Slide 1

Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapideLab 1CUPRINS

Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapideReceptoriiTehnologia FLIPR pentru detecia eliberrii Ca2+ intracelularDeterminarea Ca2+ intracelular prin sistemul FLIPRTehnica reaciilor competitive n detecia AMPc intracelular Tehnologia Complementrii Fragmentelor Enzimatice (EFC) Proteine de transport membranar Canalele ioniceTehnologia FLIPR i analiza canalelor ionice Tehnologia VIPRTM (Voltage Ion Probe Reader) i analiza canalelor ionice Proteinele MDR

O varietate de proteine membranare au fost exprimate n diferite celule eucariote (linii celulare ale mamiferelor, celule ale insectelor, drojdii) cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant, pentru a studia receptorii de suprafa celular, canalele ionice sau proteinele de transport.Proteinele membranare i rspunsurile celulare rapideReceptorii de suprafa celular mediaz semnalizarea celular de la suprafaa celular la citoplasm i/sau nucleu prin intermediul a dou procese majore, semnalizarea prin intermediul receptorilor legai la enzime sau a proteinelor de legare a GTP (proteinele G). Receptorii legai la enzime includ receptorii guanilat ciclazici, receptorii tirozin-kinazici, receptorii asociai tirozin kinazei, receptorii tirozin fosfatazici i receptorii serin/treonin kinazici n toate cazurile, n urma activrii este iniiat o cascad de evenimente care afecteaz statusul receptorilor i concentraia uneia sau mai multor molecule mici de semnalizare intracelulare. n cele ce urmeaz, vom discuta monitorizarea semnalelor mediate de proteinele G, care sunt activate de receptorii cuplai cu proteina G n urma legrii unui ligand specific.Receptorii consecutiv stimularii au loc modificari ale AMPc intracelular sau concentraiei Ca2+. - aceste dou molecule semnal specifice sunt implicate n procesele reglatoare ale sistemelor cardiovascular i nervos, mecanismelor imune, diferenierii i creterii celulare i metabolismului. Ambii mesageri acioneaz ca efectori alosterici pe proteine int specifice ale celulei, incluznd kinazele (protein kinaza A i C), lipazele (fosfolipaza C), proteinele de legare a Ca2+ (calmodulina) i canale ionice (receptori glutamat ionotropici). concentraiile citoplasmatice ale mesagerilor secundari sunt reglate prin intermediul enzimelor membranei plasmatice n cazul cii AMPc enzima adenilat ciclaza produce direct AMPc, iar n cazul cii Ca2+ lipazele sunt stimulate s produc mesagerul solubil inozitol trifosfatul (IP3) care induce eliberarea Ca2+ din reticulul endoplasmic. n unele cazuri canalele ionice sunt activate prin interaciunea direct cu subunitile proteinei G n prezent au fost realizate diferite tehnologii pentru monitorizarea intracelular a mesagerilor secundari n celule. Detectarea Ca2+ este n general bazat pe indicatorii fluoresceni, care au proprietatea de a penetra cu uurin membranele celulare i a-i altera emisia fluorescent n urma legrii Ca2+. Pentru msurtorile unui rspuns rapid i tranzitor, reacia de legare a Ca2+ trebuie s fie reversibil, oferind date cinetice importante care permit diferenierea unui semnal tranzitor tipic datorat activrii specifice a receptorului de un semnal nespecific care afecteaz homeostazia Ca2+ i permeabilitatea membranar.n mod curent se utilizeaz numeroase sisteme, diferite, pentru a detecta AMPc n testele celulare. n cele mai multe cazuri celulele sunt lizate n urma expunerii la un ligand specific, iar cantitatea de AMPc este determinat printr-o imunoreacie competitiv (Perkinelmer Life Sciences, Boston, Ma; Molecular Devices; Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, Ca) sau printr-o reacie enzimatic competitiv de complementare (Discoverx, Fremont, Ca). Tipic, receptorii cuplai cu proteina G sunt supraexprimai n liniile celulelor eucariote pentru a monitoriza concentraia mesagerilor secundari n urma stimulrii cu un ligand specific n multe cazuri, co-exprimarea unei subuniti corespunztoare sau a proteinelor G himerice este necesar pentru a obine un semnal suficient pentru detecieSistemul FLIPR permite citiri repetate pentru sistemele de analiz de mare capacitate n reaciile celulare. Pe scurt, celulele sunt ncrcate cu un indicator fluorescent (ex. Fluo-4 AM pentru Ca2+) care arat un spectru de absorbie compatibil cu o excitaie la 488 nm de la o surs laser argon mergnd pn la o emisie maxim la 516 nm n prezena Ca2+. Emisia fluorescent este indus simultan n toate situsurile unei plci cu 96 sau 384 de situsuri, iar cinetica eliberrii Ca2+ intracelular, declanat de expunerea la un ligand specific, poate fi monitorizat la o rat de maxim 60 de ori pe minut. Sistemul FLIPR distinge rapid agonitii complei, agonitii pariali i antagonitii pentru a accelera screening-ul primar i secundar.

Tehnologia FLIPR pentru detecia eliberrii Ca2+ intracelular

Fig 1.3. Determinarea Ca2+ intracelular prin sistemul FLIPR. (a) Este reprezentat o curb a cineticii Ca2+ tipice, precum i parametrii utilizai pentru calcularea semnalului fluorescent maxim. n acest exemplu maximele au fost msurate nainte i dup adiia ligandului (Max 1 si Max 2) i au fost standardizate prin diviziune la minima masurat nainte de adugarea compusului (Min). Media controalelor pozitive a fost stabilit control 100%, iar media controalelor negative a fost stabilit control 0%. Pentru fiecare godeu, au fost calculate activitile relative n funcie de controale.Ilustreaz un experiment tipic efectuat pe o linie de celular de mamifer transfectat cu un vector ce conine gena GPCR. Componentele pozitive reprezentate n figura 1.3(b) au fost verificate prin msurtori n duplicat, iar modulatorii cu molecul mic au fost ulterior testai pentru relaia doz-rspuns prin experimente EC50/IC50. Este reprezentat o curb a cineticii Ca2+ tipice, precum i parametrii utilizai pentru calcularea semnalului fluorescent maxim. n acest exemplu maximele au fost msurate nainte i dup adiia ligandului (Max 1 si Max 2) i au fost standardizate prin diviziune la minima masurat nainte de adugarea compusului (Min). Media controalelor pozitive a fost stabilit control 100%, iar media controalelor negative a fost stabilit control 0%. Pentru fiecare godeu, au fost calculate activitile relative n funcie de controale.

Determinarea Ca2+ intracelular prin sistemul FLIPR. Este reprezentat o diagram a fluxului pentru un experiment tipic. Celulele modificate genetic care au inta GPCR supraexprimat au fost adugate n plci cu 384 de godeuri peste noapte. Celulele au fost splate cu soluie tampon nainte de adaugarea soluiei tampon ce coninea colorantul Fluo-4 AM, urmat de o incubare de 45 de minute. Dup o etap adiional de splare, plcile au fost transferate n aparatul FLIPR i au fost adugai compuii chimici, urmai de adiia ligandului. Emisia fluorescenei a fost monitorizat ncepnd de la un moment anterior adiiei compusului i continuat pn cnd s-a observat o descompunere substaniala a semnalului. - exemple de agonist i antagonist sunt reprezentate n graficele mriteCele mai multe experimente utilizate pentru detecia AMPc intracelular sunt bazate pe anticorpi monoclonali care recunosc specific AMPc. Clasic, lizatele celulare sunt amestecate cu AMPc biotinilat exogen pentru a forma un heterotrimer cu un anticorp specific i streptavidina. Formarea acestui complex este n competiie cu AMPc endogen nebiotinilat. Streptavidina i anticorpii se pot lega covalent la un fluorofor donor i acceptor (criptat de europiu i aloficocianina), formnd o pereche FRET interactiv dup formarea complexului. Un semnal sczut este observat atunci cnd este crescut producia de AMPc intracelular, datorit competiiei pentru legarea la anticorpul specific. Tehnica reaciilor competitive n detecia AMPc intracelularTehnologia AlphaScreenTM (PerkinElmer Life Sciences) este o tehnologie alternativ care permite detecia cantitativ a unei game variate de componente celulare, inclusiv AMPc. AlphaScreen are la baz utilizarea unor particule donor i acceptor care sunt acoperite cu un strat de hidrogel care ofer grupri funcionale pentru bioconjugare. Cnd particulele sunt aduse una lng alta, este iniiat o cascad de reacii chimice pentru a produce un semnal nalt amplificat. nainte de excitarea laser, un fotosensibilizator din particula donoare convertete oxigenul ambiental la starea excitat de singlet. Moleculele de oxigen n starea de singlet difuzeaz pentru a reaciona cu chemiluminiscentul de la nivelul particulei acceptoare, ceea ce activeaz fluoroforii coninui n aceeai particul. AlphaScreen a fost utilizat n testele funcionale ale GPCR pentru detecia produciei endogene de AMPc. EFC are la baz organisme modificate genetic ce conin dou fragmente legate de o reacie enzimatic, de exemplu acceptorul enzimei (EA) i donorul enzimei (ED). Fragmentele separate sunt inactive i numai formarea spontan de heterodimeri duce la forma enzimatic activ Tehnologia HitHunterTM (DiscoveRx) este bazat pe o variant modificat a enzimei -galactozidaza care formeaz perechea EA/ED. Aceast tehnologie a fost adaptat pentru utilizarea n multe reacii n care sunt implicate: kinaza, receptorul progesteronic, receptorul estrogenic i AMPc. n acest capitol vom discuta numai despre aplicaia specific pentru detecia intracelular a AMPc. Tehnologia Complementrii Fragmentelor Enzimatice (EFC)Pe scurt, este utilizat un conjugat peptidic ED-AMPc din care AMPc este recunoscut de un anticorp specific. n absena anticorpului specific, fragmentul ED este capabil s complementeze EA pentru a forma un complex activ. n aceast reacie, anticorpul AMPc este titrat pentru inhibiia complet a formrii enzimei. Expunerea lizatului celular la o anumit cantitate de anticorp permite formarea complexului anticorp-AMPc, reducnd astfel cantitatea liber de anticorp. Ca urmare, adugarea de conjugat ED n urmatoarea etap a reaciei va conduce la scderea formrii complexului anticorp-ED, promovnd astfel complementarea enzimei active. ED-conjugat liber din reacie este proporional cu concentraia AMPc intracelular, acelai principiu putnd fi aplicat pentru msurarea activitii -galactozidazei. O mare varietate de substane sunt transportate n interiorul organismelor complexe, n unele cazuri prin intermediul transportului pasiv, prin difuziune facilitat datorat gradientului de concentraie sczut, sau prin intermediul cilor paracelulare sau transcelulare. Absorbia i distribuia multor constitueni alimentari precum ionii, zaharidele, aminoacizii i nucleotidele sunt mediate/facilitate de proteine specifice de transport membranar, care formeaz canale prin membranele celulare. Mecanisme similare sunt necesare pentru ndeprtarea activ a xenobioticelor, produilor de metabolism din esuturi. Proteine de transport membranarAceste proteine specifice de transport carrier sunt divizate n dou clase, transportori uniport (sisteme uniport), respectiv transportori cuplai (sisteme de transport cuplat), primii transportnd un singur tip de molecul de pe o fa pe alta a membranei, iar transportorii cuplai transfer o molecul n funcie de transportul simultan sau secvenial al celei de-a doua. Sistemele de transport cuplat sunt la rndul lor divizate n transportori simport, care transport simultan moleculele n aceeai direcie i transportori antiport, care transport moleculele n direcii opuse. Unii transportori specifici acioneaz ntr-o manier pasiv, tranfernd moleculele n funcie de gradientul de concentraie; acesta este cazul multor nutrieni precum glucoza, gsit n concentraii mari n spaiul extracelular. O situaie similar este reprezentat de canalele ionice cu poart comandat de ligand sau de voltaj din sistemul nervos, care elibereaz ionii dup stimularea de ctre neurotransmitori, respectiv depolarizarea membranar. n schimb, transportorii activi sunt dependeni de hidroliza ATP-ului i ei transfer moleculele mpotriva gradientului de concentraie. Cel mai bine cunoscut i variat grup de proteine de transport activ l constituie super-familia de transportori ABC (caset legat la ATP) Au fost descrise peste 50 de transportori ABC, substraturile transportate fiind foarte variate: aminoacizi, zaharide, ioni anorganici, polizaharide, peptide i chiar proteine mari. Unul dintre cei mai studiai transportori ABC, proteina de rezisten la mai multe medicamente - MDR1 (multi-drug resistance) a fost n centrul ateniei multor eforturi de descoperire a medicamentelor n ultimii ani deoarece supraexpresia acestei proteine n celulele canceroase umane poate determina rezistena simultan a acestor celule la o varietate de chimioterapice din clase diferite. Majoritatea celulelor menin un potenial electric de o parte i de alta a membranei,care este cel mai bine studiat la nivelul neuronilor i celulelor musculare al cror potenial atinge o valoare nalt de aproximativ -70mV. Potenialul membranar este meninut de pompa de sodiu i potasiu (Na+, K+ - ATPaza) care funcioneaz ca o pomp antiport de transport activ ce scoate din celula 3 ioni de Na+ i introduce 2 ioni de K+ pentru fiecare molecula de ATP hidrolizat, crend astfel o ncrctur negativ n interiorul celulei Canalele ioniceProteinele canal formeaz pori hidrofili care traverseaz bistratul lipidic, permind anumitor ioni s treac de pe o parte pe cealalt a membranei datorit gradientului de concentraie. O caracteristic a canalelor ionice este prezena unui mecanism cu poart care controleaz micarea ionilor. Schimbrile potenialului membranar pot fi induse ntr-o manier limitat spaial, prin intermediul canalelor de Na+ cu poart comandate de ligand n acest caz neurotransmitor. Deschiderea ulterioar a canalelor de Na+ comandate de voltaj induce auto-propagarea depolarizrii de-a lungul membranei celulare (potenialul de aciune), inducnd n final deschiderea canalelor de Ca2+ cu poart comandate de voltaj de la nivelul sinapsei. Influxul de Ca2+ induce eliberarea neurotransmitorilor n fanta sinaptic, propagnd semnalul n celula post-sinaptic. Funcionarea deficitar a canalelor ionice st la baza multor afeciuni incluznd afeciuni musculare i cardiace, epilepsia, migrena, depresia i ataxia.n acest capitol vom insista pe canalele ionice care sunt exprimate n neuroni i celulele musculare, avnd astfel un rol important n semnalizarea neuronal i contracia muscular. Deschiderea canalelor ionice este n cele mai multe cazuri monitorizat prin msurarea modificrilor potenialului membranar. Standardul de aur utilizat n acest scop este tehnologia patch clamp, care ofer o sensibilitate foarte nalt, rezoluie temporal bun, precum i msurarea conductanei unui singur canal la un voltaj precis. Aceast tehnologie ofer cele mai bune informaii pentru evaluarea funcional a canalelor ionice; dezavantajele majore ale acestei tehnici includ participarea operatorilor experimentai, experimente laborioase i rezultate puine. n prezent, diferite companii sunt implicate n dezvoltarea noilor echipamente pentru automatizarea procedurilor patch-clamp. Unul dintre cele mai avansate echipamente este staia IonWorksTM (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) care utilizeaz tehnicile de fluidic integrat pentru poziionarea automat a unei singure celule n godeurile unui suport special. n registrri ale unui singur canal ionic au fost obinute la o rat de pn la 2000 de reacii pe zi. Rezultate mai bune sunt obinute prin utilizarea coloranilor solvatocromatici pentru care celulele sunt permeabile, precum DiBAC (Molecular Probes, Eugene, OR) sau prin utilizarea colorantului recent descoperit FMP (Molecular Devices). Asocierea cu sistemul FLIPR permite monitorizarea funciei canalelor ionice prin sisteme de analiz de mare capacitate, depind numrul de 30000 de compui analizai pe zi. Detalii cu privire la alte tehnologii de analiz a canalelor ionice.Pentru identificarea compuilor care moduleaz activitatea canalelor ionice este imperativ disponibilitatea evalurilor rapide i economice ale activitilor biologice prin analize de mare capacitate. Una din metodele bazate pe fluorescen care testeaz modificrile potenialului membranar utilizeaz o sond fluorescent poteniometrica acid bis-(1,3-dibutilbarbituric) trimetin oxonol [DiBAC4(3)], care separ compartimentele intracelulare i extracelulare n funcie de potenialul electric de o parte i de alta a membranei. Tehnologia FLIPR i analiza canalelor ionice n urma depolarizrii celulei, colorantul ptrunde n celul, iar legarea la situsurile hidrofobe intracelulare se traduce ntr-o cretere a intensitii semnalului fluorescent. Invers, hiperpolarizarea membranei declaneaz eliminarea colorantului din celul i scderea fluorescenei deoarece cuantumul produciei DiBAC4(3) este sczut n mediu apos. Separarea DiBAC4(3) fiind un proces lent, aceasta tehnologie nu este aplicabil pentru evaluarea canalelor cu o cinetic rapid la nivelul porii sau cu desensibilizare rapid. mbuntiri substaniale au fost obtinue odat cu descoperirea colorantului FMP , care are o cinetic de separare mai rapid.Tehnologia VIPR (electrod folosit la msurtori de potenial ntre mediul intern i extern al unei celule) (Aurora Bioscience, San Diego, CA) este bazat pe FRET i utilizeaz dou molecule fluorescente. Prima molecul, oxonol este un ion hidrofob, nalt fluorescent, ncrcat negativ, care poate fi rapid redistribuit ntre dou situsuri de legatur pe cele dou fee ale membranei plasmatice ca rspuns la modificrile potenialului membranar. Cea de-a doua molecul fluorescent, lipidul coumarina se leag specific pe o fa a membranei plasmatice i funcioneaz c un donor FRET pentru molecula acceptoare de oxonol sensibil la voltaj.Tehnologia VIPRTM (Voltage Ion Probe Reader) i analiza canalelor ionice Cnd molecula de oxonol ajunge la nivelul situsului intracelular al membranei plasmatice n urma depolarizrii, FRET este sczut, ceea ce se traduce n creterea fluorescenei donorului i descreterea emisiei oxonolului. Aceast tehnologie permite dezvoltatea cercetrilor n domeniul biologiei canalelor ionice. Tehnologia VIPR poate furniza cadre de citire subsecvene real-time n urma reaciilor efectuate n microplci. MDR este n principal legat de supraexpresia proteinelor superfamiliei de transportori ABC. Cel mai studiat membru al acestei superfamilii este produsul genei MDR1 (glicoproteina P) care este exprimat n intestin, rinichi, ficat, bariera hemato-encefalic i n multe celule tumorale. n ultimul caz, supraexpresia genei MDR1 este unul din factorii principali ai rezistenei celulelor la chimioterapia cancerului. Aceast rezisten este rezultatul pomprii medicamentelor anticanceroase n exteriorul celulelor, rezultnd scderea nivelelor intracelulare ale acestora. Moleculele mici, capabile s reversibilizeze efluxul pot restaura sensibilitatea la medicamente a celulelor tumorale rezistente. Proteinele MDRCele mai utilizate metode pentru identificarea inhibitorilor pompei MDR sunt bazate pe substraturile fluorescente ale glicoproteinei P, precum Hoechst 33342, rodamina 123 i rodamina 6G. Celulele sunt ncrcate cu substratul, iar colorantul extracelular este ndeprtat prin splarea cu detergeni anterior lizei Msurtorile emisiei fluorescenei ofer rezultate cantitative, proporionale cu acumularea intracelular a substratului. Expunerea celulelor la inhibitorii pompei MDR va reduce efluxul substratului i deci va determina nregistrarea unui semnal fluorescent crescut. Aceste reacii nu sunt omogene i implic etape de splare dup ncrcarea celulelor cu colorantul corespunzator. Un nou substrat pentru pompa MDR a fost dezvoltat recent pentru realizarea unor reacii omogene ntr-un sistem FLIPR Tehnica FLIPR pentru Multirezistena la Medicamente (FLIPR Multidrug Resistance Assay) (Molecular Devices) este o aplicaie omogen care necesit numai 15 minute de incubare la temperatura camerei cu un colorant proprietar, care este transportat de ctre produsul genei MDR1 i el i modific proprietile fluorescente numai n urma aciunii enzimelor intracelulare asupra sa. Aceasta permite performana reaciilor cinetice asupra celulelor vii pentru screening-ul inhibitorilor pompei MDR. Eliminarea etapelor de splare i controlul temperaturii a determinat automatizarea reaciei