capitolul i-iv

Ecotoxicologie

Maria Prisecaru, Roxana Voicu

Capitolul 1 CONSIDERAII GENERALE

1.1.

NOIUNEA DE TOXIC ; RELAIILE TOXICULUI CU ORGANISMUL VIU I MEDIUL NCONJURTOR

Istoria toxicologiei arat cu prisosin locul i contribuia deosebit a acestei tiine n viaa contemporan. n prezent, toxicologia nu se limiteaz la studiul toxicilor consacrai, deoarece numeroase substane, folosite n cele mai variate domenii ale activitii umane, n aparent nenocive, pot deveni potenial toxice, aspect dovedit pe msura perfecionrii mijloacelor de investigaie. n prezent situaia n toxicologie poate fi privit sub mai multe aspecte: a) CARACTERIZAREA TOXICULUI. n toxicologia clasic se pleca de la toxic, cutnd s se acumuleze date i probe. Treptat s-au considerat urmtoarele puncte de vedere: Analitic: la nceputul toxicologiei tiinifice, ctre mijlocul secolului XIX, n cadrul medicinei legale, cteva otrviri celebre (cazurile Lafarge, Bocarne etc) au artat marea dificultate a identificrii i dozrii unui toxic n produse biologice. Ulterior aportul metodelor chimice, chimico-fizice i fizice, a fost considerabil i continu s se lrgeasc i n prezent. n plus, se practic tot mai mult, n vederea stabilirii unui diagnostic, aplicarea mai multor sisteme analitice (spectrfotometrie, U.V., cromatografie, reacii chimice sensibile, microscopie etc), ca i a unor metodologii tot mai elaborate. Sensibilitatea i specificitatea metodelor toxicologice este esenial n probleme de poluarea a mediului, din cauza complexitii frecvente a acesteia; este ns adesea dificil s se identifice totalitatea componenilor unei atmosfere i cu att mai mult s se dozeze. Biologic: cunoaterea toxicului a condus la elucidarea i interpretarea localizrii, acumulrii, metabolizrii i eliminrii sale, ca i la studierea compoziiei materiei vii. S-a conturat astfel toxicologia metabolic sau xenologia, domeniul toxicologiei care studiaz procesele fiziologice i biochimice de transformare a substanelor strine, naintea ajungerii lor la celule sau puncte de impact pe care le-ar putea leza, precum i citotoxicologia care studiaz modificrile specifice generate de diferite toxine la nivel celular i subcelular, ca i consecinele acestora asupra organismului. Studiul relaiilor reciproce dintre toxic, organism i mediu, ca i aciunea agresiv a substanelor toxice asupra mediului, constituie domeniul ecotoxicologiei. Experimental: acest studiu este indispensabil oricrei tiine. Iniial s-a practicat n special observarea aspectelor histologice pe animale de experien. Ulterior s-a trecut la studiul funciilor diferitelor organe. Progresul tehnic a condus i n acest domeniu la rezultate remarcabile (microscopia electronic). b) RELAIILE DINTRE TOXIC I ORGANISMUL VIU Mai nti este necesar s se aprecieze c nu exist un compus toxic n sine: toxicitatea se exprim prin rspunsul dat de organismul viu cu care vine n contact. Se consider c orice molecul instabil termodinamic la o temperatur superioar temperaturii absolute, poate manifesta efecte toxice n anumite condiii. Toate organismele vii se afl n echilibrustabil cu mediul nconjurtor. Acest echilibru este rezultanta a dou fore contradictorii: o for entropic tinde s fac s dispar individul prin egalizarea energiilor (conform celui de-al doilea principiu al termodinamicii), iar alt for, metabolismul, const dimpotriv, s menin diferenierea necesar fa de mediu. Din acest punct de vedere, se pot defini, n sens larg:

5

Ecotoxicologie


Toxic orice factor care are tendina s rup echilibru ntre un individ i mediul nconjurtor; factorul poate fi de natur chimic, fizic sau chiar psihic; Medicament poate fi considerat, din contra orice factor capabil s readuc la normal situaia perturbat. Efectul toxic trebuie privit n raport cu organul, celula sau molecula int. Este necesar de asemenea cunoaterea importanei intei fa de organism n ntregime, cci lanurile biosintetice sunt strns legate ntre ele. Explorarea unor astfel de organisme reprezint desigur tehnica viitorului care deja se ntrezrete. n decursul timpurilor, cnd individul a ajuns n conflict cu mediul a avut mai multe soluii: lupta, fuga sau adaptarea. Adaptarea la condiiile de mediu a fost dintotdeauna preferat de organismele vii, ns adaptarea reuete atunci cnd factorul de mediu nu variaz mai repede dect timpul necesar adaptrii biologice. n fine, n cazul substanelor cancerigene, exist o acumulare a efectelor, nct urmele aciunii nocive persist chiar atunci cnd toxicul a disprut. c) RELAIILE DINTRE TOXIC I MEDIUL NCONJURTOR n prezent comportarea toxicilor n mediu i n special la nivelul lanurilor alimentare este o preocupare general i major. Toxicologia clasic se preocup n deosebi de toxic. Toxicologia modern i-a lrgit enorm sfera de aciune. Dintr-o tiin descriptiv apoi preventiv, toxicologia a devenit n prezent selectiv, ca urmare,s-a dezvoltat o ramur a toxicologiei ecotoxicologia care prin studiul ei tinde s elimine sau cel puin s controleze ceea ce este duntor n mediul nconjurtor pentru organismul uman (dar i animal, vegetal) fr a crea, pe ct posibil, un dezechilibru ecologic. Prin urmare, pe plan practic, toxicologia este o tiin care amelioreaz calitatea vieii umane, iar pe plan teoretic, ncearc s modifice comportarea unei celule (protozoar, bacterie sau chiar receptor fiziologic afectat) fr a afecta alte celule sau receptori fiziologici.

1.2.

TOXIC, TOXICITATE, DOZ n accepiunea curent prin toxic se definete acel produs care are proprietatea ca, ptruns n organismul viu, indiferent de cale i de mod de administrare, s provoace de la o anumit doz, prin procesele fizico-chimice pe care le declaneaz, perturbri funcionale i de structur care genereaz o stare patologic numit intoxicaie. Substana sau produsul cu propriti agresive asupra organismului viu poart denumirea de toxic (etimologic provenind de la taxon, arc cu sgei otrvite) sau otrav de la termenul slavon otraviti care nseamn a amr viaa cuiva). Imensul numr de substane i produse existente n prezent care sunt capabile s provoace intoxicaii a dus la ncadrarea lor sistematic pe diverse criterii de clasificare: dup origine (minerali, vegetali, animali, organici de sintez sau semisintez, etc), dup starea de agregare (gazoi, volatili, lichizi, solizi), dup simptomele principale (convulsivani, asfixiani, halucinogeni, stimuleni, depresivi, etc), dup leziunile anatomo-patologice (leziuni locale, postresorbie, leziuni specifice, nespecifice, etc), dup domeniul de utilizare (toxici industriali, casnici, de origine medicamentoas, din sectorul agricol, etc). Intoxicaiile sunt i ele clasificate n: accidentale i intenionale (sinuciderile, inclusiv toxicomaniile, omuciderile). Din punct de vedere al intensitii cu care se manifest, de desfurarea lor n timp limitat i n raport direct cu doza de toxic, intoxicaiile se mai clasific n: acute (cu formele supra-acut i sub-acut) i cronice. Toxicitatea este o caracteristic aparte a unor produi, diferit de proprietile lor curente (stare fizic, culoare, constante fizico-chimice, etc); ea reprezint o comportare biochimic a substanei fa de un organism viu i este condiionat de o serie de factori prioritari, ca de exemplu: a) de organismul asupra cruia acioneaz (om, pasre, animal, etc);

6

Ecotoxicologie b) de doza ptruns n organism; c) de unii factori care modific gradul de toxicitate.


a) Organismul asupra cruia acioneaz produsul. Reacia biochimic rezultat din aciunea asupra organismului viu este, n unele situaii, legat de specia respectiv: de exemplu sunt substane foarte toxice pentru om i practic netoxice pentru alte vieuitoare (psrile mnnc cantarida care este foarte toxic pentru om; unele ierbivore pasc plante foarte toxice pentru om, ca de exemplu, digitala, mtrguna, convalaria). n cealalt extrem sunt substanele deosebit de toxice pentru unele specii i practic netoxice pentru om (de exemplu, diverse insecticide de uz casnic - gospodresc). b) Doza ptruns n organism. Cantitatea de produs care acioneaz asupra organismului este cea care, n general, determin prin ea nsi efectul toxic. Pe linie de protecie antitoxic sau stabilit de-a lungul anilor att cantitile de produs nepericuloase pentru organisme, inclusiv cel uman, cr i cele care produc o stare patologic. Deci, doza reprezint relaia dintre cantitate i efect. Aciunea asupra organismului poate fi, n cazul medicamentelor, terapeutic sau toxic; de aici i cele dou tipuri de doze cu referire la medicaie: - doza maxim pentru o dat; - doza maxim pentru 24 de ore. (tot n sector terapeutic mai apare i doza de atac i doza de ntreinere, aplicat la medicaia prelungit). Efectele toxice cu sfrit letal pentru toate substanele cu potenial toxic se exprim prin aprecierea cantitativ a unei doze minime (DML = doza minim letal) capabile s provoace moartea unei persoane adulte. Prin DML se nelege deci cantitatea minim de toxic care administrat n doz mic poate provoca moartea unei persoane adulte. Aceast doz a fost stabilit, de obicei, prin extrapolarea la om a dozelor rezultate din studii experimentale pe animale care se apropie de reactivitatea organismului uman. Doza experimental se exprim prin DL50 (doza letal medie) i reprezint cantitatea de toxic, exprimat n g/kg corp animal, care provoac, la administrare n doz unic, moartea ntr-un timp determinat, a 50% din animalele unui lot pe care se practic determinarea toxicitii acelei substane. n funcie de valoarea DL50 i DML este apreciat i gradul de toxicitate al unei substane, ncadrnd-o din acest punct de vedere n diverse grupe. Astfel s-au elaborat diverse moduri de ncadrare a acestei toxiciti, unele exemplificate n tabelele 1, 2 i 3. Tabelul 1. Gradul de toxicitate i relaiile cantitative ntre dozele toxice la animal i la om (dup THIENES - HALVEY) Doza posibil mortal la om DL50/g/kg animal Gradul de toxicitate (70kg) sub 0,001 Toxic foarte periculos cteva centigrame 0,001 - 0,01 Toxic puternic 0,20 - 1g 0,01 - 0,05 Toxicitate marcat 1 - 5g 0,05 - 0,5 Toxicitate apreciabil 5 - 20g 0,5 - 5 Toxicitate redus 20 - 200g 5 - 15 Toxic slab peste 200g

7

Ecotoxicologie


Tabelul 2. Gradul de toxicitate n funcie de DL50 (dup HODGE i STEANER) Categoria de toxice DL50 la obolan, per os Substane Extrem de toxice Sub 1 mg/kg Alcaloizi Foarte toxice 1 - 50 mg/kg Derivai organo-fosforici, organo-mercuriali, de arsen Moderat toxice 50 - 500 mg/kg Metale grele Slab toxice 500 - 5000 mg/kg Ni, Fe, aditivi alimentari, colorani Practic netoxice 5000 - 15000 mg/kg Unii acizi organici, NaCl Relativ fr nici un efect peste 15000 mg/kg Substane alimentare Tabelul 3. Gradul de toxicitate al unor pesticide (dup normele internaionale n vigoare) Nr. grupei de Denumirea gradului de DL50 la obolan toxicitate toxicitate (mg/kg-corp) Grupa I Produse extrem de toxice sub 50 Grupa II Produse puternic toxice 50 - 200 Grupa III Produse moderat toxice 200 - 1000 Grupa IV Produse cu toxicitate redus peste 1000 Ca un criteriu orientativ de stabilire a toxicitii unor medicamente se apreciaz de unii autori c DML este de circa 10 ori mai mare dect doza maxim terapeutic. Precizm c aceste valori de DML se refer la indivizii aduli (se exclud extremele copiii i btrnii), n greutate corporal medie (circa 70 kg), netrarai fizic. Pentru stabilirea DML la copii s-au propus o serie de tabele i formele bazate pe vrst sau pe greutate corporal. De exemplu, Jane propune formula: V DML la copii = -------- x DML adult V+12 n care V = vrsta copilului Ca o consecin a polurii mediului prin procese tehnologice i de chimizare i pentru a se evita riscurile unor intoxicaii prin expuneri repetate la anumite substane s-au stabilit n timp concentraii maxime admise din aceste substane cu caracter agresiv asupra vieii, ca de exemplu: - CMA (concentraia maxim admis) pentru ape, exprimat n mg/dm3; - CMA (concentraia maxim admis) pentru aer, exprimat n mg/m3. Din analiza cazurilor de intoxicaie, provocate mai ales pe cale respiratorie, s-au stabilit i concentraiile capabile s provoace moartea. Numeroase tabele cuprind astfel de concentraii i doze legate de toxicitatea substanelor (prezentate n partea special). c) Factorii care modific toxicitatea. Toxicitatea prin faptul c reprezint nu o caracteristic fizico-chimic a toxicului sau a substanei, ci a comportare biochimic fa de organismul viu, poate suferi modificri legate de diveri factori dependeni att de substan n sime ct i de organismul asupra cruia i exercit aciuna; de asemenea, aceast toxicitate este legat i de relaia toxic organism (subcap. 2.5). 1.3.POLUAREA I DEZECHILIBRELE ECOLOGICE N NATUR Poluarea reprezint alturi de dezvoltarea tehnologic i demografic, cauza major a crizei ecologice mondiale care se manifest n prezent, concretizat prin alterarea ecosistemelor naturale terestre i acvatice, scderea ngrijortoare a resurselor. n ansamblul lor, aceti factori au modificat profund raportul dinte om i natur. Poluarea sau alterarea mediului natural are un caracter istoric, fiind determinat de numeroase cauze, de origine natural i antropic, avnd consecine reduse (poluri locale) sau

8

Ecotoxicologie


mai extinse (poluri regionale, continentale) sau chiar planetare. Pn la dezvoltarea civilizaiei industriale din secolul al -XIX lea perturbrile ecosistemelor naturale erau puin importante, iar poluarea cu excepia celei de origine microbian inexistent. Industrializarea a determinat progresiv tulburri n desfurarea fluxurilor de energie i a ciclurilor substanelor n natur, explicat prin creterea deosebit a consumului de energie folosit (petrol, crbuni, gaze naturale) i mai recent folosirea materialelor radioactive. Producerea intens de energie a fost i este nsoit de eliminarea n ecosistemele naturale a unui numr considerabil de poluani foarte toxici i nebiodegradabili care contamineaz n multe cazuri ireversibil ecosistemele naturale. Interveniile omului asupra naturii s-au amplificat pe msura progresului i a revoluiilor tehnice. Voina uman a introdus mecanismul de control i reglare, care au dus la o artificializare a condiiilor naturale, afectnd solul, apele, atmosfera ct i speciile vegetale i animale. Consecinele biologice i ecologice ale polurii sunt foarte complexe, afectnd calitatea sau distrugnd mediul natural i echilibrul biologic. 1.3.1. Poluarea mediului terestru O important cauz a polurii solului este aplicarea n practica agricol a pesticidelor i ngrmintelor chimice. Pesticidele cuprind numeroi compui organici de sintez destinai luptei contra paraziilor animali sau vegetali care atac culturile (insecticide, fungicide, erbicide etc). Dintre insecticide, compuii organoclorurai ca: lindan, dieldrin, DDT etc., sunt poluani puternici deoarece, fiind puin sau deloc biodegradabili, se acumuleaz direct n ecosisteme. Administrarea pesticidelor contamineaz direct solurile cultivate i indirect lanurile trofice. Concentraiile insecticidelor organoclorurate cresc odat cu creterea pe vertical a nivelurilor trofice. mprtierea pesticidelor este nsoit i de trecerea lor n atmosfer i n ape, iar prin curenii atmosferici pot contamina solurile aflate la mii de Km distan. ngrmintele chimice utilizate ca fertilizani n agricultur, mai ales azotai, fosfai i sruri de potasiu reprezint o surs de poluare, datorit impuritilor toxice pe care le conin (arsenic, cadmiu, mercur) i care trec din sol n plante. Poluarea radioactiv a solului se poate produce ca urmare a irigrii culturilor cu ape contaminate radioactiv. Utilizarea necorespunztoare a apei la irigarea terenurilor agricole, asociat cu o evaporare foarte mare, urmat de acumularea de sruri n straturile superficiale ale solului, a dus la distrugerea prin salinizare a unor vaste suprafee de terenuri irigate, mai ales n rile cu climat arid (China, Egipt, Irak etc). Exploatarea forestier masiv a dus la distrugerea unor suprafee imense de pduri. n prezent, dup datele culese prin satelii, suprafaa pdurilor defriate depete 200.000 Km/an, afectnd mai ales pdurile tropicale pluviale, pdurile mediteraneene i pdurile boreale de conifere (taigaua). Lemnul obinut n urma defririlor era folosit drept combustibil, n construcii, mobil. De exemplu n rile srace terenurile rezultate n urma defririlor sunt transformate n puni pentru creterea excesiv a animalelor i de asemenea pentru culturi agricole. n felul acesta sunt practic epuizate, degradate. Incendiile accidentale sau provocate constituie o alt cauz a distrugerii solului, cu implicaii asupra ciclului apei i prin aceasta asupra climei. Eroziunea hidric i eolian, ct i alunecrile de teren sunt consecine nefaste ale defririlor. Activitatea uman, prin punat i supraexploatarea resurselor naturale duce la degradarea solurilor i ecosistemelor, antrennd o mpuinare a vegetaiei i naintarea deertului (deertificare). 1.3.2. Poluarea atmosferic Dezvoltarea civilizaiei industriale a dus la amplificarea fenomenului de poluare a atmosferei care a devenit un fenomen global. Asistm la extinderea rapid a polurii din zonele industrializate spre cele mai ndeprtate zone considerate pn nu demult nepoluate.

9

Ecotoxicologie


n parcul naional Smoky Montain (SUA), departe de zonele industrializate, cea groas ntlnit frecvent nu este un fenomen natural, ea conine numeroase particule n suspensie precum i sulfai provenii din arderea conbustibililor fosili n zonele urbane. Ceaa arctic din Alaska conine particule i gaze identice cu cele din atmosfer marilor orae americane. n timpul sezonului ploios sau n timpul primverii boreale, acest val de poluare deosebit de gros acoper zonele polare i subarctice pe suprafee imense. Atmosfera cuprinde mai multe zone care se succed n altitudine i n care presiunea descrete progresiv: troposfera, stratosfera, mezosfera, termosfera i exosfera. Primele dou straturi prezint un interes deosebit din punct de vedere al circulaiei i dispersiei poluanilor. Troposfera este ptura cea mai joas a atmosferei, se extinde pn la altitudinea de 815 km i cuprinde circa 80-90% din masa gazelor din atmosfer. Temperatura scade progresiv i rapid ajungnd la -600C la limita superioar a troposferei numit topopauz, situat la 9 km la poli, 15 km la ecuator. Stratosfera se ntinde de la nivelul tropopauzei pn la altitudinea de 35-50 km, aerul este rarefiat, iar temperatura atinge -800C, chiar la 18 km deasupra regiunilor ecuatoriale. n stratosfer ozonul are concentraii foarte ridicate formnd ptura sau ecranul de ozon. Concentraia maxim a ozonului n stratosfer este atins la 30 de km n regiunea ecuatorial i la 18 km n regiunea polilor. Cantitatea de vapori de ap din stratosfer este foarte mic, datorit temperaturilor sczute la aceast altitudine. n atmosfer compoziia chimic a aerului este relativ constant fiind format din azot (78,01%), oxigen (20,95%), argon (0,93%), bioxid de carbon (0,032%) i alte gaze (0,08%). Tabelul 4. Principalii poluani ai atmosferei i sursele lor de emisie (dup Ramade, 1992) Natura poluantului Sursa de emisie 1. GAZE Vulcanism, respiraie, combustibil solizi 1.1. Bioxid de carbon 1.2. Monoxid de carbon Vulcanism, motoare cu ardere intern 1.3. Hidrocarburi Plante, bacterii, motoare cu ardere intern 1.4. Compui organici Industria chimic, incineratoare de gunoaie, bacterii, combustibili solizi 1.5. Derivai de azot Bacterii, diferite combustii 1.6. Radionuclizi Centrale atomice, explozii nucleare 2. PARTICULE SOLIDE Vulcanism, eroziune colian, activitate 2.1. Metale grele i compui minerali industrial, motoare cu ardere intern 2.2. Compui organici naturali i de Incendiide pdure, industria chimic, sintez incineratoare de gunoaie, pesticide 2.3. Radionuclizi Explozii nucleare Compoziia atmosferei prezint schimbri care se datoresc pulberilor i gazelor provenite din erupiile vulcanice (poluare natural), ct i din activitile umane. n ultimele decenii s-a produs o cretere a concentraiei gazelor legate de utilizarea combustibililor fosili (crbuni, petrol, gaze naturale) sau de combustia biomasei vegetale. Efectele polurii atmosferei se manifest adeseori pe teritoriul altor ri, situate la mari deprtri de locul unde s-a produs poluarea. n felul acesta, se poate spune c poluarea atmosferei nu are frontiere, ci funcioneaz la scar planetar. Ca urmare a activitii industriale, a nclzirii imobilelor i a transporturilor auto rezult n orae o concentrare a poluanilor atmosferici. Aceti poluani, reprezentai mai ales prin oxizi de carbon, de sulf i de azot au un efect toxic asupra organismelor i degradeaz construciile prin coroziunea prilor metalice i prin maladia pietrei sub efectul apei de ploaie poluate. Poluarea atmosferei din orae se amplific n anumite situaii: absena vnturilor i inversiunile termice care favorizeaz stagnarea gazelor toxice i mpiedic circulaia liber a aerului.

10

Ecotoxicologie


Prin circulaia aerului, poluanii atmosferici sunt transportai la mare distan de locul polurii i pot reveni la sol ignornd frontierele administrative, sub forma ploilor acide coninnd n special acid sulfuric i acid azotic. n acest fel, anumite ri devin exportatoare a polurii acide, n timp ce altele devin importatoare, de exemplu Scandinavia import poluarea provenind din zonele industriale ale Germaniei, Angliei, Poloniei. Creterea folosirii combustibililor fosili n ultimele decenii este cauza apariiei ploilor acide, cu consecine ecologice grave: acidifierea apelor continentale, urmat de scderea i chiar dispariia organismelor acvatice, degenerescena pdurilor, degradarea monumentelor istorice etc. Deosebit de important este poluarea radioactiv artificial, care rezult din diferite activiti industriale, militare i medicale. Elementele radioactive difer prin cantitatea, energia i natura radiaiilor emise, ct i prin timpul de njumtire a nucleilor radioactivi. Unele elemente radioactive se acumuleaz n organisme i se concentreaz n lanurile trofice. Astfel, stroniu 90, analog calciului, este fixat n esutul osos, iar cesium 137, analog potasiului, este fixat n muchi, avnd grave consecine biologice i genetice prin producerea de mutaii. Catastrofa nuclear de la Cernobl (Ucraina) din 26 aprilie 1986 a dus la eliminarea n atmosfer a unui nor radioactiv coninnd iod i cesium radioactiv, care ndreptndu-se spre vest nord vest a fcut de cteva ori nconjurul emisferei nordice. Au fost contaminate radioactiv atmosfera, solul i ecosistemele naturale. O problem ecologic planetar, aprut tot prin activiti antropice se refer la creterea temperaturii medii globale prin creterea concentraiei gazelor de ser. Acestea sunt reprezentate de Co2, metan, oxid de azot, precum i vapori de ap. Aceste gaze au o aciune de absorbie a radiaiilor infraroii calorice, pe care le reflect spre suprafaa pmntului, amplificnd efectul de ser prezent n condiii naturale. Astfel, dac la nceputul secolului al XIX concentraia CO2 n atmosfer era estimat la 270 p.p.m., n anul 1990 concentraia acestui gaz a fost de 354 p.p.m. Acest fenomen reprezint o perturbare global a ciclului carbonului, indus de consumul crescut de combustibili fosili, petrol i gaze naturale n activitile industriale. Se apreciaz c o dublare a coninutului n CO2 duce la creterea cu 2,80C pn la mijlocul secolului XIX, cu perturbri n regimul de precipitaii, creterea nivelului mrii cu cca. 1,20 m prin topirea parial a calotelor glaciare, cu distrugeri n ecosistemele naturale i umane i consecine socio-economice grave. De asemenea s-a constatat o cretere impresionant a metanului care absoarbe de 20-30 ori mai mult cldur dect CO2. Acest gaz rezult i din intensificarea culturilor de orez care reprezint culturi inundate i ca produs al fermentaiei ruminale la animalele rumegtoare. Protoxidul de azot rezultat prin utilizarea fertilizanilor minerali n agricultur, rmne activ n atmosfer timp de 180 de ani. Pe lng aceti compui naturali, din activitile exclusiv umane se elimin compui de sintez care amplific efectul de ser. Astfel, freonul sau clorofluorocarbonul (CFC) este un gaz utilizat la refrigeratoare, n industria materiilor plastice i la spray-urile cu aerosoli cosmetici. Acest gaz are o durat de existen de cca. 400 de ani i absoarbe de 2000 de ori mai mult cldur dect CO2. CFC prin disociere elimin atomi de clor, care se combin cu ozonul stratosferic pe care l disociaz. Ozonul formeaz un strat de cca. 3 mm grosime, situat la 25 Km altitudine i are capacitatea de a reine o parte din radiaiile UV solare, nocive pentru biosfer. Ozonul este un component natural al atmosferei, aflat n concentraii cuprinse ntre 15 ppb deasupra zonelor de deert i 200 3000 ppb deasupra regiunilor muntoase. Concetraia lui crete odat cu altitudinea, atingnd maximum n stratosfer la 18 km n regiunea polilor i 30 km n regiunea ecuatorial. n atmosfera marilor orae poluate cu smog fotochimic s-a pus n eviden creterea concentraiei de ozon n toposfer pn la 1 ppm, cu efecte negative asupra organismelor vegetale i animale. n ultimii 50 de ani se constat o scdere cu circa 30% a cantitii de ozon din stratosfer (Rudler, 1986) iar n zona Antarcticii, n perioada primverii australe, chiar o reducere cu 50% (Stolarski, 1988).

11

Ecotoxicologie


Cauzele reducerii stratului de ozon din atmosfer par a fi ridicarea oxizilor de azot provenii din combustie, industrie i agricultur i a freonilor la altitudini de 25-50 km, urmat de reducerea ozonului la oxigen molecular prin diferite reacii. NO + O2 NO2+O2rad. UV

CFClx -----> FClx-1 + Cl-1 Cl- + O3 ClO + O2 ClO + O-2 O2 + ClLanul se repet i fiecare ion Cl- face s dispar din atmosfer circa 100.000 molecule de O3. nclzirea atmosferei i deteriorarea stratului de ozon afecteaz ecosistemele naturale i umanitatea n ansamblul ei. Fiind probleme ecologice la scar planetar, rezolvarea acestora nu poate fi rezolvat dect la nivel mondial. 1.3.3. Poluarea apelor Apele dulci de suprafa (lacuri i ape curgtoare) i subterane freatice cuprind un volum ce reprezint 0,01% din rezerva de ap a lumii. Sunt folosite n scopuri domestice, industriale i agricole. Poluarea apelor dulci se produce cnd este depit capacitatea de autopurificare sau autoepurare n condiii naturale. Ca i aerul, calitatea resurselor de ap este o problem global. Omul prin activitile sale, intervine ca factor ecologic, accelernd i amplificnd fenomenul de poluare natural. Deversarea n mediul acvatic a reziduurilor menajere umane, ct i cele rezultate din activitile industriale, agricole modific parametrii privind calitatea apei. Tipurile de poluare care amplific gradul de poluare a apelor ca urmare a activitilor umane sunt grupate n: - poluare cu pesticide; - poluare cu fertilizani (azotai, fosfai); - poluare cu detergeni (ageni tensioactivi); - poluare cu metale i metaloide toxice (mercur, plumb, aluminiu, arsenic etc); - poluare microbiologic (cu bacterii, virusuri enterice, ciuperci etc); - poluare cu hidrocarburi (petrol brut care produce mareea neagr i derivai din industria petrolier); - poluare termic, prin eliminarea apelor calde de la centralele electrice; - poluare radioactiv cu izotopi rezultai de la instalaii nucleare. Poluarea apelor produce schimbri profunde n repartiia speciilor, o nmulire a plantelor acvatice, n special algelor microscopice (fenomenul de nflorire a apelor), urmat de dispariia prin asfixiere a vieii vegetale i animale. n mediile acvatice nchise (lacuri, heletee) are loc oxigenarea lent, iar mbogirea apei prin aport de substane organice determin fenomenul de eutrofizare, caracterizate prin proliferarea plantelor acvatice. Acest fenomen natural este accelerat considerabil de om, prin deversarea n mediul acvatic a substanelor acvatice i a reziduurilor bogate n azotai i fosfai. Aceast eutrofizare accelerat prin activitile umane este cunoscut sub denumirea de distrofizare. n aceste condiii se nmulesc excesiv algele microscopice i filamentoase la suprafa; descompunerea aerob a substanelor organice duce la consumarea oxigenului dizolvat la fundul apei. Lipsa oxigenului i apariia fermentaiilor anaerobe duc la degajarea de amoniac (NH3) i hidrogen sulfurat (H2S), iar organismele vii dispar progresiv. 1.3.4. Efectul substanelor nocive de origine antropic asupra organismului viu n mediul natural sunt prezente substane chimice, ntr-o concentraie diferit, compui naturali sau rezultai n urma activitilor antropice. Substanele chimice produse ca urmare a unor procese naturale, s-au pstrat n limite normale, dar apariia de noi compui (xenobiote),

12

Ecotoxicologie


precum i a unei distribuii de compui peste limit, supun mediul natural la presiuni actuale i poteniale. n prezent s-au identificat 10.000.000 de compui chimici naturali i artificiali, din care 6.000.000 au fost sintetizate, cele mai multe n secolul al XX-lea. Anual se sintetizeaz aproximativ 1.000 de noi compui chimici, dintre care 200 300 primesc ntrebuinri practice. n prezent se comercializeaz pe piaa mondial aproximativ 100.000 substane chimice, iar producia mondial de chimicale este de aproximativ 400 milioane tone (R, Lngren, 1992). Aceste substane apar n mediul nconjurtor fie prin: - aplicare direct: utilizarea pesticidelor n agricultur; - prin evacuare direct: courile de evacuare industrial, termocentralele, metalurgia, consumul casnic, emanaiile depozitelor de deeuri, incineratoarele, etc. Transportul natural al substanelor chimice determin o dispersie n ecosisteme, astfel substanele nocive se acumuleaz i n alte compartimente ale mediului dect n cele n care s-a produs eliberarea iniial. Mare parte din substanele chimice evacuate sunt transportate prin procese de degradare biotic i abiotic n compui chimici netoxici, dar unele pot suferi transformri, producnd substane cu un potenial toxic mai ridicat dect n situaia iniial (exemplu: metilmercurul rezultat din metilarea biologic a mercurului); altele prin bioacumulare, n lanurile trofice, realizeaz o mare concentraie toxic pentru ultima verig (prdtorii de vrf) sau pot conduce la expuneri pe termen lung ale organismelor. Efectele substanelor nocive asupra mediului nu sunt cunoscute n totalitate, se tie foarte puin despre cile de trasnport n mediu i efectele ecotoxicologice. Pn n 1960 evacuarea riscurilor substanelor nocive aborda doar efectele asupra oamenilor, cele asupra mediului fiind tratate sumar, ignorndu-se capacitatea sa limitat de asimilare. Foarte puin se tia i despre bioacumularea unor substane chimice n lanul trofic i consecinele acestora asupra funcionrii ecosistemelor. Prezena substanelor chimice i impactul lor asupra mediului determin: schimbri climatice, diminuarea stratului de ozon, diminuarea biodiversitii, acidifierea i eutrofizarea cursurilor de ap. Dispersia substanelor nocive n mediu Tendina substanelor nocive de a migra de la locul de producere i penetrare n mediul nconjurtor asupra tuturor compartimentelor acestuia poart numele de dispersie. Aceasta se produce prin transport n atmosfer, n cadrul circuitului hidrologic, transport biologic, activiti umane de transport. Dispersia depinde de proprietile chimice ale substanei, precum: volatilitatea, punctul de nghe, de topire, solubilitate n ap, capacitate de absorbie. Persistena Rezistena substanelor pentru un anumit interval temporal, n starea iniial ptrunderii n mediul natural, fr a fi modificat de procesele fizice, chimice, biologice, poart denumirea de persisten. Exist dou tipuri de persisten: urmrit atunci cand substana chimic atinge o persisten optim, ce i permite pstrarea calitii atta timp ct este ntrebuinat, apoi fiind degradat n compui netoxici (exemplu: detergenii biodegradabili dup folosire sunt deversai n apele naturale i sunt degradai). Se urmrete i realizarea unei persistene ndelungate. nedorit persistena proprietilor substanelor chimice i manifestarea acestora asupra elementelor de mediu pentru un interval mai lung de timp (exemplu: DDT). Timpul de njumtire biologic, reprezint timpul necesar degradrii unei jumti din cantitatea de substan ce a penetrat mediul nconjurtor, n urma unor procese fizice, chimice i

13

Ecotoxicologie


biologice. Substanele persistente se njumtesc n ani, iar cele nepersistente n sptmni, zile i chiar ore. Bioacumularea Creterea concentraiei unui toxic n organismul viu, ajungnd la un nivel superior dect concentraia substanei toxice n mediul nconjurtor poart numele de bioacumulare. Bioacumularea presupune ptrunderea toxinelor prin aerul respirat, hran i penetrare tegumentar n organism i apoi spre organele int, stocate temporar, metabolizate, o parte din ele neutralizate i eliminate n mod diferit de la specie la specie. Compuii toxici acumulai n organism, prezint o rat de ptrundere i de stocare mai mare dect rata de metabolizare i excreie. Bioconcentrarea reprezint un proces specific bioacumulrii prin care concentraia toxicului din organism devine mai mare dect cea din mediul nconjurtor. Acest termen se refer la substanele ecosistemului acvatic i reprezint ptrunderea toxicului prin branhii i tegument. Un alt aspect n procesul de bioacumulare l reprezint biomagnificarea animalele din vrful piramidei trofice concentreaz cantiti mai mari cu multe ordine de mrime fa de primele verigi ale lanurilor trofice sau productorii primari. n urma biomagnificrii, efecte se pot evidenia prin modificri de comportament, afectarea funciilor reproducerii sau pot fi letale. Etapele procesului de bioacumulare Omul i toate celelalte animale acumuleaz zilnic substane precum: vitamine (K, A, etc), aminoacizi, oligoelemente etc, ns pentru toxicologie de mare interes sunt acele substane ce pot cauza dereglri metabolice ale organismului. Intrrile reprezint nceputul procesului de bioacumulare, atunci cnd substana toxic a penetrat celulele organismului, prsind mediul nconjurtor, dup ce a fost eliberat aici de ctre o surs origine. Fenomenul este, nc, neelucidat. Substanele chimice se difuzeaz pasiv din zonele ce au o concentraie mai ridicat spre cele ce au o concentraie sczut. Fora sau presiunea de difuzie este numit potenial chimic (R, Mihilescu, 2001), acesta fiind sub influena unor factori (exemplu: unele chimicale nu se amestec cu apa fiind hidrofobe; altele tind s migreze din mediul extracelular n celulele esuturilor). Stocarea factorii ce introduc substanele n interiorul organismului, ngreuneaz rentoarcerea lor n mediul exterior. O parte din ele sunt dirijate spre anumite inte, stocate temporar i dizolvate n grsime sau legarea de proteine. n contextul unui ritm de intrare lent sau dac substana nu este reinut n celule, organismul o poate elimina. Compuii cu solubilitate mare n ap prezint un potenial sczut de bioacumulare, fiind mai greu absorbii de organism. Dac totui ptrund n organism sunt ndeprtai, excepia o reprezint celulele ce posed un mecanism specific de reinere a lor (metalele precum mercurul, cadmiul, cobaltul i alte substane solubile n mediul apos). Substanele lipofile ptrund n celulele organismului prin membranele celulare mai uor dect cele hidrosolubile. Dup ptrunderea n organism, ele trec prin sistemele de membranare ajungnd n esutul gras unde se acumuleaz. Stocarea toxicelor liposolubile n depozitele de grsime reprezint o detoxifiere temporar, protejnd, astfel, organele mai sensibile la toxicitate. Prin mobilizarea rezervelor de grsime (slbire), substanele stocate sunt reintroduse n circuitul metabolic i ncep s produc efecte toxice. Eliminarea se face prin metabolizare i excreie. Bioacumularea stare a echilibrului dinamic n timpul unei expuneri constante la substanele toxice se poate stabili un echilibru dinamic ntre cantitile de toxine ce au intrat i cele care prsesc organismul. Dac va crete concentraia din mediu va crete i concentraia din organism, ajungndu-se la un nou echilibru. O expunere pe durate mari la concentraii ridicate de toxine poate depi capacitatea organismului de aprare. Numai printr-o izolare de mediul toxic, exist posibilitatea eliminrii totale a toxinelor acumulate.

14

Ecotoxicologie


Factorii care afecteaz bioacumularea: rata de eliminare crescut reduce bioacumularea, respectiv una sczut, ce favorizeaz acumularea; durata de expunere influeneaz cantitile de substane ce ptrund n organism i rata de acumulare; caracteristicile speciilor indivizii longevivi i grai, speciile cu metabolism sczut vor acumula o cantitate mai mare de toxine fa de organismele de talie mic i via scurt (pstrvul de lac salmo trutta acumuleaz mai mult dect porcuorul Cotus gabio). Putem concluziona: ntre expunerea organismului i procesele de intrare, metabolizare, stocare, eliminare, exist un echilibru. O bioacumulare mare depinde de concentraia toxicului n mediu, de cantitatea ptruns n organism i de timpul de stocare, degradare i eliminare a toxicului. Proprietile toxicului (solubilitatea) afecteaz intrarea i stocarea n organism. De o mare importan este i capacitatea organismului de a metaboliza i excreta toxicul. Evaluarea riscului toxicologic Evaluarea severitii ameninri fiecrui chimical i a condiiilor de utilizare se numete evaluarea riscului, aceasta se poate realiza pe baza: evalurii relaiei doz-rspuns; evaluarea expunerii (efecte negative asociate cu un nivel particular de expunere) Impactul substanelor chimice nocive Substanele chimice care ptrund n esuturile corpului uman, pot cauza rniri, pierdute ale funcionalitii, modificri ale structurilor, pot afecta sistemul reproductor, nervos i imunitar, pot genera efecte mutagene, chiar efecte letale. Efectele pot afecta un individ sau pot afecta populaii ntregi, chiar cu efecte asupra generaiilor viitoare. Aceste substane nu afecteaz doar asupra oamenilor ci i asupra florei, faunei, afectnd echilibrul mediului. Ele pot avea efecte letale pentru unele specii, pot reduce capacitatea de supravieuire a altor specii sau se pot acumula n lanurile trofice. Unele substane pot cauza efecte globale: freonii, bioxidul de carbon i metanul, ce creaz efectul de ser. 1.3.5. Dispariia speciilor plante i animale Studierea evoluiei i diversitii speciilor (biodiversitatea) la scar geologic a artat c au existat dispariii masive de-a lungul timpului (ex. trilobiii, amoniii, dinozaurieni etc.). Cu toate acestea, prin aciunile umane s-a produs n ultimele decenii creterea ritmului extinciei sau dispariiei speciilor. Pe aceast linie menionm aciunile directe ale omului, cum ar fi prelevrile excesive prin vntoare i pescuit, modificarea mediului prin defriri, poluarea ecosistemelor, distrugerea habitatelor naturale prin urbanizare, ci de comunicaie, turism. Introducerea necontrolat a speciilor de ctre om n anumite medii naturale a dus indirect la regresia sau dispariia unei pri din flora sau fauna indigen.

15

Ecotoxicologie


Capitolul II CIRCUITUL SUBSTANELOR EXOGENE N ORGANISM2.1. TRANSPORTUL PRIN MEMBRANELE BIOLOGICE Orice ptrundere din mediul exterior n interiorul organismului implic un schimb transmembranar. Prin urmare substanele exogene (toxici, medicamente, aditivi alimentari, poluani) trebuie s traverseze una sau mai multe membrane biologice nainte de a ajunge la centrii activi. Astfel, toxicii ptruni pe cale oral strbat mucoasele tractului gastro-intestinal; toxicii gazoi i volatili trec din aerul inhalant prin mucoasa cilor respiratorii; unii toxici aplicai pe tegumente sau mucoase traverseaz straturile lor superficiale. Traversarea membranelor este condiionat de: natura chimic i organizarea moleculelor constitutive ale membranei; proprietile fizico-chimice ale toxicului, structura fizico-chimic ale moleculelor mediului de o parte i de cealalt a membranei. 2.1.1. Definiia i clasificarea membranelor celulare Membranele celulare reprezint structuri complexe ce delimiteaz i compartimenteaz coninutul celular. Arhitectura tuturor membranelor celulare (membrana plasmatic i membranele organitelor) prezint drept caracteristic comun asamblarea prin legturi necovalente a biomoleculelor componente (lipide i proteine) ntr-o structur dinamic i fluid. Elementul structural fundamental al membranelor celulare, dublul strat lipidic, definete modul de organizare al lipidelor i se comport ca o barier impenetrabil pentru majoritatea membranelor hidrofile (aqua-solubile). Proteinele membranare, asociate dublului strat lipidic, asigur funcionalitatea membranelor, ele fiind implicate n multiple procese: - transportul molecular i ionic transmembranar; - realizarea conexiunilor intercelulare i a ancorrii celulelor n matricea extracelular; - desfurarea reaciilor enzimatice asociate structurilor membranare; - controlul fluxului de informaie dintre celul i mediul nconjurtor prin recunoaterea, legarea i transmiterea moleculelor-semnal; - imunitatea celular. Grefarea seturilor distincte de proteine n dublul strat lipidic, ct i stabilirea unui anumit raport ntre principalele molecule componente conduc la clasificarea membranelor celulare n trei tipuri: a) Membrana citoplasmatic (membrana plasmatic, plasmalena) este o structur bidimensional continu (grosimea 6-10nm), cu proprieti caracteristice de permeabilitate selectiv, ce confer individualitate celulei, separnd-o de mediul nconjurtor. b) Membranele interne ale celulelor eucariote (grosimea 6nm) compartimenteaz spaiul intracelular, delimiteaz organitele celulare (nucleu, reticul endoplasmatic, aparat Golgi, mitocondrii, lizozomi, peroxizomi), crend astfel spaii adecvate reaciilor enzimatice celulare. c) Membranele speciale prezint particulariti structurale, n aceast categorie ncadrndu-se:

16

Ecotoxicologie -


teaca de mielin, o structur multimembranar derivat din membrana plasmatic a celulelor Schwann ce nconjoar i izoleaz axonul celulelor nervoase; discurile suprapuse localizate n regiunea extern a celulelor fotoreceptoare din retin.

Fig. 1. Structura inframicroscopic a celulei 1-membrana celular; 2-endoplasma (hialoplasma); 3-ergastoplasm; a-reea endoplasmatic (membrane cu dublu contur); b-granulaii fine (microzomi); 4-filamente intracelulare (descoperite n celule epiteliale, fibroblati, n celule nervoase); 5-vacuol; 6-granule lipidice; 7-centrul celular; 8-centrosfer; 9-nucleu; c-membrana nucleului; d-pori n membrana nucleului; 10-nucleol; 11-aparatul Golgi; 12-mitocondrii 2.1.2. Organizarea membranelor celulare n prezent se bucur de acceptare evasiunanim modelul n mozaic fluid lipido-proteic elaborat n 1971-1972 de ctre Singer i Nicolson care satisface condiiile de stabilitate termodinamic ale sistemelor membranare. Elementele care l-au impus constau pe de o parte n confirmarea dublului strat lipidic ca element fundamental al structurii membranelor i pe de alt parte, n definirea modului de asamblare a proteinelor n dublul strat lipidic. Autorii concep membrana celular ca pe un fluid structurat alctuit dintr-un bistrat lipidic aflat ntr-o stare de cristal lichid i care este penetrat local sau parial de proteine globulare cu caracter insular (fig. 2). Lipidele i proteinele membranare, relativ libere prezint mobilitate n planul membranei executnd micri de difuziune i rotaie n jurul propriilor axe. La componentele de baz ale

17

Ecotoxicologie


membranelor lipidele i proteinele se adaug constant carbohidraii, apa i o serie de ioni. Pe partea citoplasmatic membrana este susinut (n numeroase cazuri) de o reea de proteine fibrilare ce constituie un schelet.

Fig. 2. Structura unei membrane biologice (Stryr, 1991) a i b = proteine periferice de membran; c = protein de membran (tip lectinic): traverseaz bistratul lipidic; d = protein de membran (tip Ig): traverseaz bistratul lipidic Modelul mozaicului fluid ofer cadrul conceptual adecvat pentru explicarea att a funciilor de transport, ct i a plasticitii conformaionale a celulelor, a proceselor imunologice i a efectelor produse asupra membranelor de diferii ageni chimici (hormoni, mediatori chimici, medicamente, toxine, etc). Membranele biologice au structuri fluide dinamice n continu modificare; n fiecare moment, proteinele i lipidele din structura membranelor sunt nlocuite cu altele noi. Ribozomii i reticulul endoplasmic care sintetizeaz aceste proteine de membran nzestreaz aceste proteine cu capacitatea de a se ndrepta spre anumite inte ctre anumite sedii celulare (transport vectorial). n celula vie, sinteza de membrane se face prin extensia membranelor preexistente (pattern-uri de membran) n cursul procesului de multiplicare celular (mitoza sau meioza), cnd celula mam transmite celor dou celule fiice, o dat cu zestrea celular i o anumit zestre de membran. Aceast motenire a pattern-urilor de membran de ctre celulele fiice de la celula mam reprezint un aspect al continuitii n timp i spaiu a sistemului de membrane. Aceste aspecte de continuitate asigur de fapt continuitatea de funcionare a celulei i, implicit, desfurarea normal a metabolismului celular. S-a dovedit c toate moleculele proteice din structurile de membrane vegetale sau animale au via relativ scurt, fiind nlocuite mai rapid (rapid turnover) sau mai puin rapid (slow turnover). Din acest aspect reiese c orice tip de membran biologic are o continuitate de organizare, dar nu i continuitate de substan, deoarece din stratul proteic sunt nlocuite n permanen un numr de molecule de aminoacizi vechi cu molecule noi corespunztoare, dei funcia respectivei proteine rmne n permanen nemodificat. 2.1.2.1. Caracterizarea componentelor lipidice ale membranelor celulare Lipidele membranare formeaz un dublu strat cu grosimea de 4 5 nm: un strat extern, orientat spre faa extern a membranei i un strat intern, orientat spre faa intern citoplasmatic a membranei. Lipidele sunt molecule insolubile n ap, dar nalt solubile n solveni organici (cloroform). ntr-un m2 de dublu strat lipidic se gsesc 5 x 106 molecule lipidice. Dei compoziia lipidic a diferitelor membrane variaz mult, fosfolipidele, colesterolul i glicolipidele

18

Ecotoxicologie


reprezint clasele de lipide cel mai frecvent ntlnite n structura membranelor biologice (tabelul 5). Tabelul 5. Procent din greutatea moleculara total a lipidelor membranare Membrana Membrana Membrana Membrana plasmatic a Teaca de extern i Lipide plasmatic a reticulului celulei mielin intern a eritrocitului endoplasmic hepatice mitocondriei Colesterol 17 23 22 3 6 Fosfolipide 54 60 42 76 67 Glicolipide 7 3 28 urme urme Alte lipide 22 13 8 21 27 Bistraturile lipidice membranare sunt formate din fosfo- i glicolipide, ele reprezentnd bariere de permeabilitate pentru moleculele hidrosolubile, dei straturile sunt aproape fluide. Aceste lipide de membran sunt amfipatice , conin un cap hidrofilic care are o varietate de structur relativ mic i poart sarcini electrice i o coad hidrofob, format din 12 24 atomi de carbon, lipsit de sarcini electrice i cu o mare varietate de structur care se datoreaz unor acizi grai deosebii.Acizii grai pot fi saturai sau nesaturai,ei difer cantitativ i calitativ n raport cu specia,vrsta,condiiile de via etc.Cu ct gradul de nesaturare al acizilor este mai mare, cu att fluiditatea structurilor membranare este mai mare. Datorit acestui caracter amfipatic, lipidele, n mediu lichid, pot forma: - micelii (fig. 3a) - strat dublu linear (fig. 3b) - strat dublu circular (lipozomi, fig. 3c).

Fig. 3. Cele trei forme pe care le pot lua moleculele de lipide n mediu lichid datorit proprietilor lor amfipatice n acest strat dublu, capul hidrofilic este orientat spre exterior, iar coada hidrofob este orientat spre interior. Moleculele de lipide se deplaseaz foarte rapid rotindu-se n jurul propriului lor ax i difuznd lateral, n acest fel asigurnd fluiditate de membran. Fluiditatea este asigurat de prezena acizilor grai i a colesterolului. La eucariote, proporia fosfolipide / colesterol n membrana plasmatic este de 1/1, colesterolul aflndu-se la extremitatea hidrofil, prevenind scderea fluiditii membranelor. Procesul de formare a acestui bistrat lipidic n mediu apos este un proces de autoasamblare, rolul major avndu-l fora de interaciune hidrofob (interaciune necovalent). Straturile bilipidice sunt nalt impermeabile pentru ioni i pentru cele mai multe molecule polare (cu excepia apei, care traverseaz foarte rapid aceast membran). Pentru traversarea stratului bilipidic, bstratificat, o molecul necesit o cantitate foarte mare de energie.

19

Ecotoxicologie


2.1.2.2. Componenta proteic a membranelor celulare n stratul lipidic plutesc proteine rigide hidrofobe. Proteinele reprezint 50% din volumul de membran. n timp de lipidele au rol de barier de permeabilitate i de delimitare a componentelor biologice, proteinele mediaz aproape toate funciile, de exemplu, proteinele din membrana plasmatic au rol de pompe n transportul transmembranar, receptori, enzime, antigene de membran, iar proteinele din membrana intern a mitocondriilor i cloroplastelor au rol de transductori de energie. Membranele care ndeplinesc funcii diferite conin n structura lor i proteine diferite. Proteinele pot fi inserate n dublul strat lipidic n diferite moduri; acestea ptrund adnc sau chiar traverseaz stratul de lipide al membranei, numindu-se proteine integrale sau intrinseci (tip Ig), altele pot fi implantate la nivelul unui singur strat din cele dou ale membranei lipidice (tip lecitinic) iar altele pot fi ataate doar covalent (adsorbite) la extremitatea polar hidrofil a lipidele i se numesc periferice sau extrinseci. Proteinele sunt amfipatice, coninnd o regiune hidrofob care reacioneaz cu regiunea hidrofil lipidic (din interiorul stratului lipidic) i o regiune hidrofil situat la suprafaa intern i respectiv extern a membranei. n acest fel cele dou suprafee de membran difer ntre ele prin cantitatea de lipide i proteine, realiznd o asimetrie funcional. n regiunea transmembranar, proteinele de membran conin predominant regiuni hidrofobe cu structur secundar tip -helix i structuri teriare i cuaternare compacte. Proteinele de membran pot forma pete difuze, se pot deplasa spre polii celulei unde sunt eliminate sau pot fi blocate n micarea lor lateral, rmnnd fixe n plan orizontal (formnd agregate care se ancoreaz de alte structuri ale citosolului sau de proteine din membranele celulare vecine). Proteinele periferice (extrinseci) pot fi eliberate prin simpla splare cu soluii saline sau prin modificri de pH (de exemplu, spectrina, localizat pe suprafaa citoplasmei eritrocitelor, sau actina, cu rol n contracia muscular). Proteinele integrale (intrinseci) interacioneaz strns cu hidrocarbonaii din lipidele de membran i nu pot fi disociate dect n prezena detergenilor i a solvenilor organici. 2.1.2.3. Mobilitatea lipidelor i proteinelor de membran Lipidele i proteinele de membran difuzeaz rapid n planul membranar, avnd o micare lateral constant, ceea ce face ca o membran biologic s nu fie o structur rigid. Proteinele prezint numai difuziune lateral; lipsa difuziei transverse face posibil pstrarea timp ndelungat a asimetriei de membran. O molecul lipidic poate cltori de la un capt la altul al celulei bacteriene n timp de o secund. Unele proteine de membran difuzeaz n timp de un minut la distan de civa microni; alte proteine (rodopsina) sunt la fel de mobile ca i lipidele, altele sunt virtual imobile (fibronectina). Lipidele prezint difuziune lateral micare paralel cu planul bistratului (difuziune n planul membranei) sau transvers (tip fleep - flop), adic rotaie spontan a moleculei lipidice de pe o fa a membranei pe cealalt. Este un proces foarte lent. Se produce o rotaie la cteva ore (de exemplu, fosfolipide, urmrite prin tehnica de rezonan magnetic). Pe baza datelor prezentate se poate considera c att fluiditatea dublului strat lipidic, ct i liber deplasare a lipidelor i proteinelor n structurile membranare, constituie principalele elemente ce stau la baza caracterului dinamic al membranelor celulare. 2.1.2.4. Carbohidraii componeni minori ai membranelor celulare Carbohidraii se ntlnesc pe suprafaa tuturor membranelor plasmatice ale celulelor eucariote i reprezint 2 10% din greutatea componentelor membranare. Carbohidraii, sub forma oligo- i polizaharidelor se leag covalent de proteine i lipide formnd glicoproteinele

20

Ecotoxicologie


i respectiv, glicolipidele. Dac majoritate proteinelor aflate pe suprafaa celular sunt glicoproteine, numai una din 10 molecule lipidice ale monostratului extern conine carbohidrai. Carbohidraii se ntlnesc i n structura proteoglicanilor, molecule membranare integrale alctuite din lanuri polizaharidice lungi legate de un miez proteic. Proteina din structura proteoglicanilor traverseaz dublul strat lipidic, n timp ce lanurile polizaharidice rmn n afara celulei, constituind parte component a matrixului extracelular. Zaharurile sunt foare hidrolitice, ele prefer s se orienteze spre suprafaa apoas a membranei (i nu spre miezul hidrofob), deoarece orientarea invers ar cere un consum foarte mare de energie; deci absena respectivei cantiti de energie reprezint o barier puternic n calea rotirii de tip fleep-flop a moleculei de hidrocarbonat. Hidrocarbonaii de pe suprafaa celular au o mare densitate de structur i au rol n recunoaterea intercelular (fa de celulele sistemului imunitar). Structurile de glicoproteine au funcie de receptori ele primesc informaia din mediul extern i o transmit spre interiorul celulei sub forma unor cascade de reacii biochimice, care au drept consecin modificri ale activitii celulare (activitatea secretorie, de multiplicare, etc). 2.1.2.5. Glicocalixul Suprafaa celular este alctuit din trei elemente: cortexul celular (zona periferic citoplasmei), membrana plasmatic i glicocalixul. Glicolixul reprezint zona periferic de la suprafaa celulei animale. n structura sa intr att lanurile oligo- i poliglucidice ale glicolipidelor i glioproteinelor membranare, ct i glicoproteine sintetizate de celul i apoi absorbite pe suprafaa celular (Fig. 4). Faptul c ultimele dou componente ale glicocalixului sunt n acelai timp i elemente ale matricei extracelulare face dificil stabilirea unei linii clare de demarcai ntre suprafaa celular i matrice Rolul glicocalixului nu este pe deplin elucidat. Concentraia mare de oligozaharide complexe la suprafaa celular poate sprijini ipoteza implicrii acestei structuri n procese de recunoatere celul-celul sau celul-matrice. De asemenea, majoritatea lanurilor oligozaharidice conin unul sau mai multe reziduuri de acid sialic, molecul cu sarcin electric negativ. Glicocalixul realizeaz, deci distribuia sarcinilor electrice pe suprafaa celulei. n plus, datorit ncrcrii electrice negative, glicocalixul poate funciona ca depozit de cationi (Ca2+) ce sunt mobilizai n celul n funcie de necesitile exprimate la un moment dat.

Fig. 4. Prezentarea schematic a glicocalixului 2.1.2.6. Apa Apa deine un loc important n structura membranar alturi de celelalte componente chimice.Se gsete n proporie de 30-40 % asociat intim fiestructurilor de la suprafa,fie sub form foarte ordonat,structural asemntoare gheii (apa legat chimic ).ntr-o astfel de

21

Ecotoxicologie


stare,apa joac un rol precumpnitor n procesele de organizare molecular a membranei,intervenind n stabilitatea structurilor proteice i fosfolipidice bistratificate,ca un liant. Permeabilitatea selectiv poate fi privit ca fiind n raport cu apa structuralizat din membran.Modificrile de permeabilitate determinate de procesul de excitaie poate fi consecina topirii structurii hidrice n anumite regiuni. 2.1.2.7. Asimetria distribuiei componentelor membranare Imaginea membranei celulare ca o soluie lipidic n care plutesc moleculele proteice pare, astzi, simplist. n multe celule proteinele i lipidele sunt meninute n regiuni bine delimitate ale membranelor. Distribuia asimetric a moleculelor membranare joac un rol esenial n realizarea funciilor celulare. Distribuia asimetric a compartimentului lipidic pe cele dou fee ale dublului strat lipidic a fost pus n eviden pentru prima dat n membranele eritrocitelor. Astfel, n timp ce n monostratul extern al membranei predomin fosfatidilcolina i sfingomielina, stratul intern conine fosfotidiletanolamina i fosfatidilserina drept componente lipidice majore. Deosebirile dintre aceste lipide nu se limiteaz doar la natura gruprilor polare, ea se refer i la gradul de nesaturare a lanurilor hidrocarbonate, ceea ce, n planul membranei, determin o fluiditate diferit a celor dou straturi lipidice. n acest context este de remarcat faptul c exist i o distribuie asimetric a sarcinilor electrice. Singurul fosfolipid cu sarcin electric negativ, fosfatidilserina, este localizat n monostratul intern al membranei eritrocitare. Implicaiile asimetriei lipidelor la nivel funcional nu sunt nc pe deplin cunoscute. Este posibil ca activitatea diferitelor proteine membranare s fie dependent de microclimatul creat prin prezena fosfolipidelor specifice. De asemenea, activitatea enzimatic a proteinelor asociate structurilor membranare poate fi condiionat de sarcina electric a fosfolipidelor. Localizarea glicolipidelor n monostratul extern al membranelor plasmatice, ct i caracterul lor specio- i esut specific sugereaz implicarea acestor molecule ca receptori n procesele de comunicare intercelular. n acelai timp, toate proteinele membranare integrale au o orientare strict n raport cu faa citoplasmatic i cea extern a membranei celulare. n plus, proteinele transmembranare sunt, n majoritate, molecule glicolizate. n membranele plasmatice lanurile oligozaharidice marcheaz faa exoplasmatic, n timp ce, n membranele organitelor celulare (reticul endoplasmatic, aparat Golgi) ele se gsesc pe faa citoplasmatic. Stricta orientare a glicoproteinelor este corelat cu funciile celor dou fee ale membranelor celulare. Moleculele proteice transmembranare ce conin cistein cunosc i ele o orientare strict. Mai mult, gruprile sulfhidril ale cisteinei formeaz puni disulfurice inter i/sau intra-catenare, doar pe fa extern a membranei. n anumite celule, distribuia asimetric a lipidelor i proteinelor conduce la delimitarea unor domenii specifice n membranele plasmatice. Astfel, membrana celulelor epiteliale este mprit n domenii distincte: apical i latero-bazal, ambele avnd un coninut proteic i lipidic diferit. Ca urmare, celulele epiteliale sunt capabile s mpiedice difuzia moleculelor membranare. Acest lucru se realizeaz prin intermediul jonciunilor strnse ce funcioneaz ca o barier ntre cele dou domenii membranare. 2.1.3. Mecanismele de transport prin membranele celulare Celula din punct de vedere termodinamic, este un sistem deschis, existena sa fiind condiionat de stabilirea unei permanente comunicri cu mediul nconjurtor. Abordnd aceast problem din perspectiva schimbului de substane pe care celula l realizeaz cu mediul extern, un rol major revine membranei plasmatice datorit caracteristicii sale fundamentale, permeabilitatea selectiv. Aceasta face posibil alimentarea celulei cu molecule eseniale (glucoz, aminoacizi, lipide) i eliminarea att a produilor fiziologic activi (enzime, hormoni), ct i a celor rezultai ca deeuri n urma metabolismului celular (CO2, sruri de amoniu,

22

Ecotoxicologie


uree). n paralel cu asigurarea continuitii acestor schimburi, permeabilitatea selectiv creeaz cadrul favorabil desfurrii unei activiti metabolice stabile, att prin meninerea n spaiul intracelular a unei concentraii relativ constante de substane organice, metabolii i electrolii, ct i prin reglarea volumului celular ca rezultat al relaiilor osmotice celul-mediu. Permeabilitatea selectiv se modific dinamic aflndu-se sub influena modificrilor mediului extracelular i a metabolismului celulei. Aceast caracteristic a membranelor celulare prezint particulariti n raport cu diferenierea funcional a celulelor. Selectivitatea difereniat se manifest att la trecerea substanelor din exterior n celul, ct i n sens invers. Deci, la baza noiunii de permeabilitate selectiv st conceptul de membran ca barier a schimburilor celulare. Traficul de substane ce se desfoar att prin membrana plasmatic, ct i prin membranele interne ce delimiteaz organitele celulare antreneaz diferite mecanisme de transport. 2.1.3.1. Procesul calitativ al traversrii membranelor Se consider c au loc urmtoarele etape (fig. 5): - molecula trebuie s avanseze n zona apoas (mediu i zona periferic a membranei), ceea ce se realizeaz dup legile difuziei simple n mediu apos. Fiecare molecul formeaz legturi de hidrogen cu apa din interiorul celulei. Agitaia termic a moleculelor asigur moleculei energia de activare necesar ruperii unor legturi de hidrogen, cu refacerea lor spontan i imediat. n momentul cnd molecula atinge stratul hidrofil al membranei, acesta, avnd coninut de ap apropiat de cel al mediului permite continuarea micrii libere a moleculei. Prin urmare, traversarea stratului exterior hidrofil se realizeaz fr consum de energie (fig. 5, poriunea a); - n etapa urmtoare, molecula trebuie s se desprind de stratul hidrofil i s treac n stratul lipofil, ceea ce necesit o energie de activare molecular (fig. 5, poriunea b). n raport cu caracteristicile moleculare, variaz i intensitatea energiei necesare pentru intrarea moleculei n stratul hidrofob; - continuarea difuziei n startul hidrofob nu reclam energie de activare suplimentar pentru c trebuie s se desfac legturi de hidrogen (fig. 5, poriunea c); - n fine, molecula prsete stratul hidrofob (fig. 5, poriunea d), fenomen facilitat de formarea legturilor de hidrogen cu moleculele de ap din stratul membranar proteic hidrofil interior, de unde trece prin acelai fenomen, n citoplasm (fig. 5, poriunea e).

Fig. 5. Modificrile energetice care nsoesc traversarea unei molecule hidrosolubile printr-o membran biologic (dup Maziliak) Se descriu urmtoarele posibiliti de traversare a unei membrane:

23

Ecotoxicologie -


proces pasiv: transfer pasiv, care asigur trecerea moleculelor mici hidrosolubile, inclusiv apa, prin simpla filtrare prin pori (filtrarea) i a moleculelor mari liposolubile prin dizolvare n membran (difuzia simpl); proces biochimic: transport specializat, fie activ, fie facilitat; proces biologic: endocitoz, cnd particulele de substan sunt nglobate de membrana celular prin micri de invaginare i transfer astfel spre interior.

2.1.3.2. Transportul ionilor i moleculelor mici prin membranele celulare Maniera n care substanele trec prin membranele celulare este determinat pe de o parte de caracteristicile substanelor (greutate molecular, dimensiuni, form, grad de hidratare (grad de ionizare) iar pe de alt parte, de compoziia chimic a membranelor. Principalul criteriu de clasificare a tipurilor de transport l reprezint dimensiunile substanelor ce strbat membrana. Astfel, n timp ce ionii i moleculele mici traverseaz dublul strat lipidic prin difuziune sau implicnd proteinele membranare, transportul macromoleculelor i al particulelor necesit sechestrarea lor n vezicule delimitate de membrane. Un alt criteriu de clasificare este consumul de energie metabolic sub form de ATP. Din acest punct de vedere se disting dou tipuri de transport: pasiv i activ. TRANSPORT PASIV Traversarea membranelor celulare de ctre molecule i ioni n sensul gradientului de concentraie sau electrochimic (compus din gradientul de concentraie i gradientul electric) poart numele de transport pasiv. Procesul nu implic consum de energie (ATP), dimpotriv, el decurge cu pierdere de energie liber. Unele gaze (O2, CO2) i unele molecule mici cu caracter hidrofob sunt capabile s strbat dublul strat lipidic membranar prin difuziune simpl. Transportul moleculelor solubile n ap (glucoz, nucleotide, amonoacizi) i al unor ioni (H+, K+, Na+, Ca2+) nu poate fi realizat n aceeai manier, necesitnd participarea unor proteine membranare specifice. Acest tip de transport este denumit difuziune facilitat. a1) Difuzia simpl Cel mai simplu tip de transport pasiv const n difuzia fizic a moleculelor determinat de gradientul lor de concentraie sau electrochimic. n difuzia simpl moleculele nu sunt modificate chimic sau asociate altor specii moleculare n timpul trecerii lor prin membran. Viteza cu care se desfoar etapa trecerii moleculelor din mediul apos extracelular/intracelular n interiorul hidrofob al membranei este dependent de coeficientul de partiie (K) al moleculei. Acesta msoar afinitatea relativ a moleculei pentru mediul lipidic n raport cu apa, ilustrnd gradul de hidrofobicitate al moleculei. Astfel, cu ct valoarea sa este mai mare, cu att molecula are un mai pronunat caracter hidrofob, deci, este mai liposolubil i ptrunde mai repede n celul. Se constat existena unei relaii de direct proporionalitate ntre coeficientul de partiie al unei molecule i constanta de permeabilitate (P) a membranei celulare. Datorit vscozitii dublului strat lipidic, viteza de difuziune a moleculei prin interiorul membranei este mult inferioar vitezei sale de difuziune printr-un mediu apos. n cazul transportului prin difuzie simpl a moleculelor fr sarcini electrice, se respect legea lui Fick. Aceasta enun c viteza de difuziune (dn/dt) a unei molecule este proporional cu diferena de concentraie, suprafaa (S) i coeficientul de permeabilitate (P). Deci viteza de difuziune a unei molecule prin membran coform legii lui Fick este:

(dn/dt)= PxS (C1aq C2aq)unde: S reprezint suprafaa membranei P este coeficientul de permeabilitate al membranei; C1aq, C2aq sunt concentraiile mediilor apoase separate de membrana celular. Difuzia simpl prin membranele celulare se realizeaz cu pierdere de energie liber. Calculele termodinamice demonstreaz c la deplasarea unui mol de substan fr sarcin

24

Ecotoxicologie


electric, de la o concentraie de 1M la o concentraie de 0,1M (la 250C) sistemul pierde o energie liber de 1,359 kcal/mol. n difuzia moleculelor ncrcate electric legea lui Fick nu mai are aplicabilitate, procesul fiind exclusiv determinat de gradientul electrochimic a2) Difuzia facilitat n procesul de difuziune facilitat, transportul pasiv al moleculelor prin membran este mediat de proteine membranare numite permeaze. Spre deosebire de difuzia simpl, difuzia facilitat se caracterizeaz prin specificitate fa de molecula transportat. Permeaza leag reversibil i complementar la un situs activ o singur specie molecular sau molecule aparinnd unei singure familii. n urma legturii ce are loc pe o fa a membranei se formeaz un complex molecul-permeaz ce traverseaz dublul strat lipidic, disociindu-se pe cealalt fa a membranei cu eliberarea moleculei transportate. Unul din modelele care au ncercat s explice maniera n care se desfoar difuzia facilitat este modelul transportorilor crui (carrier model). n acest model se consider c transportorul exercit o micare de navetare sau rotaie n dublul strat lipidic, fiind astfel capabil s treac molecula transportat de pe o fa pe alta a membranei celulare. Deoarece difuzia facilitat este un tip de transport pasiv, iar rotirea unei molecule proteice n planul membranei este defavorizat din punct de vedere energetic, modelul carrier rmne aplicabil numai pentru transportul anumitor ioni de ctre polipeptide antibiotice (de exemplu, transportul ionului de K+ de ctre valinomicin). Cea mai bine caracterizat permeaz D-gluco-permeaz (sau D-hexozo-permeaz) catalizeaz difuzia facilitat a glucozei prin membrana eritrocitelor (Fig. 6). D-gluco-permeaz este o protein transmembranar alctuit de 12 -helixuri care au n majoritate un caracter hidrofob. Are o greutate molecular de 45.000 Da.

Fig. 6. Mecanismul transportului mediat de D-gluco-permeaz n parte, permebilitatea selectiv a membranelor plasmatice poate fi explicit prin existena proteinelor canal. Aceste proteine transmembranare, strbtute de un canal delimitat de aminoacizi hidrofili, formeaz porii membranari. Proteinele canal specializate n transportul selectiv al diferitelor specii ionice se numesc proteine canal de ioni. Transportul mediat de aceste proteine nu necesit consum de energie, ionii difuznd cu viteze diferite prin membran n sensul gradientelor de concentraie. Proteinele canal de ioni se deschid tranzitoriu caracteristic ce a sugerat denumirea lor de proteine canal cu poart (gated channels). De regul, deschiderea canalelor reprezint un rspuns celular la diferite semnale recepionate de membrana plasmatic. n funcie de factorii ce comand deschiderea porilor, se deosebesc trei tipuri de proteine canal: - cu poart comandat de stimuli mecanici;

25

Ecotoxicologie -


cu poart comandat de liganzi. n acest caz canalele se deschid n urma legrii la un receptor a unei molecule semnal ce poate fi un mediator extracelular (neurotransmitor) sau un mediator intracelular (ion, nucleotid, protein de legare a GTP) (Fig. 7, 8); cu poart comandat de voltaj (dependente de valoarea potenialului de membran) (Fig. 9).

Fig. 7. Modificarea conformaional a receptorului acetilcolinic protein canal de Na+ cu poart comandat de ligand.

Fig. 8. Schema jonciunii neuromusculare i principalele proteine canal de ioni implicate de declanarea contraciei musculare sub aciunea impulsului nervos. A - starea de repaus B - starea activat

26

Ecotoxicologie


Fig. 9. Structura canalului de Na+ cu poart comandat de voltaj B. TRANSPORTUL ACTIV Deplasarea moleculelor i ionilor prin transport pasiv evolueaz spre egalarea concentraiilor de o parte i de alta a membranei i, implicit, dispariia potenialului membranar. Pentru a menine homeostazia mediului intracelular, celula i-a creat mecanisme de transport activ capabile s deplaseze moleculele i ionii n sens invers gradientelor lor de concentraie i electrochimic. Acest tip de transport este mediat de proteine specifice i prezint toate caracteristicile cinetice ale difuziei facilitate. Plusul de independen fa de compoziia mediului nconjurtor, pe care transportul activ l ofer celulei, implic consum de energie metabolic. Astfel, eritrocitele utilizeaz 50% din energia stocat n moleculele de ATP pentru a menine o concentraie ionic relativ constant a mediului intracelular. n funcie de modul n care este utilizat energia se deosebesc dou tipuri de transport activ. n transportul activ propriu-zis, molecula transportoare are funcie ATP-azic, fiind capabil s utilizeze direct energia rezultat n urma hidrolizei ATP n procesul de transport (pompele inonice). Al doilea tip de transport activ poart numele de cotransport. n cadrul acestui transport moleculele i ionii sunt deplasai mpotriva gradientelor lor de concentraie pe seama energiei eliberate n transportul pasiv al altor molecule i ioni. n unele cazuri de cotransport, energia moleculelor de ATP este utilizat indirect prin intermediul gradientelor ionice. b1) Pompele ionice Se cunosc trei clase de proteine ce cupleaz direct transportul ionilor mpotriva gradietelor lor electrochimice cu desfacerea legturilor fosfodiesterice din molecula de ATP i formarea de ADP (adenozin difosfat) i fosfor anorganic (P): clasa ATP azelor P; clasa ATPazelor V (H+-ATP-aze); clasa ATP-azelor F. Clasa ATP-azelor P conine trei reprezentani. Primul reprezentant al acestei clase i cel mai rspndit Na+ - K+ - ATP-aza (pompa de Na+ - K+) prezent n membranele plasmatice ale tuturor celulelor animale este unul dintre cele mai studiate sisteme de transport activ. Na+ - K+ - ATP-aza pompeaz Na+ n mediul extracelular i introduce K+ cu sarcin n celul. Mecanismul de aciune Na+ - K+ - ATP-aza, dei insuficient cunoscut, are la baz modificarea conformaional a enzimei. Astfel, este posibil formarea unor canale n proteina transportoare ce permite trecerea ionilor de Na+ i K+ -prin membrana plasmatic. Energia ce asigur conversia conformaiei enzimei (E1 E2) ct i pomparea ionilor mpotriva gradientului lor de concentraie este furnizat de hidroliza moleculelor de ATP (Fig. 10). Funcionarea Na+ - K+ - ATP-aza asigur meninerea unei concentraii intracelulare relativ ridicat a ionilor de K+ ce condiioneaz desfurarea normal a unor procese celulare vitale cum sunt: biosinteza proteic, activitatea catalitic a unor enzime (piruvat-kinaza) i meninerea potenialului de membran a celulelor excitabile. Al doilea reprezentat al clasei de ATP-azei P este Ca2+ - ATP-aza (pompa de Ca2+). Este localizat n membranele plasmatice asigurnd meninerea unei concentraii intracelulare

27

Ecotoxicologie


sczute a ionilor de Ca2+. n celulele musculare enzima este prezent n membrana reticulului sarcoplasmic, fiind implicat n transportul ionilor de Ca2+ din citosol n acest organit celular. Traficul Ca2+ prin membrana reticului sarcoplasmic n celulele musculare mediat de Ca2+- ATPaza, este esenial n procesul de contracie relaxare muscular. Pomparea ionilor din reticulul sarcoplasmic n citosol determin contracia muscular, n timp ce nlturarea ionilor din citosol permite relaxarea muscular. O protein capabil s lege specific ionii de Ca2+ a fost identificat i n citosol. Proteina numit calmodulin, este alctuit dintr-un singur lan polipeptidic i are o funcie reglatoare modificnd viteza de pompare a ionilor de Ca2+ n raport cu concentraia citosolic a acestora. Ultimul constituient al ATP-azelor P transport ionii de H+, n unele cazuri mpreun cu K+.

Fig. 10. Schema funcionrii Na+ - K ATP-azei. A- proteina aflat n conformaie E1 leag Na+ la situsurile aflate pe faa citoplasmatic a subunitii ; B-legarea ATP este urmat de hidroliza acestuia i fosforilarea unui rest de Asp din structura proteinei (E1~P); C-energia legturii macroenergice E1~P asigur modificarea conformaional a proteinei (E1-P) i transportul Na+ n spaiul extracelular; D-K+ se leag la situsurile de pe faa exoplasmatic ale subunitii ; E-defosforilarea proteinei transportoare conduce la modificarea conformaiei (E2); F-transportul K+ prin membrana plasmatic i eliberarea lui n citosol are loc simultan cu revenirea proteinei transportoare la conformaia iniial (E1) Clasa ATP-azelor V (H+ - ATP-aze) este reprezentat de proteine transportoare ce realizeaz deplasarea protonilor n sens invers gradientului lor de concentraie. H+ - ATP-aza este prezent n membranele plasmatice ale celulelor ce secret produi acizi (membrana apical a celulelor epiteliale ce mrginesc lumenul vezicii urinare) i n membranele lizozomale. Pompa de H+ dependent de ATP din membranele lizozomale are rolul de a menine un pH sczut (4,5 - 5) n interiorul acestui organit celular. Clasa ATP-azelor F, ca i cele ale clasei V sunt responsabile de transportul protonilor. Ceea ce caracterizeaz ATP-azele din clasa F, localizate n membrana mitocondrial, este faptul c acioneaz n sensul cuplrii-deplasrii H+ de la o concentraie mai mare la una mic cu sinteza ATP din ADP i P. b2). Cotransportul activ al ionilor i al moleculelor prin membrana plasmatic nu utilizeaz n toate cazurile direct energia eliberat prin hidroliza ATP. Folosirea energiei gradientelor ionice n transportul transmembranelor activ constituie o cale indirect de utilizare

28

Ecotoxicologie


a energiei stocate n ATP. Deplasarea ionilor i moleculelor mpotriva gradientelor lor de concentraie cuplat obligatoriu cu transportul pasiv al altor ioni numii ioni cotransportai definete procesul de cotransport. n acest transport activ, ionii de Na+ au un rol important n transportul zaharurilor i aminoacizilor n celul. Sunt descrise trei aspecte ale cotransportului: 1) uniport; 2) sinport; 3) antiport. Transportul uniport reprezint trecerea prin membran, la un moment dat, a unei singure specii moleculare sau ionice, fr a fi cuplat cu micarea altei specii moleculare. n acest caz, moleculele neutre nu se acumuleaz mpotriva gradienilor de concentraie, ci transportul lor prin membran este facilitat de gradientul de concentraie sczut i catalizat de o protein de import numit importer (fig. 11 a) . Tipul simport reprezint cotransportul a dou specii deosebite ( o structur chimic solvit i un ion ncrcat H+) n aceeai direcie, purtai fiind de ctre o protein porter (fig. 11, b1). Dintre toate sistemele de simport cel mai bine cunoscut este simportul de lactoz n celula bacterian (Escherichia coli) (fig. 11, b2). Antrenarea n circulaie sanguin a glucozei absorbit din lumenul intestinal i deplasarea aminoacizilor din tubii renali n snge reprezint procese cu o desfurare similar, n care un rol important l joac celulele epiteliale intestinale i respectiv, tubulare. Ptrunderea acestor molecule n celulele epiteliale este cuplat obligatoriu cu intrarea ionilor de Na+. Simportul este asigurat de proteine specifice localizate n regiunea apical (cu microvili) a membranei plasmatice (fig. 12).

Fig. 11. Mecanisme de cotransport

29

Ecotoxicologie


Fig. 12. Proteina ce realizeaz simportul glucoz Na+ asigur acumularea glucozei, mpotriva gradientului de concentraie, n celulele epiteliale ce delimiteaz lumenul intestinal. Na+ - K+ ATP-aza menine gradientul electrochimic al Na+ prin pomparea ionilor n afara celulei epiteliale. Cooperarea celor dou proteine transportoare face posibil preluarea continu a glucozei din lumenul intestinal. Sistemul antiport reprezint transportul de interschimb (fig. 11, c) ntre dou substraturi solubizante n dou direcii opuse, transport catalizat de o protein antiporter. Are loc schimbarea unei specii moleculare cu alta, de exemplu Na+ n locul ionului de H+, sau Cl- n locul gruprii HCO3-. Prin acest tip de transport activ, Na+ este transportat intracelular, iar concomitent Ca2+ este scos n spaiul extracelular; acest antiport reuete s menin sczut nivelul citosolic al calciului n multe celule. Majoritatea acestor tipuri de transport activ simport/antiport, n celulele animale, sunt declanate de gradieni de Na+, generai, la rndul lor, de pompe ionice de Na KATP-az. Proteinele uniporter, simporter i antiporter au structuri asemntoare, sunt nrudite din punct de vedere evolutiv i funcioneaz prin mecanisme similare. Cele trei tipuri de transport , uniport, simport i antiport au fost descrise nti la bacterii (Escherichia coli), ulterior dovedindu-i valabilitatea n toate celulele organismelor vii (fungi, plante, animale). C. Transportul apei i reglarea volumului celular C1. Presiunea osmotic-factor critic n transportul molecular de ap Deplasare moleculelor de ap prin membrana plasmatic sau printr-un strat de celule este rezultatul aciunii diferenei de concentraie a celor dou soluii separate de membran (stratul de celule) i /sau gradientul de presiune hidrostatic. Mecanismul transportului molecular de ap prin dublul strat lipidic nu este nc cunoscut. Studii recente sugereaz posibilitatea existenei unor proteine canal de ap la nivelul membranelor plasmatice. C2. Reglarea volumului celular i a presiunii osmotice interne Plasarea unei celule ntr-un mediu hipertonic determin contracia i respectiv destinderea spaiului intracelular. n anumite limite, celulele sunt capabile de a-i modula tensiunea osmotic intern i prin aceasta i pot menine volumul relativ constant. Introducerea unei celule ntr-un mediu hipertonic (cu o concentraie salin superioar coninutului celular) este urmat de scderea pH-ului citosolic, fapt ce determin activarea sistemului antiport Na+ H+ i ClHCO3-. Primul sistem asigur intrarea n celul a Na+ n schimbul ieirii H+. Al doilea sistem acioneaz n sensul deplasrii Cl- n celul i exportul de HCO3-. Speciile ionice exportate n mediul extracelular (H+ i HCO3-) sunt generate n celul ca rezultat al aciunii anhidrazei carbonice asupra produsului final al metabolismului celular CO2. Influxul de Na+ i Cl- conduce la creterea concentraiei saline i a tensiunii osmotice celulare ce fac posibil

30

Ecotoxicologie


intrarea moleculelor de ap n celul i n unele cazuri restabilirea volumului celular iniial (fig. 13).

Fig. 13. Principalele proteine transportoare implicate n reglarea volumului celular, condiiile n care celula se gsete ntr-un mediu hiperton (0,25 M NaCl)

n

2.1.3.3. Transportul macromoleculelor i particulelor prin membrana plasmatic Schimbul de substane pe care l realizeaz celula cu mediul nconjurtor nu este limitat numai la ioni, molecule mici i ap. Diferitele macromolecule (proteine, polinucleotide, poliglucide) i particule traverseaz membrana plasmatic prin mecanisme de transport mediate de vezicule. Se disting trei tipuri de transport: exocitoza, endocitoza i transcitoza. Prin exocitoz macromoleculele sintetizate n celul sunt excretate n spaiul extracelular. Endocitoza este implicat n transportul n celul a diverselor molecule, ct i a fraciunilor din fluidul interstiial (pinocitoza). Fagocitoza este un proces fundamental diferit de pinocitoz. Prin fagocitoz celulele ingereaz particule ale cror dimensiuni sunt de ordinul micrometrilor (bacterii, debriuri celulare etc). Dei decurg dup mecanisme diferite, cele trei procese de transport menionate prezint unele caracteristici comune: i) sechestrarea moleculelor i a particulelor transportate n vezicule; ii) asigurarea unui transport strict direcionat; iii) rolul critic al procesului de fuziune membranar. Materialele ce ptrund n celul prin endocitoz sunt fie supuse aciunii enzimelor hidrolitice lizozomale, fie eliberate din nou n mediul extracelular. De cele mai multe ori macromoleculele de screie sunt eliberate din celul prin aceeai regiune a membranei plasmatice prin care ele au ptruns. Exist ns situaii n care macromoleculele traverseaz spaiul celular fiind secretate printr-o alt regiune membranar. Acest ultim tip de transport poart numele de transcitoz. Procesul de exocitoz st la baza desfurrii secreiei celulare (fig. 14). Studiul transportului macromoleculelor din celul n mediul extracelular sugereaz existena a dou tipuri de exocitoz: constitutiv i reglat (fig. 15). Exocitoza constitutiv este comun tuturor celulelor i asigur eliminarea continu a macromoleculelor sintetizate n spaiul extracelular. Secreia celular de hormoni, neurotransmitori i enzime digestive este realizat prin exocitoz reglat. n acest caz moleculele sunt mpachetate n vezicule de secreii iar fuziunea lor cu membrana plasmatic este comandat de un semnal extracelular, de cele mai multe ori, un mesager chimic.

31

Ecotoxicologie


Fig. 14. Calea clasic de transport a moleculelor de secreie n spaiul extracelular

Fig. 15. Prezentarea schematic a exocitozei constitutive i reglate Endocitoza definete transportul mediat de vezicule din mediul extracelular n celul al unor macromolecule, ct i a substanelor dizolvate n lichidul intestiial (fig. 16). n funcie de mecanismul procesului de endocitoz distingem: endocitoza mediat de receptori i pinocitoza. Endocitoza mediat de receptori (absorbtiv) reprezint un tip de transport specific i eficient al macromoleculelor. n urma recunoateri i legrii lor la receptori de membran. Macromoleculele intr n celule sub forma complexului de ligand-receptor, fr a fi nsoite de fluidul extracelular. De exemplu, colesterolul circul n snge legat de o protein cu care formeaz complexe numite lipoproteine cu densitate sczut (LDL) (fig. 17). Pinocitoza (gr. pinen=a bea) sau endocitoza de fozofluid este un proces constitutiv, comun tuturor celulelor, prin care ptrund n celul molecule n soluie. Cantitatea macromoleculelor antrenat n acest tip de transport nespecific, este direct proporional cu concentraia lor n fluidul extracelular.

32

Ecotoxicologie


Fig. 16. Calea urmat de particulele ce au ptruns n celul prin endocitoz

Fig. 17. Endocitoza mediat de receptori pentru LDL Fagocitoza (gr. fagiere=a mnca) este un proces de transport mediat de vezicule prin care celulele sunt capabile s ingere diverse particule din spaiul extracelular. Dac la organismele unicelulare fagocitoza reprezint principala cale de nutriie, la mamifere procesul joac un rol important n aprarea organismului. Celule specializate numite fagocite sunt capabile s nglobeze i s distrug substane strine, microorganisme, celule mbtrnite i maligne, resturi celulare etc. n organismele animale se disting dou tipuri de celule sanguine ce acioneaz ca fagocite: monocitele (ce migreaz n esuturi dnd natere macrofagelor i ele celule cu funcie fagocitar) i neutrofilele.

33

Ecotoxicologie


Legarea particulelor de fagocit prima etap a fagocitozei implic participarea receptorilor de membran ce recunosc specific liganzii aflai pe suprafaa particulei int. Pentru a putea fi fagocitate, bacteriile sunt supuse unui proces de opsonizare (gr. opsonein=a pregti pentru mncare) ce const n acoperirea suprafeei bacteriene cu anticorpi i /sau componente ale complementului. Anticorpii se ataeaz pe suprafaa bacteriilor n aa fel nct regiunea prin care acetia se leag la receptori, numit regiune Fc, este expus spre exterior. Receptorul Fc din membrana plasmatic a fagocitelor interacioneaz cu anticorpii legnd cele dou suprafee membranare printr-un mecanism tip fermoar (membrane-zippering-mechanism) ce face posibil fagocitoza (fig. 18). Exist posibilitatea stabilirii unor legturi ncruciate ntre anticorpii ataai pe suprafaa celulei int cu formarea unor aglomerri (clusterii), proces numit patching. Dup un scurt timp de la formarea cluster-ilor, anticorpii se deplaseaz spre un pol al celulei-int genernd o structur de tip calot ce mpiedic fagocitarea celulei in (fig 19). Procesul de calotare (copping) este energo-dependent necesitnd prezena moleculelor de ATP. Activarea receptorilor specifici de ctre anticorpi, componente ale complementului sau diverse oligozaharide de pe suprafaa microorganismelor, prin formarea complexului ligandreceptor, genereaz un semnal intracelular ce declaneaz ingestia.

Fig. 18. Fagocitoza se realizeaz printr-un mecanism membrane-zipper A distribuirea uniform a anticorpilor pe suprafaa celulei int face posibil fagocitarea acesteia B procesul de capping mpiedic fagocitarea celulei-int nglobarea particulei int cea de-a doua etap a fagogitozei se realizeaz prin emiterea de ctre fagocit a unor prelungiri numii pseudopode ce nchid complet particula ntr-o vezicul, odat internalizat vezicula poart numele de fagozine. Fagozinul fuzioneaz cu vezicule din compartimentul prelizozomal (lizozomi primari) dnd natere fagolizozomilor unde materialul ingerat este supus aciunii enzimelor hidrolitice (faza de digestie). Substanele utile trec n citosol, iar substanele nedigerabile rmn n fagolizozomi formnd corpii reziduali care sunt eliminai la exteriorul celulei. Lizozomii din macrofage conin, pe lng hidrolizele specifice compartimentului lizozomal, enzime ce catalizeaz reacii n urma crora rezult substane toxice (peroxid de oxigen H2O2; anion superoxid O2, etc), ce au rol de a suprima bacteriile fagocitate.

34

Ecotoxicologie


Pn n prezent, mecanismul prin care formarea complexului ligand-receptor iniiaz ingestia, ct i cel care st la baza emiterii pseudopodelor de ctre fagocit, sunt neclare. Faptul c unele substane (citocalozina) ce blocheaz polimerizarea moleculelor de actin inhib fagocitoza sugereaz caracterul actino-dependent al mecanismului de formare al pseudopodelor. Transcitoza definete un tip de transport specific transcelular, al diferitelor microelemente. Procesul este ntlnit n celule (epiteliale) ale cror membrane plasmatice sunt mprite n domenii distincte (apical i latero-bazal) datorit pronunatei asimetriei n distribuia elementelor lipidice i proteice componente. Un exemplu de transcitoz l reprezint transportul din stomac n circuitul sanguin al anticorpilor la nou-nscut, anticorpi primii odat cu laptele matern.

Fig. 19. n urma interaciei anticorpi proteine de pe suprafaa celular proteinele se pot asocia n cluster-i (patching) i se pot aglomera la un pol al celulei (capping) 2.2. CI DE PTRUNDERE N ORGANISM Cunoaterea cilor de ptrundere a toxicilor n organism are o deosebit importan, cci de acestea depinde, n mare msur ritmul absorbiei, care condiioneaz concentraia la nivelul receptorilor. Cile de ptrundere sunt clasificate n: - ci indirecte (mediate): asigur ptrunderea substanei din mediul exterior n esut prin tegumente, mucoase sau seroase, trecnd apoi n circulaia general. Ele sunt: calea transcutanat, gastrointestinal, respiratorie, alte ci transmucoase, cile transseroase; - ci directe (imediate, parenterale): asigur ptrunderea substanei n esut printr-un mijloc mecanic. Numai calea venoas permite ptrundere integral, pentru c substana ptrunde direct n circulaie, nct lipsete faza de absorbie. n celelalte ci parenterale (subcutanat, intramuscular, intradermic) se poate produce o nchistare a substanei la locul injectrii; totui n comparaie cu calea gastro-intestinal, absorbia este mai rapid i mai intens deoarece nu mai intervine aciunea selectiv a epiteliului.

35

Ecotoxicologie


Calea de ptrundere are influen att asupra gradului de toxicitate, a tipului de toxicitate ct i a tipului de aciune toxic. n general, toxicitatea crete cu ct se asigur o trecere mai rapid n circulaie i din acest punct de vedere cile de ptrundere se claseaz, n ordinea descresctoare: intravenoas, respiratorie, intraperitoneal, intramuscular, subcutanat, oral, cutanat. 2.3. ABSORBIA, FIXAREA, DISTRIBUIA I DEPOZITAREA TOXICULUI Efectul unui toxic depinde de cantitatea principiului activ ajuns la sediul aciunii, precum i de timpul ct persist la acest nivel. Dup absorbie adic dup ptrunderea n snge sau n limfa circulant substana rmne un timp scurt n aceast faz, fie sub form liber (dizolvat n lichidul plasmatic), fie fixat pe hematii sau legat de prot

capitolul i-iv

Documents