Diagnosticul bacteriologic al infectiilor determinate de bacterii patogene din Familia Neisseriaceae

Definitie: - coci rotunzi, Gram (-), dispusi in perechi, cu fetele adiacente aplatizate (aspect

caracteristic „in boabe de cafea”, „reniformi”), tetrade, gramezi,- oxidaza-, catalaza- pozitivi, - imobili,- nesporulati,- speciile patogene prezinta capsula,- sunt germeni pretentiosi nutritiv,- se dezvolta optim la 35°C- 37°C, in atmosfera imbogatita cu CO2 (5-10%).

Familia Neisseriaceae cuprinde genurile:- Neisseria,- Moraxella, - Kingella,- Eikinella,

Propunere pentru noul Manual Bergey de Bacteriologie (taxonomie):Familia Moraxellaceae: - Branhamella catarrhalis,

- Acinetobacter.

Habitat si Implicatii in patologie: Cele mai multe specii de Neisseria sunt comensale: colonizeaza mucoasa orofaringiana si nasofaringiana, in special la adulti si copii. Speciile comensale pot determina infectii cu localizari diverse la pacientii imunodeficienti (meningite, osteomielite, celulite, artrite, conjunctivite, pneumonii, septicemii). Genul Neisseria- implicatii in patologia umana:Neisseria meningitidis si Neisseria gonorrhoeae sunt specii strict parazite pentru om.

1. Neisseria meningitidis: are ca habitat mucoasa cailor aeriene superioare si se transmite aerogen.

- local determina rino-faringite,- in conditii de imunodepresie, N. meningitidis difuzeaza in sange, determina

bacteriemii cu localizari secundare meningeale,- meningita meningococica se manifesta prin forme controlabile prin tratament

antibiotic corect, rapid si tintit, sau imbraca forme deosebit de grave, fulminante (sindromul Waterhouse- Friedrichsen/ CIDD- coagulare intravasculara diseminata).

- Portajul naso- faringian reprezinta sursa epidemica majora, si punctul de plecare al mecanismului de producere a meningitei.

1

2. Neisseria gonorrhoeae: este foarte agresiva pentru orice fel de mucoasa: genitala, rectala, faringiana, conjunctivala,

- determina infectii acute, localizate cu tendinta invaziva tisulara si, apoi, sistemica. Netratate, infectiile gonococice evolueaza spre cronicizare cu fibroze.- La barbat: uretrita acuta, epididimita,- La femeie: endocervicita, boala inflamatorie pelvina (salpingita, metrita,

pelviperitonita), infectii gonococice diseminate (eruptie cutanata, artrite, meningita, endocardita)

- La nou- nascut: conjunctivita, endoftalmita.

Diagnosticul de laborator:1. Infectii determinate de Neisseria meningitidis:

a) Recoltare:- In meningitele meningococice se recolteaza LCR: 3-5 mL, inainte de administrarea de

antibiotice ar fi ideal,- Transport imediat la laborator, ferit de variatii de temperatura si lumina (se transporta

la temperatura corpului/ 37°C),- Uneori se recomanda insamantarea LCR la patul bolnavului, imediat dupa punctia

lombara, cu transportul rapid al mediilor de cultura la laborator,- Sange (hemocultura): volum 3-5 mL la copil, 10 mL/ flacon de hemocultura la adult,- Exudat nazal si faringian (important pentru determinarea punctului de plecare a

infectiei, precum si la purtatori- contacti pentru stabilirea sursei de infectie, utile in ancheta epidemiologica).

- Medii de conservare si transport: Stuart si Amies (tampoane nazo-faringiene) b)Examen macroscopic: aprecierea aspectului macroscopic (LCR opalin, tulbure, purulent), c) Examen microscopic direct: - numaratoare elemente/ mmcub (camera de numarat Fuchs – Rosenthal (se foloseste LCR brut, in diferite dilutii, in functie de gradul de opacitate),- se centrifugheaza restul de LCR (20 min la 3500 rotatii) si din sediment se efectueaza frotiuri (Gram, Giemsa) si insamantari pe medii de cultura (geloza- sange berbec si geloza chocolat),- din supernatant de determina prezenta antigenelor bacteriene solubile (Neisseria meningitidis, Str pneumoniae, Haemophilus influenzae, Str. agalactiae/ grup B). * Latex aglutinarea si coaglutinarea: detectia rapida direct din supernatant LCR, inactivat prin fierbere, a antigenelor solubile de N. meningitidis, serogrup A, B, C, Y, W 135. Rezultatul pozitiv al uneia dintre reactii impreuna cu aspectul microscopic al frotiului colorat Gram, permite medicului inceperea de urgenta a tratamentul antibiotic, inainte de obtinerea culturilor.

2

- Examen microscopic: frotiuri colorate Gram si Giemsa sau albastru de metilen (aspectul celularitatii): prezenti coci Gram (-), rotunzi, in diplo, fete adiacente aplatizate, „in boabe de cafea”, „reniformi”, intra si extra- leucocitari, frecvente PMN. Prezenta leucocitelor pledeaza pentru un prognostic favorabil. Examinarea frotiurilor dureaza aprox 10 minute, deoarece, in meningita meningococica, frotiul este sarac in germeni.

d) Izolarea: - Medii de cultura imbogatite: geloza Columbia sau geloza BHI (brain, heart infusion)- sange berbec 7- 10%, geloza chocolat, pentru prelevate normal sterile (LCR, sange, lichide de punctie),

- mediul Thayer Martin, NY, selective, cu adaos de antibiotice, pentru insamantare exudate nazale si faringiene (prelevate pluribacteriene).- incubare la 37°C,atmosfera de 5- 10% CO2, umiditate 50%, timp de 24- 48 ore,- incubare in sistem automat de detectie (BacT/ALERT, BACTEC): in flacoane uz pediatric (1-3 mL sange sau LCR, la copii) sau flacoane Standard aerobe- anaerobe (pacienti care nu au primit tratament cu antibiotice), FAN aerobe- anaerobe (pacienti deja tratati), in care se inoculeaza 10 ml sange/ flacon sau 3-5 mL LCR/ flacon. e) Identificarea: - Neisseriile sunt bacterii strict aerobe; N. meningitidis necesita pentru izolare atmosfera imbogatita cu CO2 5-10%, - Pe mediile de izolare, N. meningitidis se dezvolta sub forma de colonii gri, translucide, nepigmentate, convexe, lucioase, tip „S”. Grupurile A si C, incapsulate au aspect mucoid. - Identificarea coloniilor se bazeaza pe aspectul macroscopic al acestora, aspectul microscopic si pe testele oxidazei (test pozitiv) si catalazei (test pozitiv).

3

* Testul oxidazei: pe suprafata coloniilor suspecte se depune o picatura de solutie apoasa 1% de tetrametilen- p- parafenilendiamina preparata extemporaneu. Testul este pozitiv daca coloniile devin roz, rosu purpuriu, apoi se innegresc in 10 sec. Testul poate fi efectuat si prin depunerea coloniilor pe hartie de filtru impregnata cu acelasi reactiv. Aparitia unei culori violet intens, in 3-10 sec, indica pozitivitatea testului. * Testul de fermentare a zaharurilor: - Coloniile suspecte se repica in sectoare pentru obtinerea de cultura pura, in cantitate suficienta pentru inoculare pe medii solide, inclinate ce contin zaharuri 1% (glucoza, maltoza, lactoza, zaharoza), ser de cal 10%, indicator de pH. Tuburile cu zaharuri se incubeaza in atmosfera CO2, timp de 20 ore. Meningococul fermenteaza glucoza si maltoza fara producere de gaz, si nu fermenteaza lactoza si zaharoza.

* Relativ recent, pentru diferentierea speciilor de Neisseria au fost introduse teste bazate pe substraturi cromogene. Trei dintre acestea, ß- galactozidaza (ONPG), γ- glutamiltransferaza (GGT) si hidroxiprolin- aminopeptidaza (HPAP) au fost preluate si in unele galerii comerciale de microteste:

Testul Neisseria meningitidis

Neisseria gonorrhoeae

Moraxella catarrhalis

ONPG - - -

GGT + - -

HPAP - + -

* Sisteme comerciale de identificare biochimica: bazate pe caractere exoenzimatice (VITEC/ bioMerieux, Micro Scan etc).* Identificare antigenica: determinarea grupului antigenic al meningococilor este o metoda curenta efectuata prin reactia de aglutinare, ori variante ale acesteia, reactiile de coaglutinare

4

si latexaglutinare. Sunt cunoscute in prezent 12 grupe antigenice ale meningococilor: A, B, C, W135, Y etc. Peste 95% din izolatele europene apartin grupelor B, C, A si Y. In functie de aglutinarea cu antiseruri de grup, tulpinile de meningococi pot fi:- grup aglutinabile: pot fi incadrate intr-un grup definit, - poliaglutinabile: aglutineaza cu mai multe seruri,- neaglutinabile: nu aglutineaza cu niciun ser. * Tipizarea meningococilor: Tipizarea antigenica vizeaza antigene polizaharidice, proteice si lipopolizaharidice.- antigenele polizaharidice determina serogrupele,- antigenele proteice sau antigenele de membrana externa (OMP- Outer Membrane Proteins) determina tipurile si subtipurile de meningococi,- antigenele lipopolizaharidice determina imunotipurile (8 clase diferite de LPS/ lipopolizaharid = 8 imunotipuri).* Antibiotipia (sensibilitatea la antibiotice): meningococii au pastrat in general sensibilitatea la penicilina. Tulpinile de meningococ producatoare de penicilinaza sunt rare, de aceea, rezistenta la penicilina a meningococilor ramane un marker epidemiologic cu capacitate discriminatorie buna.

2. Diagnostic bacteriologic al infectiilor produse de Neisseria gonorhoeae:a) Recoltarea:- produsul patologic este reprezentat de secretii exudative de la nivelul mucoaselor

inflamate: aspect purulent, cremoase, opace, tenta galbuie.- La femei se recolteaza secretie endocervicala, de catre ginecolog. Se recolteaza din

endocol cel putin 2 tampoane: unul pentru frotiuri si unul pentru insamantare.- La barbati se recolteaza secretie uretrala: dimineata, inainte de urinare, sau la cel putin

1 ora dupa ce pacientul a urinat. In uretritele gonococice secretiile sunt abundente, iar recoltarea se face cu tamponul sau cu ansa.

- Nou- nascutii ai caror mame au infectie gonococica pot face la nastere oftalmie gonococica, ce trebuie tratata imediat deoarece duce la orbire. La nastere se practica profilaxie cu penicilina sau azotat de argint (Protargol). Recoltarea secretiilor conjunctivale se face cu tamponul steril din unghiul intern al ochiului si fundul de sac conjunctival.

b) Transportul probelor: pentru ca gonococii sunt foarte sensibili la conditiile mediului extern, si se gasesc in numar mic in prelevatele patologice, se recomanda insamantarea direct dupa recoltare.

- Daca insamantarea imediata nu este posibila, se utilizeaza medii de conservae si transport Stuart si Amies.

c) Examen macroscopic: secretii purulente, de culoare galbuie si consistenta specifice.d) Examen microscopic direct al produsului patologic: etapa foarte importanta in

diagnosticul infectiilor gonococice. Frotiurile se coloreaza Gram. - in uretritele acute la barbati, sensibilitatea de diagnostic microscopic este de peste

95%; in multe laboratoare diagnosticul se opreste aici, renuntandu-se la izolarea gonococului.

- Pe frotiu se vede un numar f. mare de PMN care contin diplococi Gram (-), dispusi in diplo („in boabe de cafea”). In uretritele cronice cultivarea gonococului este obligatorie, interpretarea frotiului Gram fiind ingreunata de flora de asociatie, de data aceasta f. abundenta.

- La femei, examenul microscopic direct din colul uterin, ca metoda de diagnostic, are o sensibilitate de doar 50-70%. Pe frotiu se vad frecvente PMN, diplococi

5

caracteristiciintracelulari, dar interpretarea frotiului este ingreunata de flora polimorfa vaginala. Cultura este si in acest caz, obligatorie.

e) Izolarea: Neisseria gonorrhoeae este un germen foarte pretentios. Izolarea se face pe mediul geloza- chocolat. Pentru prelevate pluribacteriene se recomanda mediul HYL, cu adaos de antibiotice (vancomicina, colistin, nistatin).

- Incubarea la 35-37°C, in conditii de aerobioza, cu adaos de 5% CO2, atmosfera umeda., timp de 24-48 ore.

f) Identificarea:- caractere culturale: colonii mici, 0,5- 1mm diametru, translucide, gri, lucioase,

margini netede, convexe (tip „S”). Din prelevatele clinice se izoleaza intre 1 si 5 tipuri de colonii (T1- T5), tinere, lucioase, reflecta lumina, care, dupa repicare, devin mai opace, nu reflecta lumina.

- Caractere microscopice: coci Gram (-) dispusi in diplo, „boabe de cafea”, „reniformi”,

- Caractere biochimice, exoenzimatice: Testul catalazei pozitiv, Testul oxidazei pozitiv, Fermentarea zaharurilor (gonococul fermenteaza doar glucoza),

Degradare cromogena a unui substrat, pe baza enzimelor elaborate de gonococ (HPAP),

Kituri comerciale de diagnostic in sistem automat (API, VITEC), Caractere antigenice: teste care au la baza reactii antigen- anticorp

(latex- aglutinare, coaglutinare, imunofluorescenta).- Sensibilitatea la antibiotice: s-au semnalat tot mai multe tulpini producatoare de

penicilinaza.Tratamentul in astfel de situatii se face cu spectinomicina (aminoglicozid cu spectru ingust, specific pentru gonococ).

- In ultimul timp circula tulpini rezistente la tetraciclina si eritromicina, asadar, este importanta antibiogama difuzimetrica si cantitativa (valori CMI/ E-test). Rezultatele terapeutice cele mai bune se obtin cu cefalosporine generatia a III-a si fluoroquinolone.

6

3. Branhamella catarrhalis:- coci Gram negativi, comensal al cailor respiratorii superioare, ce poate determina la

om angine, otite medii, sinuzite, pneumonii, bronhopneumonii (pe fond de imunodepresie post- gripala, rujeola, tuse convulsiva).

- Diagnostic: importanta majora o are frotiul colorat Gram din sputa, aspirat bronsic, secretii traheo- bronsice: coci Gram (-) dispusi in diplo, gramezi, intra si extra- leucocitari, mucus, fibrina. Izolarea se face pe geloza sange si geloza chocolat, dupa incubare 24-48 ore, la 37°C, in atmosfera imbogatita cu 3-5% CO2, umiditate.

- Identificarea: colonii lucioase, gri, rotunde, 3-5 mm diametru. Examenul microscopic din coloniile caracteristice confirma prezenta cocilor Gram negativi in diplo.

- Testele oxidazei si catalazei: pozitive, ca si la neisserii,- Nu fermenteaza zaharurile (G-, L-, M-, Z-), - DNA-aza : (+),- Este beta- lactamazo- producatoare,- Singurul coc Gram (-), oxidazo- catalazo- (+), betalactamazoprducator izolat din

secretii otice, sinusale, tract respirator superior si inferior este Branhamella catarrhalis.

7