licenta finala cais horticultura

7/26/2019 Licenta Finala Cais Horticultura

1/52

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN

VETERINAR

FACULTATEA DE HORTICULTUR

LUCRARE DE DIPLOM

ndrumtor tn !"#

Pro!$ Dr. ION L%&

A'(o)*+nt#

STAVRE Io&n&

,UCURETI

-./0


2/52

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN

VETERINAR

FACULTATEA DE HORTICULTUR

Tema:

Cercetri privind studii de fenotipaj pentru screeningul unor

descendente hibride n urma infec iilor cu Plum-Pox Virus PPV!la cais


3/52

CUPRINS

CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIUL TEMEI A,ORDATE....1

1.1 Caisul caracterizare general........................................................................................... ........"

#.#.# $mportan a economic i valoarea alimentar a caiselor .......................................................%

#.#.&. 'riginea si aria de raspandire a caisului................................................................................(

#.#.". Particularit i de cre tere i fructificare ................................................................................)

1.2. Descrierea principalelor boli virotice ale caisului.....................................................................#*

#.&.#. +poplexia s,mburoas........................................................................................................#*

#.&.&. Ciuruirea frunelor Stigmina carpophila!...........................................................................##

1.3 Originea i rspndirea virusului ...............................................................................................#&

1.. !rincipalele trsturi ale plum po"#ului......................................................................................#%

#.%.# ade naturale ale virusului................................................................................................#%

#.%.& Patologia virusului Plum pox..............................................................................................#/

#.%." 0imptomele provocate de virusul Plum pox....................................................................... .#(

1.$. %denti&icarea i caracterizarea principalelor virusuri la cais .....................................................#1#./.#. 2etode de identificare a virusurilor........................................................................... .........#1

#./.#.#. Testul de floculare............................................................................................................... #)

#./.#.&. Testul 34$0+.......................................................................................................................#5

#./.&. PC6 Pol7merase chain reaction!.................................................................................. .....&*

#./.". +lte virusuri ale caisului.................................................................................................... ..

CAPITOLUL II CONTRI,UII PROPRII$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$-2

2.1 'usti&icarea temei.........................................................................................................................&%

2.2. Obiectivele cercetrilor...............................................................................................................&/

2.3 (aterial )i metod.......................................................................................................................&/

&.".#. 2aterialul biologic folosit pentru specia cais *rmeniaca vulgaris!...................................&/

1


4/52

&.".&. 2aterial viral......................................................................................................................&)

&.".". 2etodele de cercetare abordate pentru specia cais..............................................................&)

&.".".# Testul imunoenimatic 34$0+................................................................................. .......... "*

&.".".& 8eterminri moleculare -Testul PC6 tehnica de amplificare genetic!............................""

2. +ezultate ob,inute......................................................................................................................."(

2.$ Concluzii )i recomandri............................................................................................................%)

,I,LIOGRAFIE$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$0.

2


5/52

CAPITOLUL I STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII N DOMENIUL

TEMEI A,ORDATE

/$/ C&(u) 3 "&r&"t+r4&r+ %+n+r&)Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole

s,mburoase. +cest fapt se datorea scderii calit9ii fructelor i pierderilor cauate de cderile

premature ale acestora ;emeth< #55%!. Virusul este preent n liveile din 3uropa< fiind semnalat

cu &*-"* ani n urm. Pierderi importante s-au semnalat n special n estul i sud-estul 3uropei.

=oala s-a semnalat i n Turcia< Cipru i 0iria. >n Polonia i recia pierderile nregistrate de acest

virus sunt de peste 1o?< n @ugoslavia de #/ milioane de pomi< n =ulgaria peste )*?. >n 9rile

unde viroa este rsp,ndit< exportul de ramuri altoi i portaltoi este interis.

>n 6om,nia< acest virus este rsp,ndit n toate arealele de cultur ale fructelor samburoase

i provoac pierderi masive de produc9ie. 2otiva9ia alegerii acestei teme s-a datorat faptului c n

9ara noastr la momentul nceperii cerecetrilor nu era cunoscut distribu9ia tulpinilor virusului

Plum pox n 6om,nia< 9ara noastr fiind printre pu9inele 9ri europene care nu avea o strategie de

eradicare sau limitare a impactului acestui virus. ' astfel de strategie nu poate fi realiat fr a

cunoate gradul de rsp,ndire a PPV-ului i distribu9ia tulpinilor acestuia.#

Plum pox< cunoscuta si sub denumirea de 0harAa< este cea mai devastatoare boala virala a

fructelor samburoase din genul!runus.=oala este cauata de virusul Plum Pox PPV !< cat si de

tulpini derivate ale acestuia< care pot infecta o mare varietate de specii de fructe samburoase< cum

ar fi : caisul< piersicul< prunul< nectarinul< cat si ciresul. 0peciile ornamentale si salbatice ale

genului!runuspot fi< deasemenea< infectate de tulpinile acestui virus.

P,n n preent au fost identificate i caracteriate serologic i molecular apte tulpini de PPV:

0ua 8 dideron! iolat pentru prima dat la cais n sud-estul Bran9ei 0ua 2 marcus!

identificat la piersic n nordul reciei Derlan i 8une< #515 27rta i colab.< #55)! 0ua 3a

el amar! descris n 3gipt la cais Eetel i colab.< #55#a! 0ua 0oC sour cherr7! detectat n6epublica 2oldova Dalash7an i colab.< #55"! 0ua 0FC sFeet cherr7! identificat n $talia

Cresceni i colab.< #55(! 0ua PPV-6ec reultat din recombinarea celor dou tulpini majore

1 Myrta A, Di Terlizzi B, Boscia D, Caglayan K, Gavriel I, Ghanem G, Varveri C, Savino V 1!,

Detection and serotyping of Mediterranean plum pox virus isolates by means of strain-

specic monoclonal antibodies.ActaVirologica" #nglish #$. %2, 2&1'2&%"

(


6/52

2 i 8!< fiind descoperit n +lbania< =ulgaria< Cehia< ermania i 0lovacia lasa i colab.n preent< caisul se cultiv mult n emisfera nordic< unde se i produce peste 5*? din

produc9ia mondial de caise. Cele mai mari produc9ii de caise se ob9in n 3uropa< +sia< +merica

Central i de ;ord i mai pu9in n +frica< 'ceania i +merica de 0ud T&'+)u) /$'!.8intre marile

9ri productoare de caise se pot aminti: 3x. J.6.0.0.< $talia< 0pania< recia< Bran9a< 2aroc< etc.T&'+)u) /$"!

"uleti F#$, 1%%%

&r& /889 /88: /888

0J+ /%5*** "5"*** (&1***

0pania ")))/# &*&(** &1&)**

$talia #*%(1) )15/) )15/)

2aroc )()** (/1** %****

Tunisia /#*** /)1** (****

$ran 1%"5( ###55& ###55&

recia %"&&% "%1(" "%1("

Sursa: www.faostat.com

8upa datele B+'< in &*** productia de caise pe plan mondial a fost de &/##*** tone in

3uropa producandu-se %/? din aceasta< urmata de +sia cu "&?. Cea mai mare productie de caise

provine din Turcia cu %&1*** tone< $talia cu #(#*** tone< 0pania cu #%)*** tone< Branta cu

#%&*** tone< 0.J.+ cu )(*** tone< recia cu (&*** tone.

>n 6om,nia< cultura caisului este onat n principal n partea de sud a 9rii. Produc9ia de

caise a nivelul anului #551 a fost de circa &1


10/52

ob9inut din sectorul particular. @ude9ele cu produc9ie mai mare de caise sunt: Constan9a< ala9iStigmia carpop)ila?

R&(5&ndr+$ =oala preinta importanta economica deosebita prin faptul ca ataca puternic

fructele< reduce productia< ciuruieste frunele si slabeste pomii.

Sm5tom+$ Ciuperca ataca frunele si fructele si in mai mica masura lastarii si ramurile.

Pe Brune apar numeroase pete circulare< brune cu margini violacee< cu diametrul de "-/ mmt+6n"& d+ &m5)!"&r+ %+n+t"?

' alt tehnic abordat pe plan mondial< iar n ultimul timp i n 9ara noastr< o constituie

utiliarea metodelor moleculare de eviden9iere a bolilor virotice i a tulpinilor acestora la speciile

pomicole 6T-PC6< $C-6T-PC6!.

3fectuarea testrilor moleculare pentru punerea n eviden9 a tulpinilor virale< necesit un

protocol special de lucru. PC6 Pol7merase chain reaction! este o tehnic de foarte mare preciie

dar i foarte costisitoare.

+ceast metod a biologiei moleculare de identificare a +8;-ului sau +6;-ului este cea

mai precis n identificarea tipului de tulpin viral. +mplificarea unei scurte i bine definite pr9i

a acidului nucleic< trebuie foarte bine condus pe baa unor primeri specifici care sunt

repreenta9i de secven9e de nucleotide care con9in baele aotate specifice pentru tulpina viral

respectiv.(

Tehnica de amplificare genic sau PC6 este o metod extrem de sensibil de eviden9iere a

acidului nucleic specific din prob. 0ecven9a,intdin acidul nucleic< care urmea a fi detectatului la descede ele )i+ride decais.

0curtarea a fost efectuat la nceputul fiecrei perioade de cre tere pentru a induce

viguroare lstarilor noi i pentru a favoria apari ia simptomelor.

$nfectiile artificiale cu PPV effectuate atat la parinti cat si la descendentele hibride.

0imptomele au fost evaluta le #% ile si au fost confirmate prin testele serologice 3lisa si 6T-

PC6. 3ficienta inocularii cu PPV a fost foarte ridicata in ceea ce priveste portaltoiul B "*/ de

5/?. 8istributia simptomelor a fost foarte neregulata in randul plantutelor tinere preentand

simptome virale cu fae intermediare de infectie.

Sursa: fotografii proprii

Fig. 2.4.3, fig. 2.4.4 Platele scurtate

T&'+) -$2$/

R(5un(u) %+not5ur)or (tud&t+ n urm& n!+"t)or &rt!"&)+ "u PPVrcrt

;eotip lisa test &


39/52

" G&M - - reistent

% 2ari de Cenad M M susceptibil

/ ;@+ #1 - - reistent

( Cristal - - reistent1 0irena M M susceptibil

) Tabri M M susceptibil

5 03' - - reistent

#* Pop"-#1/ - - reistent

## Pop"-#)" M M susceptibil

#& Pop"-#5# - - reistent

#" Pop"-/* M M susceptibil

#% Pop"-#1) M M susceptibil

#/ Pop"-#1( - - reistent

#( Pop"-%1 - - reistent

#1 Pop"-##( - - reistent

#) Pop"-#(/ M M susceptibil

#5 Pop"-#1% M M susceptibil

&* Pop"-#51 M M susceptibil

Pop"-#11 - - reistent

&& Pop"-##1 - - reistent

&" Pop"-#)( - - reistent

&% Pop"-#)) - - reistent

&/ Pop"-/# - - reistent

&( Pop#-%* M M susceptibil

&1 Pop#-5# - - reistent

&) Pop#-%" - reistent

&5 Pop#-") - - reistent

(*


40/52

"* Pop#-%& - - reistent

"# Pop&-5 - - reistent

"& Pop&-#5( M M susceptibil"" Pop&-#(( M M susceptibil

"% Pop&-#&& - - reistent

"/ Pop&-# - - reistent

"( Pop&-#&1 - - reistent

"1 Pop&-&*( - - reistent

") Pop&-( M M susceptibil

"5 Pop&-# M M susceptibil

%* Pop&-1 M M susceptibil

%# Pop%-"1 - - reistent

%& Pop%-"& - - reistent

%" Pop%-&) M M susceptibil

%% Pop%-#5 - - reistent

%/ Pop%-&% - - reistent

%( Pop%-"% - - reistent

%1 pop%-"" - - reistent

%) pop/.// - - reistent

%5 Pop/-/& M M susceptibil

/* pop/-/" M M susceptibil

Sursa: ta+el realiat dup date proprii

8intr-un numar de /* plante analiate se observa ca "* dintre hibrii au manifestat

reistenta la PPV in urma infectiilor artificiale insemnand un procent de (*?

(!


41/52


Fig. 2.4.5, fig.2.4.6 #alia serologica !0S# petru portaltoiul ;F3-5 si )i+riii de caisi apricots

enotipurile< care nu au devoltat simptome la PPV nici viual i nici prin testul 34$0+


42/52

Sursa: fotografii

proprii

Fig. 2.4.(,fig. 2.4.% Cais

Plantele au fost clasificate ca reistente< dac acestea nu au preentat simptome i reac ii

poitive 34$0+ sau 6T-PC6 n ultimele trei perioade de cre tere care au fost evaluate timp de trei

cicluri de vegetatie.


Fig.2.4.1-, 2.4.11 ?+ 1 2 3 4 5 6 *(

T&'+) -$2$-

Sm5tom+ 5+ GF1.0

rcrt

Com+iatii )i+ride


43/52

P'P V$$$ - C%#N()-034B P'4-( M M sensibil

P'P V$$$ - C%#N()-034B P'4-1 M M sensibil

P'P V$$$ - C%#N()-034B P'4-) M M sensibil

&. P'P-$ - 2+6$ 83 C3;+8 x03'-# - - reistent

P'P-$ - 2+6$ 83 C3;+8 x03'-&

- - reistent

P'P-$ - 2+6$ 83 C3;+8 x03'-"

- - reistent

P'P-$ - 2+6$ 83 C3;+8 x03'-%

- - reistent

". P'P-$$ - 0$63;+ x ;@+ %&-# - - reistentP'P-$$ - 0$63;+ x ;@+ %&-& - M sensibil

P'P-$$ - 0$63;+ x ;@+ %&-" M M sensibil

P'P-$$ - 0$63;+ x ;@+ %&-% M M sensibil

P'P-$$ - 0$63;+ x ;@+ %&-/ M M sensibil

P'P-$$ - 0$63;+ x ;@+ %&-( - - reistent

P'P-$$ - 0$63;+ x ;@+ %&-1 - - reistent

P'P-$$ - 0$63;+ x ;@+ %&-) M M sensibil

%. P'P-$V - C6$0T+4 x ;@+ M M sensibil

P'P-$V - C6$0T+4 x ;@+ -# M M sensibil

P'P-$V - C6$0T+4 x ;@+ -& M M sensibil

P'P-$V - C6$0T+4 x ;@+ -" M M sensibil

P'P-$V - C6$0T+4 x ;@+ -% - - reistent

P'P-$V - C6$0T+4 x ;@+ -/ - M sensibil

P'P-$V - C6$0T+4 x ;@+ -( - - reistent

/. P'P $ - +2$6+4 x ;@+ -# - - reistent

P'P $ - +2$6+4 x ;@+ -& - M sensibil

%1


44/52

P'P $ - +2$6+4 x ;@+ -" - M sensibil

P'P $ - +2$6+4 x ;@+ -% M M sensibil

P'P $ - +2$6+4 x ;@+ -/ M M sensibil

P'P $ - +2$6+4 x ;@+ -( M M sensibilP'P $ - +2$6+4 x ;@+ -1 - - reistent

P'P $ - +2$6+4 x ;@+ -) - - reistent

(. P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#

- M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-&

- M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-" - M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-%

- M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-/

M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-(

M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-1 M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-)

M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-5

M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#*

M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-## M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#&

- - reistent

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#"

- - reistent

%2


45/52

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#%

- M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#/

- M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#(

M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#1

M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#)

M M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-#5

- M sensibil

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-&*

- - reistent

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-

- - reistent

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-&&

- - reistent

P'P-$$$ - ;@+ x D30TGPG'6-&"

- M sensibil

1. P'P $$ - T6+$+; x T+=6$H-# - - reistent

P'P $$ - T6+$+; x T+=6$H-& - - reistent

P'P $$ - T6+$+; x T+=6$H-" - - reistent

). P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-# - M sensibil

P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-& - M sensibil

P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-" - M sensibil

P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-% - - reistentP'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-/ - - reistent

P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-( - M sensibil

P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-1 - M sensibil

%(


46/52

P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-) - M sensibil

P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-5 - - reistent

P'P V$ - V$C36'O x ;@+ &-#* - - reistent

5. P'P - ;@+ %& x V$C36'O-# M M sensibilP'P - ;@+ %& x V$C36'O-& M M sensibil

P'P - ;@+ %& x V$C36'O-" M M sensibil

P'P - ;@+ %& x V$C36'O-% M M sensibil

#*. P'P $$$ - ;@+ #1 x T6+$+;-# - - reistent

P'P $$$ - ;@+ #1 x T6+$+;-& - - reistent

P'P $$$ - ;@+ #1 x T6+$+;-" - - reistent

P'P $$$ - ;@+ #1 x T6+$+;-% - - reistent

P'P $$$ - ;@+ #1 x T6+$+;-/ - - reistent

P'P $$$ - ;@+ #1 x T6+$+;-( - - reistent

##. P'P $ - T6+$+; x C6$0T+4-# - - reistent

P'P $ - T6+$+; x C6$0T+4-& - - reistent

P'P $ - T6+$+; x C6$0T+4-" - M sensibil

P'P $ - T6+$+; x C6$0T+4-% - M sensibil

P'P $ - T6+$+; x C6$0T+4-/ - M sensibil

#&. P'P V - 0J42';+ x ;@+ #1-# - M sensibil

P'P V - 0J42';+ x ;@+ #1-& - M sensibil

P'P V - 0J42';+ x ;@+ #1-" - - reistent

P'P V - 0J42';+ x ;@+ #1-% M M sensibil

#". P'P V$$ - E+643O0 x T+=6$H-#

M M sensibil

P'P V$$ - E+643O0 x T+=6$H-&

M M sensibil

P'P V$$ - E+643O0 x T+=6$H- M M sensibil

%%


47/52

"

P'P V$$ - E+643O0 x T+=6$H-%

M M sensibil

P'P V$$ - E+643O0 x T+=6$H-

/

M M sensibil

P'P V$$ - E+643O0 x T+=6$H-(

M M sensibil

P'P V$$ - E+643O0 x T+=6$H-1

M M sensibil

P'P V$$ - E+643O0 x T+=6$H-)

M M sensibil

T'T+4 51 individuals

Sursa: ta+el realiat dup date proprii

$n urma observatiilor serologice si moleculare se observa ca dintr-un numar de 51 plante

analiate au fost relevate "" plante hibride. 6eultatele obtinute in urma fenotipajului vor fi

corelate cu cele ale genotipajului. Pentru continuarea lucrarilor a fost iolat +8; ul de la toti

indiviii strudiati si de la parintii acestora pentru a fi apoi analiati cu marAer molecular specifici

care pun in evident genele ce sunt implicate in reistenta genetic naturala la PPV.

0olarea #

$olarea +8;-ului genomic a fost efectuat din frune proaspete de cais folosind

hexadec7ltrimeth7lammonium bromide CT+=! protocol descris de catre 3ldredge et al.#55&!.

Concentra ia de +;8 a fost msurat cu minifluorimeter TD'#**< Goefer 0cientific!. 0olu ia de

+8; genomic la concentra ie de #** ngN Zl n T3 buffer pG ).*! a fost preparat pentru analia

cu marAeri 006 0imple seQuence repeat!.1

* 8agrai, I" 2++(, $ezisten%a genetic durabil & element c"eie 'n protec%ia livezilor" B.letin

Doc.mentar In9ormativ al S:, ;l"Bistri


48/52


49/52

>n ceea ce privete iolarea +;8-ului genomic< calitatea i cantitatea acestuia depinde de

aten9ia i minu9ioitatea modului de operare a cercetatorului. 2etoda clasic de iolare baat pe

folosirea solu9iilor mam dei este mai laborioas este mai ieftin dec, tcea cu Dituri.

R+"om&ndr)+se refer la:

'b inerea B& i stabilitatea caracterului de reisten la PPV pentru genotipurile

selec ionate prin noi beaA-crossuri

Continuaarea identificarii de noi genotipuri cu reistenta genetica naturala la PPV 3xplorarea de noi combinatii hibride< 6eintroducerea in studiile de ameliorare a soiurilor autotone si in special acelor vechi

licenta finala cais horticultura

Documents