genetica ii_replicare adn
DESCRIPTION
Centrul de Cercetare, Formare si Consultanta in Microbiologie, Genetica si BiotehnologieTRANSCRIPT
Toate moleculele de ADN, linToate moleculele de ADN, lineare sau circulare, seeare sau circulare, se replică replică
1 moleculă ADN dc replicare
2 molecule ADN dc
Dpdv chimic, replicarea = sinteza unei catene noi de ADN, folosind drept matriță o altă catenă ADN,
pe bază de complementaritate (A‐T, G‐C)
O moleculă ADN d.c. se desface (se desfac legăturile de hidrogen şi se separă cele 2 catene una de cealaltă)
Fiecare din aceste 2 catene este folosită drept matriță: pe fiecare matriță se sintetizează o catenă nouă
5′ 3′
5′3′
3′5′
5′3′
5′ 3′
3′ 5′
3′5′
5′3′
Replicarea ADN
DesfacereaDesfacerealelegăturilor de Hgăturilor de H
3′
3′5′
5′1 m1 moleculă ADN dcoleculă ADN dc
3′5′
3′ 5′2 molecule ADN mc2 molecule ADN mc
AtaAtaşşarea area primerilorprimerilor5′ 3′
Prelungirea Prelungirea primerilor primerilor şşiiformareaformarea
catenelor noicatenelor noi
catene parentalecatene parentale
catene fiicecatene fiice
CC AA TT 5′3′
AA CC AA 3′5′
TT GG TTTT AA CC TTAA GGGG CC AA TT
AA CC AAAA GGTTTT AA CCCC GG TT AA
AA GGTTTT AA CCCC GG TT
AA CC TTAA GGGG CC AA TT3′
3′AA 3′
TT GG TTTT AA CC TTAA GGGG CC AA TT3′ 5′3′ TT GG TTTT AA CC TTAA GGGG CC AA TT 5′
AA CC AAAA GGTTTT AA CCCC GG TT AA 3′5′
5′
5′
AA CC AAAA GGTTTT AA CCCC GG TT AA 3′5′ AA CC AAAA GGTTTT AA CCCC GG TT AA5′ 3′
CC AA TT3′ 5′
AA CC AA 3′5′
5′TT GG TTTT AA CC TTAA GGGG CC AA TT3′
TT3′
Ptr fiecare din cele 2 catene iniţiale (parentale),se sintetizează o catenă nouă, pe bază de complementaritate :
-
pe catena parentală este o A
- pe catena nouă vine o T, şi invers-
pe catena parentală este o G
- pe catena nouă vine o C, şi invers
Sinteza catenei noi se face in direcSinteza catenei noi se face in direcţţie 5ie 5’’
→→
33’’
Ptr că în ADN d.c. cele 2 catene sunt în orientare inversă (una 5’→ 3’, iar cealaltă 3’→ 5’),sinteza celor 2 catene noi se face în direcţie opusă, dar întotdeauna în sens 5’→ 3’
La o bifurcaţie de replicare
-
una din catene este sintetizată continuu, de la un singur primer =
-
cealaltă catenă este sintetizată “din bucăţi”
= fragmente Okazaki, fiecare pornind de la un primer
catenă întârziată, lagging
Fiecare din catenele parentale este folosită
ca matriţă
ptr sinteza unei catene noi
Replicarea ADN se desfăReplicarea ADN se desfăşşoară la bifurcarea de replicare oară la bifurcarea de replicare –– zonă unde desface zonă unde desfacedublul helixdublul helix
catena
conducătoare, leading
3′
3′5′
5′1 m1 moleculă ADN dcoleculă ADN dc
3′
3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
5′
5′
3′
bifurcatie de replicarebifurcatie de replicare
Catena intarziataCatena intarziata((lagginglagging))
Sinteza continua,de la un singur primer
Sinteza discontinua,de la mai multi primeri
Catena conducatoareCatena conducatoare((leadingleading))
Dublul helix se desfaceDublul helix se desfacemai departemai departe
Bifurcatia de replicare Bifurcatia de replicare se deplaseazase deplaseaza(spre stanga)(spre stanga)
Fragmente OkazakiFragmente Okazaki
Atasarea unui nou primerAtasarea unui nou primer
P3′ 5′
P5′ 3′
3′
3′
5′
5′
5′3′
5′ 3′
3′ 5′
3′5′
5′ 3′P5′ 3′
3′
5′ 3′
3′
3′
5′
5′
5′
3′5′5′ 3′
3′
3′
5′
5′
3′5′
5′3′
De reDe rețținutinut1 moleculă
ADN
dcreplicare
2 molecule ADN dc
Fiecare catenă a moleculei parentale = matriță ptr sinteza unei catene noi
Sinteza catenelor noi se face prin complementaritate cu catenele
vechi: A – T, G ‐
C
O catenă nouă se sintetizează întotdeauna în direcție 5’ 3’
Sinteza
unei noi catene ADN începe intotdeauna de la un primer ←
ADN polimeraza poate adăuga nucleotide pornind de la un cap 3’‐OH liber,dar nu poate iniția sinteza unui lanț
polinucleotidic
Una din catenele noi este sintetizată continuu, pornind de la un singur primer
Cealaltă catenă este sintetizată discontinuu, pornind de la mai mulți primeri,
este formată din fragmente = fragmente Okazaki
Primer = un fragment oligonucleotidic
scurt, de obicei ARN
(după Watson, 2013, Molecular Biology of the Gene, 7th Edition)
Sinteza ADN este catalizată de o clasă de enzime = ADN polimeraze
ADN polimerazele o “mână” care prinde joncțiunea/regiunea matriță – primer
Prin analogie, cele 3 domenii peptidice –deget mare (thumbthumb)
degete (fingersfingers)
palma / podul palmei (palmpalm) conține situl activ, cataliticleagă 2 ioni metalici bivalenți
sau 2 Zn 2+
2 Mg 2 Mg 2+2+
Ordinea evenimentelor Ordinea evenimentelor îîn sinteza ADN:n sinteza ADN:
Nucleotidul nou se Nucleotidul nou se îîmperechează cu următorul nucleotid liber mperechează cu următorul nucleotid liber
de pe matride pe matrițță ă
cu cel liber de pe cu cel liber de pe complementarcomplementarNumai un nucleotid nou Numai un nucleotid nou
matrimatrițță se poate ă se poate îîmperecheamperechea
Domeniul Domeniul degetedegete
se se ““strângestrânge””
îîn jurul joncn jurul joncțțiunii catenă veche iunii catenă veche
matrimatrițță ă –– catenă nouă catenă nouă
Acum conformaAcum conformațția enzimei poziia enzimei pozițționează corect cei ionează corect cei 2 ioni metalici2 ioni metalici
Are loc reacAre loc reacțția de formare a legăturii fosfodiesterice ia de formare a legăturii fosfodiesterice şşi atai ataşşarea area
nucleotidului nou la primer nucleotidului nou la primer
Se redeschide domeniul degeteSe redeschide domeniul degete
Regiunea / joncRegiunea / joncțțiunea matriiunea matrițțăă‐‐primer(+1 dNTP)primer(+1 dNTP) se deplasează cu se deplasează cu 1 pereche de baze1 pereche de baze
ADN polimeraza este gata ptr următorul cicluADN polimeraza este gata ptr următorul ciclu, p, ptr adăugarea următorului nucleotidtr adăugarea următorului nucleotid
+
+
1 Mg 1 Mg 2+2+ 55’’PP‐‐primerprimer‐‐33’’OHOH 55’’PP‐‐primerprimer‐‐33’’OO––
55’’PP‐‐primerprimer‐‐33’’OO–– dNTP dNTP ––
αα
P P ––
ββ
P P ––
γγ
PP dNTP dNTP ‐‐
33’’OHOH55’’PP‐‐primerprimer
‐‐ + ββ
P P ––
γγ
PP
1 Mg 1 Mg 2+2+llegegătură fosfodiestericăătură fosfodiestericăatac nucleofilic al grupării
α‐fosfat al dNTP asupra grupării 3’O–
Domeniul palm asigură spațial complementaritatea nucleotidului
nou şi nucleotidul liber de pe matriță
+
+
1 Mg 1 Mg 2+2+ 55’’PP‐‐primerprimer‐‐33’’OHOH 55’’PP‐‐primerprimer‐‐33’’OO––
55’’PP‐‐primerprimer‐‐33’’OO–– dNTP dNTP ––
αα
P P ––
ββ
P P ––
γγ
PP dNTP dNTP ‐‐
33’’OHOH55’’PP‐‐primerprimer
‐‐ + ββ
P P ––
γγ
PP
1 Mg 1 Mg 2+2+llegegătură fosfodiestericăătură fosfodiestericăatac nucleofilic al grupării
α‐fosfat al dNTP asupra grupării 3’O–
Ordinea evenimentelor Ordinea evenimentelor îîn sinteza ADN:n sinteza ADN:
Nucleotidul nou se Nucleotidul nou se îîmperechează cu următorul nucleotid liber de pe matrimperechează cu următorul nucleotid liber de pe matrițțăă
Numai un nucleotid nou complementar cu cel liber de pe matriNumai un nucleotid nou complementar cu cel liber de pe matrițță se poate ă se poate îîmperecheamperechea
Domeniul degete se Domeniul degete se ““strângestrânge””
îîn jurul joncn jurul joncțțiunii catenă veche matriiunii catenă veche matrițță ă –– catenă nouă catenă nouă
Acum conformaAcum conformațția enzimei poziia enzimei pozițționează corect cei ionează corect cei 2 ioni metalici2 ioni metalici
Are loc reacAre loc reacțția de formare a legăturii fosfodiesterice ia de formare a legăturii fosfodiesterice şşi atai ataşşarea nucleotidului nou la primer area nucleotidului nou la primer
Se redeschide domeniul degeteSe redeschide domeniul degete
Regiunea / joncRegiunea / joncțțiunea matriiunea matrițțăă‐‐primer(+1 dNTP)primer(+1 dNTP) se deplasează cu se deplasează cu 1 pereche de baze1 pereche de baze
ADN polimeraza este gata ptr următorul cicluADN polimeraza este gata ptr următorul ciclu, p, ptr adăugarea următorului nucleotidtr adăugarea următorului nucleotid
La o bifurcație de replicare, ambele catene ADN sunt sintetizate împreună‐‐
îîn acelan acelaşşi timpi timp‐‐
Inițierea unei noi catene ADN necesită un primer
Toate ADN polimerazele au nevoie de un cap 3Toate ADN polimerazele au nevoie de un cap 3’’‐‐OH liber, al unui nucleotidOH liber, al unui nucleotid
ADN polimerazele nu pot iniADN polimerazele nu pot inițția sinteza de ADN ia sinteza de ADN ––
nu pot atanu pot ataşşa primul nucleotida primul nucleotid
Pot doar prelungi, pPot doar prelungi, prin formarea unei prime legături fosfodiesterice pornind de la urin formarea unei prime legături fosfodiesterice pornind de la un cap 3n cap 3’’‐‐OH liberOH liber
== fragment oligonucleotidic m fragment oligonucleotidic m.c. .c. ce oferă ADN polimerazei un cap ce oferă ADN polimerazei un cap 33’’‐‐OH liberOH liberPrimerPrimerÎÎn celule (n celule (in vivoin vivo) primerii = fragmente ARN) primerii = fragmente ARN ÎÎn anumite tehnici (n anumite tehnici (in vitroin vitro) se pot utiliza ) se pot utiliza şşi primeri ADNi primeri ADN
ÎÎn celule,n celule, enzima ce sintetizează primeri enzima ce sintetizează primeri = = PRIMAZĂPRIMAZĂ = = o ARN polimerază o ARN polimerază ““specialăspecială””
Primerii = fragmente ARN m.c., de 5Primerii = fragmente ARN m.c., de 5‐‐10 nucleotide 10 nucleotide
Primaza acPrimaza acțționează atât pe catena conducătoareionează atât pe catena conducătoare, cât , cât şşi pe cea i pe cea îîntârziatăntârziată, dar : , dar :
Catena conducătoare necesită un singur primerCatena conducătoare necesită un singur primer, de la el sinteza ADN mergând continuu, de la el sinteza ADN mergând continuuCatena Catena îîntârziată necesită mai mulntârziată necesită mai mulțți primeri, de la fiecare sintetizândui primeri, de la fiecare sintetizându‐‐se câte un fragment Okazakise câte un fragment Okazaki
Primerii trebuie apoi îndepărtați
Pentru terminarea replicării unei catene Pentru terminarea replicării unei catene îîntârziate, ntârziate, primerii trebuie primerii trebuie îîndepărtandepărtațți din structura fragmentelor Okazaki, i din structura fragmentelor Okazaki, şşi i îînlocuinlocuițți cu ADNi cu ADN
ÎÎndepărtarea primerilor ndepărtarea primerilor ––
RNaza HRNaza H
Taie legăturile fosfodiesterice dintrTaie legăturile fosfodiesterice dintr‐‐o catenă ARNo catenă ARN, , îîn cadrul unui dublu helix hibrid ADN : ARNn cadrul unui dublu helix hibrid ADN : ARN
Umplerea golurilor Umplerea golurilor –– ADN polimerază ADN polimerază
Formarea ultimei legături fosfodiesterice Formarea ultimei legături fosfodiesterice ––
ADN ligazăADN ligază
Separarea celor 2 catene parentale – ADN helicaze
La bifurcaLa bifurcațția de replicare, separarea celor 2 catene parentale prin rupereaia de replicare, separarea celor 2 catene parentale prin ruperea
legăturilor de Hlegăturilor de H, e, este realizată de ste realizată de ADN helicazeADN helicaze‐‐ Proteine hexamerice cu formă de inel Proteine hexamerice cu formă de inel
‐‐
““inelulinelul”” intră pe una din cele două catene parentale intră pe una din cele două catene parentale şşi avansează i avansează
pe ea, pe ea, rupând legăturile de H dintre cele rupând legăturile de H dintre cele 2 catene 2 catene
‐‐ Catenenele parentale desfăcute Catenenele parentale desfăcute (denumite (denumite şşi monocatene) sunt stabilizate prin atai monocatene) sunt stabilizate prin ataşşare de are de
proteine Ssb proteine Ssb ––
SingleSingle‐‐stranded bindingstranded binding
Monocatenele parentale sunt astfel disponibile ptr a fi utilizatMonocatenele parentale sunt astfel disponibile ptr a fi utilizate ca matrie ca matrițță ă îîn sinteza de catene ADN noin sinteza de catene ADN noi
Monocatenele ADN sunt stabilizate – proteine Ssb
Suprarăsucirile sunt îndepărtate ‐
Topoizomeraze
Desfacerea dublului helix parental Desfacerea dublului helix parental şşi avansarea bifurcai avansarea bifurcațției de replicare produce suprarăsuciri iei de replicare produce suprarăsuciri îîn fan fațța bifurcaa bifurcațției. iei.
Aceste suprarăsuciri sunt eliminate prin tăieri ale dublului helAceste suprarăsuciri sunt eliminate prin tăieri ale dublului helix, uix, urmate de derăsucire rmate de derăsucire şşi rei re‐‐ligareligare
TopoizomerazeTopoizomeraze AcAcțționează pe ADN dc nereplicationează pe ADN dc nereplicat, , îîn fan fațța bifurcaa bifurcațției de replicare iei de replicare
Taie una sau ambele catene ADNTaie una sau ambele catene ADN
–– topoizomeraze de clasă II topoizomeraze de clasă II
Rămân ataRămân ataşşate la capul tăiat ate la capul tăiat şşi i îîl derăsucesc l derăsucesc
fafațță de catenă netăiatăă de catenă netăiată
–– topoizomeraze de clasă I topoizomeraze de clasă I
Rămân ataRămân ataşşate la capetele tăiate ate la capetele tăiate şşi trec i trec zona netăiată prin zona netăiată prin ““tăieturătăietură””
Scade gradul de răsucire a moleculei ADN parentale Scade gradul de răsucire a moleculei ADN parentale şşi, i, astfel, astfel, helicaza poate desface mai departe legăturile de hidrogen helicaza poate desface mai departe legăturile de hidrogen
dintre catenele parentaledintre catenele parentale
ÎÎn ambele cazuri,n ambele cazuri, topoizomerazele refac legăturile pe care le topoizomerazele refac legăturile pe care le‐‐au tăiat au tăiat
Specializarea ADN polimerazelorÎÎn fiecare celulă există mai multe tipuri n fiecare celulă există mai multe tipuri (specii moleculare) de ADN polimeraze, fiecare având un rol dist(specii moleculare) de ADN polimeraze, fiecare având un rol distinct inct
Rolul central al ADN polimerazelor Rolul central al ADN polimerazelor ‐‐ Replicarea corectă Replicarea corectă şşi eficientă a genomuluii eficientă a genomului
Alte roluri Alte roluri Replicarea Replicarea ““golurilorgolurilor”” lăsate de excizarea primerilor ARN lăsate de excizarea primerilor ARN
Replicarea Replicarea ““golurilorgolurilor””
formate formate îîn procesele de reparare ADNn procesele de reparare ADN
Replicarea unor molecule ADN extracromozomale Replicarea unor molecule ADN extracromozomale ––
plasmide, ADN mitocondrial, ADN platidialplasmide, ADN mitocondrial, ADN platidial
DeDeşşi numele proteinelor este diferit de la o specie la alta, i numele proteinelor este diferit de la o specie la alta, activităactivitățțile enzimatice desfăile enzimatice desfăşşurate pentru replicarea ADN cromozomal urate pentru replicarea ADN cromozomal
sunt practic aceleasunt practic aceleaşşi la organisme extrem de i la organisme extrem de îîndepărtate filogenetic ndepărtate filogenetic ––
bacterii, drojdii, ombacterii, drojdii, om
Viteza ADN polimerazei este crescută de SLIDING CLAMPS
(β‐clamp)
Procesivitatea mare a ADN polimerazei la bifurcaProcesivitatea mare a ADN polimerazei la bifurcațția de replicare ia de replicare Replicarea rapidă a cromozomuluiReplicarea rapidă a cromozomului
ADN pol adaugă milioane de nucleotide fără să se desprindă de peADN pol adaugă milioane de nucleotide fără să se desprindă de pe
ADNADN
Viteza foarte mare a ADN polimerazei Viteza foarte mare a ADN polimerazei O proteină denumită O proteină denumită ““sliding clampsliding clamp
““
Sliding clamps sunt poziționate de CLAMP LOADERS
Proteinele Proteinele sliding clampssliding clamps
sunt sunt ““deschisedeschise””
––ionate pe molecula de ADN de către alte proteine ionate pe molecula de ADN de către alte proteine țți pozii pozişş
clamp loadersclamp loaders
Au 5 Au 5 subunităsubunitățți i şşi folosesc ATP i folosesc ATP
La La E.coliE.coli, clamp loader = complexul g (, clamp loader = complexul g (γγ))
ÎÎn celulele EK, clamp loader = factorul de replicare C (RFn celulele EK, clamp loader = factorul de replicare C (RF‐‐C) C)
ADN pol III holoenzimaADN pol III holoenzima
Sinteza ADN la bifurcația de replicare
La bifurcaLa bifurcațția de replicare, ia de replicare, catenele conducătoare catenele conducătoare şşi i îîntârziată ntârziată ((leadingleading
şşi i lagginglagging) sunt sintetizate simultan ) sunt sintetizate simultan
La o aceeaLa o aceeaşşi bifurfci bifurfcaațție funcie funcțționează mai multe ADN pol ionează mai multe ADN pol
La La E.coliE.coli, l, la o singură bifurcaa o singură bifurcațție de replicare se formează un complex proteic ie de replicare se formează un complex proteic = = ADN polimeraza III holoenzimăADN polimeraza III holoenzimă
3 copii ADN pol III miez 3 copii ADN pol III miez
1 sliding clamp loader1 sliding clamp loader
1 sliding clamp1 sliding clamp
F IGUR E 9‐24 Binding of the DNA helicase to DNA Pol III holoenzyme stimulates the rate
of DNA strand separation. The t subunit of the sliding clamp loader interacts with both the DNA
helicase and the DNA polymerase at the replication fork. (a) When this interaction occurs, the DNA
helicase unwinds the DNA at approximately the same rate as the DNA polymerases replicate the
DNA. (b) If the DNA helicase is not associated with DNA Pol III holoenzyme, DNA unwinding
slows by 10‐fold. Under these conditions, the DNA polymerases can replicate faster than the
DNA helicase can separate the strands of unreplicated DNA. This allows the DNA Pol III holoenzyme
to “catch up”
to the DNA helicase and re‐form the replisome.
Arthur Kornberg
Aparat enzimatic care realizează replicarea ADNAparat enzimatic care realizează replicarea ADN
::
ADN polimerază ADN polimerază (III)(III) = e= enzimă complexănzimă complexă, f, formată din mai multe subunităormată din mai multe subunităţţi cu diverse funci cu diverse funcţţii;ii; cea mai importantă func cea mai importantă funcţţie : ie : formarea legăturilor fosfodiesterice dintre deoxiribonucleotideformarea legăturilor fosfodiesterice dintre deoxiribonucleotide
HelicazăHelicază
–– desface legăturile de hidrogen dintre cele desface legăturile de hidrogen dintre cele 2 catene parentale2 catene parentale
TopoizomerazeTopoizomeraze
–– relaxează dublul helix relaxează dublul helix, s, scade numărul de spire cade numărul de spire / kpb/ kpb
Proteine Proteine SsbSsb
(Single(Single--Stranded Binding) Stranded Binding) –– se leagă de monocatene ADN se leagă de monocatene ADN şşi le stabilizeazăi le stabilizează
PrimazăPrimază = = o ARN polimerazăo ARN polimerază, s, sintetizează scurte catene de ARN numite primeriintetizează scurte catene de ARN numite primeri
LigazaLigaza
–– formează legături fosfodiesterice formează legături fosfodiesterice îîntre nucleotidentre nucleotide
Nu poate porni sinteza catenei noi Nu poate porni sinteza catenei noi de novode novo, ci o poate doar prelungi, ci o poate doar prelungi
Are nevoie de o catenă scurtă pe care sa o prelungească Are nevoie de o catenă scurtă pe care sa o prelungească --
PRIMERPRIMER
RNază HRNază H
–– scoate ribonucleotidele ce formează primerii scoate ribonucleotidele ce formează primerii
ADN pol IADN pol I
––
umple golurile lăsate de RNaza Humple golurile lăsate de RNaza H
holoenzimaholoenzima
3 ADN pol III 3 ADN pol III miez (palm, fingers, thumb)miez (palm, fingers, thumb)1 sliding clamp1 sliding clamp1 clamp loader 1 clamp loader
EtapeEtape InițiereElongareTerminare
Pre‐inițiere
Pre‐inițiere
Regiunea unde începe replicarea moleculei de ADN = origine a replicăriiO moleculă ADN poate avea:
1 regiune ori Cromozom bacterian
Plasmide bacteriene
ori
C
ori
VCromozomul bacterian este un replicon unic
INIȚIEREA REPLICĂRII ADN
mai multe regiuni ori Cromozomi de la eucariote
Cromozomii de tip eucariot sunt structuri multirepliconice
INIȚIEREA REPLICĂRII ADN
Formarea unei bifurcaFormarea unei bifurcaţţii de replicare necesită separarea celor ii de replicare necesită separarea celor 2 catene parentale2 catene parentale
Replicarea unei molecule de ADN NU Replicarea unei molecule de ADN NU îîncepe ncepe îîn orice punct al moleculei,n orice punct al moleculei,ci ci îîn anumite situsuri = n anumite situsuri = origini de replicareorigini de replicare
((oriori))
RepliconReplicon
= fragment de ADN replicat de la 1 origine de replicare= fragment de ADN replicat de la 1 origine de replicare
Cromozomul de Cromozomul de E.coliE.coli are 1 are 1 oriori ►►cromozom unirepliconic (replicon unic)cromozom unirepliconic (replicon unic)
Majoritatea bacteriilor au cromozomi unirepliconiciMajoritatea bacteriilor au cromozomi unirepliconici
Fiecare cromozom de la eucariote are mai multe regiuni Fiecare cromozom de la eucariote are mai multe regiuni ori ori ►►cromozomi multirepliconicicromozomi multirepliconici
Sistemul de iniSistemul de iniţţiere a replicării ADN este format din iere a replicării ADN este format din 2 componente:2 componente:
replicatorreplicatori i şştă tă regiunea ori, denumiregiunea ori, denumi = = Componenta ADNComponenta ADNare o anumită secvenare o anumită secvenţţă de nucleotideă de nucleotide
iator , PRIMOSOMiator , PRIMOSOMţţiniinii i şşiere, denumite iere, denumite ţţ= proteine de ini= proteine de iniComponenta proteicăComponenta proteicăse atase ataşşează la ează la oriori (replicator)(replicator)
Majoritatea secvenMajoritatea secvenţţelor replicator de la diverse organisme conelor replicator de la diverse organisme conţţin:in:--
o regiune de legare a proteinelor de inio regiune de legare a proteinelor de iniţţiereiere-- o regiune bogată o regiune bogată îîn A/Tn A/T uuşşor de desfăcut legăturile de H or de desfăcut legăturile de H de către proteinele inide către proteinele iniţţiatoriator
Situsul oriC este Situsul oriC este îîn afara acestei regiunin afara acestei regiuni5 cutii dna A (9)5 cutii dna A (9)= regiuni 9= regiuni 9--mericemericeaici se ataaici se ataşşează proteina Dna A ează proteina Dna A
3 regiuni 133 regiuni 13--merice (13)merice (13)bogate bogate îîn A/Tn A/Taici se desface dublul helixaici se desface dublul helix
E.coli E.coli
SV40SV404 situsuri P4 situsuri P= regiuni 5= regiuni 5--mericemericeaici se ataaici se ataşşează proteina iniează proteina iniţţiatoriator
––
antigenul Tantigenul T
2 regiuni EP 2 regiuni EP (Early Palindrome(Early Palindrome) ) = 20 pb= 20 pbaici se desface dublul helixaici se desface dublul helix
S.cerevisiaeS.cerevisiae2 regiuni A, B12 regiuni A, B1aici se ataaici se ataşşează proteina ORCează proteina ORC
1 regiune B21 regiune B2aici se ataaici se ataşşează helicazaează helicazaaici se desface dublul helixaici se desface dublul helix
proteine iniproteine iniţţiatoriator
3 13-mersDna A5 dna A, 9-mersE.coli
2 EP (20pb)antigenul T4 P, 5-mersSV40
1 B2ORC2 A, B1S.cerevisiae
situsuri de atasitusuri de ataşşareare situsuri de desfaceresitusuri de desfacere
Proteinele iniProteinele iniţţiator:iator:--
se atase ataşşează la replicatorează la replicator, situs, situs--specific: specific: E.coliE.coli ––
5 cutii dnaA 5 cutii dnaA --
interacinteracţţionează cu alte proteine pe care le ionează cu alte proteine pe care le ““aducaduc””
la replicator la replicator --
unele desfac dublul helix unele desfac dublul helix îîn reginile adiacente situsului de legaren reginile adiacente situsului de legare
E.coliE.coliierii replicării cromozomului ierii replicării cromozomului ţţPrincipalele etape ale iniPrincipalele etape ale ini
(a) (a) Mai multe exemplare de proteină DnaAMai multe exemplare de proteină DnaA--ATP ATP →→
situsurile dnaAsitusurile dnaA
(b) Desfacerea dublului helix (b) Desfacerea dublului helix îîn zona situsurilor 9n zona situsurilor 9--mers mers
(c) Ata(c) Ataşşarea helicazei bacteriene area helicazei bacteriene –– Dna B Dna B, a, adusă de către Dna Cdusă de către Dna C
(complexul Dna B (complexul Dna B ––
Dna C)Dna C)
(d) Deplasarea helicazei (d) Deplasarea helicazei îîndepărtează proteinele Dna A ndepărtează proteinele Dna A
https://highered.mcgrawhttps://highered.mcgraw--hill.com/sites/dl/free/0072835125/126997/animation17.htmlhill.com/sites/dl/free/0072835125/126997/animation17.html
Cromozomii de la EK se replică o singură dată per ciclu celularCromozomii de la EK se replică o singură dată per ciclu celularReplicarea ADN cromozomal Replicarea ADN cromozomal ––
numai numai îîn faza S a ciclului celularn faza S a ciclului celular toată cantitatea de ADN cromozomal toată cantitatea de ADN cromozomali doar o singură datăi doar o singură datăşşo dată o dată n faza S este replicată n faza S este replicată ÎÎ
Originile de replicare de pe cromozomii EK sunt separate de Originile de replicare de pe cromozomii EK sunt separate de ~~
30 kpb 30 kpb : : crz EK mici au crz EK mici au >>
10 10 orioricrz crz umani mari umani mari au au mii de mii de oriori
Ptr ca fiecare crPtr ca fiecare crtt
EKEK să fie replicat integral să fie replicat integral îîn timpul fiecărei faze Sn timpul fiecărei faze S, t, trebuie activat un număr suficient de mare de rebuie activat un număr suficient de mare de oriori(nu (nu neapărat toate neapărat toate oriori, d, dar dacă sunt prea puar dacă sunt prea puţţine, atine, atunci anumite regiuni din genom vor rămâne neunci anumite regiuni din genom vor rămâne ne--replicate) replicate)
ÎÎn mod normal, nici un n mod normal, nici un oriori nu poate ininu poate iniţţia 2 runde de replicare ia 2 runde de replicare îîn aceean aceeaşşi fază Si fază S;; deci, estdeci, este inactivat până la următoarea S e inactivat până la următoarea S
Un crz EK cu 5 secvenUn crz EK cu 5 secvenţţe replicatore replicator
--
mai mai îîntâi sunt activate secvenntâi sunt activate secvenţţele 3 ele 3 şşi 5i 5-- se formează se formează 2 bucle de replicare 2 bucle de replicare ––
4 bifurca4 bifurcaţţii de ii de replicare bidirecreplicare bidirecţţională ională
--
secvensecvenţţele ele oriori de pe moleculele fiice sunt blocate de pe moleculele fiice sunt blocate până la următoarea rundă până la următoarea rundă ((XX))
--
elongarea bifurcaelongarea bifurcaţţiilor de replicare depăiilor de replicare depăşşeeşşte te replicatorii 2 replicatorii 2 şşi 4 i 4 îînainte ca acenainte ca aceşştia să se activezetia să se activeze
--
ca urmare, 2 ca urmare, 2 şşi 4i 4 nu se mai activează nu se mai activează, iar refginile , iar refginile respective sunt replicate respective sunt replicate îîn mod n mod ““pasivpasiv””
--
îîn contrast, replicatorul 1 se inin contrast, replicatorul 1 se iniţţiază iază îînainte ca nainte ca replicarea să ajungă replicarea să ajungă îîn regiunea lui n regiunea lui
PrezenPrezenţţa pe un crz a mai multor replicatori decât ar fi a pe un crz a mai multor replicatori decât ar fi necesar este o redundannecesar este o redundanţţăă, d, dar asigură replicarea ar asigură replicarea
completă a fiecărui crzcompletă a fiecărui crz..
ÎÎncărcarea helicazei ncărcarea helicazei –– Prima etapă Prima etapă îîn inin iniţţierea replicării la EKierea replicării la EK
La EK, etapele iniLa EK, etapele iniţţierii replicării ADN se desfăierii replicării ADN se desfăşşoară oară îîn faze distincte ale ciclului celular n faze distincte ale ciclului celular şşi i îîn ordine diferită fan ordine diferită faţţă de PK ă de PK
ÎÎncărcarea helicazei la toncărcarea helicazei la toţţi replicatorii i replicatorii ––
îîn n G1G1
((îînainte de S)nainte de S)
Activarea replicatorilor (inclusiv activarea helicazei)Activarea replicatorilor (inclusiv activarea helicazei)Asamblarea replisomuluiAsamblarea replisomului îîn n SS
ÎÎncărcarea helicazei pe crz EKncărcarea helicazei pe crz EK
--
proteina ORCproteina ORC~ATP~ATP
se atase ataşşează la replicator ează la replicator
--
se atase ataşşează proteina Cdcează proteina Cdc6 6
-- helicaza helicaza (Mcm2(Mcm2--7) 7) este adusă de Cdteste adusă de Cdt11
--
helicaza este helicaza este îîncărcată pe ADN ncărcată pe ADN (ca dimer) (ca dimer)
--
sunt eliberate Cdc6 sunt eliberate Cdc6 şşi Cdt1i Cdt1
Cdc6, Cdt1 sunt similare cu DnaC de la PKCdc6, Cdt1 sunt similare cu DnaC de la PK
Helicazele Helicazele îîncărcate sunt activate de ncărcate sunt activate de 2 protein2 protein--kinaze: kinaze: CDK (cyclinCDK (cyclin--dependentdependent--kinase)kinase) DDK (Dbf4DDK (Dbf4--dependentdependent--kinase), kinase),
[ [ ProteinProtein--kinaze = proteine care atakinaze = proteine care ataşşeazăează, c, covalent, gruovalent, grupări fosfat la alte proteinepări fosfat la alte proteine, , ţţintăintă
]]
ce sunt activate la intrarea ce sunt activate la intrarea îîn faza Sn faza S
Aceste 2 proteinAceste 2 protein--kinaze sunt activate la inrarea in faza S kinaze sunt activate la inrarea in faza S si, fie direct, fie prin intermediul altor proteinesi, fie direct, fie prin intermediul altor proteine::
--
ddesfac helicaza in monomeresfac helicaza in monomer
--
aataseaza cate un monomer de helicazataseaza cate un monomer de helicazape cate o monocatena ADN pe cate o monocatena ADN
--
In final are loc asamblarea replisomului = complex proteicIn final are loc asamblarea replisomului = complex proteic
Primaza (ADN pol Primaza (ADN pol αα))ADN pol ADN pol εεADN pol ADN pol δδClampClamp, clamp loader, clamp loaderHelicaza Helicaza
G1G1 SS+ ORC
Incarcarea helicazei pe ADN
Activarea helicazeiDeschiderea dublului helix
Formarea replisomului
TERMINAREA REPLICĂRII MOLECULELOR ADNTERMINAREA REPLICĂRII MOLECULELOR ADN
Necesită un set de evenimente specificeNecesită un set de evenimente specifice
Diferă de la molecule ADN Diferă de la molecule ADN CIRCULARECIRCULARE
la molecule ADN la molecule ADN LINEARELINEARE
Terminarea replicării ADN circular Terminarea replicării ADN circular ––
cromozomul cromozomul E.coliE.coli
La terminarea replicării, cele 2 molecule fiice ramân legate una de alta într-o structură de tip catenancatenan
Catenan = structură formată din 2 cercuri interconectate
(2 zale dintr-un lanţ)
Separarea celor 2 cromozomi = segregare Separarea celor 2 cromozomi = segregare Ptr că cei Ptr că cei 2 crz sunt circulari: segregarea = decatenare2 crz sunt circulari: segregarea = decatenare
Topoizomeraze de clasă IITopoizomeraze de clasă II-
taie una din cele 2 molecule (ambele catene)-
trage molecula întreagă (netăiată) prin tăietură- reface molecula tăiată
Replicarea avansează pe cele 2 bifurcaţii
(replicare bidirecţională)
Molecula ia forma literei greceşti THETA replicare pe model THETA
θθ
Topoizomerază IITopoizomerază II
Topoisomerase 1 and 2.flvTopoisomerase 1 and 2.flv
Terminarea replicării ADN linearTerminarea replicării ADN linear--
cromozomii de la eucariotecromozomii de la eucariote
Topoizomeraze de clasă IITopoizomeraze de clasă II
1.
Deşi cromozomii d ela EK sunt molecule ADN lineare, datorită dimensiunii mari, la terminarea replicării cele 2 molecule fiice sunt înfăşurate una în jurul celeilalte
2.2.
Replicarea catenei Replicarea catenei îîntârziate ridică probleme ntârziate ridică probleme îîn n regiunile terminale ale cromozomilor (telomere) regiunile terminale ale cromozomilor (telomere)
-
ultimul primer se găseşte exact la capătul 3’
al catenei parentale
-
după îndepărtarea acestui primer de către RNaza H, molecula rămâne cu o catenă mai lungă –
capul 3’
- dacă procesul s-ar opri aici, atunci la fiecare rundă de replicare, cromozomii s-ar scurta semnificativ, în final cu pierdere de gene
Telomeraza Telomeraza
TELOMERAZA = o ADN poTELOMERAZA = o ADN pol ce nu necesită primer l ce nu necesită primer separatseparatCapetele cromozomilor eucariotici = TELOMERECapetele cromozomilor eucariotici = TELOMERE
RepetiRepetiţţii ii ““capcap--coadăcoadă””
ale unei secvenale unei secvenţţe bogate e bogate îîn TGn TGdde ex., telomerele cromozomilor umani = repetie ex., telomerele cromozomilor umani = repetiţţii ale secvenii ale secvenţţei ei 55’’
––
TTAGGG TTAGGG ––
33’’
Majoritatea acestor repetiMajoritatea acestor repetiţţii suntii sunt
d.c., dar capul 3d.c., dar capul 3’’ al fiecărui cromozom se prelunge al fiecărui cromozom se prelungeşşte monocatenarte monocatenar
Această structură acAceastă structură acţţionează ca o nouă origine de replicare pentru o ADN polimerază sionează ca o nouă origine de replicare pentru o ADN polimerază specială pecială --
TELOMERAZATELOMERAZA
TELOMERAZA TELOMERAZA = r= ribonucleoproteină ibonucleoproteină ==Complex de proteine, una din ele = Complex de proteine, una din ele = reverstranscriptază telomerazică TERTreverstranscriptază telomerazică TERT
--
ca ca şşi alte ADN pol, extinde capul 3i alte ADN pol, extinde capul 3’’
al unui primeral unui primer
--
pe post de primer, folosepe post de primer, foloseşşte capul 3te capul 3’’--OH al catenei parentaleOH al catenei parentale
-- include o scurtă regiune complementară cu repeti include o scurtă regiune complementară cu repetiţţia telomericăia telomerică
La om:La om:
55’’––
AAUCCCAAUC AAUCCCAAUC ––
33’’
O moleculă de ARN O moleculă de ARN = = ARN telomerazicARN telomerazic
TERTER
-- pe post de catenă matri pe post de catenă matriţţă foloseă foloseşşte ARNte ARN--ul propriuul propriu
--
astfel, extinde capul 3astfel, extinde capul 3’’
al catenei ADN parentaleal catenei ADN parentale
-- telomeraza se desprinde de pe catena ADN telomeraza se desprinde de pe catena ADN,, se deplasează spre capul se deplasează spre capul 33’’
şşi se reai se reaşşeazăează
Procesul se reia de multe oriProcesul se reia de multe ori
Capul 3Capul 3’’--OH este prelungitOH este prelungitcu multe repeticu multe repetiţţii TTAGGGii TTAGGG
Apoi telomeraza se desprinde complet Apoi telomeraza se desprinde complet ADN pol ADN pol ““obiobişşnuitănuită””
prelungeprelungeşşte capul 5te capul 5’’
ÎÎn final, la EK cromozomii au capul 3n final, la EK cromozomii au capul 3’’
extins, prelungit monocatenar extins, prelungit monocatenar
MBOG 8 MBOG 8 ––
Action of telomeraseAction of telomerase
Ordinea evenimentelor Ordinea evenimentelor îîn replicarea telomerelorn replicarea telomerelor
--
Telomeraza (T) se aTelomeraza (T) se aşşează cu ARNează cu ARN--ul propriu (TER) ul propriu (TER) îîn zona de complementariatte a monocatenei ADN de la capul 3n zona de complementariatte a monocatenei ADN de la capul 3’’--OHOH
-- extinde această monocatenă ADN extinde această monocatenă ADN, folosind drept primer capul 3, folosind drept primer capul 3’’--OH al acesteiaOH al acesteia
drept matridrept matriţţă ă ––
propriul ARN propriul ARN
-- T repetă de multe ori acest ciclu T repetă de multe ori acest ciclu Extinde capul 3Extinde capul 3’’
cu multe repeticu multe repetiţţii [ TTAGGG ] ii [ TTAGGG ]
--
apoi T se desprinde complet apoi T se desprinde complet
--
capul 5capul 5’’
este prelungit, pe modelul unei catene este prelungit, pe modelul unei catene îîntârziate, de ntârziate, de către o ADN pol către o ADN pol ““obiobişşnuitănuită””
ÎÎn final, la EK cromozomii au capul 3n final, la EK cromozomii au capul 3’’
extins, prelungit monocatenar extins, prelungit monocatenar
REPLICAREA ADNREPLICAREA ADN
I. INII. INIŢŢIEREAIEREA oriori 1 1 oriori pe crz bacterian pe crz bacterian →→
crz unirepliconiccrz unirepliconicn n oriori pe crz EK pe crz EK →→
crz multirepliconicicrz multirepliconici Replicon = secvenReplicon = secvenţţă ADN replicată de la un ă ADN replicată de la un oriori
SecvenSecvenţţele ADN din ele ADN din oriori au funcau funcţţie de ie de replicatorreplicator
++ Proteine iniProteine iniţţiator = iator = PRIMOSOMPRIMOSOMsitusuri de legare a proteinelor inisitusuri de legare a proteinelor iniţţiatoriator
regiunile A/Tregiunile A/T, , uuşşor de desfăcut or de desfăcut Aici se formează bucla de replicareAici se formează bucla de replicare
PK PK PK PK Complexul proteic primosomComplexul proteic primosom
Proteina Proteina DnaADnaA
se atase ataşşează la cutiile dnaA ează la cutiile dnaA
Distorsionarea ADN Distorsionarea ADN îîn zona de legaren zona de legare
Desfacerea dublului helix Desfacerea dublului helix îîn regiunile A/Tn regiunile A/T
ÎÎncărcarea ncărcarea helicazeihelicazei
((DnaBDnaB) p) pe ADN de către e ADN de către DnaCDnaC
Formarea buclei de replicare cu cele 2 bifurcaFormarea buclei de replicare cu cele 2 bifurcaţţiiiiAsamblarea replisomuluiAsamblarea replisomului
Proteina ORCProteina ORC~ATP~ATP
se atase ataşşează la replicator ează la replicator
Complexul proteic de iniComplexul proteic de iniţţiereiere
+ proteine CDC ( + proteine CDC ( --
DnaC)DnaC)
ÎÎncărcarea ncărcarea helicazeihelicazei
((MCMMCM) pe ADN) pe ADN G1G1
+ proteine CDK + proteine CDK
Activarea helicazeiActivarea helicazei SS
Desfacerea dublului helix Desfacerea dublului helix
Formarea buclei de replicare cu cele 2 bifurcaFormarea buclei de replicare cu cele 2 bifurcaţţiiiiAsamblarea replisomuluiAsamblarea replisomului
recapitularerecapitulare
II. ELONGAREAII. ELONGAREA
REPLISOMREPLISOM
PrimazăPrimazăHelicază Helicază ADN polimerazăADN polimerazăProteine ajutătoare Proteine ajutătoare –– Sliding Clamp Sliding Clamp, C, Clamp loaderlamp loaderRNază RNază Ligază Ligază
PKPKADN pol III holoenzimaADN pol III holoenzima
3 copii ADN pol III miez 3 copii ADN pol III miez 1 sliding clamp1 sliding clamp1 clamp loader1 clamp loader
Catena ADN nouă este sintetizată Catena ADN nouă este sintetizată îîn direcn direcţţie 5ie 5’’
→→
33’’
Catena ADN matriCatena ADN matriţţă este citită ă este citită îîn direcn direcţţie inversă ie inversă
Catena ADN nouă este sintetizată prin complementaritate cu cea vCatena ADN nouă este sintetizată prin complementaritate cu cea vecheeche
La o bifurcaLa o bifurcaţţie de replicareie de replicareUna din catenele noi = cUna din catenele noi = catena conducătoareatena conducătoare, in direc, in direcţţia de deplasare a bifurcaia de deplasare a bifurcaţţieiiei
Cealaltă catenă nouă Cealaltă catenă nouă = catena = catena îîntârziatăntârziată, , îîn direcn direcţţie inversă ie inversă
EucarioteEucarioteProcarioteProcarioteFuncFuncţţiiiiORCDnaAPrincipala proteină de iniţiere a replicării
MCMDnaBDesfacerea legăturilor de H - Helicază
RPASsbStabilizarea monocatenelor ADN
ADN pol αDnaGSinteză de primeri – Primază = o ARN polimerază specială
PCNASliding Clamp (β-Clamp)Menţine ADN pol pe ADN şi îi creşte procesivitatea
RFCClamp Loader (subunităţi: γ δ δ’
τ)Încarcă sliding clamp pe ADN
ADN pol δ pe catena întârziatăADN pol ε pe cat.conducătoare
ADN pol III miezADN polimeraza replicativă
RNaza HRNaza HProcesarea fragmentelor Okazaki(a) Eliminarea primerilor
Dna2, FEN1ADN pol I(b) Umplerea golurilor prin sinteză ADN
ADN ligaza IADN ligaza H(c) Ligarea fragmentelor Okazaki
Topoizomerază de clasă ITopoizomerază de clasă II
Topoizomerază de clasă ITopoizomerază de clasă II (ADN girază)
Derăsucirea ADN parental în faţa buclei de replicare
Topo cls I, Topo cls IITopo cls I, Topo cls IIDerăsucirea moleculelor d.c. fiice
Topoizomerază cls IITerminarea replicăriiPK –
segregarea celor 2 crz bacterieni
TelomerazaEK – terminarea replicării la telomere
III. TERMINAREAIII. TERMINAREA
PK PK EK EK
Cromozomul bacterian = ADN dc CIRCULAR Cromozomul bacterian = ADN dc CIRCULAR Cromozomii eucariotelor = ADN dc LINEAR Cromozomii eucariotelor = ADN dc LINEAR
Terminarea replicării Terminarea replicării →→
2 molecule ADN dc circulare2 molecule ADN dc circulareinterconectateinterconectate
Desfacerea celor 2 molecule Desfacerea celor 2 molecule ––
TOPO cls IITOPO cls II
Terminarea replicării Terminarea replicării →→
capul 3capul 3’’
al moleculei parentale este extinsal moleculei parentale este extins
TELOMERAZA TELOMERAZA
(a) Prelunge(a) Prelungeşşte capul 3te capul 3’’
cu multe repeticu multe repetiţţii TTAGGGii TTAGGG
--
Primer = capul 3Primer = capul 3’’
al catenei vechi al catenei vechi --
MatriMatriţţă ă = ARN telomerazic (TER)= ARN telomerazic (TER)
Acest proces de reverstranscriere se repetă de multe ori Acest proces de reverstranscriere se repetă de multe ori
(b) Se desprinde complet de pe ADN (b) Se desprinde complet de pe ADN
(c) ADN pol (c) ADN pol δδ
prelungeprelungeşşte capul 5te capul 5’’(sinte(sinteză prin fragmente Okazakiză prin fragmente Okazaki))
ÎÎn final, cromozomii au capul 3n final, cromozomii au capul 3’’
extins, prelungit monocatenar extins, prelungit monocatenar
Alfabet grecesc Alfabet grecesc
Se citeşteLiteră micăLiteră mareSe citeşteLiteră micăLiteră mare
niuνΝalfaαΑksiξΞbetaβΒomicronοΟgamaγΓpiπΠdeltaδΔrho (ro)ρΡepsilonεΕsigmaσΣzetaζΖtauτΤetaηΗipsilon υΥthetaθΘphi (fi)φΦiotaιΙchi (hi)χΧkappaκΚpsiψΨlambdaλΛomegaωΩmiuμΜ
DEZASAMBLAREA / ASAMBLAREA NUCLEOSOMILOR în replicarea ADN
Nucleosomii sunt Nucleosomii sunt ‐‐
dezasambladezasamblațți pe molecula parentalăi pe molecula parentală, , îîn fan fațța bifurcaa bifurcațției de replicareiei de replicare
‐‐
asamblaasamblațți pe moleculele fiice, i pe moleculele fiice, îîn ordinea anterior prezentată n ordinea anterior prezentată
Tetramerii H3Tetramerii H3‐‐H4 H4 vechivechi rămân asocia rămân asociațți cu i cu
molecula ADN molecula ADN şşi trec ca atare,i trec ca atare, fie la una fie la una
din moleculele noi, fdin moleculele noi, fie la cealaltăie la cealaltă
Dimerii H2ADimerii H2A‐‐H2B H2B vechivechi
se desprind de pe se desprind de pe
ADN ADN şşi trec i trec îîntâi ntâi îîn solun soluțție.ie.