(2014) coprocultura vs 1.3 martie 2012

7/16/2019 (2014) Coprocultura vs 1.3 Martie 2012

http://slidepdf.com/reader/full/2014-coprocultura-vs-13-martie-2012 1/14

DEPARTAMENT MICROBIOLOGIE – LABORATOR SYNEVO MEDGIDIA

PROCEDURA SPECIFICA –EXAMINAREA MICROBIOLOGICAA MATERIILOR FECALE

COD: PS-MG-MI 30, 102 VERSIUNEA 1.3/!"#.2012 EXEMPLAR NR.

Nota asupra dreptului de proprietate

Acest document este proprietatea SC Synevo Romania SRL.

Acest document este elaborat pentru utilizarea de catre personalul Laboratorului Synevo Romania Medgidia. Reproducerea integralăsau parţială a prezentului document în orice publicaţii şi prin orice procedeu electronic! mecanic! "otocopiere! micro"ilme etc.#! esteinterzisă! dacă nu e$istă acordul scris al Synevo Romania.%u se permite modi"icarea acestui document de catre utilizator. Synevo Romania nu îşi asumă responsabilitatea! nu garanteazăe$plicit sau implicit caracterul complet! nealterat şi gradul de utilitiate a documentului în cazul în care utilizatorul a operat modi"icărişi nu poate "i "ăcut responsabil de orice "el de pagube rezultate în urma utilizării sale. &tilizatorul! isi asuma intreaga responsabilitatepentru des"asurarea! "inalizarea si implementarea corespunzatoare a documentului.

Indicatorul actualizarilor

'ersiunea(#

)ersoana care a elaboratdocumentul

Mentiuni asupra documentului elaborat *ata elaborarii

+., *r. -ugen S-/A%-SC& *ocument initial 0anuarie 1,,2

+.+ *r. Sorin 3MAS0A% )rima revizie Martie 1,+,

+.1 *r. Sorin omasian A doua revizie Martie 1,++

+.4 *r. Sorin omasian A treia revizie Martie 1,+1

ELABORAT VERIFICAT APROBAT

NUME *r. Sorin 3MAS0A% Mi5aela 'ladut *r. Sorin 3MAS0A%

FUNCTIE Se" departament Specialist SMC Se" Laborator

SEMNATURA

ATA

!" NOTIUNI INTROUCTIVE

Cunoasterea si respectarea prezentei proceduri este obligatorie pentru tot personalul implicat in determinareagermenilor patogeni din materii "ecale 1/1






!"!" Scop

Stabilirea procedurii pentru determinarea prezentei germenilor patogeni si a levurilor in materile "ecale.

1.2. ocu#ente de re$erinta%6 *iagnostic Microbiology 7 8aily 9 Scott:s +1 t5 edition 1,,;6 0nstructiuni de lucru speci"ice6ratat de microbiologie clinica ed a 0006a! 8uiuc si %egut 7 1,,2! -d Medicala 8ucuresti6 0nstructiuni de lucru cu micropipeta6 <5idul serviciilor medicale ale Laboratorului Synevo! ultima editie in vigoare6 <5idul national de biosiguranta pentru laboratoarele medicale! -d. 0! 8ucuresti! -d. Medicala! 1,,=! pg. >; 7 ;+

!"&" Ter#eni' de$initii si a(re)ieri%- ?C 7 control de calintate- S0 7 mediu triple sugar iron agar

-M0L/ 7 mobilitate! indol! lizindecarbo$ilaza! "enilalanina

-

!"*" o#eniu de aplicare)rocedura este stabilita pentru a "i utilizata in *epartamentul de Microbiologie de catre personalul te5nic atunci cand este necesar.

1.5. In$or#a+ii ,eneraleSindromul diareic este! ca "recvenţă! al treilea sindrom înt@lnit în practica medicală.

*eşi maoritatea pacienţilor prezintă o in"ecţie autolimitantă! e$istă şi "orme severe! caracterizate prin scaune "recvente 46>,Bzi#! deconsistenţă redusă uneori apoasă#! cu pierderi lic5idiene mari! ce pot duce la dezec5ilibru 5idroelectrolitic însoţit de tulburări5emodinamice grave colaps cardiovascular# cauzatoare de deces.

Etiolo,ie%

Parazitar- <iardia lamblia! Cryptosporidium parvum! -ntamoeba 5istolyticaBacterian- aero(-% -nterobateriaceae patogene Salmonella spp.! S5igella spp.! -sc5eric5ia coli enteropatogen! enteroto$igen!entero5emoragic! enteroinvaziv! enteroaderent! enteroagregativ! Dersinia enterocolitica6 -nterobacteriaceae condiţionat patogene Elebsiella spp. sindromul diareic al noului născut#! Serratia marcescens Fsindromulscutecului roşuG 6 prin colonizare anormală cu această bacterie la nou născuţi#

6 'ibrio c5olerae! 'ibrio para5aemoliticus

6 Alţi bacili <ram negativi Aeromonas! Alcaligenes! )lesiomonas

6 Coci <ram pozitivi Stap5ylococcus aureus

Bacterian- anaero(- 8acillus cereus! Clostridium di""icile enterocolită pseudomembranoasă post antibioterapie#! Clostridiumper"ringens! Clostridium botulinum.

Microaero$il- Campylobacter sppMicotic- Candida albicans

Viral- Rotavirus! Adenovirus! %oro virus

*in materiile "ecale muco6sangvinolente! purulente in "rotiu sunt prezente leucocite# se izoleaza mai "recvente bacterii enteroinvaziveS5igella! -. coli enteroinvaziv -0-C#. *in materii "ecale lic5ide pe "rotiu! leucocitele sunt absente# se izoleaza mai "recvent bacteriienteroto$igene -.coli enteroto$igen --C# si -. coli entero5emoragic -H-C#. 0n materiile "ecale mucoase! muco6sangvinolente pe"rotiu prezenta 5ematiilor si a mucusului# se izoleaza mai "recvent Salmonella spp.! -. coli enteropatogen -)-C#! Dersinia spp. *into$iin"ectiile alimentare anamneza# mai "recvent se izoleaza Salmonella spp! Stap5ilococcus aureus! Clostridium per"ringens!8acillus cereus. 0n diareeile postantibiotice anamneza# se izoleaza mai "recvent "lora endogena Stap5ilococcus aureus! Clostridium







di"icile! levuri de Candida spp. *in diareeile in"ectioase nebacteriene mai "recvent izolam paraziti! levuri.0n laboratorul Synevo in cadrul analizei coprocultura se testeaza principalii patogeni enterici S5igella spp. Si Salmonella spp! precum

si patotipurile enteropatogene de -sc5eric5ia coli la copii mai mici de 1 ani.

*e asemenea la nou nascuti! sunt cautate si cele doua specii conditionat patogene Elebsiella spp. si Serratia marcescens.

1.$.R%&'!()*"+ %(#" )%#%"+(!"%! &'"'&#"++- *iaree cu stare generala alterata- *iaree intr6un conte$t epidemic "amilie! cresa! scoala#- *iareea turistilor- *iaree "ebrila sau sangvinolenta- Control obligatoriu la personalul din alimentatie publica.

!"." Masuri de securitate in #unca si pre)ederi in caz de accidente0nainte de des"asurarea oricarei activitati in laborator personalul trebuie sa se asigure ca poseda cunostinte de protectia si securitateamuncii in laboratorul medical. -ste obligatoriu sa purtati ec5ipament de protectieI

oate ec5ipamentele de diagnostic in vitro! probele pacientilor! trebuie tratate ca materiale cu potential risc biologic. oate materialelecare intra in contact cu produsele mai sus mentionate sunt considerate materiale in"ectioase.-c5ipamentele si instructiunile de protectie constau in manusi c5irurgicale! 5alatB costum inc5eiat! parul strans! oc5elari de protectiesau 5ote de siguranta biologica! "ara biuterii sau accesorii mari.

R+&"+ +( &! (%"%%&#!"++ ('"%'" )% %&"+#!#% +( (&! 6 Conta#inrea cu pro(e (iolo,ice ' riscul de e/punere la aerosoli' stropiri si inoculari accidentale"Aerosolii sunt produsi de orice activitate care determina aparitia de miniparticule sau stropi de material lic5id sau semilic5id! cum ar "iagitarea! turnarea! amestecarea sau picurarea unui lic5id pe o supra"ata sau intr6un lic5id. Activitatile de laborator precuminsamantarea placilor de agar prin e"ectuarea de striuri paralele! inocularea "lacoanelor de culturi prin "olosirea unei pipete pentru adistribui suspensii de agenti in"ectiosi! e"ectuarea de dilutii in tuburi sau placi! omogenizarea si agitarea prin producerea de varte amaterialelor in"ectioase! centri"ugarea lic5idelor contaminate pot genera aerosoli in"ectiosi. )articulele de aerosoli cu diamentru sub Jmicrometri si picaturile mici cu diametrul J6+,, micrometri nu sunt vizibile cu oc5iul liber. Contactul cu toate acestea poate duce la

in"ectii. e5nicianul de laborator trebuie avertizat asupra "ormarii acestor particule si asupra "aptului ca ele pot "i in5alate sau potcontamina supra"ete si materiale. Atunci cand manipulati probele si deseurile asigurati6va ca purtati ec5ipament de protectie. *acaprobeleBdeseurile vin in contact direct cu pielea! spalati6o imediat cu apa si aplicati dezin"ectant. Consultati de urgenta un medic.-$ista posibilitatea de per"orare a manusilor de protectie. *e aceea! este necesara o atentie sporita atunci cand lucrati in zona delucru.6 *aca proba biologica este varsata pe o supra"ata de lucru! aceasta se acopera cu o solutie dezin"ectanta! se lasa sa actionezepentru inactivarea microorganismelor si apoi se indeparteaza.0 Contactul cu reacti)ii si solutiile de curatenie si dezin$ectare% /olositi intotdeauna manusi de protectie rezistente c5imic# sioc5elari de protectie atunci cand manipulati solutiile de colorare . -$ista posibilitatea de per"orare a manusilor de protectie. *e aceea!este necesara o atentie sporita atunci cand lucrati in zona de lucru.0n cazul reactivilor tineti cont de atentionarile e$istente la nivelul cutiilor de reactivi.0 Socul electric La orice ec5ipament electric! poate surveni socul electric. %& incercati sa accesati nici o componenta aec5ipamentului marcata corespunzator. %& incercati sa lucrati in nici un compartiment electronic. 0nstalarea! service6ul si reparareatrebuie e"ectuate doar de catre personal autorizat si cali"icat.0 Manipularea in si,uranta a pro(elor de la(oratorContainerele pentru pro(e pot "i din sticla sau pre"erabil din plastic. -le trebuie sa "ie rezistente si nu trebuie sa permita scurgereamaterialului din ele cand dopul sau capacul sunt corect aplicate. %imic din materialul recoltat nu trebuie sa ramana ina"aracontainerului .Containerele trebuie corect etic5etate pentru o identi"icare usoara . *ocumentele de insotire nu trebuie in"asurate in

urul containerului ci plasate separat.Transportul pro(elor in la(orator. )entru evitarea scurgerilor accidentale sau a varsarii probelor! trebuie utilizate containeresecundare cum sunt cutiile cu stative pentru ca probele sa ramana in picioare atunci cand sunt transportate. Containerele secundarepot "i din metal sau plastic! pentru a putea "i autoclavabile sau rezistente la actiunea dezin"ectantilor c5imici. -le trebuiedecontaminate regulat.Pri#irea pro(elor" Laboratorul care primeste un numar mare de probe trebuie sa aiba o incapere separata sau un spatiu special







pentru acest scopesc1iderea pac1etelor" )ersonalul care primeste si despac5eteaza probele trebuie sa "ie constient de potentialul pericol si trebuie

instruit sa adopte precautiile standard in special cand se con"runta cu spargerea sau varsarea containerelor. Containerele primare cuprobe trebuie desc5ise intr6o 5ota. rebuie sa e$iste dezin"ectante la indemana.

Tre(uie respectate precautiile de si,uranta"

2" FA3A PREANALITICA

2"!" E$ectuarea co#enzii se realizeaza con"orm )<6,1! G)rocedura generala de analiza a comenzii! o"ertei si contractuluiG

2"2" Pre,atirea pacientului pentru recoltare inaintea instituirii oricarui tratament antimicrobian

2"&" Recipient% coprorecoltor steril cu mediu de transport Carry 8lair! sau "ara mediu de transport cand proba aunge la laborator inmai putin de doua ore de la recoltare.

2"*" Speci#en recoltat materii "ecale! vizand portiunile lic5ide si mai ales cele mucoase siBsau sangvinolente daca e$ista!)relevarea rectală 7 este recomandată în

6 s5igelozele cronice! unde raclarea mucoasei rectale cu sonda ori tamponul o"eră şanse mai mari izolăriiI

6 investigarea purtătorilor de S5igella şi Salmonella! cu e$cepţia celor de S. yp5i.

)entru acest tip de prelevare se "olosesc sonde %elaton nr.+>6+=# ori tampoane adecvate! ast"el cu tamponul! umectat în soluţiesalină izotonă a nu se "olosi geluri lubre"iante#! se penetrează s"incterul anal prin rotire lentă! introduc@ndu6se intrarectal apro$. +Jcm. Se va proceda identic şi cu sonda %elaton! la care se adaptează o seringă +, ml# cu care se "ac +61 aspiraţii. *upă prelevare!sondele şi tampoanele se introduc în recipiente sterile ce conţin mediu de conservare! se etic5etează corespunzător şi se trimit lalaborator

2"2" Etic1etarea recipientilor se "ace cu etic5eta alba! pe care este notat barcode6ul! numele si prenumele.

Transportul pro(elor la nivelul laboratorului se e"ectueaza in conditii de pastrare a securitatii si integritatii probei. Se "ace in ma$im15 daca au "ost recoltate in recipiente "ara mediu de transport sau pot "i pastrate pana la 1>5 la temperatura camerei daca s6aurecoltat in recipiente cu mediu de transport .

2"&" Conditii de prelucrare si pastrare a pro(elor patolo,ice pana la e/a#inare)roba patologica se prelucreaza la sosirea in laborator nu se pastreaza#.

2"*" Volu#ul #ini# necesar minim J ml din materii "ecale lic5ide sau 4 7 J mmc daca scaunul este "ormatI

Criterii de respin,ere a pro(ei probe neidenti"icateBneetic5etate corespunzatorI volum insu"icient de proba! tip de recipient de

recoltare necorespunzator! recipiente degradate&" FA3A ANALITICA

&"!" Ec1ipa#ente si consu#a(ile&"!"!" Ec1ipa#ent principal de #asurare% nu este aplica(ila &"!"2" Ustensile si consu#a(ile necesare%0 ermostat6 bec 8unsen6 ansa bacteriologica6 dispenser







6 placi )etrii6 microscopul

6 densimat 8ioMerieu$

&"2" Reacti)i 4prelucrare' conditii de pastrare' sta(ilitatea5%6 Mediile utilizate pentru culturi si imbogatire mediu lactozat MacConKey! mediu moderat selectiv HeKtoen! bulion selenit de sodium!Sabouraud cu cloram"enicol si gentamicina.6 estele pentru identi"icari bioc5imice S0! M0&! M0L/! Citrat Simmons6 microcomprimate de antibiotice.6 teste de identi"icare a levurilor6 teste de determinare a sensibilitatii la anti"ungice6 seruri de aglutinare seruri polivalente pentru Salmonella! S5igella! -. coli enteropatogen! enteroinvaziv! entero5emoragic#.

3.3.C'()+#++ )% %)+ + )% '%"!"%: Mediu%

0 Mediu "ara pra" cu o ventilatie adecvata 6 emperatura trebuie sa "ie +61= CI

6 &miditatea >J6;,NIApa 7 apa distilata pentru prepararea mediilor pentru identi"icareI

Electric% La termostate nu se deconecteaza de la sursa de energie in timpul utilizarii acestuia.

3.4. Speci$icatii de per$or#anta 6 nu este cazul

&"7" Principiul Metodei0nsamantarea probei pe doua medii de cultura! unul lactozat MacConKey# si unul moderat selectiv HeKtoen# si incubare la 4J 74;OC! permite aparitia pe mediile de cultura a coloniilor caracteristice lactozo6negative S5igella! Salmonella# si lactozo6pozitive -.coli! Elebsiella#.

3.6. Prelucrarea pro(ei inainte de introducerea in aparat 6 nu este aplicabila

&"." Mentenanta analizorului 7 pentru microscop! respectandu6se planul de mentenanta.

&"8" Etalonare analizor% -talonarea se "ace con"orm planului de etalonare! de catre institutii autorizate in domeniu etalonareatermostatelor#I

&"9" Cali(rare% nu este aplicabila

&"!:" Control de calitate ;CFrec)enta ;C% 0 controlul recipientelor sterile la "iecare sara de turnare 6 cu autorul tulpinilor de re"erinta se e"ectueaza controlul mediilor de cultura testarea e"icientei biologice# la "iecaresara de turnare si la sc5imbarea lotului si veri"icarea saptamanala a microcomprimatelor de antibiotice si la sc5imbarea lotuluiI

6 controlul sterilitatii mediilor turnate se e"ectueaza la "iecare sara de turnareI 6 controlul truselor de coloratie cu tulpini de re"erinta se "ace la sc5imbarea lotului si zilnic in cazul coloratiei <ramI 6 controlul sterilizarii la etuva 7 la "iecare sterilizare teste bioc5imice# si lunar teste biologice#I 6 veri"icarea sterilitatii la autoclavul de medii si in"ecte la "iecare autoclavare teste bioc5imice# si lunar testebiologice#I 6 controlul supra"etelor 7 saptamanalI

6 controlul aeromicro"lorei 7 saptamanal.)repararea mediilor se e"ectueaza con"orm instructiunilor de lucru si prospectelor producatorului0denti"icarea "ractiunilor 6 nu se aplicaStabilitate la intuneric 6 nu se aplica







*escrierea modului de lucru pentru e"ectuarea controlului intern se e"ectueaza con"orm )< + P:)rocedura generala de control internde calitate::.

&"!!"Criterii de acceptare<respin,ere ale rezultatelor controlului intern"%u se utilizeaza tulpini de re"erinta cu e$pirarea termenului de valabilitate si cu peste > pasae.

&"!2" A&#+(+% &'"%&#+% !+&!#% ! +(&!&!"%! "%+'" #!++#% %(#" &'(#"' +(#%"(4- daca controlul sterilitatii si e"icientei biologice a mediilor de cultura utilizate apar necon"ormitati! pentru controlul sterilitatii se

toarna o noua sara! iar pentru controlul e"icientei biologice se sc5imba mediul.- la veri"icarea aeromicro"lorei si supra"etelor pentru evitarea contaminarii incrucisate la aparitia necon"ormitatilor se "ace

sterilizarea cu lampa &' si substante dezin"ectanteI- pentru sterilitatea recipientelor de recoltare 7 se sc5imba lotul

&"!&" R!"%! "'%'"

I'!"%! !&#%"++'" !%"'%:

3iua I− e$amen macroscopic materii "ecale lic5ide mucopurulente! mucosangvinolente! 5emoragice etc.

− 0nsamantari pe medii solide de izolare MacConKeyQ 0nsamantare pe mediu lic5id de imbogatire bulion selenit de sodiu#

3iua a II0a

− citirea primelor placi insamantate 7 prima orientare asupra diagnosticului

− insamantare pe mediul solid HeKtoen de pe mediul lic5id de imbogatire si repicarea coloniilor lactozonegative de pe

MacConKey tot pe mediul solid HeKtoen

− identi"icare bioc5imica! pornind de la colonii suspecte

3iua a III0a - interpretarea testelor bioc5imice din ziua precedenta- acelasi proces din ziua a 006a cu un decala de 1> de ore teste bioc5imice pentru coloniile suspecte obtinute pe mediu solid

HeKtoen dupa imbogatire#- identi"icarea serologica complementara a unor specii Salmonella! S5igella! -)-C- e"ectuarea antibiogramei

3iua a IV0a - interpretarea testelor bioc5imice din ziua precedenta- e"ectuarea antibiogramei pentru speciile identi"icate bioc5imic in ziua respectiva- Citirea B interpretarea antibiogramei din ziua precedenta- eliberarea rezultatului

3iua a V0a - Citirea B interpretarea antibiogramei din ziua precedenta- eliberarea rezultatului

Se "ac insamantari pe mediile de cultura mentionate. Mediile sunt incubate la 4; , C in aerobioza timp de 1>5.0n ziua urmatoare se citesc culturile in "unctie de aspectul microscopic si macroscopic al acestora se e"ectueaza testele necesareidenti"icarii "iecarei specii in parteE(#%"'!&#%"+!&%!%/amilia -nterobacteriaceae este o "amilie largă de bacterii incluz@nd multi dintre cei mai "amiliari agenti patogeni sau conditionatpatogeni.a$onomia /amiliei -nterobacteriaceae cuprinde peste 4, de genuri si +1, specii. Cele care prezintă importantă clinică! în proportiede 2JN! sunt grupate în +, genuri! după cum urmează genul -sc5eric5ia! genul S5igella! genul Salmonella! genul Elebsiella!! genulMorganella ! genul -nterobacter ! genul )rovidencia! genul )roteus! genul Citrobacter ! genul Serratia! genul Ha"nia ! genul Dersinia.Caractere mor"otinctoriale sunt bacili <ram6negativi! cu dimensiuni de ,!46+!, $ +!,6=!,m! ciliati sau neciliati! nesporulati! cu sau "ără







capsulă.Caractere de cultură sunt nepretentiosi si cresc pe medii simple. Sunt germeni aerobi! "acultativ anaerobi care necesită! pentru o

crestere optimă! temperaturi de 1164;OC. )e mediile neselective! "ormează colonii de culoare gri e$cept@nd Serratia marcescens! deculoare rosie#! de tip SG! MG e$ceptie )roteus spp.! "enomen de cătărare#. )e geloză6s@nge! unele specii determină 5emoliză T.este bioc5imice pentru identi"icarea enterobacteriilorestele bioc5imice e$ploreaza metabolismul glucidic si al aminoacizilor bacteriei si evidentiaza tipul de "ermentatie. estele utilizate inlaborator sunt

+. TSI 4triple su,ar iron a,ar5" Mediul se insamanteaza utilizand o ansa "ara bucla care odata incarcata cu produsul deanalizat se introduce steril in eprubeta cu mediu e$ecutandu6se o intepatura unica si verticala a coloanei drepte amediului pana in pro"unzimea acestea si descarcand apoi ansa pe portiunea inclinata. Se incubeaza la 4;OC timp de1>5 o incubare prelungita determina reactii nespeci"ice#.

0 portiunea dreapta evidenteaza degradarea glucozei cu eliberare de gaz vireaza culoarea mediului in galben si aparbule de gaz#

0 portiunea inclinata evidenteaza degradarea lactozei! za5arozei vireaza culoarea mediului in galben#0 H1S se evidenteaza prin innegrirea mediului. H1S 7 evidentiaza prezenta enzimei care descompune aminoacizii cu sul".

*aca bacteria are enzima pentru sul"! descompune acetatul de plumb in sul"ura de plumb inegreste mediul#.1. MILF 4#o(ilitate 6 indol 6 lizindecar(o/ilaza 0 $enilalanina5" Mediul se insamanteaza utilizand o ansa "ara bucla

care incarcata cu produsul de analizat se introduce steril in eprubeta cu mediu e$ecutandu6se o intepatura unica siverticala a coloanei de mediu pana in pro"unzimea acestea. Se incubeaza la 4;OC timp de 1>5 o incubare prelungitadetermina reactii nespeci"ice#.

Rezultate si criterii de interpretare0 mobilitatea se evidenteaza prin cresterea bacteriei in interiorul mediului mobilitate Q# U opacitate! mobilitate 6# U

mediul transparent#! reactie "als negativa daca s6a realizat o incalzire e$cesiva a culturii si ast"el este denaturant"lagelul bacterian.

0 lizina Q# se evidenteaza prin virarea culorii mediului de la violet desc5is la violet intens! lizina 6# se modi"ica culoareamediului virand de la violet desc5is la galben. Lizina evidenteaza prezenta lizindecarbo$ilazei.

0 "enilalanina 7 se evidenteaza prin adaugarea a 164 picaturi de clorura "erica +,N si "ormarea unui inel verde in ma$im164 minute de la adaugarea solutiei. -videnteaza "enilalanindezaminazei. esul pozitiv de "enilalanina trebuie sa "ie

interpretat imediat dupa agaugarea reactivului deoarece culoarea verde se stinge rapid. 3 interpretare "ie negative! "iepozitiva trebuie "acuta in primele J minute. Rotirea reactivului de /eCl4 pe supra"etele insamantate contribuie laobtinerea unei reactii mai rapide cu o culoare mai pronuntata. Reactivul se pastreaza in "lacoane la intuneric si latemperatura de sub 4,OC! pana la e$pirarea termenului de valabilitate.

4. Citrat Si#onns 0 mediul cu citrat. Mediul se insamanteaza utilizand o ansa "ara bucla care incarcata cu produsul deanalizat se descarca pe portiunea inclinata a mediului. Se incubeaza la 4;OC timp de 1>5 o incubare prelungitadetermina reactii nespeci"ice#.*aca bacteria utilizeaza citratul are sistem de transport# vireaza culoarea mediului de la verde la albastru.

>. MIU" Mediul se insamanteaza utilizand o ansa "ara bucla care incarcata cu produsul de analizat se introduce steril ineprubeta cu mediu e$ecutandu6se o intepatura unica si verticala a coloanei de mediu pana in pro"unzimea acestea. Seincubeaza la 4;OC timp de 1>5 o incubare prelungita determina reactii nespeci"ice#. Mediul cu uree arata daca bacteria produce ureaza! aceasta modi"ica indicatorul de pH! iar mediul isi sc5imbaculoarea din galben in roz6rosu.

Tabelul urmator prezinta principalele caracteristici biochimice ale enterobacteriaceaelor







Stap1=lococcus aureusMicroscopic coci s"erici <ram pozitivi! asezati in mod obisnuit in "orme neregulate! de ciorc5ine.Cultural pe placi cu mediu Columbia cu JN sange de berbec! coloniile produc o zona circulara de 5emoliza in urul lor! au aspect Ssmoot56 neted#! cremoase! rotunde! cu diametrul cuprins intre 164 mm! margini per"ecte! supra"ata neteda! bombata! lucioasa dupaincubare +61> de ore la 4;O C. %u toate tulpinile de S. aureus produc 5emoliza iar pigmentul si 5emoliza devin mai pronuntate adoua zi sau daca sunt lasate la temperatura camerei cateva zile.*i"erentierea S. aureus de alte specii de sta"ilococi se realizeaza prin intermediul

1. Caracterelor culturale 6 repicarea coloniilor suspecte pe mediul C5apman6manitol dau posibilitatea di"erentierii

Sta"ilococilor patogeni coagulazo6pozitivi care sunt manito6pozitivi si "ormeaza colonii galbene sc5imband si culoareamediului in galben#! "ata de cei sapro"iti coagulazo6negativi care sunt si manito6negativi si produc colonii mici rosii "ara sasc5imbe culoarea mediului din ur#I

1. -S&L *- A<L&0%AR- C& LA-V 6 )AS3R-V SA)H6)L&S sau 3M-<A A'0)AH SA)HPrincipiul #etodei%)astore$ Stap56)lus si 3mega Avipat5 Stap5 au "ost concepute pentru detectarea simultana a urmatoarelor componente

0 "actorul de a"initate pentru "ibrinogen! cunoscut ca si FcoagulazaG sau F"actor de prindereG! este proteina A care posedaa"initate "ata de "ragmentul cristalizabil /c# sau gamaimunglobulina 0g<#I

0 poliza5aridul capsular al Stap5ilococcus aureus.Reactivul este alcatuit din particule late$ cu a"initate pentru "ibrinogen si 0g<! asemanatoare anticorpilor monoclonalispeci"ici! indreptati "ata de poliza5aridul capsular al Stap5ilococcus aureus. Combinatia "ibrinogenului! 0g< si anticorpiimonoclonali anticapsulari in acelasi reactiv auta la recunoasterea tulpinilor capsulate de Stap5ilococcus aureus in aceeasimasuara ca si a tulpinilor de Stap5ilococcus aureus ce prezinta microcapsule.)entru tulpinile cu capsula! anticorpii "ata de capsula poliza5aridica aglutineaza bacteria. )entru tulpinile care si6au pierdutcapsula poliza5aridica! bacteriile sunt agglutinate de "ibrinogen si 0g<.0zolatele de Stap5ilococcus aureus sunt amestecate cu reactivul late$ pe slide. Se urmareste o amestecare completa! slide6ul este e$aminat visual pentru prezenta aglutinarii care indica prezenta Stap5ilococcus aureus.Reacti)iLate$ ,.,1N metiolat de %a si W ,.+N azida de sodium

Controlul negtiv ,.,1N metiolat de %a si W ,.+N azida de sodium)astrare si depozitare odata desc5isi! toti reactivi sunt stabili pana la data e$piarii mentionata in conditiile unei pastrari la 16C si absenta contaminari microbiene. )astrati tuburile cu reactivi in pozitie verticala. Reactivii late$ nu trebuie ing5etati.Mod de lucruulpinile utilizate cu acest Kit trebuie sa "ie pure si tinere. Se recomanda urmatoarele medii de izolare sau mediiec5ivalente agar Columbia Q JN sange de berbec! agar Columbia! agar sange! C5apman manitol 5iperclorurat.Se testeaza tulpinile cu coloratia <ram si testul catalazei. ulpiniile care sunt testate cu reactivi )astore$ Stap56)lus sau3mega Avipat5 Stap5 trebuie sa "ie coci gram pozitivi si sa aiba catalaza pozitiva.Reactia de aglutinare3mogenizati complet reactivul de late$ prin agitare. 'orte$area reactivului este necesara)uneti separat o picatura de reactiv late$ si una de control negativ in doua din cercurile cardului de testare.Cu o lopatica sau cu un bat puneti cate + 6 4 colonii catalazo6pozitive in ambele cercuri.-mulsionati amestecurile din ambele cercuri timp de +, secunde. 3mogenizati cu blandete! rotind cardul.

Rezultatul se citeste dupa 4, secunde de la inceperea rotirii cardului.-valuati rezultatul dupa care puneti cardul in solutie dezin"ectanta. %u reutilizati cardul.0nterpretarea rezultatelor A" Reactie poziti)a 3 reactie pozitiva este evidentiata de "ormarea unor agregate numai cu reactivii test! vizibile cu oc5iul liber la luminanormala inainte de 4, secunde de la inceputul rotatiei cardului. Agregatele particulelor late$ pot "i de marimi di"erite cu un"ond mai mare sau mai mic roz! intrucat o aglutinare slaba poate semni"ica aglutinare non6speci"ica. B" Reactie ne,ati)a 0ntr6o reactie negativa! suspensia nu produce agregate si se mentine aspectul laptos. -ste cazul controlului negativ.Controlul de calitateSe evalueaza reactivii late$ la "iecare sc5imbare de lot si la "iecare suspiciune de alterare a calitatii. estul de calitate se







"ace utilizand tulpina de re"erinta Stap5ilococcus aureus ACC 1;J4 unde trebuie sa arate prezenta aglutinarii.

A" Identi$icarea serolo,ica a tulpinilor de E" coliulpinile de -. coli care produsc diaree sunt clasi"icate pe baza mecanismelor patogene in -. coli enteropatogen -)-C#! -. colienteroinvaziv -0-C#! -. coli entro5emoragic -H-C#.0denti"icarea bioc5imica nu di"erentiaza tulpinile de -. coli patogene de cele nepatogene! de aceea se recomanda testul serotipare.)entru patotipul -. coli enteropatogen se "oloseste antiserul de -. coli nonavalent 7 o mi$tura din 2 serotipuri 3+++! 3JJ! 31=! 3=!3++2! 3+1;! 3+1J! 3+1=! 3+1)rincipiul metodeiCand reactivul care contine aglutinine speci"ice "iecarui tip este amestecat cu organisme omoloage de -. coli se produce o reactieantigen6anticorp care produce aglutinarea celulelor vizibila cu oc5iul liber si ast"el se poate determina serotipul.

Mod de lucru in "unctie de antiserurile utilizate.)entru antiserurile -sceric5ia coli procedura de lucru este urmatoareaSerotiparea se recomanda a "i e"ectuata dupa identi"icarea tulpinii de -. coli! in cultura pura. 0nainte de aceeasta trebuie e"ectuatcontrolul tulpinii prin aglutinarea acesteia in ser "iziologic. *aca apare aglutinare in ser "iziologic nu se mai continua aglutinarea cu

antiserurile 7 tulpina este considerata Froug5Gsi deci este nepatogena desi va prezenta aglutinare si cu antiserul.Mod de lucru

6 pe o lama de microscop se depune o picatura de antiser6 cu o ansa sterila se preleveaza cultura din tulpina de testat si se pune pe lama6 cu un betisor steril din plastic se amesteca continuu! adaugand gradat cultura bacteriana pana se obtine o

suspensie omogena.6 e$aminarea suspensiei se e"ectueaza cu oc5iul liber! pe o supra"ata intunecata sau deasupra lampii &'

Rezultatul pozitiv corespunde aparitiei unei aglutinari masive immediate. Aglutinarea aparuta dupa J minute nu este luata inconsiderare. Aceasta aglutinare intarziata ! "ina de obicei! nu are nici o valoare diagnostica..)astrare si stabilitatea reactivilorSunt stocati la "rigider la 16O C pana la data e$pirarii.

B" Identi$icarea serolo,ica a tulpinilor din ,enul Sal#onella

<astroenetritele sau to$in"ectiile alimentare produse de bacteriile din genul Salminella se datoreaza ingerarii de alimente contaminatecu aceste bacterii. Cele mai "recvente Salmonelle izolate in Romania sunt S. typ5imurium! S. c5oleresius! S. enteritidis! S. panama.)rincipiul metodei

Setul de reactiv "olosit in laborator sunt6 antiser Salmonella anti 7 3 polivalent 3MA A! 8! *! -! L care contine aglutinine anti6Salmonella!6 antiser Salmonella anti 7 3 polivalent 3M8 C!/!<!H care contin contin aglutinine anti6Salmonella6 antiser Salmonella omnivalent omni3 care le contine pe toate

Reactia de aglutinare dintre antigenul reprezentat de tulpina suspecta de Salmonella si anticorpii din serul imun speci"ic duce laidenti"icarea serologica a tulpinilor Salmonella care apartin serogrupurilor A3! 83! *3! -3! L3! con"orm sc5emei Eau""mann6 X5itepentru primul ser si tulpini de Salmonella care apartin serogrupirilor C3! /3! <3! H3! con"orm sc5emei Eau""mann6 X5ite pentru aldoilea ser. Al treilea ser identi"ica ambele grupuri.

Mod de lucru0denti"icarea se "ace cu autorul reactiei de aglutinare pe lama pentru ambele tipuri de seruri polivelente.+. pe o lama de microscop se depune o picatura din serul imun diluat si alaturi o picatura de SS/. /olosind ansa bacteriologica se

suspensioneaza + 6 1 colonii din cultura bacteriana identi"icata bioc5imic in varsta de + 6 1, ore! in picatura de SS/. Aceasta etapane auta sa e$cludem de la serotipare tulpinile de Salmonella "orma FRG care aglutineaza spontan cu SS/! moment in care nu maicontinuam cu pasul 1#.1. daca suspensia a ramas omogena la pasul +#! se procedeaza la "el "olosind o picatura de ser aglutinant in loc de SS/I pentru"avorizarea reactiei lama de sticla se inclina usor. -$aminarea se e"ectueaza cu oc5iul liber cu lupa! sau deasupra lampii &'.4. interpretarea reactiei

a. aglutinarea este pozitiva daca apare in +64 minute si este de tip predominant granularb. aglutinarea este negativa daca suspensia ramane omogena in intervalul de +64 minute.

Limitele testuluia. pot apare reactie de aglutinare "als positive cand tulpina de identi"icat este o tulpina "orma FRG

Cunoasterea si respectarea prezentei proceduri este obligatorie pentru tot personalul implicat in determinareagermenilor patogeni din materii "ecale 10/






b. pot apare reactii de aglutinare "als negative cand serul este utilizat la un titru mai mare decat cel indicat de producator.)astrarea si stabilitatea reactivilor

Serurile se pastreaza la 16, C la "rigider! nu se congeleaza. *upa desc5iderea "laconului serul poate "i utilizat pe durata valabilitatii curespectarea conditiilor de pastrare.Antbiograma se e"ectueaza con"orm F)rocedurii speci"ice pentru e"ectuarea antibiogrameiG! pentru "iecare specie izolata si identi"catapatogena sau raspunzatoare de sindromul diareic. 0n cazul germenilor conditionat patogeni raportarea si e"ectuarea antibiogramei see"ectueaza in cazul in care cultura este predominenta sau la cererea clinicianului.%u se e"ectueaza antibiograma pentru Stap5ylococcus aureus izolat din materii "ecale deoarece un tratament antibiotic poate antrenadismicrobism intestinal urmata de col ite pseudomembranoase.Izolarea le)urilor%)robele sunt insamantate pe mediul Sabouraud cu cloram"enicol si gentamicina si incubate in atmos"era aeroba! la 4; , Celsius.0n cazul probelor pozitive! se "ac repicari pentru izolarea levurii in cultura pura! dupa care e"ectueaza identi"icarea si anti"ungigrama.Cultura pe mediul Sabouraud cu cloram"enicol se urmarireste timp de > 7 ;1 5.)e mediul Sabouraud se izoleaza cel mai "recvent speciile de Candida.

&"!*" E$ectuarea dilutiilor 6 nu se aplica

&"!7" Calcularea si inre,istrarea rezultatelor%u este cazul calculului.0nregistrarea rezultatelor se e"ectueaza pe suport in"ormatic prin introducere manuala a rezultatului.

&"!>" Coduri de alar#a si de$ectiuni 6 nu se aplica

&"!." Validare si trans#iterea rezultatului in LISI'eri"icarea rezultatelor se realizeaza de catre se"ul de departament medic de laborator#.Trans#isia si )alidarea rezultatelor la nivelul S0LA8 se e"ectueaza manual6 se introduce rezultatul manual in sistemul in"ormatic.

*" FA3A POSTANALITICA

*"!" Raportarea si interpretarea rezultatelor

*aca dupa ;1 ore de incubare la 4;°C! pe medii nu s6au dezvoltat Salmonella! S5igella! - coli enteropatogen! sau alti germeni

considerati patogeni in conte$t clinic! se elibereaza un buletin cu mentiunile- Salmonella 6 absent- S5igella 6 absent- -. coli enteropatogen 7 absent

*aca dupa ;162= ore de incubare la 4;°C! s6au dezvoltat germeni patogeni sau implicati in sindromul diareic! se elibereaza un buletin

pe care se mentioneaza- germenul patogen izolat si identi"icat- sensibilitatea la antibiotice)entru "ungi se testeaza sensibilitatea la anti"ungice.0n cazul rezultatelor critice! acestea sunt transmise rapid catre mediculBpacientul respectivI se respecta )rocedura <enerala deRaportare a Rezultatelor )<6+1)entru germenii conditionat patogeni in rezultat se mentioneaza urmatorul comentariu F)e mediile de cultura s6au dezvoltatapro$imativ Y.. N colonii de Elebsiella pneumoniae! sugerand un dezec5ilibru al "lorei intestinale.Medicul pediatru va aprecia oportunitatea tratamentului in "unctie de conte$tul clinic.G0n cazul in care pe mediile de cultura nu s6au dezvoltat colonii din "amilia -nterobacteriaceae! in rezultat nu se mai mentioneazaS5igella si Salmonella ci doar urmatorul comentariu F)e mediile de cultura nu s6au dezvoltat colonii din "amilia -nterobacteriaceae.)osibil dezec5ilibru intestinal sau pacientul se a"la sub tratament cu antibiotic.Goate tulpinile de S5igella si Salmonella izolate in cadrul departamentului sunt reidenti"icate si in sistem automat pentru o mai bunaacuratete a diagnosticului.







*"2" Inter$erente

Recoltarea si transportul incorect a probei si tratamentul cu antibiotice poate in"luenta calitatea rezultatului.La prelucrarea produsului patologic in di"eritele etape de lucru! daca nu sunt respectate cu strictete masurile de siguranta biologicaaducerea la incandescenta a ansei! "lambarea eprubetelor! evitarea contaminarii incrucisate#! pot sa apara erori de diagnostic.Alegerea incorecta a mediilor de cultura poate a"ecta raportarea rezultatului.%erespectarea etapelor de lucru e$amenul microscopic inaintea culturii# poate a"ecta deasemenea diagnosticul de laborator.Lipsa datelor clinice sau date cl inice incomplete despre pacient si produsul biologic recotat poate a"ecta diagnosticul de laborator

*"&" Stocarea si distru,erea pro(elor dupa prelucrare 4Neutralizare<Inacti)are5)lacile )etri ! inainte de incinerare! se neutralizeaza prin autoclavare.Materialele in"ectioase probe biologice si orice material ce a intrat in contact cu acestea#! sunt eliminate in saci galbeni cu inscriptiaRisc biologicGMaterialele nein"ectioase sunt eliminate in saci negriiBtransparenti.)robele sunt ulterior trimise spre incinerare prin intermediul personalului care e"ectueaza curatenia si transportul! care asigura

eliminarea tuturor deseurilor#.

*"*" Ar1i)area rezultatelorAr1i)area rezultatelor analizelor se e"ectueaza pe demande6uri! timp de + an la departament! dupa care sunt trecute in ar5ivagenerala a laboratorului identi"icate prin continut! perioada si persoana care a e"ectuat ar5ivarea#.Ar1i)area rezultatelor de control intern se e"ectueaza pe "ormularele corespunzatoare.Ar1i)area rezultatelor cali(rarilor 7 nu este cazulFisele de #entenanta sunt ar5ivate la nivelul departamentului timp de + an! dupa care sunt trecute in ar5iva generala a laboratoruluiidenti"icate prin continut! perioada si persoana care a e"ectuat ar5ivarea#.

*"7" Potentiale surse de )aria(ilitate 4Bu,etul de incertitudine5







Co#ponenteleincertitudinii

Cauza Metoda de deter#inare4de esti#are5 a

incertitudinii% A<B

Ponderea asupra incertitudinii totale a

deter#inariiModul de recoltare 6 nerecoltarea corecta a materiilor "ecale %u pot "i cuanti"icabile Mare

ransportul 6 nerespectarea conditiilor de transportdurata! temperatura#

%u pot "i cuanti"icabile Mare

Mediile de cultura 6 nu se respecta instructiunile de lucru6 cantitate variabila la turnare6 neasigurarea sterilitatii la turnare6 conditiile improprii de pastrare6 neetalonarea sticlariei

%u pot "i cuanti"icabile

ip 8

MareMicaMareMare

0nsamantarea 6 nerespectarea modului de lucru6 neasigurarea sterilitatea

%u pot "i cuanti"icabile MareMare

0ncubare 6neetalonarea termostatului variatii ale

temperaturii#6 nerespectarea temperaturii si a duratei deincubare

ip 8

%u pot "i cuanti"icabile

Mica

Mare

Citire "rotiuri! cultura# 6 instruirea insu"icienta a personalului %u pot "i cuanti"icabile Mare

Repicarea 6 nerespectarea modului de lucru %u pot "i cuanti"icabile Mare

)rezentarea rezultatelor 6 necorelarea probei rezultatului# cudemande6ul6 interpretarea incorecta a rezultatului6 nevalidarea sistemului in"ormatic

%u pot "i cuanti"icabile Mare

MareMare

Controlul respectariiprocedurii de lucru )S#

6 nerespectarea procedurii de lucru )S# %u pot "i cuanti"icabile Mare

/actorul uman 6 oboseala6 neatentia

%u pot "i cuanti"icabile MareMare

*">" Instruire personal si Responsa(ilitati*">"!" Instruire personal%*eterminarea prezentei germenilor patogeni si a levurilor in materile "ecale va "i e"ectuata numai de personal instruit de catre Se"ul de*epartament! respectand procedura si planul de instruire.*">"2" Responsa(ilitati%

Asistentii de la *epartamentul Recoltare- etic5etare probe biologice

- asezarea in stative pe tipuri de recipiente de recoltare

- transporta probele biologice la *epartamentul de Microbiologie

- veri"ica criteriile de acceptare ale probelori biologice probe neidenti"icateBneetic5etate corespunzatorI tip de recipient derecoltare necorespunzator! recipiente degradate

Asistentii din *epartamentul de Microbiologie- receptioneaza sau transporta probele de la *epartamentul Recoltare

- veri"ica criteriile de acceptare ale probelor biologice recoltarea corecta a materilor "ecale recipient steril#! recipiente degradate

- e"ectueaza procedurile de insamantare B testare speci"ice







- inregistreaza rezultateleMedic de laborator

-instruieste personalul

- supervizeaza personalul in curs de instruire- intreprinde actiuni corective! preventive si propune imbunatatiri- organizeaza activitatea in cadrul departamentului- este responsabil de actualizarea procedurii- citeste probele insamantate si testele speci"ice- veri"ica si valideaza buletinul de rezultate.- adauga comentarii generale! daca este cazul.- dispune repetarea unor determinari sau veri"icarea aparatelor! daca observa valori neconcordanteSe" Laborator- stabileste metoda de determinare- aproba procedura de determinare- este responsabil de respectarea normelor de protectie a muncii

-organizeaza activitatea te5nica a laboratorului

- este responsabil de asigurarea calitatii rezultatelorManager Laborator- aproba procedura de determinare- organizeaza activitatea intregului laboratorResponsabil cu Managementul CalitatiiB*irector Calitate- stabileste "ormatul procedurii- veri"ica continutul procedurii- e"ectueaza audituri interne- este responsabil de tinerea sub control a proceduriiResponsabilul metrologic6 e"ectueaza planul de etalonare si service con"orm producatorului6 este responsabil de contactare si mentinere a legaturii cu "irmele autorizate in ceea ce priveste etalonarea aparaturii


(2014) coprocultura vs 1.3 martie 2012

Documents