7/24/2019 Cap 23 Final

1/15

CAPITOLUL 23DETECIA I BIOMARKERII APOPTOZEI

23.1. Introducere

n cele dou capitole anterioare am analizat apoptoza, ca mediator al aciunii

substanelor toxice. n plus, am prezentat n detaliu att la nivel celular ct i la nivel

molecular cile care regleaz moartea celular prin apoptoz. Totui, o nelegere

complet a rolului apoptozei n medierea oricror procese biologice depinde de o

cuantificare precis. Acest capitol va descrie morfologia i biomarerii apoptozei i

va avea n vedere aplicarea acestor informaii n cuantificarea morii celulare in vivo

iin vitro.

!rima descriere a morfologiei apoptozei s"a bazat pe stimularea timocitelor cu

glucocorticoizi

#Arends i $%llie, &''&(. )lterior, a devenit evident c trsturile

morfologice descrise erau comune la multe alte esuturi cum ar fi rinic*iul i ficatul.

n esutul sntos sau pentru celulele aderente n cultur, celulele capt un aspect

rotun+it i apare un *alou clar care ncepe s le separe de celulele nvecinate #figura

-.&A(. !rin folosirea coloraiilor *istologice clasice s"a observat c nucleul intens

colorat cu *ematoxilin apare condensat i delimitat de cromatin, iar citoplasma

devine intens eozinofil. Aceast serie de modificri morfologice este reprezentat

sc*ematic n figura -.&.

23.2 Paraetr!! care !nter"!n #n detec$!a a%o%to&e!

Aa cum s"a discutat n capitolul & stadiile bioc*imice ale apoptozei pot fi

descrise ca o suprapunere de leziune, analiz, cuplare i execuie. /a+oritatea

te*nicilor disponibile identific modificrile celulare asociate n final cu faza de

execuie a apoptozei mai degrab dect cu oricare alt faz latent de semnalizare i

transmitere.Astfel, toate metodele subestimeaz numrul celulelor apoptotice prezente.

7/24/2019 Cap 23 Final

2/15

'!(ura 23.1#A( M!cro)oto(ra)!e e*ectron!c+ a unu! ,e%atoc!t a%o%tot!c. 0elula s"a rotun+ti a pierdut contactul cu celulele nvecinate. !rezint citoplasm #0( i nucleu #1( condensate nsorganitele precum mitocondriile nc se pot recunoate. /rire 2.3456. #( -ec"en$+ ae"en!ente*or or)o*o(!ce care au *oc atunc! cnd o ce*u*+ de"!ne a%o%tot!c+. 7tadiul final alnecrozei secundare are loc n mod normal dup ce fragmentele celulare au fost fagocitate de ctrealte celule.

Ali factori care afecteaz rezultatul care cuantific apoptoza includ esutul

studiat i marerii alei #vezi tabelul -.&(. n plus, unele etape ale 8execuiei9

apoptozei sunt mult mai uor detectate dect altele: de exemplu, aspectul marginii de

cromatin este mult mai uor de recunoscut dect n stadiile urmtoare cnd apare

dezintegrarea nuclear. ;iferitele esuturi din organismele vertebratelor prezint rate

diferite ale apoptozei dependente de funciile lor. Aceste esuturi care prezint o rat

nalt de replicare celular cum ar fi esutul *ematopoetic i tractul gastrointestinal

prezint n general o rat mai ridicat a apoptozei dect celelalte esuturi, cum ar fi

ficatul, unde rata replicrii celulare tinde s fie sczut.

7/24/2019 Cap 23 Final

3/15

proporie de celule apoptotice pun cercettorului probleme suplimentare fa de cele

cu o rat nalt a apoptozei. Te*nicile care implic omogenizarea ntregului esut,

cum ar fi testul =>?7A, pot dilua micile proporii ale celulelor apoptotice att de mult

nct scad sub limitele de detecie #@aaradai colab., &''B(.

7imilar, te*nicile *istologice care folosesc coloraia *ematoxilin C eozin pe

seciuni tisulare pot descoperi o singur celul apoptotic prezent n interiorul

seciunii tisulare dar cuantificarea poate necesita un efort considerabil i experien

din partea operatorului.

Ta/e*u* 23.1. Mo*ecu*e ar0er %oten$!a*e %entru tud!! de a%o%to&+

Mar0er -%ec!)!c!tate%entru a%o%to&+

-c,!/

c"m%cDfos 1especific Ecl"Dfamilie ax un FDE0aG 1especific EHragmentare A;1 un E

p4- >imitat E/orfologie Hoarte bun 0ondensareD

fragmentareIoec*st ---2 unJ 0ondensare a A;1

Transglutaminaza un E0aspaze un E #activitate

enzimatic(

/etoda =>?7A furnizeaz date cantitative ca urmare a omogenizrii tisulare i

a centrifugrii difereniale a componentelor celulare. ;eoarece este necesar o

cunoatere a distribuiei marerului la nivel celular este dificil s raportm rezultatele

obinute prin metoda =>?7A la modificrile din populaia celular. Asemntor,

gradul de desfurare a A;1 a fost considerat ca un marer definitiv al apoptozei, dar

aceasta este o situaie care se refer la fenomenele aprute n toate fazele apoptozei,

iar n situaii n care numai o mic proporie din celule sunt supuse apoptozei nivelul

sczut al sensibilitii exclude detecia lor ridicat datorit unui factor de diluie cu

valoare nelimitat a A;1"ului de la celulele non"apoptotice.

n funcie de marerul folosit, metodele *istologice pot fi sensibile #vezitabelul -.&(, i sunt aplicabile la aproape toate esuturile ce necesit studiul. Totui

-

7/24/2019 Cap 23 Final

4/15

aprecierea cantitativ a prepartelor *istologice tisulare va presupune ntotdeauna un

efort considerabil, c*iar dec acurateea acestor metode este ridicat.

Adeseori, poate exista un compromis ntre specificitate i uurina deteciei. )n

marer care nu este exprimat specific de celulele apoptotice poate fi totui util dac

permite unui cercettor s disting celulele apoptotice de celulele vecine #/c0art*%,

=van, &''B(. )n exemplu de astfel de marer este *ematoxilina i eozina n te*nicile

*istologice clasice, i Ioec*st ---2 n culturile celulare. 1ici una din metode nu

localizeaz specific celulele apoptotice, dar ele sunt folosite n mod real, datorit

faptului c marc*eaz diferenial celulele apoptotice.

23.3. Metode %entru detectarea ce*u*e*or a%o%tot!ce

/etodele pentru detectarea celulelor apoptotice pot fi mprite n trei categorii

generale n funcie de te*nica de preparare tisular. !rima presupune procesri ale

esutului intact pentru *istologie i utilizeaz mareri specifici i nespecifici ai

celulelor apoptotice. 0ea de"a doua presupune obinerea celulelor separate din esutul

intact, iar cea de"a treia metod presupune dezagregarea esutului i a celulelor i

analiza proteinelor celulare rezultate i sau a A;1"ului.

23.3.1. Metode care )o*oec $eut !ntact

7/24/2019 Cap 23 Final

5/15

cercettorului, celulele pot fi corect recunoscute i pot fi cuantificate folosind te*nici

morfometrice pe un numr de seciuni tisulare suficient pentru a susine un eantion

reprezentativ. !rintre avanta+e aminitim uurina n utilizare datorat compatibilitii

acestor te*nicii morfologice cu mi+loacele de examinare *istologice i ultrastructurale

folosite curent. !rincipalul dezavanta+ deriv din subiectivitatea n recunoaterea

celulelor apoptotice care poate depinde de experiena examinatorului. 7tudiile lui

ursc*i colab.#&'BL( au combinat cuantificri de celule apoptotice att cu, ct i

fr fragmente nucleare, cu identificarea celor din urm doar pe baza corpilor

eozinofilici rotunzi, cel mai adesea prezeni n alte celule neafectate. Astfel,

variabilitatea de la examinator la examinator i de la laborator la laborator trebuie s

fie evitat. n plus stabilirea mrimii eantionului att din interiorul seciunii ct i

dintre seciunile aceleiai probe trebuie determinat statistic pentru a limita

variabilitatea.

=xaminarea celulelor apoptotice n microcopia optic #figura -.( are ca

avanta+e pregtirea rapid i necostisitoare i investiiile te*nice minime. n plus,

numrul de celule apoptotice pe fiecare seciune este suficient pentru cuantificare:

acest proces poate fi automatizat prin utilizarea te*nicii similare celei descrise

anterior pentru evaluarea de rutin a indicilor celulari de proliferare.

n plus fa de microscopia optic, pentru identificarea celulelor apoptotice

prin morfologia acestora se poate aplica microscopia electronic. Aceast

metodologie reprezint probabil 8standardul de aur9 n ceea ce privete apoptoza n

esutul intact deoarece corpii apoptotici pot fi identificai n toate stadiile lor de

progresie, cu sau fr fragmente nucleare #figura -.(.!entru detectarea apoptozei se poate folosi imuno*istoc*imia datorit faptului

c multe proteine sunt exprimate specific sau preferenial de ctre celule intrate n

apoptoz. =xist cteva proteine propuse n acest scop, care sunt prezentate n tabelul

-.&. Transglutaminaza este o enzim implicat n reacia din care rezult

condensarea proteinelor tubulare ce permit recunoaterea celulelor apoptotice n

seciuni tisulare cu coloraii *istologice de rutin. Keacia de legare ncruciatcatalizat de glutaminaz conduce la polimerizarea proteic, care este extrem de

4

7/24/2019 Cap 23 Final

6/15

puternic. 7upraexpresia transglutaminazei tisulare sau de tipul ?? se crede a fi

specific pentru apoptoz dei au fost remarcate niveluri sczute ale acesteia n celule

endoteliale, celule musculare netede i celule mezangiale viabile.

'!(ura

23.2 #A( A%ectu*,!to*o(!c a* une!ce*u*e a%o%tot!ce

#n )!catu* deo/o*an. 0oloraie *ematoxilin"eozin, mrire -B56. #( M!cro)oto(ra)!e e*ectron!c+ a a!u*tor cor%! a%o%tot!c! AB45 un!! cu nuc*eu ! a*$!! )+r+ nuc*eu. Acetia sunt prezeni att n*epatocite ct i n celulele @upffer, n ficatul unui oarece cruia i s"a administrat un solventclorinat. n toate cazurile sunt prezente organite citoplasmatice ce pot fi recunoscute, cu omorfologie similar celor prezente n *epatocitele care au fagocitat celulele. /rire .-346.

;ei n identificarea celulelor apoptotice s"au adus argumente n favoarea

proteinelor marer precum c"m%c, p-2, 7!M" i vitronectin, acestea sunt n modcert nespecifice procesului i utilizarea lor trebuie combinat cu morfologia pentru

L

7/24/2019 Cap 23 Final

7/15

identificarea sigur a celulelor apoptotice. /ai nou se folosesc caspazele ca

biomarei ai apoptozei. 0aspazele constituie o familie de proteaze care sunt activate

n stadiul final, de execuie al apoptozei prin clivarea dintr"o pro"caspaz. Activarea

cascadei proteolitice a caspazei determin moartea celular apoptotic. ;ei

anticorpii pentru caspaz sunt disponibili i pot fi utilizai pentru imuno*istoc*imie,

nivelurile proteinei caspaza pot s par nesc*imbate, activarea rezultnd din cliva+ul

enzimatic. Astfel, experimentele bazate pe caspaz sunt foarte utile ca i biomareri

ai apoptozei i vor fi discutate n subcapitolul -.2.-.

0u toate metodele imuno*istoc*imice, metodologia de fixare trebuie adaptat

pentru a se potrivi esutului i epitopilor. Hixatorii bazai pe alde*ide precum

paraformalde*ida i formalde*ida, sau fixatori alcoolici precum met*acarn i sunt toi

utilizai n imuno*istoc*imie. n general, fixativii alcoolici sunt mai puin distructivi

pentru deteminanii antigenici, fixativii alde*idicii inducnd legturi ncruciate

extinse ce pot face de nerecunoscut epitopul pentru un anticorp ndreptat mpotriva

proteinei native. n unele cazuri fixatorii pot fi contraindicai iar esuturile vor trebui

s fie ng*eate rapid naintea secionrii. n cazul esuturilor de+a fixate, trebuie

efectuat recuperarea antigenic. n general trebuie meninut un ec*ilibru delicat ntre

fixarea care pstreaz morfologia i pierderea antigenicitii: aceti factori trebuie

ec*ilibrai pentru identificarea reuit a celulelor apoptotice prin te*nici

imuno*istoc*imice #Koberts, 555(.

n cursul apoptozei, fragmentarea A;1 are loc simultan cu modificrile

morfologice ale condensrii cromatiniene. 7"au elaborat cteva sisteme care permit

localizarea acestor rupturi A;1 n seciuni tisulare i n celule izolate n cultur. !eransamblu, metodele se mpart n trei categorii funcionale n funcie de enzima

folosit n procesul de legare. /arcarea procesului final in situ #?7=>( utilizeaz

A;1"polimeraza ? #polimeraza @ornberg( care are funcie dubl: poate aduga baze

marcate cu digoxigenin la grupurile libere niate -N*idroxil dar de asemenea poate

marca i ntrerupe translaia din monocatenele rupte, de unde acronimul ?71T # in situ

nic translation(. Alternativ, fragmentul @leno al A;1"polimerazei ? #lipsit deactivitate de ntrerupere a translaiei a polimerazei @ornberg( poate fi folosit pentru

3

7/24/2019 Cap 23 Final

8/15

efectuarea marcrii finale a A;1 pe seciuni tisulare. Alternativ, enzima terminal

deoxinuclotidil"transferaza #Tdt( a fost utilizat pentru marcarea captului ntrerupt

d)T! Tdt metilat C T)1=> #Tdt"mediated d)T! nic end labelling( sau codare.

Acest enzim poate aduga baze marcate ;?M att grupurilor -N*idroxil

monocatenare ct i celor bicatenare. /arerii legai pe A;1"ul nou sintetizat poate

fi ulterior detectat cu a+utorul peroxidazei con+ugate cu avidin sau alt marer

enzimatic adecvat #Hoster, 555(.

Te*nica a fost criticat ca fiind nespecific deoarece marc*eaz i celulele

necrotice i d rezultate fals pozitive. Totui, acest lucru era de anticipat din moment

ce catenele rupte de A;1 nu sunt specifice apoptozei: ca i n cazul tuturor te*nicilor

imunocitoc*imice, trebuie acordat atenie interpretrii, iar ca i criteriu suplimentar

ar trebui folosit cel morfologic al apoptozei simultan cu marca+ul.

23.3.2. Metode ce )o*oec ce*u*e !&o*ate

n multe aplicaii necesitatea meninerii organizrii tisulare este secundar

multiplelor avanta+e oferite de celulele izolate. ;e exemplu, celulele obinute pot fi

relativ omogene i n numr mare. n unele cazuri celulele pot fi sicronizate pentru a

intra n apoptoz n numr mare iar aspectele dependente de timp ale apoptozei pot fi

studiate n aceiai celul n timpul progresiei de la stadiul normal la necroza

secundar. )n aspect important este faptul c efectele factorilor exogeni, cum ar fi

calciul, xenobioticele i factori de cretere cum ar fi factorul de transformare a

creterii O, pot fi studiate n condiii prestabilite.

/c0art*% i =van #&''B( au utilizat video"microscopia ultra"rapid pentru astudia efectele densitii celulare i contactului celular asupra frecvenei apoptozei i

fagocitoza consecutiv a fragmentelor celulare apoptotice. Holosind acest sistem ei au

demonstrat c factorii de supravieuire precum cl" i factorul de cretere insulin"

lie ? au supresat instalarea apoptozei n celule ns nu au afectat dinamica

evenimentelor la nivel individual. n contrast, in*ibitorii caspazelor nu au avut efect

asupra instalrii apoptozei dar au prevenit fiecare moarte celular prin apoptoz.Astfel, video"microscopia ultra"rapid poate oferii informaii unice asupra evoluiei i

B

7/24/2019 Cap 23 Final

9/15

ratei apoptozei la celule izolate. Totui, necesitatea ec*ipamentelor de specialitate

poate fi pro*ibitiv.

!rocesul apoptozei poate fi studiat prin imuno*istoc*imie n celule izolate

folosind anticorpi mpotriva unei categorii de antigene asociate apoptozei #tabelul

-.&(, aa cum s"a precizat anterior n cazul seciunilor tisulare #subcapitolul -.-.&(.

;in nou, experiena operatorului este esenial pentru identificarea precis a celulelor

apoptotice iar pentru un imunomarca+ optim este necesar o metod de fixare

adecvat. n plus, celulele n cultur au o membran celular intact care trebuie s

fie permeabilizat pentru a permite ptrunderea moleculelor relativ mari de anticorpi.

Acest lucru este de obicei realizat prin fixarea cu alcool sau printr"o combinaie de

expunere la soluii saline *ipotone i ng*eare parial. Alegerea produsului final de

reacie pentru vizualizarea celulelor apoptotice poate fi reprezentat de un cromogen

sau un fluorocrom.

0a o alternativ la imuno*istoc*imie poate fi folosit marca+ul intercalrii A;1

pentru detecia apoptozei n celule izolate primare sau n linii celulare in vitro. =xist

cteva substane de marca+ disponibile precum iodura de propidium, acridine orange

sau Ioesc*t --4B. Aceti colorani permit detecia A;1"ului condensat n interiorul

nucleilor celulelor apoptotice i reprezint un instrument important n studiul

apoptozei in vitro. n condiii bune se pot face estimri foarte precise ale numrului

de celule apoptotice n urma tratamentului culturii cu factori de cretere sau

medicamente citotoxice #Hoster, 555(. Te*nica T)1=>, descris pentru esuturi n

subcapitolul -.-.&, este aplicabil i culturilor celulare.

Hlo"citometria este probabil una din cele mai eficiente metode pentru studiuli cuantificarea apoptozei #van =ngelandi colab.,&''B(. >a trecerea celulelor printr"

un fascicul laser, acestea pot fi difereniate pe baza dimensiunii i densitii lor.

0oninutul A;1 pentru fiecare celul poate fi determinat cu a+utorul iodurii de

propidium pentru a permite analiza proporiei de celule ce vor intra n apoptoz.

Tabelul -. prezint o list de colorani A;1 folosii n flo"citometrie

#Hraeri colab., &''4(. Hlo"citometria poate fi util n special atunci cnd trebuiescanalizate populaii de celule amestecate, te*nica putnd diferenia mai mult de un

'

7/24/2019 Cap 23 Final

10/15

parametru simultan. ;e exemplu, timocitele pot fi analizate simultan pentru

coninutul n A;1 cu a+utorul iodurii de propidium i tipizate celular prin expresia

0;2D0;B folosind anticorpi #/c0art*% i =van, &''B(. Alternativ, iodura de

propidium poate fi folosit alturi de ali mareri asociai cu apoptoza precum

transglutaminaza, anexina P #vezi -.-.-(, T)1=> #vezi -.-.-( sau cl".

Ta/e*u* 23.2. Co*ora$!! AD6 )o*o!te #n od o/!nu!t #n or)o*o(!e ! )*o78c!toetr!e

Co*orant ce e *ea(+ *a AD6L!n!e de e9c!ta$!e*aer n4

Inter"a* de e!!en4

?odura de propidium ?ntercalar 2BB 445"L25romura de et*idium ?ntercalar 2BB 445"L25Acridin orange ?ntercalar 2BB, 42& 4&5"4-53"amino"actinomicina ; ?ntercalar 2BB L25"LB5

;aunomicina ?ntercalar 2BB 4L5"L55/itramicina A =xtern 243 4&5"4-50romomicina A =xtern 243 445"4B5Qlivomicina =xtern 243, 2B5"455 4-5"4L5Ioec*st --4B =xtern -4&"-L2 -B5"25Ioec*st ---2 =xtern -4&"-L2 -B5"25;A!? =xtern -4&"-L2 -B5"25

23.3.3. Metode ce )o*oec )rac$!un! u/ce*u*are

/ulte teste folosesc alte proprieti ale celulelor apoptotice precum modificri

proteice, membranare sau ale A;1"ului. =xist multe ituri disponibile comercial ce

folosesc aceste modificri n scopul de a oferi msurtori rapide i un cost mai mic

pentru celulele moarte. )nele experimente utilizeaz =>?7A pentru a detecta proteine

specifice sau a cerceta prezena A;1 n fraciuni celulare neadecvate #@aaradai

colab., &''B,(. Q metod folosit n studiul apoptozei utilizeaz anticorpi primari

ndreptai fie mpotriva A;1"ului monocatenar nsui, fie mpotriva proteinei

*istonice.

>a baza te*nicii comerciale denumit 8=>?7A moarte celular9 a stat

combinaia de utilizare a anticorpilor ndreptai att mpotriva A;1 ct i a *istonelor

#figura -.-(. n cursul etapelor incipiente ale apoptozei, membrana plasmatic

devine relativ impermeabil, dar membrana nuclear rmne nesc*imbat: pe msur

ce A;1"ul nuclear se dezintegreaz, aceste fragmente pot fi detectate n citoplasm.A%ala i colab. #&''B( au folosit te*nica pentru a studia instalarea leziunilor

&5

7/24/2019 Cap 23 Final

11/15

*epatocelulare induse prin sepsis la oareci, evideniind dezavanta+ele acesteia i a

oricrei alte te*nici bazate pe =>?7A. !rincipalul inconvenient este imposibilitatea de

a raporta datele la numrul real de celule i, consecutiv, imposibilitatea de a compara

aceste date cu altele precedente complementare.

'!(ura 23.3 #A( Re%re&entare (ra)!c+ a te,n!c!! ELI-A :oarte ce*u*ar+;. Anticorpiianti"*istone sunt adsorbii pe peretele plcuei, apoi nucleozomii coninui n prob se leag prinintermediul *istonelor la anticorpii anti"*istone imobilizai. )n anticorp anti"A;1 con+ugat cu

peroxidaza reacioneaz cu A;1 imobilizat din prob, cantitatea de anticorp imobilizat fiind directproporional cu cantitatea de mono" i oligonucleozomi din citoplasma prezent n esutul original.#( D!a(ra+ de #%r+t!ere a !nd!ce*u! a%o%tot!c der!"at d!n ec$!un!*e ,!to*o(!ce a*eec$!un!*or ,e%at!ce arcate %r!n etoda TU6EL AB< contro*4.

Q alt te*nic utilizat n evaluarea apoptozei care a ctigat popularitate este

detecia fosfatidil serinei #!7(, un fosfolipid ncrcat negativ, reinut n mod normal

la nivelul suprafeei interne a bistratului membranar plasmatic. n cursul apoptozei,

&&

7/24/2019 Cap 23 Final

12/15

!7 este externalizat, acionnd n sensul declanrii fagocitozei. Acest proces poate fi

urmrit folosind proteina de legare a fosfolipidului, ce ataaz anexina P sau

anticorpi anti"!7. Anexina P poate fi utilizat n celule vii i este folosit n studierea

dinamicii i ratei apoptozei n culturiile celulare.

0aspazele constituie o familie de proteaze care sunt activate n etapa de

execuie a apoptozei #vezi capitolul &( prin cliva+ul dintr"o form pro"activ.

Activarea cascadei proteolitice a caspazei determin moartea celular prin apoptoz.

Activarea caspazelor n cursul apoptozei mpreun cu descoperirea ctorva substraturi

pentru caspaze au dus la dezvoltarea testelor pentru caspaze ca biomareri pentru

apoptoz #/c0art*% i =van, &''B(.

Aceste teste se mpart n dou mari categorii, cele care monitorizeaz cliva+ul

caspazelor nsei prin estern blott i cele care msoar cliva+ul substratului fie prin

estern blott, fie prin metode colorimetriceDfluorometrice. Actual, anticorpii anti"

caspaze sunt disponibili comercial i pot fi folosii n urmrirea cliva+ului proteolitic

al membrilor cei mai importani ai familiei caspazelor, ca de exemplu caspazele -, B

i &5. Acest tip de studii asigur detalii importante asupra progresiei n timp a

cascadei caspazelor i au fost utilizate pentru determinarea rolurilor +ucate de diferii

membrii ai familiei n diferite esuturi. ;ezavanta+ele acestei abordri sunt

specificitatea anticorpilor i complexitatea. !entru cele mai multe aplicaii,

experimentele bazate pe cliva+ul substraturilor caspazelor sunt mai flexibile i

practice. @iturile ce testeaz cliva+ul substratului natural al caspazei"- prin estern

blot, poli #A;!"ribozei( polimerazei #!AK!(, nu sunt disponibile. n plus, exist o

varietate mare de substraturi peptidice artificiale, care se bazeaz pe situsurile declivare cunoscute, legate de un fluorofor sau de un cromogen. Anumite substraturi

peptidice au o specificitate mare, n timp ce altele sunt clivate de ctre civa membrii

ai familiei caspazelor. ;e asemenea, sunt disponibili i in*ibitorii, demonstrnd nc

o dat specificitatea metodei.

&

7/24/2019 Cap 23 Final

13/15

23.3.=. Cuant!)!care

Te*nicile reevaluate mai sus sunt diferite dar toate au ca obiectiv asigurarea

unei metode de cuantificare semnificativ a morii celulare n diferite condiii

experimentale. 0onversia numerelor brute obinute pe baza rezultatelor cu o

asemenea semnificaie determin numeroase provocri. !entru metode ce cuantific

proporia celulelor apoptotice i viabile fie n culturi celulare, fie in vivo, indicele

apoptotic poate fi calculat direct. !entru estimrile in vivo, aprecierea morfologic i

numrarea manual a seciunilor tisulare este cea mai comun prin analogie cu

metodologia indicelui de marca+ folosit pentru numrarea celulelor ce au iniiat

sinteza A;1 #Hoster, 555(.

/etodele tipice numr 555 de celule i evalueaz indicele apoptotic ca

raport al celulelor apoptotice fa de numrul total. Totui, acest lucru ar putea fi

insuficient datorit indicilor apoptotici bazali sczui #de ex. B"&4 celule apoptotice la

&5.555 de celule n ficatul de obolan(. Astfel, trebuie s existe un numr suficient de

celule pentru obinerea unor date semnificative.

n figura -.2A se prezint o te*nic T)1=> ce combin analiza imagistic

automatizat cu numrarea manual. 1umrul total de celule din fiecare lob *epatic

poate fi estimat prin analiza imagistic a numrului de nuclei din fiecare seciune

#dintr"o medie de 4 cmpuri luate la ntmplare( i o estimare a ariei seciunii.

7electarea a 4 cmpuri se bazeaz pe numrul minim necesar pentru obinerea unor

deviaii standard acceptabile de pn la &5R din valoarea medie. ;up aceast

apreciere automat a numrului total de celule, numrul total de celule apoptotice este

numrat manual prin scanarea sistematic a seciunii.)n exemplu al efectului a patru substane c*imice ce determin creterea ratei

apoptozei n ficatul obolanului este redat n figura -.2. n ciuda unor niveluri

foarte sczute ale apoptozei n ficatul netratat, s"a putut detecta o in*ibiie

semnificativ statistic a indicelui apoptotic #Koberts, 555(.

&-

7/24/2019 Cap 23 Final

14/15

'!(ura 23.= #A( D!a(raa te,n!c!! )o*o!te %entru ca*cu*area !nd!ce*u! a%o%tot!c #nec$!un! de )!cat co*orate %r!n te,n!ca TU6EL. B4 E)ectu* na)eno%!n8u*u!5 )eno/ar/!ta*u*u!od!c PB4 ! a %re(ne*o*on car/on!tr!*u*u! PC64 au%ra !nd!ce*u! a%o%tot!c AB>1?.???ce*u*e4 ! !nd!ce*e de arcare -%,ae BrdU LI4 #n )!catu* de o/o*an! #n )unc$!e de u/tan$e*e

! do&e*e %re&entate %e %atru &!*e.7e poate remarca cum indicele de marcare crete cu tratamentul,indicele apoptotic scade iar ficatul obolanilor tratai crete n dimensiuni.

;atele obinute prin flo"citometrie permit ele nsele cuantificarea, din

moment ce indicele apoptotic este derivat direct din profilul fluxului. n cazul

suspensiilor celulare sau n cazul sistemelor ce utilizeaz limfocitele, de exemplu,

te*nica flo"citometriei este relativ simpl i interpretarea uor inteligibil #Hraericolab., &''4(. n ciuda acestor aspecte, exist lucrri unde s"au observat doar corelaii

&2

7/24/2019 Cap 23 Final

15/15

limitate ntre apoptoza estimat prin flo"citometrie i evaluarea morfologic

#Koberts, 555(.

!entru metodele =>?7A, se livreaz o scal de densitate optic, ceea ce

necesit interpretarea pe baza unui set de curbe standard. Aa cum este descris n

subcapitolul -.-.-, raportarea scalei densitii optice la numrul real de celule pare

destul de dificil. Higura -.-0 prezint o comparaie ntre indicele apoptotic derivat

din metoda =>?7A 8moarte celular9, descris n subcapitolul -.-.-, cu cea derivat

dintr"un procedeu T)1=>.

23.=. Conc*u&!!

=xist numeroase metode de evaluare a modificrilor indicelui apoptotic,

fiecare avnd meritul lor #tabelul -.-(. Acestea vor continua s se dezvolte pentru a

crete uurina i acurateea cu care evenientele relativ rare precum apoptoza pot fi

urmrite.

Ta/e*u* 23.3. Co%ara$!! #ntre te,n!c!*e d!%on!/!*e de et!are a !nd!ce*u! a%o%tot!c

Te,n!ca Re)er!n$eMor)o*o(!e

&. /icroscopie optic ursc*i colab., &'BL. /icroscopie electronic

'ra(entare AD6

&. /icroscopie optic Hraer i colab., &''4. Hlo"citometrie /c0ar*%,=van, &''B

Te,n!c! cu ant!cor%!

&. /icroscopie optic Koberts, 555. =>?7A 8moarte celular9 A%alai colab., &''B-. Hlo"citometrie Hoster, 5555

/odificri ale procedeelor de pregtire i creterea specificitii te*nicilor

aplicate, mpreun cu descoperirea unor mareri noi, mai specifici promit s fac

acest domeniu din ce n ce mai productiv pe viitor.

&4