cnd pH atins 8,1. Rezultatele au fost exprimate ca echivalent acid malic, gram de acid malic per litru de soluie. Indicelui de maturizare a fost calculat ca raportul dintre coninut de solide solubile (0 Brix) i aciditate de titrare (gram de acid malic per litru de soluie)

2.3. Extracia proteinelor prin electroforez capilar

Extracia direct a probelor de ciree cu ap ar putea avantaja alte componente , dect proteinele, acetea fiind ndeprtate, avnd ca i consecin o rezoluie slab prin metoda de FZCE. O particularitate a acestor extracte este faptul c pot conine i alte componente cum ar fii: polizaharide, polifenoli, antociani, taninuri, ADN-ul, aminoacizi liberi i zaharuri care ar putea eventoal s colmatezecapilarele de silicon prin depunerea acestora pe pereii acestora. Astfel, probele omogenizate au fost filtrate cu vat de sticl, centrifugat la 5800 rot timp de 2 min, iar apoi n urmtoarea etap a fost realizat pre-extracia. Pentru volumul de supernatant a fost adaugat acela volum de metanol i a fost filtrat sulfat de sodiu anhidru. Dup o rcire la temperatura de -80C timp de 5 minute, extractul de metanol este centrifugat la 5800 rot timp de 1 min. Cu scopul de a obine o extracie rapid i eficient de proteine, au fost testate dou protocoale:-n prima, s-a luat o prob de 0,5 ml de extract proteic solubil, metanol a fost parial precipitat cu 1 ml de cloroform i se centrifugheaz la 24,000 rot timp de 5 min.Bilutele au fost curate de dou ori cu cloroform pentru a le elibera de pigment, iar apoi s-au resuspendat n 100 l de acetonitril de 30% (v / v).-n al doilea protocol, s-a luat o prob din extractului de protein solubil-metanol 0,5 ml s-a evaporat n mod direct cu azot i apoi s-au resuspendat n 100 l de acetonitril de 30% (v / v).

2.4. Analiza prin FZCE

Extractele proteice, dupa filtrarea printr-un filtru de 0,2 m, au fost analizate prin FZCE. Conductorul tampon a fost preparat cu ap de calitate HPLC obinute dintr-un sistem de purificare a apei Milli-Q, i a constat din 8,75 mM fosfat 20,6 tetraborat mM la un pH de 9. Acest tampon a fost folosit cu succes pentru determinarea proteinelor din legume prin FZCE.Stratu de siliciu topit al capilarelor de 75 lm i.d. i 57 cm lungime total (50 cm la detector fereastr) s-au folosit (Supelco, Tecknocroma, Barcelona, Spania). Capilarele au fost iniial condiionate cu 100 mM NaOH timp de 10 min, iar apoi cu ap deionizat timp de 5 min.Au fost supuse cltirii ntre separaii timp de 2 min cu 100 mM NaOH, timp de 2 min cu ap deionizat i apoi cu soluie tampon de separare timp de 2 min. Atunci cnd capilarele nu sunt folosite, acestea sunt cltite cu 100 mM NaOH timp de 10 minute, apoi cu ap timp de 10 min, iar n final sunt uscate cu azot gazos timp de 10 min.

Tensiunea de separare a fost de 263 V / cm (15 kV) i temperatura de separare a fost de 23C.Lungimea de und folosit pentru analiz a fost de 214 nm.Probele s-au injectat sub presiune (0,5 psi) timp de 5 s i spectrele de protein au fost monitorizate 190-300 nm cu un detector cu matrice de diode PACE.Pentru determinarea parametrilor de analiz, a fost vizualizatvla o lungime de und de 254 nm un vrf negativ de acetonitril ce a fost utilizat pentru a normaliza zonele de vrf i pentru a calcula timpii de migrare corect (CMT) ale vrfurilor. Vrfurile proteinelor au fost identificate folosind migrare corect i spectre de absorbie UV.P / ACE staia Beckman (Versiunea 1.21) acest pachet de software a fost utilizat pentru a stoca, manipula i compara Electroferogramele.

2.5. Analiza prin SDSPAGE

Proteinele pentru SDS-PAGE au fost pre-extrase cu metanol aa cum s-a descris mai sus pentru FZCE. Biluele obinute din 1,5 ml de metanol, proteinele au fost extrase direct prin evaporare cu azot, acestea au fost curate n prealabil cu cloroform i amestecat cu 20 l Page tampon de ncrcare (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v / v) glicerol, 2% (m / v) SDS, 5% (v / v) b-mercaptoetanol, 0,025%(w / v) albastru bromfenol), ce se ncubeaz la 99?C timp de 5 min, pentrudenaturarea proteinelor. Condiiile de electroforez au fost cele descriseprin Laemmli (1970), iar concentraiile de acrilamid(29: 1 acrilamid / bisacrilamid), iar n geluri au fost de 4% (greutate / volum) pentrustivuirea gelurilor i 15% (g / v) pentru separarea pe geluri. Gelurile au fost distribuite i funcioneaz pe baza unui dispozitiv Miniprotean III (Bio-Rad Laboratories, Richmond,CA). Gelurile au fost ulterior colorate cu 0,5% (g / v) Coomassie blue (G-250)ce se dizolv n 45% ap, 45% metanol, i 10% acidm acetic timp de 30 de minute, i se decoloeazt cu o soluie format din 20% metanol, 10% acid acetic i 70% ap distilat timp de 4 ore. Un program de analiz a imaginii de calculator (Genetools, Sinoptici Ltd., Cambridge, Marea Britanie) a fost utilizat pentru analiza densitometric a electroforezei pe gel.

2.6. Analiza statisticSoiurile au fost distinse pe baza diferenelor n ariile vrfurilor Electroferogramele FZCE i densitograms SDS-PAGE.Vrfurile de absorbie au fost studiate prin analiza unidirecional a varianei(ANOVA). Mijloacele au fost separate de Tukey , fiind o ncercare semnificativ ce a reprezentat o diferen la utilizarea versiunii celuilalt pachet software SPSS 10.0.6 din SPSS Inc. (Chicago, IL, Statele Unite ale Americii). Relaiile dintreparametrii fizico-chimici i valorile din zona de vrf au fost evaluateprin coeficienii de corelaie Pearson, i analiza de regresie fiind verificat liniar.3. Rezulte i discuii3.1. Optimizarea analizei prin FZCEProbele de ciree din soiul autohton de "Ambruns" au fost utilizate pentru a evalua extracile celor dou proteine ce au fost testate sub cele doua protocoale. Rezultatele au aratat diferene relevante n Electroferogramele obinute pentru aceeai prob extras cudiferitele proceduri (Fig. 1). Rezoluia i migraia pentru proteine solubile cu metanol au fost apropiate de cele dou protocoalede extract. Proteinele au fost rezolvate n 25 de minute i separatentre 15-26 vrfuri i umeri. Cu toate acestea, au existat mai puinevrfuri i cantiti relativ mici de compui proteici cu precipitarea cloroformlui de proteinelor solubile n metanol(Fig. 1, Trace A). Aceast procedur a fost folosit cu succes pentru extracia proteinelor solubile n metanol la produse uscate, cum ar fi boiaua.

Pentru ciree , evaporare direct cu azot a fost, prin urmare, adoptat ca o analiza de rutin, protocolar.n ceea ce privete parametrii de analiz, metoda FZCE fostgsit ca o metod excelent n ceea ce privete repetabilitatea, CMT cu coeficieni de variaie (RSD%; n = 5) de