1

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE DIN CRAIOVA ŞCOALA DOCTORALĂ

TEZĂ DE DOCTORAT

NANOPARTICULE DE OXID DE FIER CU ÎNVELIȘ DE ACID CITRIC: PROPRIETĂȚI ȘI

STUDII PE MODELE EXPERIMENTALE

REZUMAT

CONDUCĂTOR DE DOCTORAT: PROF. UNIV. DR. NEAMȚU JOHNY STUDENT-DOCTORAND: TRINCU NICU FLORIAN CRAIOVA

2015

2

CUPRINS

INTRODUCERE ......................................................................................................................................... 3

STADIUL CUNOAȘTERII ......................................................................................................................... 3

CONTRIBUȚII PERSONALE.................................................................................................................... 4

CAPITOLUL VIII. Sinteza şi caracterizarea nanoparticulelor de magnetită cu înveliş de acid

citric (MA-COOH) ....................................................................................................................................... 4

CAPITOLUL IX. Studierea proprietăților biologice in vivo ale MA-COOH pe modele

experimentale ............................................................................................................................................. 5

Modelul experimental folosit pentru studierea cineticii de eliminare din sânge a MA-COOH .... 5

Model experimental folosit pentru determinarea biodistribuției în organe a MA-COOH ............. 5

Model experimental folosit pentru determinarea influenței MA-COOH în hemostază ................. 6

CAPITOLUL X. REZULTATE ................................................................................................................... 6

Rezultate analiză rezonanță electronică paramagnetică ................................................................. 6

Rezultate analiză histopatologică ........................................................................................................ 8

Rezultate ale influenței MA-COOH asupra hemostazei ................................................................... 9

DISCUȚII ................................................................................................................................................... 10

CONCLUZII ............................................................................................................................................... 10

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ: ................................................................................................................. 11

Cuvinte cheie: nanoparticule magnetice, MA-COOH, biodistribuție, model murin, hemostază

3

INTRODUCERE

Se poate afirma că nanotehnologia magnetică reprezintă viitorul științei. Aceasta a fost definită ca fiind "înţelegerea şi controlul materiei la dimensiuni de aproximativ 1-100 nanometri (10-9 la 10-7 m), unde fenomene unice dau posibilitatea unor aplicaţii noi" potrivit National Nanotechnology Initiative (NNI) din Statele Uniteale Americii [1].

În ultimul deceniu, nanoparticulele magnetice de oxid de fier au fost singurele nanomateriale magnetice aprobate pentru utilizarea clinică de către FDA (Food and Drug Administration, SUA) [2,3].

Nanoparticulele magnetice au multe aplicaţii biomedicale importante, precum: sisteme de transport medicamentos, agenţi de contrast, tratamentul cancerului, terapia genică, hipertermia, biosenzori şi mai recent, s-a demonstrat că joacă un rol nou în funcţia cognitivă a creierului uman [4,5].

Deși nanoparticulele magnetice au un caracter hidrofob, acestea nu sunt stabile în condiții fiziologice și au tendința de a forma agregate. În fluide magnetice apoase, faza magnetică (în principal oxizi de fier) necesită diferite materiale de acoperire, care le conferă stabilitate și compatibilitate cu fluidele biologice [6,7].

Materialele de acoperire utilizate pentru a stabiliza steric nanoparticulele de oxid de fier conțin adesea grupe funcționale carboxil. Aceste grupe funcționale sunt populare, deoarece ele formează legături covalente stabile între agenții de acoperire și suprafața miezului de oxid de fier.

STADIUL CUNOAȘTERII

Această parte este alcătuită din următoarele șase capitole, în care am prezentat

date din literatura de specialitate (articole, manuscrise, monografii etc.). În primul capitol am prezentat caracteristicile generale ale diferitelor tipuri de

nanoparticule magnetice, evidenţiind în mod special nanoparticulele pe bază de oxizii de fier.

În capitolul al doilea am discutat despre magnetism. Am prezentat diferite tipuri de magnetism pe care îl pot manifesta nanoparticulele în funcție de structura, dimensiunea și materialul de acoperire folosit, și anume: feromagnetism, superparamagnetism, respectiv paramagnetism.

Capitolul al treilea a reprezentat o trecere în revistă a metodelor de sinteză ale nanoparticulelor. Am detaliat cele mai importante metode: litografia, coprecipitarea, microemulsia, sinteza hidrotermală, descompunerea termică, piroliza și sinteza cu plasmă, punând în evidență avantajele și dezavantajele fiecăreia dintre acestea.

În capitolul al patrulea am detaliat cele mai importante tehnici pentru detectarea, măsurarea și caracterizarea nanoparticulelor.

În capitolul al cincilea am prezentat cele mai importante și de succes aplicații ale nanoparticulelor în medicină. Cercetări recente arată utilizări ale nanoparticulelor magnetice în: imagistică, hipertermie, sisteme de transport medicamentos, tratamente biomedicale, etc.

4

În capitolul al șaselea am descris particularitățile hemostazei. Nanomaterialele medicale se pot comporta fie ca agenți procoagulanți, fie ca agenţi hipocoagulanți, în funcţie de dimensiunea, materialul de acoperire, încărcare şi compoziţia materialelor.

CONTRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL VIII. Sinteza şi caracterizarea nanoparticulelor de magnetită cu înveliş de acid citric (MA-COOH)

Procesul de sinteză al nanoparticulelor de Fe3O4(magnetită) cu înveliș de acid citric s-a realizat în colaborare cu Institutul de Chimie Macromoleculară "Petru Poni" Iași, prin reacția de coprecipitare, astfel: au fost dizolvate 2,7 g FeCl2x4H2O și 4,0 g FeCl3x6H2O în 200 ml de apă ultrapură. Apoi amestecul a fost agitat puternic până când sărurile de fier au fost complet dizolvate. Ulterior, peste amestec, a fost adăugat rapid 10 ml hidroxid de amoniu la temperatura camerei. S-a continuat cu o agitare puternică timp de 15 min la 75 °C. După ce reacția s-a finalizat, produsul negru obținut a fost colectat pe un magnet permanent și a fost spălat de trei ori cu apă ultrapură. Pentru a evita aglomerarea nanoparticulelor de Fe3O4, s-a adăugat peste acestea 150 ml soluție apoasă de acid citric 10% și s-a agitat timp de 15 minute la 60 °C.

Nanoparticule magnetice de Fe3O4 modificate cu acid citric (MA-COOH) au fost separate magnetic și au fost spălate cu apă ultrapură de trei ori pentru a îndepărta impuritățile.

Proba de MA-COOH dispersată în soluție apoasă a fost analizată sub aspect dimensional cu ajutorul tehnicii Dynamic Light Scattering și din punct de vedere al stabilității coloidale cu tehnica potențialului zeta cu un aparat Brookhaven 90 PLUS. Rezultatele indică o distribuţie uniformă, fiind prezent un singur interval granulometric, iar cele mai multe nanoparticule se situează la dimensiunea de 9,5 nm, iar potențialul zeta determinat are valoarea situată în intervalul 27-29 mV, rezultând că suspensia are stabilitate moderată [8,9].

Proba uscată de nanoparticule a fost analizată chimic prin spectroscopie de fotoelectroni cu raze X (X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS) şi magnetic prin magnetometrie optică Kerr (Magneto-Optic Kerr Effect, MOKE) în colaborare cu Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Fizica Materialelor (INCDFM) București.

Analiza din punct de vedere chimic al MA-COOH prin XPS, s-a realizat într-o incintă de analiză a unui cluster de Ştiinţa suprafeţelor şi interfeţelor marca Specs GmbH, în condiţii de vid ultraînalt, cu valori ale presiunii de bază de ordinul a 1-2×10-9 mbar şi cu valori în timpul măsurătorii de 3-5×10-8 mbar. În urma analizei se remarcă din spectre şi din valorile energiilor de legătură la care apar aceste linii de fotoemisie, că într-adevăr formula chimică se respectă, Fe apare ca oxidat şi în poziţia specifică Fe-ului din magnetită, iar celelalte elemente apar la valori care concordă cu valorile din bazele internaţionale de date pentru compuşi de tipul acid citric.

Pentru analiza magnetică prin MOKE a fost utilizat un sistem AMACC Anderberg and Modéer Accelerator AB, care permite aplicarea asupra probei a unui câmp

5

magnetic de maxim 0,55 T (437,68 kA/m). Analiza a arătat că nanoparticulele sintetizate prezintă proprietăți magnetice.

CAPITOLUL IX. Studierea proprietăților biologice in vivo ale MA-COOH pe modele experimentale

Datorită faptului că o suspensie de nanoparticule magnetice într-un mediu fiziologic artificial, nu ar putea să simuleze pe deplin diferite tipuri de celule ale sistemului biologic, ne-am concentrat atenția pe evaluarea farmacocineticii și biodistribuției nanoparticulelor, in vivo, folosind un model murin. Modelul murin rămâne unul dintre cele mai bune modele pentru studiul biomedical datorită caracteristicilor diferite, cum ar fi dimensiunile mici, similaritatea cu oamenii și totalitatea genomului ordonat in functie de similitudinile la om [10].

Modelul experimental folosit pentru studierea cineticii de eliminare din sânge a MA-COOH

Au fost folosiți 10 șobolani masculi Sprague Dawley (dintre care doi pentru control) cu o greutate corporală medie de 400 g și vârsta de nouăzeci de zile. Animalele au fost cântărite si apoi anesteziate cu un amestec de xilazină 10 mg/kgc și ketamină 100 mg/kgc, administrat intraperitoneal. Apoi, cu ajutorul unei seringi conectate la un cateter, afost injectat în vena jugulară un volum V (µl) echivalent cu concentrația de 15 µmol Fe/kg de ferofluid biocompatibil, compus din nanoparticule magnetice de Fe3O4 acoperite cu acid citric, diluate într-o soluție izotonică glicozilată, la un volum final de 0,5 ml. După intervale de timp de 0, 30, 90, 150 și 240 de minute, respectiv o zi, animalelor li s-au recoltat probe de sânge din vena codală. Temperatura ambiantă a fost menținută în intervalul 24-27 °C. Sângele a fost colectat folosind o seringă cu ac de 23G introdusă direct în vasul de sânge și a fost păstrat în tuburi Eppendorf cu capac la temperatura de -80 °C. După încheierea procedurii de colectare a sângelui, sângerarea a fost oprită cu o soluție de azotat de argint și aplicând presiune [11].

După injectare, șobolanii au fost recuperați în decubit lateral într-o cușcă cu așternut de talaj. Aceștia au fost observați cel puțin 4 ore sau până când nu au mai dat nici un semn de durere, iar apoi o dată pe zi.

Cinetica de eliminare a MA-COOH din sânge a fost determinată în colaborare cu INCDFM București, prin rezonanță electronică paramagnetică cu spectrometrul EPR în bandă X model Bruker ELEXSYS E580 echipat cu o cavitate rezonantă de tip Super High QE (SHQE) model ER 4123SHQE.

Modelul experimental folosit pentru determinarea biodistribuției în organe a MA-COOH

Am folosit un lot de 10 șobolani Sprague Dawley. La 24 de ore după administrarea intrajugulară a MA-COOH similar procedurii anterior descrise, animalele au fost eutanasiate cu 120 mg/kgc de pentobarbital de sodiu administrat intraperitoneal. Șobolanii eutanasiați au fost apoi perfuzați transcardial cu soluție salină prin

6

introducerea unui ac 23G conectat la un recipient cu ser fiziologic, situat la înălțimea de 50 cm față de masa de disecție, în ventriculul stâng. Eșantioanele de țesut din ficat, pancreas, creier, mușchi, rinichi au fost colectate și congelate la -80°C. Apoi au fost liofilizate și omogenizate pentru a fi supuse analizei stabilirii concentrațiilor în organe prin rezonanță electronică paramagnetică. Probele de control au fost colectate de la doi șobolani cărora nu li s-a administrat suspensia de nanoparticule.

Pentru analiza histopatologică am folosit colorația cu albastru de Prusia, care conține un amestec de acid clorhidric 20% și soluție ferocianură de potasiu 10% în raport volumic de 1:1 (Merck KGaA Corp., Darmstadt, Germania) pentru observarea distribuției MA-COOH în țesuturi. Acidul clorhidric degradează MA-COOH în ioni ferici care vor reacționa cu ferocianida de potasiu, formând ferocianură ferică Fe4[Fe(CN)6]3, un precipitat albastru, insolubil în solvenți organici.

Au fost colectate de la un lot de 10 șobolani, diferite organe (ficat, splină, pancreas, rinichi, creier și mușchi) prin metode chirurgicale specifice. Mostrele de organe au fost transferate în recipiente etichetate, conținând o cantitate adecvată de formalină tamponată neutră 10% (NBF).

Țesuturile în corporate în parafină, de la șobolanii cărora li s-au administrat MA-COOH, au fost colorate cu o soluție de albastru de Prusia și apoi spălate cu o soluție PBS (tampon pH fosfat salin).

Modelul experimental folosit pentru determinarea influenței MA-COOH în hemostază

Cunoscând faptul că nanoparticulele, folosite în studiul nostru, sunt acoperite cu molecule de acid citric și faptul că acidul citric este un chelator de ioni de calciu, am încercat să cuantificăm eventualele modificări ale cascadei coagulării sângelui.

În acest sens, am hotărât să evaluăm aceste alterări ale hemostazei cu ajutorul unor teste simple de laborator (timp de coagulare și timp de sângerare), dar și cu ajutorul unei noi metode imagistice, experimentală, tomografia optică coerentă (OCT), folosită de curând în premieră de grupul nostru de cercetare pentru evaluarea coagulării sângelui integral.

CAPITOLUL X. REZULTATE

Rezultate analiză rezonanță electronică paramagnetică

Prin metoda EPR cantitativă se determină numărul absolut de spini electronici care contribuie la semnalul EPR. În cazul de față, acest număr este echivalent cu numărul de ioni Fe3+ în cantitatea de sânge liofilizat, introdusă în tubul EPR.

Intensitatea EPR la g=2,1 s-a dovedit a fi proporțională cu concentrația de nanoparticule, iar temperatura optimă pentru achiziționarea de spectre este temperatura camerei (T = 298 K) [12].

7

Curba concentrației MA-COOH în sânge, în timp, după administrarea intravenoasă

Timpul de înjumătățire al procesului de eliminare al nanoparticulelor din circulația sanguină este de t1/2= 14,06 minute.

Nanoparticulele magnetice nu sunt distribuite numai în ficat, dar ele sunt, de asemenea, transferate și către alte organe ale șobolanului [13].

Pentru determinările cantitative ale concentrațiilor de MA-COOH din organe s-a utilizat rutina de calcul a cantității absolute de spini inclusă în programul XEPR de la Bruker, bazată pe dubla integrare a spectrelor EPR.

Având concentrația de nanoparticule la 30 minute după administrarea ferofluidului, drept concentrația de referință, CREF, nanoparticulele magnetice au avut următoarele concentrații în organe: Ficat: (120 +/- 24) CREF Splina: (706 +/- 141) CREF Rinichi: (3,3 +/- 1,5) CREF Pancreas: (0,7 +/- 1,5) CREF

În creier și mușchi, concentrațiile nanoparticulelor au fost aproximativ egale cu zero. Datorită masei mult mai mici a splinei, concentrația absolută de nanoparticule este mai mare în splină decât în ficat.

8

Spectrele EPR la temperatura camerei ale diferitelor organe liofilizate de șobolan, la 24 h după administrarea MA-COOH

Rezultate analiză histopatologică

Evaluarea histopatologică a confirmat acumularea nanoparticulelor în organe, utilizând colorația cu albastru de Prusia. În ceea ce privește rinichii, o parte dintre nanoparticule au fost localizate în spațiul interstițial medular renal, precum și în tuburile colectoare. Macrofagele spațiului interstițial medular renal, precum și celulele epiteliale care acoperă tuburile colectoare par a încapsula MA-COOH. Un proces similar s-a regăsit și în splină. Atât pulpa albă cât și cea roșie a splinei prezintă încapsulate în macrofage depozite de nanoparticule. Secțiunile de ficat au relevat o cantitate mare de nanoparticule stocate în lobul hepatic, precum și între lobuli. Unele depozite au fost observate la nivelul sinusoidelor capilare și intracelular în celulele Ito și Kupffer.

9

Depozite de MA-COOH în a) ficat, b) splină, c) plamân, d) rinichi de șobolan sacrificat la 24 ore după administrarea intravenoasă a MA-COOH. Colorație albastru de Prusia 40x

Rezultate ale influenței MA-COOH asupra hemostazei În urma analizei timpilor de coagulare am observat o valoare minimă de 180

secunde și o valoare maximă de 240 de secunde pentru lotul test, cu o valoare medie de 211,5±4,731 secunde (DS). S-a observat o ușoară creștere a timpului de coagulare în raport cu lotul control (205,5±4,229), însă nesemnificativă statistic (P= 0,3503>0,05).

De asemenea, în urma analizei timpilor de sângerare, am observat o valoare minimă de 285 secunde și o valoare maximă de 360 de secunde pentru lotul test cu o valoare medie de 324,8±5,888 secunde (DS). S-a observat o ușoară creștere a timpului de sângerare în raport cu lotul control (315,8±5,807), însă nesemnificativă statistic (P= 0,2833 >0,05)

În plus, rezultatele noastre demonstrează că imaginile tomografiei OCT ale celor două loturi de sânge (test și control) sunt similare, ceea ce înseamnă că MA-COOH nu produce anomalii semnificative în procesul de coagulare.

10

DISCUȚII Moleculele de acid citric de pe suprafața nanoparticulelor pot servi la

funcționalizare prin conjugare cu o serie de biomolecule în aplicații biomedicale, cum ar fi sistemele de transport medicamentos, bioseparare, îmbunătățirea contrastului pentru imagistica prin rezonanță magnetică, etc.

Studii anterioare au demonstrat că cea mai mare parte a nanoparticulelor introduse în fluxul sanguin, sunt preluate de către organele sistemului fagocitar mononuclear (SFM), cum ar fi ficatul și splina. Este cunoscut faptul că nanoparticulele de oxid de fier sunt preluate de către SFM prin endocitoză în celulele Kupffer din sinusoidele hepatice și de către macrofagele din pulpa roșie splenică, unde acestea sunt apoi degradate în lizozomii acestor celule. Fierul degradat este în cele din urmă eliminat sau reutilizat în organism prin intermediul căilor metabolice ale fierului, produșii de degradare ai Fe (II) și Fe (III) devenind apoi parte a hemoglobinei eritrocitare și a diverselor proteine structurale sau funcționale sau a transportatorilor și depozitelor de fier (transferină, feritină și hemosiderină) [14,15].

Rezultatele obținute în urma analizei farmacocinetice și a distribuției tisulare au fost înconcordanță cu studiul lui Gamarra et al. [12] în care timpul de înjumătățire al nanoparticulelor de magnetită acoperite cu dextran cu diametrul 80-150 nm a fost de aproximativ 11-12 min și s-a observat o acumulare a acestora în ficat, în urma analizei EPR.

De asemenea Gu et al. [16] au evaluat biodistribuția și degradarea nanocristalelor de oxid de fier acoperite cu polietilenglicol la șoareci. Fierul acumulat în organe la 24 de ore după injectarea intravenoasă (5 mg Fe/kg) de Feridex și nanocristale (5÷30 nm) confirmă rezultatele obținute în acest studiu.

Motivul pentru care am studiat influența nanoparticulelor MA-COOH în hemostază este acela că acidul citric este un chelator al calciului, care în forma sa ionică este un cofactor pentru o serie de factori ai coagulării. Informațiile cu privire la efectul nanoparticulelor în procesul de coagulare sunt limitate, însă în câteva studii s-a arătat că acestea prezintă un efect anticoagulant [17,18]. Cu toate acestea, aceste experimente nu sunt comparabile cu ale noastre, deoarece nanoparticulele fie au fost neacoperite, fie au avut altă structură.

Încazul MA-COOH, având în vedere doza mică de nanoparticule injectată la șobolani, efectul anticoagulant al acestora este nesemnificativ statistic.

CONCLUZII

1. În studiul nostru, în urma folosirii metodei de coprecipitare s-au sintetizat nanoparticule de oxid de fier cu înveliş de acid citric, a căror structură a fost caracterizată și confirmată prin metode specifice: spectrometrie XPS, magnetometrie optică MOKE, Dynamic Light Scattering, potențial zeta.

2. Nanoparticulele sintetizate şi testate în studiile ulterioare au avut diametrul mediu de 9,5 nm şi un potenţial Zeta de 29 mV, caracteristici care le conferă o bună

11

stabilitate a dispersiei apoase, putând fi administrate prin injectare intravenoasă, intraarterială, intraperitoneală sau chiar per os, prin sondă intragastrică.

3. În urma administrării intravenoase a nanoparticulelor pe model murin, s-a observat existenţa unei capacități rapide de extravazare din circulația sangvină, și migrarea acestora spre diferite țesuturi, având un timp de înjumătățire în circulația venoasă de 14,06 minute.

4. Din punct de vedere al comportamentului după administrarea intravasculară (intravenoasă jugular), nanoparticulele au dovedit o acumulare semnificativă în special în ficat și în splină, ambele organe având o circulație capilară de tip special (sinusoidală) dar și o bogată populație de celule cu capacitate fagocitară.

5. Influența nanoparticulelor asupra coagulării sângelui a fost în sensul creșterii ușoare a timpilor de coagulare și sângerare, însă nu semnificativă din punct de vedere statistic.

6. În concluzie, nanoparticulele utilizate în studiul nostru, având un trofism pentru organe ca splină și ficat și putând fi ușor funcționalizate (având înveliș bogat în grupări carboxil) pot fi utilizate în viitor în teste ce pot viza patologii ale acestor două organe, posibil ca vector terapeutic.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ:

1. National Nanotechnology Initiative, the Initiative and Its Implementation Plan, 2000; 2. Neuberger T, Schöpf B, Hofmann H, Hofmann M, von Rechenberg B .Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications:Possibilities and limitations of a new drug delivery system. J MagnMagn Mater. 2005, 293(1):483–496; 3. Bourrinet, P., Bengele, H.H., Bonnemain, B., Dencausse, A., Idee, J.M., Jacobs, P.M., Lewis, J.M., 2006. Preclinical safety and pharmacokinetic profile of ferumoxtran-10, an ultrasmall superparamagnetic iron oxide magnetic resonance contrast agent. Invest. Radiol. 41, 313–324; 4. Hafeli U, Schutt W, Teller J, Zborowski M. Scientific and Clinical Applications Of Magnetic Microspheres, Plenum Press,1997, New York; 5. Banaclocha MA, Bókkon I, Banaclocha HM. Long-term memory in brain magnetite. Med Hypotheses. 2010, 74(2):254-7. doi: 10.1016/ j.mehy. 2009.09.024; 6. Mahmoudi M, Simchi A, Imani M. Recent advances in surface engineering of superparamagnetic iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Journal of the Iranian Chemical Society. 2010: 7, 1-27. 7. Lübbe AS, Alexiou C, Bergemann C. Clinical applications of magnetic drug targeting. J Surg Res. 2001 Feb;95(2):200-6. 8. Jans H, Liu X, Austin L, Maes G, Huo Q. Dynamic Light Scattering as a Powerful Tool for Gold Nanoparticle Bioconjugation and Biomolecular Binding Studies. Analytical Chemistry 2009 81 (22), 9425-9432.

12

9. Greenwood R, Kendall K. Electroacoustic studies of moderately concentrated colloidal suspensions. Journal of the European Ceramic Society 1999; 19 (4): 479–488. 10. Frese KK, Tuveson DA. Maximizing mouse cancer models. Nature Reviews Cancer. 2007;7(9):654-8. 11. Parasuraman S., Raveendran R., &Kesavan R. (2010). Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology &Pharmacotherapeutics, 1(2), 87–93. doi:10.4103/0976-500X.72350 12. Gamarra LF, Pontuschka WM, Amaro E, et al. Kinetics of elimination and distribution in blood and liver of biocompatible ferrofluids based on Fe3O4 nanoparticles: An EPR and XRF study. Materials Science and Engineering C 28 (2008) 519–525. 13. Weissleder R, Bogdanov A, Neuwelt EA, and Papisov M. Long-circulating iron oxides for MR imaging. Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 16, no. 2-3, pp. 321–334, 1995. 14. Weissleder R, Stark D, Engelstad BL.; Bacon BA.; Compton CC; White DL.; Jacobs P; Lewis J. Superparamagnetic Iron Oxide: Pharmacokinetics and Toxicity. Am. J. Roentgenol. 1989, 152, 167–173. 15. Pouliquen D; Jeune JJ; Perdrisot R.; Ermias A.; Jallet P. Iron Oxide Nanoparticles for Use as an MRI Contrast Agent: Pharmacokinetics and Metabolism. Magn. Reson. Imaging 1991 , 9, 275–283. 16. Gu L, Fang RH, Sailor MJ, Park J-H. In Vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS nano. 2012;6(6):4947-4954. 17. Ostomel TA., Shi Q., Stoimenov PK, and Stucky GD., Metal oxide surface charge mediated Hemostasis. Langmuir 23, 11233 (2007). 18. Fernandez Pacheco R., Marquina C., Gabrielvaldivia J, Gutierrez M., Soledadromero M., Cornudella R, Laborda A., Viloria A., Higuera T. and Garcia A., “Magnetic nanoparticles for local drug delivery using magnetic implants,” J MagnMagn Mater, vol. 311, no. 1, pp. 318–322, 2007.