laborator microbiologie speciala 2010-2011 imapa

LUCRARI LABORATOR MICROBIOLOGIE SPECIALA

L1 Protecia muncii. Prezentare lucrri

L2 Tehnici de eantionare, recoltare i pregtire a probelor pentru analiza microbiologic

Metode clasice de evaluare a principalelor grupe de microorganisme de alterare din alimente

Determinarea numrului total de bacterii aerobe mezofile

L3 Determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri

Determinarea microorganismelor osmofile

L4 Determinarea bacteriilor sporulate aerobe i anaerobe

Determinarea bacteriilor de putrefacie

L5 Metode rapide, clasice i moderne de evaluare a calitii microbiologice a alimentelor

Proba reductazei

Metode bazate pe utilizarea Petrifilmelor

L6 Tehnici de evaluare a microorganismelor indicatori sanitari

Bacterii coliforme. Coliformi fecali si Escherichia coli

L7 Colocviu de laborator

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR

Pag 1

TEHNICI DE EANTIONARE, RECOLTARE SI PREGTIRE A PROBELOR PENTRU ANALIZA MICROBIOLOGIC

1. Eantionarea probelor Pentru efectuarea analizelor microbiologice, probele de analizat trebuie s reflecte condiiile microbiologice existente n momentul recoltrii i s reprezinte fidel lotul din care provine. De modul n .care se face recoltarea i transportuI probelor la laborator depinde de multe ori rezultatul analizei. De aceea, o etap foarte important const n stabilirea eantioanelor, a condiiilor de recoltare a probelor i de transport n condiii corespunztoare la laboratorul de analize. n activitatea de prelevare a probelor exist o terminologie general, i anume:

! lotul - reprezint cantitatea de produse cu aceleai caracteristici, realizate n condiii tehnologice uniforme, ntr-o arj, schimb de producie sau ntr-o perioada limitat de timp;

! elementul - este partea indivizibil a lotului;

! eantionul global - reprezint prob format prin mai multe prelevri din acelai lot; ! eantionul redus - este fraciunea reprezentativ dintr-un eantion global; ! eantionul de laborator - este fraciunea din eantionul global sau redus destinat analizelor de laborator;

! prelevarea (recoltarea) - reprezint tehnica de recoltare a unui eantion elementar dintr-un lot sau a unui element indivizibil.

Sunt posibile dou tipuri de recoltare a eantioanelor: prelevarea elementelor cu defecte pentru a evidenia cauza producerii

acestora;

prelevarea la ntmplare a unor elemente care aparin unor condiii normale de producie, pentru controlul calitii microbiologice. n acest caz sunt aplicate metode statistice, astfel nct eantionul s fie statistic semnificativ.

Eantioanele se aleg prin tragere la sori, dup scheme prestabilite, pe baza tabelelor de recoltare ce conin numere echivalente numrului de probe din lot, dar dispuse la ntmplare (tabelul 1). Dup numerotarea elementelor lotului, se coreleaz aceste numere cu cele din tabel, i, apoi, se preleveaz probele corespunztoare numerelor din tabel n succesiunea stabilit de echipa de control. Astfel, pornind de la un punct i ntr-o ordine arbitrar aleas se compune eantionul cu elementele corespunztoare. De exemplu, dac se dorete ca dintr-un lot de 80 buci s se preleveze la ntmplare 5 probe, se vor


Pag 2

preleva elementele corespunztoare numerelor primei linii din tabel: 07; 59; 66; 63; 46 (valoarea 97 este exclus pentru c nu exist). Tabelul 1. Exemplu de ordonare aleatorie a elementelor unui lot n vederea eantionrii

07 59 66 97 63 46 18 42 62 56 68 93 43 12 48 68 87 45 01 64 32 48 85 43 84 10 24 32 26 62 65 90 57 06 32 36 52 26 54 28 95 13 08 32 92 24 87 91 13 18 72 62 44 03 61 09 37 48 42 28 49 58 54 36 07 15 68 12 84 88 65 64 14 01 20 79 16 11 22 54 46 39 79 14 89 96 44 92 77 26 52 29 34 45 04 45 37 23 66 02 05 92 74 50 33 45 66 25 42 27 25 09 39 18 08 90 72 75 26 54 41 90 46 51 73 98 35 84 59 78 96 05 59 89 61 38 80 95 01 67 22 84 05 97 09 46 62 73 17 63 46 45 83 96 47 23 51 45 37 83 09 17 71 96 79 58 92 78 70 80 53 62 97 78 95 08 84 61 71 59 49 20 83 56 61 85 88 52 50 28 59 26 29 62 89 83 10 13 25 32 72 83 58 75 45 53 94 02 22 22 08 91 36 76 59 69 05 89 14 98 14 98 26 99 26 14 91 52 01 85 24 45 52 95 27 25 94 63 89 39 07 26 11 26 45 52 63 65 79 03 12 93 28 37 45

Alegerea elementelor pentru analiz (x) se poate stabili pe baza formulelor:

n

Nx =

sau Nx =

n care: N = numrul elementelor unui lot; n = numrul eantioanelor de prelevat.

Dup stabilirea valorii x se numeroteaz i se asociaz n grupe diferite elemente ale lotului notate de la 1 la x. Se extrage din fiecare grup elementul notat cu x. Aceste tehnici sunt aplicabile att loturilor de produse finite din depozite, ct i pe fluxul de fabricaie sau n momentul livrrii. Pe fluxul de fabricaie prelevarea se efectueaz, de obicei, dup terminarea unei etape de procesare. Pentru a fi semnificativ, eantionarea trebuie s fie realizat n timp, deoarece un eantion constituit exclusiv din elemente succesive este puin reprezentativ pentru ansamblul unei producii sau al unui lot. Frecvena prelevrilor i a controlului depinde n general de nivelul produciei, riscurile de contaminare, sau de apariia defectelor de fabricaie. n cazul unei producii mari, frecvena prelevrilor va fi mai mare. Este de asemenea important s se efectueze analize ori de cte ori au loc variaii la nivelul fabricaiei, generate de:

- schimbarea lotului de materie prim; - fluctuaiile generate de modificarea schimbului; - modificri sau reparaii ale utilajelor, .a.


Pag 3

Prelevrile se efectueaz pe elemente indivizibile (produse de dimensiuni mici, pachete mici, cutii, .a.), din produse ambalate n vrac, sau pri dintr-un element de dimensiuni mari.

Pentru acest domeniu se recomand analize n cadrul unui plan cu 2 sau 3 clase, fiecare prelevare trebuie s fie compus din 5 probe (n=5).

2. Tehnici de prelevare De cele mai multe ori prelevrile se efectueaz pe elemente indivizibile (cutii de conserve, sticle, produse de dimensiuni mici, pachete mici .a.). n alte cazuri, probele se recolteaz din produse n vrac sau pari dintr-un element de dimensiuni mari. Prelevrile ce corespund primului caz sunt simple i nu necesit masuri de precauie suplimentare. Condiii generale de prelevare (recoltare) Cantitatea de prob recoltat depinde de natura analizei i de planul de eantionare. Omogenizarea Repartizarea microorganismelor n produsul analizat nu este ntotdeauna omogen, mai ales n cazul produselor voluminoase sau cu structuri eterogene. n asemenea cazuri se recomand ca prelevrile s se realizeze din mai multe zone. De aceea este foarte important s se cunoasc zonele cu riscuri mari de contaminare, sau se impune omogenizarea produselor vrac nainte de prelevarea probelor. Msuri aseptice Este absolut necesar s se evite contaminarea suplimentar a probelor n timpul recoltrii sau dup aceast etap. Pentru aceasta recipientele utilizate i instrumentele de recoltare trebuie s fie sterile i protejate n ambalaje sterile. Unele instrumente trebuie sterilizate la locul de recoltare. Recoltarea produselor lichide Se realizeaz apelnd la diferite tehnici, n funcie de natura produsului, de forma i volumul recipientului. nainte de recoltare se recomand omogenizarea probei, care se poate realiza manual, cu ajutorul unei baghete, sau cu ajutorul unui agitator mecanic steril, precum i prin utilizarea sistemelor de omogenizare mecanic cu care sunt prevzute recipientele. n funcie de volumul de produs ce trebuie recoltat se pot utiliza pipete sterile sau instrumente speciale de recoltare (polonic steril sau flacon special). n cazul n care recoltarea se face de la reea, se flambeaz gura robinetului, se las s curg o parte din produs pentru a elimina microorganismele stagnante pe conduct i apoi se face recoltarea propriu-zis. Recoltarea produselor solide n funcie de natura produsului, pentru recoltare se folosete scalpelul, sonda (de exemplu, pentru brnz), pipeta tip harpon, etc.


Pag 4

Instrumentele trebuie s fie sterilizate. n general, microorganismele de la suprafaa produsului,.expus contactului cu aerul, se analizeaz prin metoda tamponului, iar cele din profunzime se analizeaz prin recoltare de probe dup ce s-a ndeprtat o poriune de produs de la suprafa sau s-a cauterizat suprafaa cu ajutorul unei spatule nclzite la rou. n cazul n care structura produselor este neomogena semisolida sau semilichid este absolut necesar omogenizarea probelor.

3. Pregtirea probelor pentru analiz Prepararea eantionului presupune deschiderea aseptic a recipientelor nchise (produse ambalate, sticle, cutii de conserve), omogenizarea i pregtirea extractelor lichide (n cazul produselor solide). Etichetarea

O mare atenie trebuie s se acorde etichetrii eantioanelor. Eticheta trebuie s cuprind toate elementele necesare, i anume: numrul lotului, numrul de ordine, data, ora, locul exact de unde s-a realizat recoltarea, modalitatea de recoltare (metoda eantioanelor, tehnica de recoltare .a.). Stabilitatea eantioanelor Calitatea microbiologic a eantionului nu trebuie s se modifice n intervalul de timp de la recoltare pn n momentul analizei. Principalii factori care influeneaz stabilitatea sunt: temperatura i durata de pstrare, protecia fata de contaminrile externe. Omogenizarea i mcinarea n cazul produselor lichide proba ca atare reprezint suspensia iniial . Pentru produsele solide este necesar obinerea i standardizarea suspensiei iniiale, prin stabilirea raportului de diluie (n general 1:10 sau 1:5) ntre proba de analizat i lichidul de extracie (diluare). Astfel, n cazul produselor dense se procedeaz n dou moduri:

- se cntrete n condiii aseptice o cantitatea de produs (de exemplu 10g), direct n sistemul de mrunire, apoi se adaug un volum cunoscut de lichid de diluie (40 ml pentru diluia 1/5; 90 ml pentru diluia 1/10); - se introduc n recipientul de mrunire o cantitate aproximativ de prob i se cntrete tot ansamblul (tara recipientului fiind cunoscut), apoi se adaug lichidul de diluie, n funcie de cantitatea de prob.

n ambele cazuri concentraia suspensiei iniiale este perfect definit n raport cu produsul de analizat. Astfel, x ml suspensie corespund la y g produs analizat. Rezultatele analizei se raporteaz la 1 ml suspensie sau 1 g produs. Dup cntrire n condiii aseptice, probele constituite din produse solide sau eterogene sunt omogenizate, n paralel cu extracia microorganismelor n lichidul de diluie, aplicnd


Pag 5

diverse tratamente precum: mojarare manual cu nisip steril sau bile de sticl sau mrunire mecanic .

Pentru mojararea cu nisip steril sau bile de sticl se utilizeaz un mojar care conine 5-20 g nisip special, steril, sau bile din sticl (=0,5 mm). Mojararea se realizeaz manual n apropierea becului Bunsen. Pe parcursul mrunirii se adaug 2-5 volume de ap steril. Proba se las n repaus timp de 5 minute, apoi se colecteaz supernatantul ntr-un vas steril. Aceast metod nu este ntotdeauna practic, dar este simpl i nu necesit aparatur special. Tehnicile moderne de omogenizare prevd utilizarea sistemelor performante, care permit meninerea condiiilor aseptice i o bun eliberare a microorganismelor n lichidul de extracie. Pentru acest scop sunt comercializate diferite tipuri de omogenizatoare peristaltice: Stomacker (Stomacker / Seward-Bioblock-OSI-Prolabo), Digi-system, Ultraturax, Waring Biender/ Bioblock-OSI-Prolabo, etc. n cazul utilizrii omogenizatorului Stomacher proba de analizat (dimensionat, g) i un volum corespunztor de lichid de extracie (diluie) sunt introduse ntr-o pung de plastic steril (de unic folosin), care se nchide ermetic i se monteaz n aparat pentru omogenizare, prin intermediul unor palete speciale. Pungile sterile din material plastic trebuie s aib o capacitate suficient pentru a permite amestecarea corect a probei cu o cantitate echivalent de lichid de diluare. n general, volumul recipientului trebuie s fie egal cu aproape de dou ori volumul probei plus volumul soluiei de diluare. Recent, a fost realizat un nou aparat, care funcioneaz dup un principiu similar cu aparatul tip Stomacher, la care ns s-a mbuntit tehnica de omogenizare prin vibraii (fig.1). Acest tratament (vitez vibratorie mare) ofer o eliberare a microorganismelor (n general a bacteriilor) n lichidul de diluare similar cu cazul prelucrrii probei n stomacher (grad de similaritate a rezultatelor de 96%), ns asigur obinerea unui extract clar cerin impus de analizele moderne precum: evaluarea cantitativ a microbiotei prin ATP bioluminiscen, teste imunologice i analize PCR (din limba englez Polymerase Chain Reaction) (Fung 1999).

Figura 1. Sisteme de omogenizarea tip Pulsifier Pentru unt i margarin protocolul de pregtire a probelor prevede o serie de etape preliminare, particulare, n concordan prevederile impuse de unele normative (adaptare dup Tofan i colab, 2002):


Pag 6

1) Proba este topit pe baie de ap la 45oC i omogenizat. Se prepar diluia 1:10 prin prelevarea a 10 ml produs topit i transferare ntr-un flacon de 200 ml, care conine 90 ml soluie Ringer cu 0,1% geloz, pentru stabilizarea emulsiei. Diluantul i pipetele trebuie s aib temperatura de 45oC. Alte diluii i analizele microbiologice trebuie realizate n urmtoarele 10 minute. 2) Se preleveaz n condiii aseptice 2,5 g produs, care sunt apoi transferate ntr-o eprubet de analiz coninnd 2,1 ml de soluie Ringer , i se termostateaz la 45oC pn la topire. Dup omogenizare, amestecul este meninut pe baie de ap (la 45oC) pn la separarea celor dou faze. Faza apoas este utilizat pentru analiza microbiologic . 3) O cantitate de 50 g de prob se suspend n 42 ml de soluie 0,1 M tampon fosfat (pH=7,58,0), apoi se termostateaz la 4045oC pn la topire (timp de maximum 1 h, cu agitare intermitent ). Separarea fazelor este realizat n final prin centrifugare n condiii aseptice, timp de 110 minute, la 2000-3500 rpm. Faza apoas este utilizat pentru examen microbiologic. O alt mbuntire a vizat tehnica de realizare a diluiilor. Prin realizarea unui instrument de dispersie (dispersor) este posibil transferul automat i aseptic a unui volum cunoscut de lichid de diluare pentru realizarea suspensiei iniiale sau a diluiilor decimale. Astfel, cu ajutorul unui dispozitiv denumit DILUFLO pot transfera volume variabile de lichid de diluie, cuprinse ntre 0,1 ml i 100 ml, direct n pungi sau vase sterile, n care s-a introdus n prealabil aseptic proba de analiz . Instrumentul poate fi programat pentru a realiza diluii 1:10, 1:50, 1:100 sau orice raport de diluie, realiznd transferul automat a unui volum corespunztor de lichid, n funcie de greutatea probei solide sau volumul probei lichide luate n analiz (fig. 2).

Figura 2. Sistem automat de realizare a suspensiei iniiale n general, condiiile particulare de eantionare i pregtire a probelor de analiz sunt precizate n standardele specifice pentru evaluarea calitii microbiologie a fiecrui produs. n absena unor standarde specifice disponibile, sau n cazuri speciale, metodologia se adapteaz la condiiile specifice din laborator, cu respectarea regulilor generale de analiz.

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE CLASICE DE EVALUARE A PRINCIPALELOR GRUPE DE MICROORGANISME DE ALTERARE DIN ALIMENTE

Pag 1

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE MEZOFILE

DEFINIII

Microorganismele aerobe sunt dependente de oxigenul din aer, se dezvolt la suprafaa lichidelor, a mediilor solide. Bacteriile mezofile reprezint grupul majoritar cu temperaturi minime la 15-20C, temperaturi optime n intervalul 30 - 40C i maximum la temperaturi peste 45C

PRINCIPIUL DE DETERMINARE A NUMRULUI DE BACTERII AEROBE MEZOFILE Numrul de bacterii aerobe mezofile se apreciaz indirect, pe baza numrului de colonii generate de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd proba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv, dup termostatare la 37C, timp de 48 de ore. Numrul de bacterii aerobe mezofile reprezint un indicator valoros pentru aprecierea calitii generale i a stabilitii la pstrare a produselor alimentare.

MODUL DE LUCRU Se iau dou cutii Petri sterile. Cu o pipet steril se introduc, n fiecare cutie, cte 1 cm2 prob de analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 cm2 diluie iniial, n cazul altor produse. Se realizeaz apoi prima diluie decimal a probei de analizat (10-1). Se repet aceste operaii cu diluiile urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare diluie decimal. Se toarn n fiecare cutie Petri cte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de 455C. Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor. Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat, temperatura la care se va face termostatarea. Plcile ce conin mediul solidificat se plaseaz cu capacul n jos, pentru 48 de ore, n termostat cu temperatura de 37C.

PARTICULARITI PRIVIND NUMRAREA COLONIILOR Dup termostatare, se aleg pentru numrare plcile care conin un numr colonii cuprins ntre 25 i 250, acestea trebuie s fie repartizate pe o suprafa mai mare de 25% din suprafaa total a mediului de cultur. Pentru numrare se poate adopta:


Pag 2

numrarea manual, cu ajutorul unui numrtor electronic (care la atingerea fiecrei colonii o contabilizeaz n memoria sa), pentru a evita erorile de numrare;

numrare automatizat, utiliznd instrumente speciale de numrare, cnd se consum numai 10% din timp, comparativ cu numrarea manual. Exist totui i unele limitri ale acestui procedeu i anume: pot s apar erori de numrare n cazul prezenei n mediu a unor impuriti solide sau bule de gaz; nu se obin rezultate bune cnd coloniile au diametru mare i sunt rspndite pe o suprafa mare etc. La numrare pot fi ntlnite urmtoarele tipuri de colonii:

lanuri de colonii, care aparin unei singure surse (celule asociate, n perechi, lanuri, pachete etc.). n acest caz se va numra ntregul lan ca o singur colonie;

colonii dezvoltate n filmul de ap dintre baza mediului de cultur i suprafaa capacului inferior;

colonii dezvoltate n filmul de ap de la suprafaa mediului cu agar. Rezultatele se exprim, dup caz, n uniti formatoare de colonii (ufc) per gram sau ml produs, astfel:

1) Plcile din dou diluii succesive conin 25250 colonii pe plac:

( )dnn

Cmlgufc

+=

)1,0(/ 21

n care: C = suma coloniilor numrate n toate plcile reinute;

n1 = numrul de plci reinute din prima diluie; n2 = numrul de plci reinute din a doua diluie succesiv; d = factor de diluie corespunztor primei diluii

Rezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10x, unde x este puterea atribuit numrului 10. Exemplu: Dac la numrare au fost alese cte 2 plci corespunztoare diluiilor a doua i a treia, iar numrul de colonii din cele 4 plci reinute este:

la prima diluie reinut, 10-2: 232 i 244 colonii; la a doua diluie reinut, 10-3: 33 i 28 colonii.

( ) ( )[ ]4

221

104,224409022,0

5371021,02

2833244232)1,0(/ ==+

+++=

+=

dnn

Cmlgufc

(prin rotunjire la dou cifre semnificative*)


Pag 3

* Exemplu: ufc calculat ufc

estimat 12700 13000 12400 12000 15500 16000 14500 14000

Prin analiz statistic s-a stabilit c n 95% din cazuri limitele de ncredere ale acestei metode variaz de 12% la 37% (pentru numrul total de microorganisme aerobe) i ntre 16% la 52%. n practic ns se pot obine variaii mai mari ce deriv din condiiile de analiz aplicate i experiena analistului. 2) Plcile inoculate din dou diluii succesive conin mai puin 25 colonii. Se aplic modul de calcul prezentat mai sus. Plcile inoculate n paralel din proba de analizat (d = 1, produse lichide) sau suspensia iniial (d =10-1, produse solide), conin mai puin de 25 colonii:

( )dC

mlgufc

=2

/

Conform SR ISO 4833, pentru o abatere medie ptratic r2=0,95, intervalele de variaie a numrului posibil de ufc, pentru plcile n care se dezvolt mai puin de 15 colonii, sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Limite de ncredere pentru estimri n cazul unui numr de colonii sub baremul minim

Numr de colonii/plac

Interval posibil de variaie a ufc

Numr de colonii/plac

Interval posibil de variaie a ufc

1


Pag 4

4) Cnd plcile conin mai mult de 250 (sau 300) de colonii, numrarea se poate realiza:

pe anumite sectoare delimitate ale suprafeei plcii = tornn

secnr. sectoare

delimitate (4, 8 sau 16) pe o suprafa delimitat (ptrat) de 1 cm2, astfel: cnd numrul de colonii pe un ptrat

este mai mare de 10 se numr la ntmplare coloniile de pe 4 zone reprezentative, se determin media aritmetic, apoi se raporteaz la suprafaa total a plcii Petri; cnd numrul de colonii distribuite pe un ptrat este mai mic dect se numr coloniile de pe 12 ptrele reprezentative, se determin media aritmetic, apoi se raporteaz la suprafaa total a plcii Petri. 5) Cnd numrul de colonii pe plac este foarte mare rezoluia este imposibil numrarea, concentraie de celule mult mai mare dect diluia estimat. 6) Cnd se produce contaminarea accidental sau se obin rezultate neconcludente rezoluia este analiz efectuat necorespunztor.


REZULTATE LUCRARE nr. __________

Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE BACTERII AEROBE

MEZOFILE

1. nregistrai n tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n

plcile selectate pentru numrare)

Proba Diluia

Nr. colonii/plac

1

2

3

4

2. Stabilii gradul de contaminare exprimat n uniti formatoare

de colonii (ufc) per gram sau ml produs:

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

Proba 3 _______________

Proba 4 _______________


Pag 1

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE DROJDII SI MUCEGAIURI

DEFINIII

Drojdii microorganisme eucariote, mono sau pluricelulare, care se reproduc asexuat prin nmugurire sau, mai rar, prin sciziune. Unele drojdii se pot reproduce si sexuat (meioz). Majoritatea drojdiilor sunt saprofite i multe dintre ele au activitate fermentativ.

Mucegaiuri microorganisme eucariote, care prezint organe de reproducere difereniate. Sunt agenii mucegirii. Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza (Anexa 1)

PRINCIPIUL METODEI Prin aceast metod, numrul de drojdii i mucegaiuri se apreciaz indirect, pe baza coloniilor generate de celulele acestor microorganisme prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd proba sau o diluie a acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv gelozat, dup termostatare la 25C timp de 72 de ore.

ECHIPAMENTE Omogenizator Balan analitic

Termostat reglat la 25C Baie de ap pentru fluidificarea mediului de cultur reglat la 45C

MATERIALE I STICLRIE 25g produs alimentar 225 ml 0.1% apa peptonat Cutii Petri 10 cm sterile Pipete de 1 cm3 i 10 cm3 sterile Eprubete cu ser fiziologic steril, cte 9 cm3 per eprubet Baloane cu ser fiziologic steril


Pag 2

Pungi sterile pentru omogenizarea probelor solide sau semisolide Numrtor de colonii Reactivi pentru determinare Mediu de diluare: Soluie ser fiziologic

Mediu de cultur: Anexa 2

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Se cntresc 25 g proba produs alimentar, peste care se adaug 225 ml apa peptonat. Se omogenizeaz timp de 1 min. Pentru diluarea probei se aplic schema de diluie din figura 1.

Figura 1 Schema de lucru pentru realizarea diluiilor si inocularea probelor *Toate probele se realizeaz in duplicat.

Cu o pipet steril se transfer n fiecare cutie Petri sterila, cte 1 cm2 prob de analizat, dac produsul este lichid sau cte 1 cm2 diluie iniial, n cazul altor produse. Se realizeaz apoi prima diluie decimal a probei de analizat (10-1). Se repet aceste operaii cu diluiile urmtoare, folosind cte o nou pipet steril pentru fiecare diluie decimal (Fig.1). Se toarn n fiecare cutie Petri cte cca. 15 cm2 mediu PCA (Plate Count Agar) cu temperatura de 455C. Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor. * Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat, temperatura la care se va face termostatarea.


Pag 3

Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, pentru 3-5 zile la temperatura de 25-28C.

REZULTATE Se rein cutiile care conin 15300 de colonii. Numrul de ufc de drojdii i mucegaiuri per ml sau gram de produs se calculeaz ca medie ponderat, cu formula urmtoare:

dnnC

mlgufc+

=

)1,0()(/ 21

unde C suma coloniilor numrate n toate cutiile reinute; n1 numrul de cutii reinute dintr-o diluie n2 numrul de cutii reinute din diluia succesiv d factorul de diluie corespunztor primei diluii din care s-a realizat reinerea plcilor. Rezultatele calculate se rotunjesc la dou cifre semnificative. Se exprima gradul de contaminare printr-un numr cuprins ntre 1,0 i 9,9 multiplicat cu 10x, unde x este puterea atribuit lui 10. Dac cele dou cutii Petri, la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluiei iniiale (alte produse) conin mai puin de 15 colonii, se face media aritmetic, m, a coloniilor numrate n cele dou cutii. Rezultatul se exprima sub forma: - numr de ufc de drojdii i mucegaiuri estimat per ml: NE=m (produse lichide) - numr de ufc de drojdii i mucegaiuri estimat per gram NE=md-1 (alte produse), n care d este factorul de diluie al diluiei iniiale (alte produse). Dac cele dou cutii Petri , la nivelul probei de analizat (produse lichide) sau al diluiei iniiale (alte produse) nu conin nicio colonie, rezultatul se exprima sub forma: - mai puin de o ufc de drojdii sau mucegaiuri per ml (produse lichide); - mai puin de 1d-1 ufc de drojdii sau mucegaiuri pe gram (alte produse)


Pag 4

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. Grupe de produse

1. Pine i produse de panificaie

2. Produse lactate acide si brnzeturi

3. Carne i produse din carne

4. Uleiuri, grsimi i semine oleaginoase

5. Fructe. Legume i produse prelucrate

6. Buturi alcoolice

7. Buturi nealcoolice

8. Finuri proteice, furaje , roturi 9. Zahr i produse zaharoase

10. Cereale i produse din cereale

11. Produse de cofetrie i patiserie

12. Condimente, supe, sosuri, salate


Pag 5

ANEXA 2

CONDIII DE CULTIVARE I COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU NUMRAREA MICROORGANISMELOR

Condiiile particulare de lucru conform prevederilor din normativele romneti adaptate la condiiile ISO (SR ISO) sunt prezentate n tabelul 1.

Tabelul 1. Condiii de cultivare pentru numrarea microorganismelor impuse de normativele ISO

Grup de microorganisme Medii de cultur Condiii de termostatare Temperatur/timp

Numr total de microorganisme aerobe, care se dezvolt la 30C (bacterii, drojdii i mucegaiuri)

- PCA 30C/72h 3h

Drojdii i mucegaiuri - YGC - OGA (OGYE)

25C/5 zile

Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentat n tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru determinarea i confirmarea numrului de uniti formatoare de colonii

Indicator microbiologic Compoziie medii de cultur, gl-1 Numr total de microorganisme PCA

(engl. Plate count agar1); SMA- Standard methods agar2)) Tripton ..................... 5,0g Extract de drojdie ...... 2,5g Glucoz anhidr .......... 1,0 Agar-agar ........ 12,0-18,0g Ap pn la .......... 1000ml pH=7,2 Mediul este disponibil comercial.

Drojdii i mucegaiuri YGC (Extract de drojdie, glucoz, cloramfenicol agar ) Extract de drojdie ......... 5g Glucoz ...................... 20g Cloramfenicol ............ 0,1g


Pag 6

Agar-agar ................... 15g Ap pn la .......... 1000 ml pH=6,6

OGA (OGYE) (Oxitetraciclina glucoz agar) Extract de drojdie ......... 5g Glucoz ...................... 20g Agar-agar ................... 16g Ap pn la ........... 1000ml pH=7,2 n momentul utilizrii, n mediul fluidificat se adaug 100 ml soluie 1mg/ml oxitetraciclin. Geloz nutritiv (geloz alba) Agar-agar ......................... 1218g Ap pn la ...................... 1000 ml


REZULTATE LUCRARE __________

Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA NUMRULUI TOTAL DE DROJDII I

MUCEGAIURI



Proba

Diluia

Nr. colonii/plac

1

2

3


de colonii (ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

Proba 3 _______________


Pag 1

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE I ANAEROBE

DEFINIII

Bacteriile sporulate aerobe sunt bacterii care aparin genului Bacillus. Sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica, cu dimensiuni diferite, cu capetele drepte sau rotunjite, singulare sau asociate in unghiuri (Bacillus subtilis) sau lanuri. Sporii nu se coloreaz prin colorare Gram, sunt sferici sau ovali, cu diametru mai mic sau egal dect al celulei, fiind poziionai central sau terminal. Bacteriile sporulate anaerobe sunt bacterii care aparin genului Clostridium. Sunt bacterii Gram+, mobile, cu celule de forma cilindrica cu dimensiuni mai mari dect cele din genul Bacillus, singure sau in lanuri, care formeaz endospori dispui central sau terminal, care dau celulelor forma de suveic sau paleta. Tipurile de produse alimentare pentru care se recomand analiza sunt prezentate n Anexa 1.

PRINCIPIUL METODEI

Determinarea microorganismelor sporulate aerobe i anaerobe estimeaz numrul microorganisme in stare sporulata prezente per g sau ml de produs. Proba de analizat sau diluii succesive se supun pasteurizrii la 80C timp de 10 minute, pentru a distruge toate formele vegetative , apoi se rcete si se inoculeaz in medii specifice, cultivarea realizndu-se in condiii particulare in condiii aerobe sau anaerobe.

MATERIALE I ECHIPAMENTE SPECIALE

1. Baie de ap reglabil la 45C i la 80C 2. Stomacher pH-metru. 3. Plci Petri. 4. Termostat reglabil la 37C 5. Anaerostat sau Recipient pentru cultivare in anaerobioza 6. Numrtor de colonii 7. Reactivi si medii de cultura: mediu de diluare (ap peptonat), medii de

cultur: (Anexa 2),.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU

Testul se efectueaz n conformitate cu instruciunile de mai jos:


Pag 2

Manipularea eantioanelor n laborator, nainte de analiz, cu excepia produselor alimentare care nu necesit condiii speciale de depozitare, probele se pstreaz fie la frigider la temperatura de 0-5C, fie congelate, n funcie de natura produsului. Prepararea mediilor de cultur Se pregtete mediul Trypticase Soy Agar n cantiti corespunztoare i se sterilizeaz.

Se tempereaz mediul de cultur ntr-o baie de ap la temperatura de 45C, asigurndu-se c nivelul apei este de 1 cm peste nivelul de mediu din eprubete. Se cur zona de lucru cu un dezinfectant adecvat. Se marcheaz n mod clar plcile Petri cu numrul probei, diluia i data termostatrii.

Pregtirea diluiilor Se prepar un raport de diluie de 1:10 a produsului alimentar, prin suspensionare a de 10g (ml) produs n 90 ml ap peptonat. Probele se omogenizeaz:

- timpul de amestecare nu trebuie s depeasc 2.5 min, n scopul prevenirii supranclzirii.

- n cazul produsele alimentare care au tendina de a spuma, este indicat agitarea moderata.

- diluiile se omogenizeaz prin meninere pe vortex ( de 25 de ori, printr-un arc de 30 cm, n aproximativ 7 sec).

Pentru fiecare prob de analizat, se pipeteaz 20-25 ml din diluia 10-1 ntr-o eprubet steril. Se plaseaz eprubetele n baia de ap la 80C. si se menin timp de 20 de minute. Dup rcire se prepar diluii (diluii recomandate sunt de 10-1,10-2, i 10-3). Inocularea si termostatarea probelor Cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 ml prob de analizat.

Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 ml mediu de cultur cu temperatura de 455C. Mediile se uniformizeaz rapid, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea. Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos. Pentru bacteriile aerobe sporulate, plcile se termostateaz la 35oC 0.5oC timp de 48 2 ore.


Pag 3

Pentru bacteriile anaerobe sporulate, plcile se termostateaz 35oC 0.5oC timp de 48 2 ore. ntr-un sistem anaerob de cultivare cum ar fi sistemul BBL Gaspack (Anexa 3). Numrarea coloniilor

Coloniile se numr imediat dup perioada de termostatare. Dac este posibil, se selecteaz plcile cu 20-200 colonii.

REZULTATE

Numrul de bacterii formatoare de spori per ml sau gram de produs se calculeaz cu urmtoarea formula:

Plcile din dou diluii succesive conin 25250 colonii pe plac:

( )dnn

Cmlgufc

+=

)1,0(/ 21

n care: C = suma coloniilor numrate n toate plcile reinute; n1 = numrul de plci reinute din prima diluie; n2 = numrul de plci reinute din a doua diluie succesiv; d = factor de diluie corespunztor primei diluii

Rezultatele se exprim printr-un numr de forma (1,0 9,9)10x, unde x este puterea atribuit numrului 10.


Pag 4

PROCEDURI PARTICULARE DE ANALIZA PENTRU ANUMITE GRUPE DE PRODUSE ALIMENTARE

Bacterii sporulate aerobe mezofile din zahr Din proba de analizat se executa in condiii aseptice diluia 1/5 prin cntrire a 20g zahr i dizolvarea n 80 ml ap steril. Pentru inactivarea termic a formelor vegetative se face pasteurizarea prin meninerea diluiei 1/5 pe baie de ap la 80C, timp de 20 minute i rcire n jet de ap rece. Din proba pasteurizat si rcit, cu o pipet steril se transfer n fiecare plac Petri steril, cte 1 ml prob de analizat. Se toarn n fiecare plac Petri cte cca. 15 ml mediu de cultur cu temperatura de 455C. Plcile se termostateaz la 32oC 1oC timp de 48 3 ore. Numrul de bacterii sporulate aerobe mezofile se raporteaz la 10 g zahr. Bacterii anaerobe sporulate din lapte Se execut prin metoda Weinyirl n probe de lapte destinat fabricrii brnzeturilor. n 5 eprubete sterile ce conin parafin (cca. 1ml in stare fluida) se introduc cte 5 ml proba de analizat (lapte destinat fabricrii brnzeturilor). Dup pasteurizare (meninere 10 minute la 80C) i termostatare 48 ore la 24-48C se apreciaz eprubetele pozitive, n care s-a produs deplasarea dopului de parafin. Interpretarea rezultatelor Lapte calitate buna - Toate eprubetele sunt negative Lapte calitate satisfctoare 1 eprubeta pozitiva din 5 Lapte de calitate nesatisfctoare 2 pn la 5 eprubete pozitive.


Pag 5

ANEXA 1

GRUPELE PRINCIPALE DE PRODUSE PENTRU CARE SE RECOMANDA ANALIZA

Nr.crt. Grupe de produse

1. Finuri

2. Lapte

3. Produse lactate acide i brnzeturi

4. Carne i produse din carne

5. Conserve alimentare

6. Zahr i produse zaharoase

7. Produse deshidratate

8. Condimente i plante aromate


Pag 6

ANEXA 2 CONDIII DE CULTIVARE I COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR PENTRU

NUMRAREA MICROORGANISMELOR

Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru evaluarea diferitelor categorii de microorganisme este prezentat n tabelul 2.

Tabelul 2. Compoziia mediilor de cultur recomandate pentru determinarea i confirmarea numrului de uniti formatoare de colonii

Indicator microbiologic Compoziie medii de cultur, g/l

Bacterii sporulate aerobe BD Trypticase Soy Agar

Extract pancreatic de cazein.15,0 g Clorur de sodiu 5,0

Extract papaic de soia ..5,0 Agar .15,0

pH 7,3 0,2*Ajustat i/sau completat n funcie de necesiti

pentru a corespunde criteriilor de performan.

Bacillus cereus MYP

Mediu de baz ................. 90 ml

Soluie polimixin B ......... 1,0ml

Emulsie de glbenu de ou10,0ml

Se lichefiaz mediul de baz, se tempereaz la 50C, apoi se adaug

aseptic celelalte componente.

Mediul de baz Soluie de polimixin B

Extract de carne ..................1,0g

Pepton ............................10,0g

D-manitol ..........................10,0g

Clorur de sodiu ..............10,0g

Rou de fenol ................. 0,025g

Agar-agar .................. 12g-18g 3)

Ap pn la ................... 900 ml

pH=7,2, la 25C

Sulfat de polimixin B ...... 106 UI

Ap pn la ..................... 100 ml

Agar glucozat

Tripton ............................10,0g

Extract de drojdie ...............1,5g

Glucoz .............................10,0g

Clorur de sodiu .................5,0g

Purpur de bromcrezol .... 0,015g

Agar-agar ................... 12g-18g 3)

Ap pn la .................. 1000 ml

pH=7,0 (la 25C, dup sterilizare)

Mediul Voges-Proskauer (VP)

Pepton ..............................7,0g

Glucoz ...............................5,0g

Clorur de sodiu .................5,0g

K2HPO4 ................................ 5,0g

Ap pn la .................. 1000 ml


Mediul cu nitrat

Pepton ..............................5,0g

Extract de carne ..................3,0g

Azotat de potasiu................1,0g

Ap pn la .................. 1000 ml



Pag 7

ANEXA 3 SISTEME DE CULTIVARE IN ANAEROBIOZA

1. Sistemele GasPak sunt sisteme utilizate pentru crearea atmosferei controlate (anaerobioza, microaerofilie, mbogita in CO2).

Figura a. Sisteme anaerobioza (GASPACK) Containerele sunt rezistente la ocuri si sistemul perfect de etaneizare transforma sistemele GasPak EZ in condiii ideale de stocare si transport. Noua tehnologie, bazata pe un sistem rectangular de termostatare, etaneizare uoar si rezisten la ocuri, minimizeaz riscul apariiei condensului, asigurnd astfel o vizibilitate perfecta a coloniilor bacteriene. Structura sistemului anaerob si indicatorii CO2 asigura metoda optima de obinere a condiiilor anaerobe.

2. Anaerostate sunt sisteme din care oxigenul a fost ndeprtat sau nlocuit cu un amestec controlat de alte gaze.



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR SPORULATE AEROBE I

ANAEROBE

1. nregistrai in tabelul de mai jos numrul de colonii/plac (n


Proba

Diluia

Nr. colonii/plac

1

Stabilii gradul de contaminare exprimat in uniti formatoare de colonii

(ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

2. nregistrai in tabelul de mai jos eprubete pozitive i negative,

stabilind in funcie de rezultatele obinute calitatea probei

analizate

Proba Eprubetele testate

1 2 3 4 5

1

Proba 1 _______________


Pag 1

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE

PRINCIPIUL METODEI Drojdiile, mucegaiurile i bacteriile osmofile sunt microorganisme capabile s se creasc ntr-un mediu cu concentraii ridicate de zahr sau sare producnd alterri care conduc la modificarea calitii senzoriale i a valorii nutritive a alimentelor (Anexa 1). Prin aceast metod, numrul de microorganisme osmofile se apreciaz prin examen cultural indirect, pe baza coloniilor formate microorganismele prezente n proba de analizat, sau o diluie a acesteia, prin cultivare pe medii specifice solidificate, suplimentate cu 10% zahar sau sare, dup termostatare optim. Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza: zahr i produse derivate, produse conservate prin adaos de zahar, lapte condensat, amestecuri de srare, saramuri i produse conservate prin srare.

MATERIALE I ECHIPAMENTE 1. Mediu de baza (Anexa 2):

Pentru bacterii: dextroz, 110 g; Plate Count Agar 23.5 g, ap distilat, 1.000 ml.

Pentru drojdii i mucegaiuri: mediu hiperglucidic 2. Mediul de diluare:zaharoz sau NaCl 400 g; ap distilat 1000 ml.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Pentru obinerea diluiilor decimale pot fi folosite dou tehnici pentru orice tip de prob luat n analiz. Numrul de diluii depinde de calitatea microbiologica a probei luate in analiza, i anume:

Din proba de analizat se executa in condiii aseptice diluia 1/5, prin transferul a 20g prob n 80 ml mediu de diluare. Aceasta reprezint diluia iniial - 1:5 (proba martor). Se transfer aseptic 20 ml din proba martor n 80 ml mediu de diluare, proba este astfel diluata cu un factor de diluare de 25.

Se cntresc in condiii aseptice 10 g prob de analiza i se transfera n 90 ml mediu de diluare, obinnd diluia nti, din care se obin alte diluii decimale prin diluare succesiva.


Pag 2

Cu o pipet steril se transfer n 2 placi Petri in paralel, cte 1ml prob de analizat. Se repartizeaz n fiecare cutie Petri cte cca. 15ml mediu de cultur fluidificat i temperat la temperatura de 455C. Mediile se uniformizeaz rapid n plci, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor1. Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos in urmtoarele condiii:

A. Bacterii osmofile

Plcile Petri se termostateaz la 35-37C timp de 48 3 ore (2 zile). Se rein plcile care conin 25250 de colonii. Se numr colonii formate, realizndu-se media aritmetic a plcilor realizate n dublu exemplar i se stabilete numrul de uniti formatoare de colonii per ml sau gram de produs.

B. Drojdii i mucegaiuri osmofile Plcile Petri se termostateaz la 25-30C timp de 72 h (3 zile). Daca coloniile formate sunt de dimensiuni mici, se extinde perioada de termostatare la 96-120 h (4-5 zile). Se numr colonii formate, realizndu-se media aritmetic a plcilor realizate n dublu exemplar i se stabilete numrul de uniti formatoare de colonii per ml sau gram de produs. Se nregistreaz numrul de drojdii/mucegaiuri per ml sau gram de produs

REZULTATE Numrul de microorganisme osmofile per ml sau gram de produs se calculeaz cu urmtoarea formula:

ufc/g(ml) = nd unde n este numrul mediu de colonii/plac d este factorul de diluie. Se aplica aceeai formula de calcul ca i la bacterii aerobe mezofile sau drojdii i mucegaiuri

1 Pe capacul plcilor Petri se noteaz: denumirea i numrul probei, mediul de cultura, diluia din care se realizeaz

inocularea, temperatura la care se realizeaz termostatarea.


Pag 3

ANEXA 1

MICROORGANISME OSMOFILE CONTAMINATE ALE PRODUSELOR ALIMENTARE

Microorganism Drojdii

aW min

Saccharomyces rouxii 0.62

Saccharomyces bailii 0.80

Saccharomyces cerevisiae 0.90

Debaryomyces 0.83

Bacterii Genul Hallobacterium (H. salinarium, H. morrhnae) Genul Hallococcus


Pag 4

ANEXA 2

COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR

Tabelul 1. Compoziia mediilor de cultur recomandate

Mediu de cultura/Denumire Compoziie medii de cultur, gl-1

PCA

(engl. Plate Count agar)

Tripton ......................... 5,0g

Extract de drojdie .......... 2,5g

Glucoz anhidr ............... 1,0

Agar-agar ............. 12,0-18,0g

Ap pn la .............. 1000ml

pH=7,2

Mediul este disponibil comercial.

Mediu hiperglucidic Extract de drojdie ........... 10g

Glucoz ......................200,0 g

Uree .............................. 1,0 g

Agar-agar ............. 12,0-18,0g

Ap pn la .............. 1000ml



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA MICROORGANISMELOR OSMOFILE



Proba

Diluia

Nr. colonii/plac

1

2


de colonii (ufc) per gram sau ml produs:

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________


Pag 1

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACIE

PRINCIPIUL METODEI Bacteriile de putrefacie sunt microorganisme care produc hidroliza proteinelor de origine animal pn la produi simpli, gaze, NH3, H2S, amine biogene, compui indolici. Primele semne ale alterrii prin putrefacie sunt formarea de mucus, apariia mirosului neplcut i modificarea gustului. Bacteriile de putrefacie aparin urmtoarelor genuri: Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, Escherichia, Proteus, Clostridium etc. Determinarea lor are la baz dou principii:

I. Evidenierea hidrolizei substratului de natur proteic, astfel se determin bacteriile cazeinolitice (produc hidroliza cazeinei).

II. Evidenierea produilor finali ai hidrolizei proteinelor prin realizarea de teste biochimice reunite in testul HIL (H - evidenierea producerii de hidrogen sulfurat; I - evidenierea producerii de indol; L- capacitatea de a lichefia gelatina)

Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: carnea, preparatele din carne sau pete, brnzeturile.

MATERIALE I ECHIPAMENTE1 1. Mediul de baza:Plate Count Agar cu 1% cazein sau 10% lapte; 2. Mediul de diluare: ap peptonat; 3. Reactivi pentru testele biochimice: reactiv Erlich sau Kovacs, acetat de plumb.

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU Se pregtete suspensia iniial prin cntrirea a 10 g prob, peste care se adaug 90 ml ap peptonat. Se omogenizeaz timp de 1 min.

a. determinarea bacteriilor cazeinolitice Se realizeaz diluii decimale. Prin tehnica cultural Koch se fac inoculri in mediu PCA suplimentat cu 1% cazein sau 10% lapte. 1 Anexa 1


Pag 2

Mediile se uniformizeaz rapid n plci Petri sterile, prin rotirea plcilor n plan orizontal, apoi sunt lsate n repaus pn se produce solidificarea lor2. Dup solidificarea mediului plcile se termostateaz cu capacul n jos, timp de 48h, la temperatura de 37C. Bacteriile care prezint capacitatea de a hidroliza cazeina vor prezenta n jurul coloniilor o zon clar incolor comparativ cu restul mediului care este opac. Aceasta deoarece, bacteriile cazeinolitice produc enzime proteolitice extracelulare care difuzeaz n exteriorul coloniilor i hidrolizeaz cazeina.

b. determinarea produilor finali ai hidrolizei proteinelor - testul HIL Testul H evideniaz prezena hidrogenului sulfurat, rezultat din proteoliza proteinelor

Se transfer 1ml suspensie iniial ntr-o eprubet cu 9 ml ap peptonat steril. Se plaseaz deasupra lichidului o hrtie steril mbibat n acetat de plumb. Proba se termostateaz la temperatura de 37C, timp de 48h. Proba este pozitiv dac hrtia se nnegrete, ca urmare a formarii de sulfura de plumb, prin reacia dintre acetatul de plumb si H2S care se degaja. Testul I evideniaz prezena indolului

Se transfer 1ml suspensie iniial ntr-o eprubet cu 9 ml ap peptonat steril. Proba se termostateaz la temperatura de 37C, timp de 48h, apoi se adug 1 ml reactiv Kovacs sau Erlich. Proba se consider pozitiv prin apariia unui inel de culoare roie la interfaa mediu-reactiv, care indic prezena indolului. Testul L evideniaz bacteriile care lichefiaz gelatina

Se recolteaz cu ansa celule din suspensia iniial i se neap un tub de gelatin ntr-o eprubet sterila. Se termostateaz la temperatura de 20C, timp de 7 zile3. Proba este pozitiv dac se produce lichefierea parial sau total a tubului de gelatin. REZULTATE Stabilirea numrului de bacterii cu activitate cazeinolitic se aplica aceeai formula de calcul utilizata pentru stabilirea numrului de unitatea formatoare de colonii (metoda indirecta de numrare)

2 Se noteaz pe capacul plcilor numele probei, mediul utilizat, diluia inoculat, temperatura la care se va face termostatarea.

3nainte de analiza, probele se menin timp de 30 min la frigider


Pag 3

ANEXA 1

COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR SI A REACTIVILOR UTILIZATI

Tabelul 1. Compoziia mediilor de cultur recomandate

Mediu de cultura/Denumire Compoziie medii de cultur, gl-1

PCA

(engl. Plate count agar)

Tripton ......................... 5,0g

Extract de drojdie .......... 2,5g

Glucoz anhidr ............... 1,0

Agar-agar ............. 12,0-18,0g

Ap pn la .............. 1000ml

pH=7,2

Mediul este disponibil comercial.

Tabelul 2. Compoziia soluiilor si a reactivilor utilizai

Reactiv - Soluie/Denumire Compoziie medii de cultur, gl-1

Ap peptonat Pepton ....................... 10,0g

Ap pn la .............. 1000ml

Soluie de acetat de plumb Acetat de plumb .......... 10,0g

Ap pn la ................ 100ml

Reactiv Kovacs p dimetilnanobenzaldehida..10,0g

HCl.25,0ml

Alcool amilic pn la .100ml



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

DETERMINAREA BACTERIILOR DE PUTREFACIE



Proba

Diluia

Nr. colonii/plac

1

2

Stabilii gradul de contaminare exprimat in uniti formatoare de colonii

(ufc) per gram sau ml produs

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

2. nregistrai in tabelul de mai jos probele pozitive i negative, prin

aplicarea testului HIL

Proba Testul HIL

Testul H Testul I Testul L

1

2

Proba 1 _______________

Proba 2 _______________

MICROBIOLOGIE SPECIALA - METODE RAPIDE, CLASICE SI MODERNE DE EVALUARE A CALITATII MICROBIOLOGICE A ALIMENTELOR

Pag 1

PROBA REDUCTAZEI

PRINCIPIUL METODEI Proba reductazei este o metod indirect de apreciere a numrului de microorganisme vii dintr-un produs, in funcie de corelaia dintre gradul de contaminare si durata n care se produce modificarea culorii unor indicatori redox (albastru de metilen i resazurina), sub aciunea enzimelor din categoria reductaze sintetizate de celulele vii prezente n produs. Indicatorii redox au in forma oxidata culoare albastru (in cazul albastrului de metilen) si albastru violet (in cazul resazurinei), iar prin reducere (in prezenta reductazelor) se transforma in leucoderivai incolori. Analiza se preteaz cel mai bine pentru evaluarea calitii microbiologice a laptelui materie prima. In funcie de tipul indicatorului si concentraia acestuia variaz durata analizei si culoarea probei, parametrii in funcie de care se poate aprecia gradul de contaminare si calitatea microbiologica a produsului. Astfel, in cazul utilizrii albastrului de metilen, iniial, proba are culoarea albastru care in timp se transforma in incolor. Resazurina i schimb culoarea de la albastru la violet spre roz i apoi incolor.

MATERIALE I ECHIPAMENTE 1. Soluie de albastru de metilen 1% 2. Soluie de resazurin 0,05%

DESCRIEREA MODULUI DE LUCRU a. Proba reductazei cu albastru de metilen

Pentru analiza laptelui, se transfer 20 ml lapte ntr-o eprubeta steril peste care se adaug 1 ml soluie de albastru de metilen. Eprubeta se menine n baie de apa termostatat la temperatura de 38-40C, astfel nct nivelul apei s fie superior probei. Se fac notaii asupra modificrii culorii la intervale de 20, 60, 120, 180, 330 minute. Exist i varianta rapida a acestei metode cnd se utilizeaz aceeai tehnic de lucru utiliznd urmtoarele cantiti: 10 ml lapte i 1 ml soluie albastru de metilen, diluie 1/10.

b. Proba reductazei cu resazurina n eprubete sterile se transfera 10 ml lapte de analizat peste care se adaug 1 ml soluie de resazurina 0,05%, apoi proba se termostateaz la temperatura de 38-40C, urmrindu-se modificarea culorii in intervalul 20 i 60 minute.


Pag 2

REZULTATE a. Proba reductazei cu albastru de metilen

Aprecierea calitii laptelui se face in conformitate cu specificaiile din tabelul 1. Tabelul 1. Aprecierea calitii laptelui n proba reductazic cu albastru de metilen

Durata decolorrii probei, minute Numr bacterii per ml Calitatea laptelui Categoria

Metoda clasica Metoda rapida

330 180 5105 Buna I

120-330 60-180 5105 - 4106 Satisfctoare II

20-120 8-60 4106 20106 Slaba III

20 8 20106 Foarte slaba IV

b. Proba cu resazurina In proba cu resazurina aprecierea calitii laptelui si a gradului de contaminare se face realizeaz in conformitate cu datele nscrise n tabelul 2. Se apreciaz c la temperaturi de 38-40C, o capacitatea reductazic superioar o au lactobacilii, streptococii i bacteriile coliforme. Dac probele se menin la temperatura de 22C la reducere particip i bacterii din genurile Achromobacter, Bacillus, Enterococcus.

Tabelul 2 Aprecierea numrului de bacterii din proba de lapte

Timp de modificare a culorii

Culoare proba

Numr de bacterii per ml

Calitatea laptelui

Categoria

Dup 1h Albastru 5105 Buna I

Dup 1h Albastru violet 5105 - 4106 Satisfctoare II

Dup 1h Rou-alb 4106 20106 Slaba III

Dup 20 min. Alb 20106 Foarte slaba IV



Nume______________________________

Grupa______________________________

Data_______________________________

PROBA REDUCTAZEI

1. nregistrai n tabelele de mai jos variaia culorii probelor

analizate, stabilind n funcie de rezultatele obinute calitatea

acestora

1.1. Proba reductazei cu albastru de metilen

PROBA Durata decolorrii probei, minute Metoda rapida

Numr bacterii per ml Calitatea laptelui

1.

2.

1.2. Proba reductazei cu resazurin

PROBA Timp de modificare a culorii

Culoare proba

Numr bacterii per ml

Calitatea laptelui

1.

2.


Pag 1

METODE BAZATE PE UTILIZAREA PETRIFILMELOR

Metodele culturale sunt n prezent mult simplificate prin utilizarea unor sisteme comerciale, denumite Petrifilme (n limba englez, Petrifilms), n care mediul de cultur specific (n general, un mediu selectiv), deshidratat, dar uor rehidratabil este fixat sub forma unui film (cu diametru i grosime variabil) pe un suport din carton plastifiat i acoperit cu o folie din plastic. Prin inocularea suspensiei de celule, lichidul hidrateaz mediul i prin termostatare este posibil dezvoltarea microorganismelor. Petrifilmele au fost concepute n vederea satisfacerii conceptelor sistemului HACCP (analiza hazardului, punctele critice de control), care prevd aplicarea unor msuri corective, pe tot parcursul procesului de producie, fr ca acesta s stagneze, ceea ce impune analiza unui numr mare de probe, cu obinerea unor rezultate prompte i n scurt timp, obiective ce nu pot fi realizate prin aplicarea metodelor clasice de control microbiologic (Bahrim, 2003). Practica a demonstrat c Petrifilmele constituie sisteme eficiente de analiz microbiologic, aplicabile mai ales pentru evaluarea calitii materiilor prime i controlul n punctele critice pe parcursul procesrii acestora, oferind numeroase avantaje, care se regsesc n reducerea timpului de analiz, reducerea costului analizei per prob, creterea numrului de probe analizate, asigurarea inocuitii alimentelor i mbuntirea substanial a productivitii (Jordano i Medina, 1999).

Tehnica de utilizare a Petrifilmelor n analiza microbiologic este extrem de simpl i presupune parcurgerea urmtoarelor etape:

Se pregtete proba, conform metodologiei clasice, i se dilueaz prin tehnica diluiilor decimale, pn la o concentraie de celule de aproximativ 104 celule per ml.

Se ridic filmul superior.


Pag 2

Se inoculeaz 1 ml suspensie dintr-o diluie corespunztoare n centrul Petrifilmului aezat pe un suport special.

Se elibereaz filmul superior, care se las s cad liber. Cu ajutorul dispozitivului de rspndire se preseaz uor deasupra zonei inoculate

pentru distribuia uniform a celulelor din suspensie pe toat suprafaa circular a mediului de cultur.

Se ndeprteaz dispozitivul de rspndire i se ateapt un minut pentru solidificarea mediului.

Se termostateaz (pachete de pn la 20 Petrifilme) n condiii optime, specifice pentru dezvoltarea microorganismelor analizate, n funcie de recomandrile din instruciunile de utilizare a Petrifilmului.


Pag 3

Se realizeaz numrarea coloniilor (pragul optim de detecie 25-250 colonii/petrifilm); faptul ca pe suportul pentru mediu este imprimat un caroiaj care mparte suprafaa mediului n ptrate cu suprafaa de 1cm2, uureaz mult numrarea.

Se calculeaz ufc/g (ml), similar cu metodele clasice.

Eficiena oferit de utilizarea Petrifilmelor a condus la extinderea utilizrii acestora pentru evaluarea calitii microbiologice a numeroase alimente, inclusiv n industria de panificaie pentru analiza finii, a pastelor finoase, a cerealelor i a cerealelor pentru micul dejun. n tabelul 1 sunt prezentate tipurile de Petrifilme comerciale, existente pe pia i principalele lor caracteristici.


Pag 4

Tabelul 1. Tipuri de Petrifilme comerciale (Bahrim, 2003b)1 Tip Petrifilm Grup de

microorganisme analizate

Condiii de termostatare

Particulariti

PYM (Petrifilm yeast/mould)

Drojdii i mucegaiuri

72-120 ore, 25C

determinarea numrului total de drojdii i mucegaiuri; nu necesit adugarea de antibiotice sau acid tartric.

PAC (Petrifilm aerobic count)

Bacterii aerobe mezofile

48 2 ore, 30 1C

determinarea numrului total de bacterii aerobe; analiza este eficient prin prezena unui indicator care coloreaz coloniile n rou.

PCC (Petrifilm coliforms count)

Bacterii coliforme 24 2 ore, 35 1C sau 37 1C

evidenierea coliformilor totali; analiza este nlesnit de prezena unui indicator ce coloreaz coloniile n rou; filmul superior reine gazele rezultate prin fermentaia substratului lactoz, cu apariia specific a bulelor de gaz n jurul coloniilor.

PHSCC (Petrifilm high sensivity coliforms count)

Bacterii coliforme 24 2 ore, 32...35C

evidenierea bacteriilor coliforme la diluii mari n probele de analizat (1-2 celule g-1); permite inocularea a 5 ml prob, sau diluii ale acesteia; evaluare similar ca i n cazul utilizrii Petrifilmelor tip PCC.

P 2000 CC (Petrifilm rapid coliforms count)

Bacterii coliforme 24 2 ore, 35 1C

dezvoltarea rapid a bacteriilor coliforme; indicator de pH foarte sensibil, cu evidenierea producerii de acid, chiar de la nceputul formrii coloniilor; reducerea timpului de analiz prin asigurarea unei creteri accelerate; rezultate test prezumtiv n 6-14 h, cu confirmare n 18 -24 h.

PEC (Petrifilm E. coli)

Escherichia coli 48 2 ore, 35 1C sau

24 2 ore, 42 1C

dou teste n unul singur: evaluarea cantitativ a coliformilor fecali i a lui E. coli; conine indicator -glucuronidaz pentru evidenierea selectiv a tulpinilor de E. coli; rezultate pozitive n 24 - 48 ore; nalt selectivitate.

Petrifilm Kit HEC Escherichia coli tip enterohemoragic

48 2 ore, 35 1C sau 24 2 ore, 42 1C

evidenierea serotipurilor E. coli enteropatogene (O157: H7), care produc glucuronaze; se bazeaz pe utilizarea membranei active ELISA, care se menine 2 minute n contact cu Petrifilmul, iar dup 18 ore de termostatare testul pozitiv se evideniaz prin apariia unor pete gri pe membran.

Petrifilm Enterobacteriaceae

Enterobacterii 24 2 ore, 30 1C sau 37 1C

evidenierea bacteriilor din familia Enterobacteriaceae; producerea de acid este pus n eviden cu ajutorul unui indicator de pH, ce vireaz n galben n mediu acid; evidenierea formrii de gaz prin fermentaia heterolactic a lactozei.

Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express Disk)

Staphylococcus aureus

24 2 ore, 37 15C

evidenierea selectiv a tulpinilor de Staphylococcus aureus prin formarea de colonii de culoare rou-violet; confirmarea prezenei lui Staphylococcus aureus, cu ajutorul discului, care conine albastru-toluidin-O, ce faciliteaz developarea unei zone de culoare roz (reacie DN-az pozitiv), n jurul coloniilor specifice.

1 |Anexa 1


Pag 5

Garania utilizrii Petrifilmelor este validat oficial de numeroase asociaii de renume din ntreaga lume (tabelul 2). Validarea s-a realizat pe trei criterii de baz: reproductibilitate, repetabilitate i precizie.

Tabelul 2. Validarea oficial a utilizrii Petrifilmelor pentru evaluarea calitii microbiologice a alimentelor

Organizaia internaional*

Produse pentru care s-a realizat validarea

Indicator microbiologic

AOAC Majoritatea alimentelor Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme i Escherichia coli Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru

determinarea rapid a bacteriilor coliforme ANFOR Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile

Bacterii coliforme i Escherichia coli Petrifilm seria 2000 (P 2000 CC) pentru determinarea rapid a bacteriilor coliforme

Enterobacterii NMKL Majoritatea alimentelor Bacterii aerobe mezofile

Bacterii coliforme i Escherichia coli

VDIA Lapte i produse lactate Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme

HPB Lapte i produse lactate

Alte alimente Evaluarea calitii mediului

Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme Drojdii i mucegaiuri Bacterii aerobe mezofile Bacterii coliforme i Escherichia coli Test Kit HEC

* AOAC Association of Official Analytical Chemists (SUA); AFNOR French Standardization Association (Frana); NMKL Nordic Committee of Food Analysis; VDIA Victorian Dairy Industry Authority (Australia); HPB Health Protection Branch, Compendium of Analytical

Analiza comparativ a fidelitii evalurilor cantitative, pentru patru indicatori microbiologici: drojdii i mucegaiuri, bacterii aerobe mezofile, bacterii coliforme i Escherichia coli, realizat pentru tipuri diferite de produse alimentare prin utilizarea Petrifilmelor, n paralel cu tehnicile culturale clasice ce utilizeaz medii selective (OGYE, PCA, VRBL, EMB), a evideniat c evalurile privind numrul total de drojdii i mucegaiuri au condus la rezultate inferioare, n variantele analizelor realizate cu Petrifilme, comparativ cu metodele convenionale. Explicaia const probabil n existena unei suprafee insuficiente pentru creterea extins a coloniilor de mucegai, ceea ce conduce n multe cazuri la suprapunerea coloniilor, genernd erori n evaluarea corect a unitilor formatoare de colonii (ufc). De remarcat este faptul c la Petrifilmele destinate evalurii drojdiilor i mucegaiurilor, suprafaa mediului de cultur este de 30 cm2, comparativ cu 20 cm2, n cazul majoritii Petrifilmelor concepute pentru studiul bacteriilor (Jordano i colab., 1995).


Pag 6

Evalurile statistice, realizate pe baza coeficienilor de corelaie i a pantei ecuaiilor de regresie liniar, ofer certitudini privind fidelitatea rezultatelor pentru principalii indicatori microbiologici i recomand utilizarea Petrifilmelor ca o alternativ la metodele microbiologice convenionale pentru controlul microbiologic, realizat att pe faze de fabricaie, ct i n cazul materiilor prime i al produselor finite (tabelul 3).

Tabelul 3. Evaluri statistice privind acurateea analizelor microbiologice realizate cu Petrifilme, comparativ cu metodele convenionale (Jordano 1995, 1999)

Parametrul statistic Indicatorul microbiologic Petrifilme/ Metode culturale clasice*

Coeficient de corelaie Bacterii aerobe mezofile 0,897 Bacterii coliforme 0,861 Drojdii i mucegaiuri 0,981

Panta ecuaiei de regresie

Bacterii aerobe mezofile 0,599 Bacterii coliforme 1,051 Drojdii i mucegaiuri 0,998

* Valori medii pentru 5 probe n paralel (n = 5) Datele obinute, exprimate ca valori medii, stabilite prin calcul statistic (P > 0,05), pentru cinci probe n paralel (n = 5), certific fidelitatea i acurateea analizelor realizate cu Petrifilme, amplificarea preciziei realizndu-se prin asigurarea condiiilor selective de cultivare i interpretare a rezultatelor, ceea ce permite evaluarea corect i distinctiv a speciilor analizate (fig. 5).

1 2

3 4

Fig. 5. Dezvoltarea selectiv a microorganismelor n funcie de natura Petrifilmelor 1 drojdii i mucegaiuri; 2 bacterii aerobe mezofile; 3 enterobacterii; 4 bacterii coliforme/

Escherichia coli


Pag 7

n concluzie, implementarea utilizrii Petrifilmelor n controlul calitii microbiologice a alimentelor ofer numeroase faciliti care se reflect n: uurina n exploatare; analiza presupune parcurgerea a numai trei etape: inoculare, termostatare i evaluare cantitativ i calitativ;

simplitate n utilizare i n interpretarea cu acuratee a rezultatelor, prin crearea unor condiii selective de cretere i de evaluare a microorganismelor testate. Evalurile cantitative sunt facilitate, chiar n cazul dezvoltrii unui numr mare de colonii, prin caroiajul tiprit pe filmul inferior, care delimiteaz suprafee de 1 ml; reducerea semnificativ a costului manoperei per analiz; reducerea la jumtate a timpului necesar pentru realizarea analizelor microbiologice, cu impact pozitiv asupra: controlului eficient al punctelor critice, optimizrii strategiilor de control, creterii numrului de analize efectuate, eficientizrii procesrii, mbuntirii calitii i asigurrii inocuitii produselor finite; impact pozitiv asupra organizrii laboratorului de microbiologie, prin eliminarea operaiilor de pregtire i sterilizare a mediilor de cultur i a ustensilelor de laborator, impuse de metodele convenionale de analiz microbiologic; riscuri reduse pentru mediul nconjurtor dup utilizare; volum redus de produse reziduale la finalul analizei care pot fi uor anihilate pin incinerare; economie de spaiu la transport, pstrare i termostatare (un pachet de 50 de Petrifilme ocup un spaiu similar cu cel ocupat de 2 plci Petri clasice); valabilitate prelungit (mai mult de un an, prin meninere la 4C). Practica a demonstrat c exist i unele limitri n utilizarea Petrifilmelor generate de (Williams i Busta, 1999b):

capacitatea unor microorganisme de a produce hidroliza agentului de solidificare, ceea ce conduce la rspndirea i suprapunerea coloniilor;

unii compui din alimente (acizi, sruri etc.) pot exercita efect inhibitor asupra dezvoltrii coloniilor n cazul utilizrii Petrifilmelor, comparativ cu tehnicile clasice.

Studii efectuate n 85 de companii productoare de alimente, privind eficiena economic a tehnicilor de evaluare a calitii microbiologice, au demonstrat c manopera se reflect n proporie de 70,7 % n costul tot al analizelor, iar prin utilizarea Petrifilmelor se pot economisi anual 99-400 ore, timp ce poate fi valorificat pentru elaborarea de programe eficiente pentru evaluarea calitii i creterea numrului de analize (Jordano, 1999).


Pag 8

ANEXA 1 Tipuri de Petrifilme comerciale

Tip Petrifilm/ Grup de microorganisme analizate

Exemple Tip Petrifilm/ Grup de microorganisme

analizate

Exemple

Petrifilm yeast/mould

Drojdii i mucegaiuri

Petrifilm high sensivity coliforms

count) Bacterii coliforme

Petrifilm aerobic count

Bacterii aerobe mezofile

Petrifilm rapid coliforms count

Bacterii coliforme

Petrifilm coliforms count

Bacterii coliforme

Petrifilm E. coli

Escherichia coli

Petrifilm E. coli / Coliform count plate

Bacterii coliforme i E. coli

Petrifilm Enterobacteriaceae

Enterobacterii

Petrifilm Staph Express Count System (Petrifilm

Staph Express Count Plate + Petrifilm Staph Express

Disk) Staphylococcus aureus

Petrifilm Environmental Listeria plate

Listeria

MICROBIOLOGIE SPECIALA - TEHNICI DE EVALUARE A MICROORGANISMELOR INDICATORI SANITARI

Pag 1

BACTERII COLIFORME. COLIFORMI FECALI SI ESCHERICHIA COLI

Bacteriile coliforme conform definiiei ISO sunt bacterii Gram negative nesporulate, oxidazo-negative, aerobe sau facultativ anaerobe, ce pot s se nmuleasc n prezena srurilor biliare (care inhib dezvoltarea bacteriilor Gram pozitive sau a altor ageni cu proprieti echivalente), capabile de a produce fermentaia heterolactic a lactozei cu producere de acid lactic i gaze, in timp de 48 ore si la temperaturi de 35-37C. Grupul bacteriilor coliforme cuprinde speciile: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloaceae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Citrobacter diversum, Citrobacter amalonatica Tipuri de produse alimentare pentru care se recomanda analiza sunt: lapte i produse lactate, carne i produse din carne, pete i produse din pete, buturi alcoolice, buturi nealcoolice, produse de cofetrie i patiserie

PRINCIPIU METODEI Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include trei etape diferite de analiza concretizate in: testul prezumtiv, testul de confirmare i testul complet, bazate pe capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, n timp de 48 ore la 35C. Testul prezumtiv const in inocularea probei n mediu nutritiv cu lactoz. Aprecierea probelor pozitive se face fie n funcie de prezena gazelor acumulate n tubul Durham, fie ca urmare a scderii pH-ului prin acumularea de acid lactic. Testul de confirmare const in transferul si inocularea din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv in medii selective care favorizeaz dezvoltarea bacteriilor coliforme de origine fecala. Testul complet permite identificarea speciilor grupului bacteriilor coliforme i se bazeaz pe testarea unor proprieti biochimice caracteristice. Din grupul bacteriilor coliforme specia Escherichia coli, este indicatorul care certifica o contaminare fecal recent.

MODUL DE LUCRU DETECTIA COLIFORMILOR TOTALI

Analiza se efectueaz n dou etape, dup cum urmeaz: 1. Etapa de mbogire (testul prezumtiv) are rolul de a previziona prezena

bacteriilor coliforme i multiplicarea acestora, dac sunt n concentraii reduse, n vederea evidenierii lor facile n etapa urmtoare.


Pag 2

2. Etapa de confirmare certific prezena bacteriilor coliforme prin cultivare n condiii selective specifice.

Pornind direct de la eantionul de analiz (n cazul unui produs lichid) sau de la suspensia iniial (10-1) (n cazul unui produs solid), n funcie de gradul de contaminare presupus se pot adopta dou modaliti de evaluare. Astfel, se pot folosi pentru inoculare cte 10 ml de prob (pentru probele cu grad de contaminare mai redus) utiliznd mediu selectiv de mbogire dublu concentrat, sau cte 1 ml de prob prin inoculare n mediu selectiv de mbogire simplu concentrat. Pentru acest din urm caz, se inoculeaz serii de cte trei eprubete n paralel pentru i pentru urmtoarele diluii succesive: 10-1, 10-2,...a. Probele inoculate se termostateaz la temperatura de 37C, timp de 24-48 h. Se nregistreaz eprubetele pozitive (mediu tulbure, bule de gaz n plutitor), iar eprubetele negative sunt din nou termostatate timp de 24 h i se nregistreaz din nou eprubetele pozitive. Pentru confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz cte o ans i se inoculeaz eprubete cu bulion lactoz bil verde briliant; dup termostatare la temperatura de 37C, timp de 48 h, n condiiile n care se produc gaze n plutitor, tulburare, si virajul culorii indicatorului verde briliant de la verde la galben, se confirma ca n produsul analizat sunt prezente bacteriile coliforme (fig. 1).

EVIDENTIEREA PREZENTEI BACTERIILE COLIFORME DE ORIGINE FECALA

Testul const n transferul cu o ans a probelor din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv, n eprubete cu mediu E.C. i termostatare la temperatura de 45.5C, timp de 24 de ore.

CERTIFICAREA PREZENTEI SPECIEI Escherichia coli Din eprubetele pozitive ce conin mediu E.C., dup termostatare la temperatura de 45.5C, timp de 24 de ore, se fac trasri aplicnd metode scarificate pe suprafaa mediului Levine cu agar, repartizat n plci pentru a obine colonii distincte. Se termostateaz apoi la temperatura de 35C, timp de 18-24 de ore. Din coloniile caracteristice se fac inoculri pentru testele biochimice denumite generic IMViC*, care permit diferenierea a lui E. coli de Enterobacter aerogenes. *I producere de indol din triptofan M reacia fa de rou de metil V reacia Vages Proskauer de producere a acetoinei C utilizarea citratului.

Difereniere intre specii se face pe baza proprietarilor dopa cum urmeaz : Specii I M V C Mobilitate Escherichia coli + + - - + Enterobacter aerogenes

- - + + -


Pag 3

Suspensie iniial (produs solid) Eantion de analiz (produs lichid)

Etapa de mbogire

10-1/10-2

10-2/10-3

10 ml 10 ml 10 ml

1 ml 1 ml 1 ml Idem Idem

+ + + + + + 10 ml

Mdc1) 10 ml Mdc1)

10 ml

Mdc1)

10 ml

Msc2)

10 ml Msc2)

10 ml

Msc2)

Termostatare 24h Termostatare 48h4) Idem Idem

Etapa de confirmare

+* + -

10 ml BLBV3)

10 ml BLBV

10 ml

BLBV

10 ml

BLBV

10 ml BLBV

Idem Idem

Termostatare 48h 2h 4)

Termostatare 48h 2h 4)

Interpretarea rezultatelor

+** + - +** - Idem Idem

Calculul MPN

Fig. 1. Schema de lucru pentru evaluarea cantitativ a bacteriilor coliforme prin tehnica numrului probabil

Legend: 1) Mediu selectiv de mbogire dublu concentrat (Mdc) + tub Durham 2) Mediu selectiv de mbogire simplu concentrat (Msc) + tub Durham

3) Mediu selectiv de confirmare + tub Durham

4) Temperatura de termostatare poate fi 30C, 35C sau 37C i este stabilit n funcie de scopul analizei i anume: scop

tehnologic sau evaluarea riscului privind sigurana alimentar; n anumite cazuri testul pozitiv poate fi evideniat i dup o perioad de termostatare de 24 h 2h

* Prob pozitiv: modificarea turbiditii; reducerea pH-ului; acumularea de gaz n tubul Durham ** Prob pozitiv: modificarea turbiditii; virajul culorii mediului din verde n galben; acumularea de gaz n tubul Durham


Pag 4

CALCULUL I INTERPRETAREA REZULTATELOR Folosind, metoda titrului, in funcie de numrul eprubetelor pozitive se stabilete cifra caracteristica si din tabelul lui Mac Cready (tabel 1), corespunztor cifrei caracteristice si numrul de eprubete inoculate in paralel, se determina numrul probabil de coliformi (MPN) Pentru a calcula numrul probabil de coliformi/cm3 prob, valoarea din tabel se nmulete cu factorul de diluie corespunztor primei cifre din cifra caracteristic.

Tabel Mac Cready Cifra caracteristica

Numr probabil de microorganisme

Cifra caracteristic


Cifra caracteristica


000 0.0 201 1.4 302 6.5 001 0.3 202 2.0 310 4.5 010 0.3 210 1.5 311 7.5 011 0.6 211 2.0 312 11.5 020 0.6 212 3.0 313 16.0 100 0.4 220 2.0 320 9.5 101 0.7 221 3.0 321 15.0 102 1.1 222 3.5 322 20.0 110 0.7 223 4.0 323 30.0 111 1.1 230 3.0 330 25.0 120 1.1 231 3.5 331 45.0 121 1.5 232 4.0 332 110 130 1.6 300 2.5 333 140 200 0.9 301 4.0

Interpretarea rezultatelor Pentru fiecare eantion examinat se rein trei diluii consecutive, care, dup caz,

corespund uneia dintre situaiile urmtoare: 1) Cel puin o diluie prezint trei eprubete pozitive. Se alege diluia cea mai mare (adic cea care corespunde celei mai mici concentraii de eantion inoculat) care prezint trei eprubete pozitive, i nc dou diluii succesive. Dac schema de diluie adoptat este necorespunztoare, adic nu exist diluii la care s se fi nregistrat i probe negative, se aleg cele mai mari trei diluii succesive din serie (adic cele care au cea mai sczut concentraie de prob inoculat). 2) Nu exist cazuri e s prezinte trei eprubete pozitive. Cazul 1 nu poate fi aplicat. Se aleg cele mai mari trei diluii succesive din serie (adic cele care au cea mai sczut concentraie de prob inoculat), care conin cel puin un rspuns pozitiv. 3) Cazuri particulare. n toate cazurile n care mai mult de una dintre cele trei diluii de la pct. 1) i 2) nu prezint eprubete pozitive (adic cea n care s-a inoculat cea mai mare cantitate de prob) i cele dou diluii consecutive mai mici (adic cele n care concentraiile de prob inoculat sunt de 10 i respectiv 100 de ori mai mici dect n prima diluie aleas), excluznd cazul n care se nregistreaz probe pozitive, doar la prima diluie preparat, pornind de la eantion. n acest ultim caz, se vor reine primele trei diluii, chiar dac seria include dou diluii care nu prezint nici o prob pozitiv.


Pag 5

Calcul MPN1 Pentru a stabili MPN/g sau ml prob se recomand utilizarea aproximaiei

propus de Thomas, stabilit prin formula:

( ) 21)(/ TNP

mlgMPN+

=

n care: P numrul de eprubete pozitive; N cantitatea de prob inoculat n probele negative, g sau ml T cantitatea total de prob luat n analiz (inoculat n toate seturile de

probe realizate n paralel), g sau ml Pentru fiecare analiz trebuie s se decid categoria de rezultate acceptat,

adic 1, 1 i 2, sau 1, 2 i 3. Astfel, gradul de contaminare va corespunde cu MPN calculat, conform specificaiilor din tabelul 1.

Tabelul 1. Msuri privind interpretarea i acceptabilitatea rezultatelor analizei

Categoria Definiie

1 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mare ans de a fi obinute. ansa de a obine acest rezultat (care este mai puin probabil dect cel mai puin probabil) este de cel mult 5% n aceast categorie.

2 Rezultatul este unul din cele care au cea mai mic ans de a fi obinute, chiar dect cel mai puin probabil din categoria 1. Exist ansa de cel mult 1% de a obine un rezultat mai puin probabil dect cel mai puin probabil n aceast categorie.

3 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mic ans de a fi obinute, chiar dect cel mai puin probabil din categoria 2. Exist ansa de cel mult 0,1% de a obine un rezultat care este mai puin probabil dect cel mai puin probabil n aceast categorie.

0 Rezultatul este unul dintre cele care au cea mai mic ans de a fi obinute, chiar dect cel mai puin probabil din categoria 3. Nu exist dect o ans de 0,1% de a obine un rezultat n aceast categorie, fr erori de analiz

Dup alegerea setului de trei diluii reprezentative pentru stabilirea MPN, care, conform uneia din situaiile de mai sus, sunt acceptabile din punct de vedere statistic. Acceptabilitatea depinde totodat de numrul de eantioane analizate i de decizia de a accepta sau refuza rezultatele din categoria 2.

Un exemplu de alegere a diluiilor pentru calculul valorii MPN este prezentat n tabelul 2.

Acceptarea rezultatelor va ine seama de categoria impus. Astfel, atunci cnd sunt acceptate numai rezultate numai din categoria 1, combinaia 221 nu poate fi

1 numrul cel mai probabil (MPN)


Pag 6

reinut dect dac au fost examinate 10 probe n paralel (din lotul considerat). n cazul cnd sunt acceptate mai puin probabile (din categoria 2), combinaia 221 va fi reinut n cazul n care au fost examinate 2, 3 sau 5 probe n paralel. Dac combinaia 221 este rezultatul unei singure analize, acesta nu poate constitui o baz pentru stabilirea MPN.

Tabelul 2. Stabilirea valorii MPN n funcie de diagrama probelor pozitive (adaptare dup SR ISO 4831, 1992)

Exemplu Numrul de eprubete pozitive corespunztor seturilor de trei eprubete termostatate, corespunznd urmtoarelor cantiti de eantion inoculate n fiecare eprubet1)

MPN2)

Produs lichid

10 ml 1ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml MPN/ml MPN/g

Alt produs 1 g 10-1g 10-2 g 10-3 g 10-4 g 1 3 3 2 1 0 1,5101 1,5102 2 3 3 3 0 2,4101 2,4102 3 2 2 1 1 0 7,4 7,410 4 3 3 0 0 0 2,4 2,410 5 2 2 0 1 1 2,110-1 2,1

1) Seria (combinaia) de eprubete aleas

2) Conform datelor din tabelele ntocmite pe baze statistice


Pag 7

ANEXA 1 COMPOZIIA MEDIILOR DE CULTUR

Etapa Denumirea mediului

Compoziie Instruciuni de pregtire

Etapa de mbogire

Bulion-tripton i lauril sulfat

(mediul selectiv de mbogire)

Mediu dublu concentrat: Tripton ............................... 40,0gLactoz ................................ 10,0gK2HPO4 ................................ 5,5 gKH2HPO4 ............................. 5,5 gNaCl..................................... 10,0gLauril sulfat de sodiu ............. 0,2gAp .................... pn la 1000 mlpH=6,8; la temperatura de 25C (dup sterilizare)

Se dizolv componentele sau mediul comercial n ap, nclzind dac este nevoie. Se ajusteaz pH-ul dac este nevoie. Se repartizeaz cte 10 ml de mediu dublu concentrat n eprubete mari (20mm x 200mm), fr tub Durham. Se repartizeaz cte 10 ml de mediu simplu concentrat n eprubete mici (16mm x 160mm), cu tub Durham. Se sterilizeaz n autoclav la 121C, timp de 15 minute. Tuburile Durham nu trebuie s conin bule de aer dup sterilizare.

Mediu simplu concentrat Tripton ............................... 20,0gLactoz .................................. 5,0gK2HPO4 ............................... 2,75gKH2HPO4 ............................ 2,75gNaCl....................................... 5,0gLauril sulfat de sodiu ............. 0,1gAp .................... pn la 1000 mlpH=6,8; la temperatura de 25C (dup sterilizare)

Etapa de confirmare

Bulion lactozat cu bil i verde briliant (BLBV)

(mediul de confirmare)

Pepton ............................... 10,0gLactoz ................................ 10,0gBil....................................... 20,0gVerde briliant ................... 0,0133gAp ...................... pn la 1000mlpH=7,2; la temperatura de 25C (dup sterilizare)

Se dizolv componentele sau mediul comercial n ap, nclzind dac este nevoie. Se ajusteaz pH-ul dac este nevoie. Se repartizeaz cte 10 ml de mediu n eprubete mici (16mm x 160mm), cu tub Durham. Se sterilizeaz n autoclav la 121C, timp de 15 minute. Tuburile Durham nu trebuie s conin bule de aer

laborator microbiologie speciala 2010-2011 imapa

Documents