adn arn exogen

8/10/2019 ADN ARN Exogen

1/11

TEHNOLOGII MODERNE PENTRU IDENTIFICAREA PATOGENILOR

Tehnicile de biologie molecular s-au dovedit utile pentru diagnosticul de laborator i promita fi extrem de utile pentru diagnosticul, terapia i investigaiile epidemiologice i controlul

infeciilor.Sistemele actuale au o acuratee i sensibilitate ce le permit utilizarea pe scar larg n

monitorizarea pacienilor n ambulator, n programe ample de screening n rile n curs dedezvoltare precum i n serviciile de asisten medical n ambulator. n urma acestui procescontinuu de dezvoltare tehnicile bazate pe analiza de acizi nucleici promit s devin noul standardde aur n detecia, identificarea i caracterizarea agenilor patogeni microbieni.

!intre aceste noi tehnologii, diversele variante ale "eal-Time #$" i tehnicilor nrudite suntcele mai potrivite pentru utilizarea n laboratorul de diagnostic clinic datorit maturitii lor cametode verificate. Tehnicile de microarra% i flo&citometrie se anun drept viitoare candidate la

adoptarea pe scar larg deoarece permit procesarea unui volum mare de date n acelai experiment'Tabelul ().

Tehnicile bazate pe analiza acizilor nucleici tind s devin noul standard n detecia agenilorpatogeni microbieni deoarece tehnicile consacrate cum sunt culturile necesit prea mult timp sausunt insuficient de sensibile n special dac pacientul a primit antibiotice sau medicul are de-a facecu organisme cu necesiti nutriionale deosebite. *ai mult, tehnicile bazate pe acizi nucleici permitmai mult dec+t simpla detecie i identificare. Se pot obtine informaii asupra chimiorezistenei,

prezenei factorilor de virulen i tipului molecular, tehnicile fiind ncununate de succes n gradediferite av+nd n vedere intrarea lor recent n uz.

!atorit numrului mare de aplicaii i posibilitii permanente de dezvoltare a unor noiaplicaii adiionale, tehnicile bazate pe acizi nucleici nlocuiesc n prezent strategiile convenionalede identificare a microorganismelor patogene, fie c sunt folosite n analiza coloniilor suspecteidentificate prin metode curente, fie pentru detecia direct n probe biologice.

ceste tehnici rapide continu s evolueze alert de la utilizarea n cercetare la deteciaclinic a agenilor patogeni ncep+nd de la nivelul laboratoarelor de referin i continu+nd spresistemele bazate pe servicii de ngriire n ambulator. olumul de date procesat crete n paralel cuaceast tendin pe msur ce detecia unei singure inte este nlocuit de detecia unor intemultiple i accentul se mut pe folosirea unor metode mai puin invazive pentru obinerea de probe.

1


2/11

TABEL 1 Comparaie ntre dierite !i!teme de ana"i#$

%i!tem dee&a"'are

%en!i(i"itate

%pe)i*)itate

+o"'m'"inormaiei

,enerate

Timp Co!t'" re"ati& Comp"e

$ulturi sau

alte teste

convenionale

.na"t$ .na"t$ Moderat/!)$#'t 0i"e Moderat/!)$#'t Moder

!)$#'t

"ealTime #$" .na"t$ .na"t$ Moderat/!)$#'t Min'te /ore

Mare Moder

*icroarra% .na"t$ .na"t$ Mare Ore Foarte mare Moder

mare

/lo&-citometrie .na"t$ .na"t$ Mare Min'te Mare/ oarte mare Moder

mare

!ezvoltarea sistemelor bazate pe acizi nucleici e supus unor sisteme de evaluareinterrelaionate0 cantitative i calitative. #arametrii cei mai importani aparin+nd primei categoriisunt sensibilitatea, specificitatea i valorile predictive pozitive i negative. $u c+t o tehnic este maisensibil i mai specific cu at+t este mai valoroas. Similar, mai muli parametri calitativiinflueneaz o tehnic, printre acetia numr+ndu-se uurina utilizrii, antrenamentul necesar,sensibilitatea la contaminani i interfereni, varietatea probelor care pot fi analizate i, cel maiimportant, avantaele asupra metodelor standard. n cursul procesului de dezvoltare tehnicile trebuieoptimizate pentru a obine niveluri de performan acceptabile pe baza acestor parametri. 1dat

puse n aplicare, tehnicile trebuie constant monitorizate, urmrindu-se rezultatele fals pozitive i falsnegative.

2


3/11

A,enii pato,eni mi)ro(ieni i Rea"/Time PCRncep+nd cu sf+ritul anului 233(, numrul tehnicilor "eal-Time #$" destinate agenilor

infecioi descrise n literatur a crescut spectaculos n paralel cu varietatea agenilor pentru care aufost dezvoltate aceste tehnici. !in nefericire, utilizarea unei tehnici folosite n cercetare n contextul

diagnosticului clinic nu este simpl i este supus unor constr+ngeri de ordin practic.!up cum s-a explicat mai sus, pe l+nga evaluarea comparativ cu tehnica standard, trebuie

determinai un numr mare de parametri ncep+nd cu sensibilitatea i specificitatea analitic iclinic i merg+nd p+n la efectele substanelor potenial inhibitoare i la indicatori statisticicompleci cum ar fi valorile predictive pozitive i negative. #rin urmare, puine dintre aceste tehniciau fost comercializate i un numr i mai mic au fost certificate formal pentru utilizarea de rutin nlaborator. cest fapt a limitat ntr-un oarecare grad acceptarea "eal-Time #$" n context clinic irm+ne cea mai mare provocare n adoptarea de ctre clinicieni a metodelor bazate pe acizi nucleici.

+ir'!'ri"en ciuda acestor obstacole, abundena tehnicilor "eal-Time #$" i a agenilor pentru care au

fost dezvoltate sunt uimitoare. !intre subspecializarile microbiologiei, "eal-Time #$" a ucat celmai semnificativ rol n virusologie, dezvluind relaiile dintre ageni i manifestrile clinice. "eal-Time #$" a fost folosit pentru confirmarea unor multiple genotipuri virale i pentru discriminareantre ageni n co-infecii.

Studiile ce au utilizat "eal-Time #$" ca miloc de investigaie au dezvluit detalii asupraunor relaii puin nelese ntre agenii virali specifici i boli cronice cum sunt malignitile isindroamele imune.

Spre exemplu, grupul lui Sidrans4% a folosit "eal-Time #$" pentru a demonstra c prezena!5 aparin+nd papillomavirusului uman n serul pacienilor cu carcinoame scuamoase de cap ig+t poate servi ca mar4er util precoce al bolii metastatice. ntr-un alt studiu recurg+nd la "eal-Time#$", *ac6enzie i colaboratorii au putut exclude implicarea virusului herpetic n leucemia acutalimfoblastica.

lte studii au determinat ncrctura viral n diferite stadii ale infeciei, demonstr+nd c"eal-Time #$" poate fi utilizat pentru a stabili dac o infecie este activ, cronic sau n remisiune,eficacitatea terapiilor antivirale i interaciunile gazd-patogen, toate av+nd implicaii practiceasupra tratamentului clinic.

"eal-Time #$" a ucat de asemenea un rol maor n investigarea izbucnirii epidemiilor isupravegherea virusurilor nou descoperite cum sunt irusurile 7endra, 8est 5ile i 9bola.$ercetri susinute de sensibilitatea i puterea acestor tehnici au demonstrat sau susinut legturiepidemiologice ntre secvenele virale i manifestrile clinice.

1 gam vast de tehnici cu diverse grade de acuratee au fost descrise pentru diveripatogeni transmii prin alimente sau ap cum sunt virusurile hepatitice i 9: pentru ageni cutropism respirator cum sunt adenovirusurile, rinovirusurile, virusul sinciial respirator i virusulinfluenza i cei exotici, cum sunt virusul variolei i febrei hemoragice.

Ba)terii"e"eal-Time #$" a avut un impact aproape la fel de remarcabil n bacteriologie. $a i n cazul

virusologiei, aceast tehnic, alturi de cele de hibridizare este cea mai folosit. #rintre numeroasele3


4/11

aplicaii ale acestei tehnici se numr identificarea patogenilor, detecia unor gene specifice devirulena i a altor mar4eri i estimarea chimiorezistenei. semenea aplicaii au beneficii imediate

pentru pacieni deoarece pot determina agenii infectani i nivelul de infecie i de asemeneaatitudinea terapeutic de urmat duc+nd la reducerea perioadelor de spitalizare i a numrului detulpini rezistente ce ptrund n circulaie.

E')ariote"eSpre deosebire de organismele anterioare, eucariotele au beneficiat de un numr mai mic de

tehnici. n ciuda acestui fapt, respectivele tehnici, n principal de "eal-Time #$" au produs unimpact semnificativ asupra studiului fungilor, paraziilor i protozoarelor cu caracter patogen,definind relaii ntre agenii patogeni i patologie, chimiorezistena i permi+nd simpla detecie iidentificare a patogenilor.

Te2no"o,ii n )'r! de de#&o"tare

!ou tehnologii recent aprute ce prezint un interes deosebit pentru identificareapatogenilor pornind de la acizi nucleici sunt microarra% i flo&citometria. mbelor li s-a demonstratutilitatea la nivel conceptual, dar nu au auns s fie nc utilizate n context clinic. 1 a treiatehnologie, numita analiza profilului gazdei se bazeaz pe "eal-Time #$" pentru a detectamodificri la nivelul gazdei care semnalizeaz infecia i manifestrile clinice. #oate fi de asemeneaadaptat pentru utilizare alturi de microarra% i flo&citometrie. Totui, dei promitoare la nivelteoretic, realizarea profilului gazdei va trebui se depeasc nite obstacole importante 'dar nuinsurmontabile) nainte de fi aplicat pe scar larg n laborator pentru identificarea patogenilor.

4


5/11

C"a!i*)area &ir'!'ri"or anima"e#ilonii ciclului biologic al unui virus sunt tipurile de acizi nucleici formai n timpul

replicrii sale i calea de sinteza a "5m. "elaia dintre "5m viral i acidul nucleic al particuleiinfectante st la baza unei metode simple de clasificare a virusurilor. n acest sistem, "5m viraleste denumit catena p"'!3 iar secvena sa complementar, care nu poate funciona ca "5m

reprezint catena min'!. 1 caten !5 complementar unui "5m viral reprezint de asemeneao caten min'!. ;enerarea unei catene p"'!de "5m necesit ca matria o caten minus de "5sau !5.

/olosind acest sistem, se identific ase clase de virusuri animale.


6/11


7/11

C"a!a6+ir'! Ga#de)'no!)'te

Dimen!i'nea ,enom'"'i78(9

Cap!'"a

A"te proprietati Domenii de )er)eta

7


8/11

CLA%A I 7ADN9

denovirusuri'clasa =a)

ertebrate >? 5u Se replic n nucleul celulei gazd: folose teenzimele gazdei pentru sinteza "5m viral.

Sinteza i modularea sinterapia genic 'vectori).

7erpesvirusuri'clasa =a)

ertebrate (@3 !a Se replic n nucleul celulei gazd: folose teenzimele gazdei pentru sinteza "5m viral.


SA3'clasa =a)

#rimate @.@ 5u Se replic n nucleul celulei gazd: folose teenzimele gazdei pentru sinteza "5m viral.


accinia virus'clasa =b)

ertebrate 233 !a Se replic n citoplasma celulei gazd folosindenzime virale.

Structura genomului: sin

CLA%A II 7ADN9

#arvovirusurile ertebrate @ 5u u un genom !5ss "eplicarea !5: terapia

CLA%A III 7ARN9

"eovirusurile ertebrate (.2-A.33 5u u un genom compus din (3 segmente "5ds:folosesc pentru replicare enzime virale.

Sinteza "5m folosind

CLA%A I+ 7ARN9

#oliovirus 'clasa=a)

#rimate B 5u Sintetizeaz o singur molecul de "5m careeste translatat ntr-o poliprotein clivat pentrua genera proteine func ionale

"eplicarea "5 viral: npoliproteic.

irusul Sindbis'clasa =b)

ertebrate,insecte

(3 !a Sintetizeaz cel pu in 2 molecule "5m, fiecaredintre ele fiind translatat ntr-o poliproteincare va fi clivat n proteine func ionale.

/ormarea membranei: bi

CLA%A + 7ARN9

irusul Stomatiteiveziculoase 'clasaa)

ertebrate (2 !a !e ine o "5 polimeraz virus-specific ceproduce c+teva molecule "5m din genomul snesegmentat

/ormarea membranei: bi

irusul gripal'clasa b) *amifere,psri (.3CDC>.> !a #rezint un genom cu E segmente "5ss:folose te o "5 polimeraz virus-specificpentru a moleculele de "5m

/ormarea membranei: bpreven ia bolilor.

CLA%A +I 7ARN9

"etrovirusurile ertebrate,insecte,levuri

@-E !a $opiaza "5-ul genomic n !5 folosind orevers-transcriptaz viral: integreaz !5-ulviral n genomul gazdei

Transformarea celular:

8


9/11

Fi,'ra 15$lasificarea virusurilor animale n funcie de genom i calea de sinteza a "5m.!5 este colorat n albastru: "5 n ro u. "5m viral este considerat av+nd catena p"'!, fiindsintetizat dintr-o caten min'! de "5 sau !5. irusurile din $lasa = de virusuri'retrovirusuri) au 2 catene p"'!de "5 genomic identice "5, din motive nc neelucidate.Adaptat d'p$ Lodi!23 Har&e:; Ber83 Arno"d; 0ip'r!8:3 %5 La pana la (3 ori mai mari. $utoate acestea, in conditiile unor teste efectuate cu gria metodele cantitative pot aduce dateimportante asupra naturii hepatitei de tip $. *aoritatea pacientilor cu infectie cronica prezintaniveluri de "5 viral 'incarcaturi virale) intre (33,333 '(3 @) si (3,333,333 '(3B) copii pe mF.9xprimate ca G=, acestea corespund unor valori medii intre @3,333 si @ milioane de G=.

=ncarcaturile virale nu se coreleaza cu severitatea infectiei sau cu un prognostic sumbru 'cain infectia cu 7=): in schimb, ele sunt corelate cu probabilitatea raspunsului la terapia antivirala.

"atele de raspuns la un tratament complet cu peginterferon si ribavirina sunt mai mari la pacientiicu niveluri mici de "5 viral. 9xista mai multe definitii ale termenului de HHnivel scazutHH de "5viral, dar definitia uzuala este a unui nivel sub E33,333 G= 'I 2 milioane de copii) per mF.

9
http://www.whfreeman.com/college/book.asp?disc=BIO&id_product=1124001436&@id_course=1058000157&disc_name=Biologyhttp://www.whfreeman.com/college/book.asp?disc=BIO&id_product=1124001436&@id_course=1058000157&disc_name=Biologyhttp://www.whfreeman.com/college/book.asp?disc=BIO&id_product=1124001436&@id_course=1058000157&disc_name=Biologyhttp://www.whfreeman.com/college/book.asp?disc=BIO&id_product=1124001436&@id_course=1058000157&disc_name=Biology


10/11

#e langa aceasta, monitorizarea nivelurilor "5 viral in fazele precoce ale tratamentuluipoate aduce informatii utile asupra probabilitatii de raspuns. !ar datorita neaunsurilor actualelortehnici de detectie a incarcaturii virale, aceste teste nu pot sta intotdeauna la baza deciziilorterapeutice.

C'anti*)area &ir'!'"'i 2epatiti) C prin Rea"/Time PCR

#entru evaluarea viremiei prin metoda "eal-Time #$" cantitativa 'J"T-#$" - Juantitative"eal Time #ol%merase $hain "eaction) se utilizeaza 4it-ul Ro(oGene HC+ 'antitati&eRNA p'ri*)ation and dete)tion mod'"e.

Sistemul SuperScript === 1ne-Step "T-#$" S%stem cu #latinumK TaJ !5 polimeraz'=nvitrogen) este destinat detectrii i analizei moleculelor "5 prin "T-#$". Gtilizarea formuleintr-un singur pas este posibil sinteza !5c i amplificare pri #$" ntr-un singur tub folosind

primeri specifici intei.

Metode PCR pentr' dete)tia !i )'anti*)area &ir'!'"'i 2epatitei B

$ea mai eficienta si directa metoda, cu valoare prognostica in evolutia infectiilor acute saucronice, este detectarea cantitativa a !5-ului 7


11/11

11

adn arn exogen

Documents