Analiza structurala prin raze X

Transformata Fourier si cristalografia de raze X

Cea mai mare putere a rezolutiei pentru determinarea structurilor macromoleculelor si complexelor macromoleculare

Matematic: transformata Fourier si inversa ei convertesc dintre doua

domenii (“spatii”) r (exemplu: spatiu sau timp) si domeniul k

(exemple: momente sau frecvente)

Transformata Fourier

21( ) ( )2

i r kF k f r e dr

21( ) ( )2

i r kf r F k e dk

Pierderea fazei prin transformata Fourier inversa unidirectionala

Daca se considera faza corecta

Faza incorecta (=0)

In doua dimensiuni (xy)

Amplitudine si faza

Aranjare hexagonala a “pick”-urilor

Unele componente au fost sterse

Se regaseste distributia initiala

Componente de amplitudini mici au continut redus de informatie

Aplicatie: metoda de reduce a zgomotului

3. Se face transformata Fourier inversa

1. Transformata Fourier a unui obiect zgmotos

2. Se substituie anumite componente de amplitudine mica din transformata Fourier

= 0

Doar o sectiune prin transformata Fourier

Distorsiune semnificativa daca se

foloseste doar un

numar redus de coordonate pentru

reconstructie

Exemplu de design experimental

Imaginea de difractie a cristalului este trasformata Fourier a structurii

Difractia pe un singur punct

0/ /S s s

Difractia pe doua obiecte punctiforme

0/ /rS rs rs

• Interferenta constructiva daca rS=0,+1, +2, • Interferenta destructiva daca rS=+1/2, +3/2,

• Imaginea de difractie F(S) este data de:

2( ) i r SF s e

Pentru un obiect macroscopic constand din mai multe puncte cu diverse puteri de

imprastiere:

2( ) ( ) i r SF S r e dr

Densitatea electronica a structurii proteinei poate fi

obtinuta din inversa transformatei Fourier a

imaginii de difractie

In microscopie, inversa transformatei Fourier este facuta de catre lentile!

• Nu exista microscop de raze X cu rezolutie si sensibilitate suficienta

• Oglinzile de raze nu au rezolutiei suficienta pentru o singura proteina.

• Puterea radiatiei ar trebui sa fie prea mare iar proteina ar fi …. denaturata

Procedeu general:

• Se inregistreaza imaginea de difractie a cristalului proteic

• Se calculeaza inversa transformatei Fourier

• Dezavantaj: se pierde informatia de faza

Problema fazelor

• Metode prin care se incearca cunoasterea fazelor

• Cea mai folosita metoda: inlocuirea cu atomi grei

• Un specific al difractiei pe cristale macroscopice: nu se obtine o image continua ci spoturi de difractie

Retea cristalina in spatiul real/reciproc

• Celula unitara: cea mai mica unitate din care se poate genera cristalul doar prin translatii

• Pentru un cristal proteic celula unitara este formata din una sau mai multe molecule

Cristalografia de raze X a proteinelor

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl?template=highlights.html&pdbcode=n/a&highlights=TRUE

Producerea unor cristale adecvateMonoscrital cu geometrie si marime potrivita

Neadecvate

Adecvate

In mod obinuit, neadecvate

TransparenteFara neomogenitatiFara culoare sau indice de refractie

Metoda “picaturii”

Robot pentru metoda picaturii

• Se incepe cu o concentratie de proteina de 2-50 mg/ml

• Nu trebuie sa contina contaminanti (alte proteine, virusuri)

• Fara proteine impachetate gresit• Fara aditivi chimic care nu sunt necesari la

stabilitate• Proteinele cu capete mai putin flexibile crsitalizeaza

mai bine• Dimensiunea optima a cristalului: ~0,1 mm

Exista kituri comerciale petru “screening” de cristalizare

http://www.jenabioscience.com/cms/en/1/browse/631_macromolecular_crystallography.html

Parametri importanti:

• Concentratia proteinei• Tipurile de sare si concentratia lor• pH• Tipul si concentratia surfactantilor• Temperatura• Viteza de cristalizare

Detector CCD (charge-coupled device)

Sursa: anod rotitor sau sincrotron

Sincrotron

Imaginea de difractie

Determinarea fazei, inlocuirea cu atomi grei

Cristalizare in solutie care contine atomi grei

Calcularea densitatii elecronice si rafinarea structurilor

http://www.netsci.org/Resources/Software/Struct/xray.html