CERCETARI EPIDEMIOLOGICE PRIVIND INFLUENTA FACTORILOR REPRODUCTIVI SI A POLIMORFISMELOR GENELOR CYP1A1 SI P53

ASUPRA RISCULUI PENTRU NEOPLAZII GENITALE IN POPULATIA DIN REGIUNEA DE NORD-EST A ROMANIEI

Director proiect: Prof. Univ. Dr. DOINA AZOICĂI

I. Descriere proiect:

Vom derula un studiu caz-martor al carui scop este stabilirea frecventei factorilor de risc asociati (reproductivi si susceptibilitate genetica) in grupul de bolnavi (paciente cu neoplazii ginecologice) comparativ cu cel al martorilor (care nu prezinta istoric de neoplazii ginecologice).

Principii de desfasurare: selectia subiectilor se face in functie de prezenta sau absenta bolii, astfel vom avea doua grupuri (cazuri si martori); ambele grupuri trebuie sa fie reprezentative (marimea esantioanelor) si sa asigure comparabilitate maxima (criterii de expunere); raportul cazuri/martori va fi de 1/2.

Selectia cazurilor si cea a subiectilor martori se va face dintre persoanele care vor frecventa Ambulatorul Spitalului Universitar Sfantul Spiridon Iasi in perioada 2008-2011. Grupul de studiu va include: subiecti cu cancer ovarian, endometrial si de col uterin (numarul de cazuri pentru fiecare neoplazie va fi stabilit in functie de freventa tipului de cancer in populatie), iar martorii vor fi selectati dintre persoanele care vor frecventa Ambulatorul si nu vor prezenta istoric de cancer de orice tip.

Fiind un studiu de epidemiologie moleculara, principalele probleme legate de metodologia cercetarii sunt: informatia oferita subiectilor si tipul de consimtamant obtinut de la subiectii participanti la studiu (consimtamant scris, clar si informat pentru participarea la studiu se va obtine atat de la cazuri, cat si de la martori); modul de recoltare, transport si conservare a probelor; cantitatea de sange care trebuie recoltata; reproductibilitatea si repetabilitatea testelor; eterogenitatea rezultatelor (erori de masurare, erori de selectie, variabilitate in raspuns la nivel inter- si intra- populational, interactiunea impredictibila intre expunerile la factori de mediu si susceptibilitatea genetica); factori de confuzie; erori de publicare; metodele de laborator utilizate; interpretarea biologica a testelor; puterea asocierii; consideratii statistice (necesara stratificarea pentru indepartarea erorilor); considerente etice (respectarea protocoalelor in obtinerea informatiilor, precautii de confidentialitate si securitate a datelor, asigurarea anonimatului bazei de date in cazul unor colaborari, stabilirea unor politici pentru dreptul de proprietate intelectuala; obtinerea consimtamatului scris, clar si informat al subiectului partcipantla studiu; stabilirea unui protocol clar de comunicare a rezultatelor care sunt de ajutor pentru binele pacientului; avizul Comitetului de Etica al UMF Gr.T.Popa Iasi).

Pentru studierea factorilor de risc reproductivi se va utiliza un chestionar special conceput care va fi validat pe populatia studiata. Chestionarul va include informatii privind: varsta, varsta menarhei, varsta menopauzei, varsta la prima nastere, numar nasteri numar avorturi, infertilitate, consum de CO, THS, indice de masa corporala.

Pentru evaluarea polimorfismelor genei CYP1A1 si polimorfismului codonului 72 al genei p53 vom utiliza tehnica RFLP care presupune urmatoarele etape: amplificarea, restrictia, migrarea si analiza diferentiala a rezultatelor. Vom studia polimorfismele MspI si Ile/Val ale genei CYP1A1 si polimorfismul codonului 72 al genei p53 (Arg/Pro), implicate in aparitia cancerelor ginecologice, pe

probe de sange de la cazuri si de la martori, care vor fi stocate la -20 °C. ADN-ul genomic va fi izolat din globulele albe din sangele periferic utilizand un kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega, Madison, Wi). Genotiparea polimorfismului MspI al CYP1A1 si a polimorfismului Ile/Val va fi facuta prin metoda PCR-RFLP descrisa de Hayashi si Oyama. Este o metoda bazata pe identificarea lungimii fragmentelor de ADN dupa digestia cu enzime de restrictie. ADN-ul va fi amplificat prin PCR utilizand diferite oligonucleotide ca primeri, apoi va fi sectionat in fragmente de restrictie utilizand endonucleaze corespunzatoare, care sectioneaza moleculele de ADN la nivelul site-urilor de restrictie recunoscute de catre acestea. Produsii rezultati vor fi separati prin electroforeza in gel de agaroza-TBE (solutie tampon) si vizualizati cu bromura de etidiu.

Se va realiza o colectie de ADN utila si pentru efecuarea unor cercetari ulterioare legate de aceleasi gene sau de alte gene.

Monitorizarea ulterioara a pacientului cu risc va include sfatul genetic.

Se va realiza o baza de date in Excel, care va fi ulterior importata si prelucrata cu ajutorul programului SPSS si EpiInfo 3. Se vor utiliza statistici descriptive, teste de semnificatie statistica (chi2, t-student, Fisher), compararea mediilor cu ajutorul stastisticii ANOVA, corelatii, regresii liniare si logistice, calcularea riscurilor (odds ratio - OR), calculate la un prag de semnificatie de 5%, cu un interval de incredere de 95%.