(2014) cultura colectie purulenta vs 1.3

DEPARTAMENT MICROBIOLOGIE – LABORATOR SYNEVO MEDGIDIA

PROCEDURA SPECIFICA –EXAMINAREA MICROBIOLOGICA A PUROIULUI

COD: PS-MG-MI 09, 01 VERSIUNEA 1.3 / martie 2012 EXEMPLAR NR.

Nota asupra dreptului de proprietate

Acest document este proprietatea SC Synevo Romania SRL.

Acest document este elaborat pentru utilizarea de catre personalul Laboratorului Synevo Romania. Reproducerea integrală sau parţială a prezentului document în orice publicaţii şi prin orice procedeu (electronic, mecanic, fotocopiere, microfilme, etc.), este interzisă, dacă nu există acordul scris al Synevo Romania.Nu se permite modificarea acestui document de catre utilizator. Synevo Romania nu îşi asumă responsabilitea, nu garantează explicit sau implicit caracterul complet, nealterat şi gradul de utilitiate a documentului în cazul în care utilizatorul a operat modificări şi nu poate fi făcut responsabil de orice fel de pagube rezultate în urma utilizării sale. Utilizatorul, isi asuma intreaga responsabilitate pentru desfasurarea, finalizarea si implementarea corespunzatoare a documentului.

Indicatorul actualizarilor

Versiunea (#)

Persoana care a elaborat documentul Mentiuni asupra documentului elaborat Data elaborarii

1.0 Dr. Stefanescu Eugeniu Document initial Ianuarie 20091.1 Dr. Tomasian Sorin Prima revizie Martie 20101.2 Dr Tomasian Sorin A doua revizie Martie 20111.3 Dr Tomasian Sorin A treia revizie Martie 2012

ELABORAT VERIFICAT APROBAT

NUME Dr. Sorin Tomasian Mihaela Vladut Dr. Sorin Tomasian

FUNCTIE Sef Departament Specialist SMC Sef Laborator

SEMNATURA

DATA

1. NOTIUNI INTRODUCTIVE

1.1. Scop

Cunoasterea si respectarea prezentei proceduri este obligatorie pentru tot personalul implicat in examinarea puroiului1/13




Stabilirea procedurii pentru determinarea prezentei germenilor patogeni din puroi (M109).

1.2. Documente de referinta:-Tratat de Microbiologie clinica editia a III-a – Ed. Medicala 2009, D. Buiuc, M Negut, - Procedura specifica pentru efectuarea antibiogramei PS-MG01- Procedura specifica pentru cultura fungi cu antifungigrama PS-MG102- Diagnostic Microbiology – Baily & Scott’s 12th edition 2007- Instructiuni de lucru (IL) specifice- Instructiuni de lucru cu micropipeta: IL 01- Ghidul serviciilor medicale ale Laboratorului Synevo, ultima editie in vigoare- Ghidul national de biosiguranta pentru laboratoarele medicale, Ed. I, Bucuresti, Ed. Medicala, 2006, pg. 47 – 71

1.3. Termeni, definitii si abrevieri:- QC – control de calitate- TSI – mediu triple sugar iron agar- MILF – mobilitate, indol, lizindecarboxilaza, fenilalanina- MIU – mobilitate, indol, uree1.4. Domeniu de aplicareProcedura este stabilita pentru a fi utilizata in Departamentul de Microbiologie de catre personalul tehnic atunci cand este necesar.

1.5. Informaţii generaleSupuraţiile pot afecta orice ţesut şi organ cu acumulare de puroi în interstiţiile cutanate (pustule, hidrosadenită, furuncule, abcese, gome), în ţesuturile musculo-scheletale (abcese, flegmoane, osteomielită), în ganglionii limfatici, în viscere (abcese), în cavităţi preformate (sinusuri paranazale, meninge, peritoneu, sinovialele articulare).În ceea ce priveşte rolul laboratorului de microbiologie, trebuie luată în considerare relevanţa culturilor polimicrobiene, valoarea identificării şi testării sensibilităţii unuia sau mai multor microorganisme.Informaţiile privind localizarea plăgii, semnele clinice de infecţie sau prezenţa necrozei asociată cu miros specific, terapia antimicrobiană, îl vor ghida pe microbiolog în stabilirea unui diagnostic corect.Bacteriile cele mai frecvent izolate si identificate sunt:

- in infectiile tegumentului si ale tesului subiacent acute se izoleaza mai frecvent specii de Staphilococcus si Streptococcus- in infectiile postoperatorii, in functie de localizare, etiologia este diferita (ex. in chirurgia abdomenului inferior se izoleaza

specii de Enterobacteriaceae si Enterococcus.- plagile produse prin muscaturi si infectate au ca agenti etiologici specii de Staphylococcus si Streptococcus.- etiologia infectiilor ulcerului de gamba si cel de decubit este polimicrobiana, cel mai frecvent implicat fiind Staphylococcus

aureus in asociere cu specii de Enterobacteriaceae si bacili Gram negativi nonfermentativi.

1.6. Recomandări pentru determinare - in infecţiile tegumentului şi ale ţesutului subiacent unde sunt dominate de piodermitele stafilococice (furunculoză, foliculită, hidrosadenită) şi streptococice (erizipel, impetigo, pemfigus, celulită). - in infecţiile postoperatorii,- in infecţiile din cadrul arsurilor,- in plagi produse prin muscaturi;- in infectii localizate profund care comunica cu exteriorul (fistule, abces fibrolizat)

1.7. Masuri de securitate in munca si prevederi in caz de accidenteInainte de desfasurarea oricarei activitati in laborator personalul trebuie sa se asigure ca poseda cunostinte de protectia si securitatea muncii in laboratorul medical. Este obligatoriu sa purtati echipament de protectie;Toate echipamentele de diagnostic in vitro, probele pacientilor, trebuie tratate ca materiale cu potential risc biologic. Toate materialele care intra in contact cu produsele mai sus mentionate sunt considerate materiale infectioase.Echipamentele si instructiunile de protectie constau in: manusi chirurgicale, halat/ costum incheiat, parul strans, ochelari de protectie sau hote de siguranta biologica, fara bijuterii sau accesorii mari.Riscuri in cazul nerespectarii normelor de securitate in munca - Contaminrea cu probe biologice , riscul de expunere la aerosoli, stropiri si inoculari accidentale.Aerosolii sunt produsi de orice activitate care determina aparitia de miniparticule sau stropi de material lichid sau semilichid, cum ar fi agitarea, turnarea, amestecarea sau picurarea unui lichid pe o suprafata sau intr-un lichid. Activitatile de laborator precum insamantarea placilor de agar prin efectuarea de striuri paralele, inocularea flacoanelor de culturi prin folosirea unei pipete pentru a





distribui suspensii de agenti infectiosi, efectuarea de dilutii in tuburi sau placi, omogenizarea si agitarea prin producerea de vartej a materialelor infectioase, centrifugarea lichidelor contaminate pot genera aerosoli infectiosi. Particulele de aerosoli cu diamentru sub 5 micrometri si picaturile mici cu diametrul 5-100 micrometri nu sunt vizibile cu ochiul liber. Contactul cu toate acestea poate duce la infectii. Tehnicianul de laborator trebuie avertizat asupra formarii acestor particule si asupra faptului ca ele pot fi inhalate sau pot contamina suprafete si materiale. Atunci cand manipulati probele si deseurile asigurati-va ca purtati echipament de protectie. Daca probele/deseurile vin in contact direct cu pielea, spalati-o imediat cu apa si aplicati dezinfectant. Consultati de urgenta un medic. Exista posibilitatea de perforare a manusilor de protectie. De aceea, este necesara o atentie sporita atunci cand lucrati in zona de lucru.- Daca proba biologica este varsata pe o suprafata de lucru, aceasta se acopera cu o solutie dezinfectanta, se lasa sa actioneze pentru inactivarea microorganismelor si apoi se indeparteaza.- Contactul cu reactivii si solutiile de curatenie si dezinfectare: Folositi intotdeauna manusi de protectie (rezistente chimic) si ochelari de protectie atunci cand manipulati solutiile de colorare . Exista posibilitatea de perforare a manusilor de protectie. De aceea, este necesara o atentie sporita atunci cand lucrati in zona de lucru.In cazul reactivilor tineti cont de atentionarile existente la nivelul cutiilor de reactivi.- Socul electric La orice echipament electric poate surveni socul electric. NU incercati sa accesati nici o componenta a echipamentului marcata corespunzator. NU incercati sa lucrati in nici un compartiment electronic. Instalarea, service-ul si repararea trebuie efectuate doar de catre personal autorizat si calificat.- Manipularea in siguranta a probelor de laboratorContainerele pentru probe pot fi din sticla sau preferabil din plastic. Ele trebuie sa fie rezistente si nu trebuie sa permita scurgerea materialului din ele cand dopul sau capacul sunt corect aplicate. Nimic din materialul recoltat nu trebuie sa ramana inafara containerului. Containerele trebuie corect etichetate pentru o identificare usoara . Documentele de insotire nu trebuie infasurate in jurul containerului ci plasate separat.Transportul probelor in laborator. Pentru evitarea scurgerilor accidentale sau a varsarii probelor, trebuie utilizate containere secundare cum sunt cutiile cu stative pentru ca probele sa ramana in picioare atunci cand sunt transportate. Containerele secundare pot fi din metal sau plastic, pentru a putea fi autoclavabile sau rezistente la actiunea dezinfectantilor chimici. Ele trebuie decontaminate regulat.Primirea probelor. Laboratorul care primeste un numar mare de probe trebuie sa aiba o incapere separata sau un spatiu special pentru acest scopDeschiderea pachetelor. Personalul care primeste si despacheteaza probele trebuie sa fie constient de potentialul pericol si trebuie instruit sa adopte precautiile standard in special cand se confrunta cu spargerea sau varsarea containerelor. Containerele primare cu probe trebuie deschise intr-o hota. Trebuie sa existe dezinfectante la indemana.

Trebuie respectate precautiile de siguranta.

2. FAZA PREANALITICA

2.1. Efectuarea comenzii se realizeaza conform PG-02, ”Procedura generala de analiza a comenzii, ofertei si contractului”

2.2. Pregatirea pacientului pentru recoltare: - nu se aplica

2.3. Recipient: eprubeta cu dop steril, tampon simplu steril sau tampon cu mediu de transport steril

2.4. Specimen recoltat: puroi;2.5. Etichetarea recipientilor se face cu eticheta alba, pe care este notat cel putin barcode-ul, numele si prenumele, sectia precum

si zona de unde s-a prelevat proba.

2.6. Transportul probelor Transportul probelor către laborator se face imediat dupa prelevare, pentru a asigura viabilitatea bacteriilor la temperatura camerei.In cazul intarzierii cu peste 2 h de la prelevare se recomanda recipientele cu mediul de transport.

2.7. Conditii de prelucrare si pastrare a probelor patologice pana la examinareProba patologica se prelucreaza la sosirea in laborator (nu se pastreaza);

2.8. Volumul minim necesar: 1 ml minim in eprubeta sterila, doua tampoane in cazul recoltarii pe tampon steril.





2.9. Criterii de respingere a probei: probe neidentificate/neetichetate corespunzator; tip de recipient de recoltare necorespunzator, recipiente degradate

3. FAZA ANALITICA

3.1. Echipamente si consumabile3.1.1. Echipament principal de masurare: nu este aplicabila3.1.2. Ustensile si consumabile necesare:- Termostat - Bec Bunsen- ansa bacteriologica- dispenser- placi Petri- microscop- exicator- densimat BioMerieux

3.2. Reactivi (prelucrare, conditii de pastrare, stabilitatea)- Set coloratie Gram, ser fiziologic steril;- Mediile utilizate pentru culturi: Columbia agar cu 5% sange de berbec, mediu lactozat MacConkey, Muller-Hinton, Muller-Hinton cu 5% sange de berbec, Chapman manitol, BEA (bile esculine azide) pentru enterococ, mediul Sabouraud cu cloramfenicol pentru levuri (la solicitarea clinicianului).- Testele necesare pentru identificari: ID catalaza, benzi oxidaza, trusa identificare stafilococ coagulazo-pozitiv, trusa latex aglutinare pentru streptococ, discuri Optochin, mediile politrofe: TSI, MIU, MILF, citrat Simmons.- Microcomprimate de antibiotice- teste de identificare a levurilor si de determinare a sensibilitatii la antifungice

3.3. Conditii de mediu si de operare:Mediu:- Mediu fara praf cu o ventilatie adecvata- Temperatura trebuie sa fie 18-26ºC;

- Umiditatea 30-85%;Apa – apa distilata pentru preparare mediiElectric: La termostate nu se deconecteaza de la sursa de energie in timpul utilizarii acestuia.

3.4. Specificatii de performanta: - nu se aplica

3.5. Principiul Metodei Prin insamantarea puroiului pe mediile enumerate cu incubare in aerobioza se obtin colonii bacteriene cu anumite caractere morfologice care permit izolarea primara a germenilor patogeni din proba recoltata.

3.6. Prelucrarea probei inainte de introducerea in aparat – nu este cazul

3.6. Mentenanta analizorului: numai a microscopului, respectandu-se planul de mentenanta.

3.8. Etalonare analizor: - Etalonarea se face conform planului de etalonare, de catre institutii autorizate in domeniu (etalonarea termostatelor);

3.9. Calibrare: nu este aplicabila

3.10. Control de calitate QC: Frecventa QC: - controlul mediilor de cultura cu ajutorul tulpinilor de referinta (testarea eficientei biologice) la fiecare sarja de turnare si la schimbarea lotului iar verificarea microcomprimatelor cu ajutorul tulpinilor de referinta se va face saptamanal si la schimbarea lotului; - controlul sterilitatii mediilor turnate se efectueaza la fiecare sarja de turnare;- controlul truselor de coloratie cu tulpini de referinta se face la schimbarea lotului si zilnic in cazul coloratiei Gram;





- controlul sterilizarii la etuva – la fiecare sterilizare (teste biochimice) si lunar (teste biologice);- verificarea sterilitatii la autoclavul de medii si infecte la fiecare autoclavare (teste biochimice) si lunar (teste biologice);- controlul suprafetelor – saptamanal; - controlul aeromicroflorei – saptamanal. Prepararea mediilor se efectueaza conform instructiunilor IL M03Identificarea fractiunilor: nu se aplicaStabilitate la intuneric: nu se aplicaUtilizare: Controlul intern pentru mediile utilizate se efectueaza cu tulpinile de referinta de unica utilizare. Acestea se pastreaza la frigider la tenperatura de 2 – 8° C cu acces controlat.Descrierea modului de lucru pentru efectuarea controlului intern se efectueaza conform PG 18 ‘’Procedura generala de control intern de calitate’’.

3.11.Criterii de acceptare/respingere ale rezultatelor controlului intern.Nu se utilizeaza tulpini de referinta cu expirarea termenului de valabilitate si cu peste 5 pasaje.

3.12. Actiunile corective aplicate la incalcarea regulilor stabilite pentru controlul intern; - daca controlul sterilitatii si eficientei biologice a mediilor de cultura utilizate apar neconformitati, pentru controlul sterilitatii se

toarna o noua sarja, iar pentru controlul eficientei biologice se schimba mediu.- la fel se procedeaza si cu celelalte medii utilizate la antibiograma- la verificarea aeromicroflorei si suprafetelor pentru evitarea contaminarii incrucisate la aparitia neconformitatilor se face

sterilizarea cu lampa UV si substante dezinfectante- pentru sterilitatea recipientelor de recoltare – se schimba lotul

3.13. Rularea probelorIn prima zi se efectueaza insamantari pe mediile de cultura mentionate in functie de examenul microscopic si datele clinice despre bolnav. Mediile sunt incubate la 37° C. In ziua a doua se citesc culturile unde se pot izola urmatorii germeni. Staphylococcus aureus:Microscopic: coci sferici Gram pozitivi, asezati in mod obisnuit in forme neregulate, de ciorchine.Cultural: pe placi cu mediu Columbia cu 5% sange de berbec, coloniile produc o zona circulara de hemoliza in jurul lor, au aspect S (smooth- neted), cremoase, rotunde, cu diametrul cuprins intre 2-3 mm, margini perfecte, suprafata neteda, bombata, lucioasa dupa incubare 18-24 de ore la 37° C. Nu toate tulpinile de S. aureus produc hemoliza iar pigmentul si hemoliza devin mai pronuntate a doua zi sau daca sunt lasate la temperatura camerei cateva zile.Diferentierea S. aureus de alte specii de stafilococi se realizeaza prin intermediul:

- Caracterelor culturale - repicarea coloniilor suspecte pe mediul Chapman-manitol dau posibilitatea diferentierii Stafilococilor patogeni coagulazo-pozitivi (care sunt manito-pozitivi si formeaza colonii galbene schimband si culoarea mediului in galben), fata de cei saprofiti coagulazo-negativi (care sunt si manito-negativi si produc colonii mici rosii fara sa schimbe culoarea mediului din jur);

- TESTUL DE AGLUTINARE CU LATEX - PASTOREX STAPH-PLUS sau OMEGA AVIPATH STAPHPrincipiul metodei:Pastorex Staph-Plus si Omega Avipath Staph au fost concepute pentru detectarea simultana a urmatoarelor componente:

- factorul de afinitate pentru fibrinogen, cunoscut ca si “coagulaza” sau “factor de prindere”, este proteina A care poseda afinitate fata de fragmentul cristalizabil (Fc) sau gamaimunglobulina (IgG);

- polizaharidul capsular al Staphilococcus aureus.Reactivul este alcatuit din particule latex cu afinitate pentru fibrinogen si IgG, asemanatoare anticorpilor monoclonali specifici, indreptati fata de polizaharidul capsular al Staphilococcus aureus. Combinatia fibrinogenului, IgG si anticorpii monoclonali anticapsulari in acelasi reactiv ajuta la recunoasterea tulpinilor capsulate de Staphilococcus aureus in aceeasi masuara ca si a tulpinilor de Staphilococcus aureus ce prezinta microcapsule.Pentru tulpinile cu capsula, anticorpii fata de capsula polizaharidica aglutineaza bacteria. Pentru tulpinile care si-au pierdut capsula polizaharidica, bacteriile sunt agglutinate de fibrinogen si IgG. Izolatele de Staphilococcus aureus sunt amestecate cu reactivul latex pe slide. Se urmareste o amestecare completa, slide-ul este examinat visual pentru prezenta aglutinarii care indica prezenta Staphilococcus aureus.ReactiviLatex: 0.02% metiolat de Na si < 0.1% azida de sodiumControlul negtiv: 0.02% metiolat de Na si < 0.1% azida de sodiumPastrare si depozitare: odata deschisi, toti reactivi sunt stabili pana la data expiarii mentionata in conditiile unei pastrari la 2-





8ºC si absenta contaminari microbiene. Pastrati tuburile cu reactivi in pozitie verticala. Reactivii latex nu trebuie inghetati.Mod de lucruTulpinile utilizate cu acest kit trebuie sa fie pure si tinere. Se recomanda urmatoarele medii de izolare sau medii echivalente: agar Columbia + 5% sange de berbec, agar Columbia, agar sange, Chapman manitol hiperclorurat.Se testeaza tulpinile cu coloratia Gram si testul catalazei. Tulpiniile care sunt testate cu reactivi Pastorex Staph-Plus sau Omega Avipath Staph trebuie sa fie coci gram pozitivi si sa aiba catalaza pozitiva.Reactia de aglutinare:Omogenizati complet reactivul de latex prin agitare. Vortexarea reactivului este necesaraPuneti separat o picatura de reactiv latex si una de control negativ in doua din cercurile cardului de testare.Cu o lopatica sau cu un bat puneti cate 1 - 3 colonii catalazo-pozitive in ambele cercuri.Emulsionati amestecurile din ambele cercuri timp de 10 secunde. Omogenizati cu blandete, rotind cardul.Rezultatul se citeste dupa 30 secunde de la inceperea rotirii cardului.Evaluati rezultatul dupa care puneti cardul in solutie dezinfectanta. Nu reutilizati cardul.Interpretarea rezultatelor A. Reactie pozitivaO reactie pozitiva este evidentiata de formarea unor agregate numai cu reactivii test, vizibile cu ochiul liber la lumina normala inainte de 30 secunde de la inceputul rotatiei cardului. Agregatele particulelor latex pot fi de marimi diferite cu un fond mai mare sau mai mic roz, intrucat o aglutinare slaba poate semnifica aglutinare non-specifica. B. Reactie negativaIntr-o reactie negativa, suspensia nu produce agregate si se mentine aspectul laptos. Este cazul controlului negativ.Controlul de calitateSe evalueaza reactivii latex la fiecare schimbare de lot si la fiecare suspiciune de alterare a calitatii. Testul de calitate se face utilizand tulpina de referinta Staphilococcus aureus ATCC 27853 unde trebuie sa arate prezenta aglutinarii.

Enterococcus spp.Microscopic nu se deosebeste de ceilalti coci Gram pozitivi, pot fi izolati, in perechi sau lanturi. Unele specii sunt mobile.Cultural,sunt bacterii nepretentioase si cresc pe medii uzuale intre 10-45˚C, cu un optimum la 35˚C.Pe geloza Columbia cu 5% sange de berbec coloniile sunt gri, nehemolitice sau pot da o zona hemoliza α.Identificarea se face pe baza aspectului coloniilor, prin reducerea esculinei in prezenta sarurilor biliare (BEA +) sau prin trusa de aglutinare pentru streptococ. Deasemenea testul PYR este pozitiv pentru Enterococ ca si pentru Streptococcus pyogenes.Streptococii β hemolitici Streptococii β hemolitici A, C,si G – pe mediul Columbia cu 5% sange de berbec au coloniile inconjurate de o zona clara de hemoliza completa, cu diametrul variabil si margini clar delimitate.Examenul microscopic evidentiaza coci Gram pozitivi asezati in diplo si lanturi de diferite lungimi. Acesta nu este de folos decat in orientarea asupra morfologiei deoarece nu exista diferente in cadrul genului.Identificarea definitiva a streptococilor β hemolitici A, C,si G trebuie bazata pe corelarea caracterelor culturale cu identificarea antigenica prin latexaglutinare.Trusa de aglutinare pentru streptococ este un Kit pentru identificarea grupelor de streptococ (test de aglutinare cu particule de latex si reactivi sunt constituiti pentru grupele A, B, C, D, F si G).ReactiviFiecare reactiv latex este gata pentru utilizare dupa ce a fost mentinut la temperatura camerei. Este esential ca reactivul latex sa fie puternic agitat pentru a se obtine o suspensie omogena inainte de utilizare.Ca pregatire pentru utilizare, reactivul enzimatic trebuie reconstituit cu apa distilata dupa cum scrie pe eticheta.Controlul pozitiv contine extracte din toate cele 6 grupe antigenice.Tuburile cu reactivii latex trebuie pastrate in pozitiue verticala la 2-8C. In absenta acestor conditii este afectata activitatea acestora.Enzimele extrase trebuie mentinute la 2-8C. Dupa amestec cu apa distilata se pastreaza la 2-8C. Prepararea culturilorSpecimenele bateriene pentru identificare trebuie sa se dezvolte pe mediul geloza sange, dupa 24h la 37C. Observati reactia hemolitica a coloniilor suspecte. Este indicat sa se efectueze coloratia Gram si testul catalazei pentru a confirma prezenta cocilor gram pozitivi, catalaza negativa.Pentru fiecare cultura:1. Se deschide un tub cu enzima de extractie – Streptococcus (DR593) si se amesteca cu apa distilata dupa indicatiile de pe eticheta. Se distribuie in fiecare tub test 0.4 ml de enzima.2. Se selecteaza 2-5 colonii test cu ajutorul unei anse bacteriologice si se amesteca cu solutia de enzima. Daca aceasta cultura este amestecata, evitati contaminarea.3. Incubati pentru 10 minute la 37C. Dupa 5 minute de incubare este important sa agitati fiecare tub pentru 2-3 secunde, apoi continuati incubarea. Plasati-l apoi la temperatura camerei. Acum extractul este gata de utilizare.





Metoda de testare1. Puneti reactivii latex la temperatura camerei, incalzindu-i in mana. Asigurativa ca suspensia latex este amestecata viguros.2. Puneti cate o picatura din fiecare reactiv latex in cate un inel pe un card de reactie (DR500).3. Utilizand o pipeta Pasteur adaugati cate o picatura de extract in fiecare din cele 6 inele.4. Cu ajutorul unor betisoare (pentru fiecare inel cate un betisor) se raspandeste amestecul pe inreaga arie inelara.5. Rotim cardul cu blandete. Aglutinarea in unul sau mai multe inele este normal sa apara inainte de 30 de secunde. Nu rotiti cardul mai mult de 1 minut. Nu utilizati lupa pentru citirea rezultatului.Controlul pozitiv trebuie utilizat pentru a verifica performanta reactivilor latex.Cardul utilizat se pune cu grija intr-un amestec dezinfectant. Interpretarea rezultatelor:Testul trebuie considerat pozitiv cand aglutinarea apare la un grup de reactivi sau cand aceasta este mai puternica la unul fata de ceilalti 5. Testul trebuie considerat negativ cand aglutinarea nu apare.Materialul granular ce poate fi observat in cazul reactiei negative trebuie ignorat.Streptococcul agalactiae:Microscopic nu se deosebeste de ceilalti coci Gram pozitivi.Cultural pe Columbia agar cu 5% sange de berbec Streptococcus agalactiae (hemolitic de grup B), formeaza colonii alb-cenusii, usor acuminate cu zona ingusta de ά hemoliza.Pentru identificare se poate folosi identificarea antigenica prin latexaglutinare.

EnterobacteriaceaeFamilia Enterobacteriaceae este o familie largă de bacterii incluzând multi dintre cei mai familiari agenti patogeni sau conditionat patogeni.Taxonomia Familiei Enterobacteriaceae cuprinde peste 30 de genuri si 120 specii. Cele care prezintă importantă clinică, în proportie de 95%, sunt grupate în 10 genuri, după cum urmează: genul Escherichia, genul Shigella, genul Salmonella, genul Klebsiella,, genul Morganella , genul Enterobacter , genul Providencia, genul Proteus, genul Citrobacter , genul Serratia, genul Hafnia , genul Yersinia.Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, cu dimensiuni de 0,3-1,0 x 1,0-6,0μm, ciliati sau neciliati, nesporulati, cu sau fără capsulă.Caractere de cultură: sunt nepretentiosi si cresc pe medii simple. Sunt germeni aerobi, facultativ anaerobi care necesită, pentru o crestere optimă, temperaturi de 22-37°C. Pe mediile neselective, formează colonii de culoare gri (exceptând Serratia marcescens, de culoare rosie), de tip „S”, „M” (exceptie Proteus spp., fenomen de cătărare). Pe geloză-sânge, unele specii determină hemoliză β.Teste biochimice pentru identificarea enterobacteriilor Testele biochimice exploreaza metabolismul glucidic si al aminoacizilor bacteriei si evidentiaza tipul de fermentatie. Testele utilizate in laborator sunt:

- TSI (triple sugar iron agar). Mediul se insamanteaza utilizand o ansa fara bucla care odata incarcata cu produsul de analizat se introduce steril in eprubeta cu mediu executandu-se o intepatura unica si verticala a coloanei drepte a mediului pana in profunzimea acestea si descarcand apoi ansa pe portiunea inclinata. Se incubeaza la 37°C timp de 24h (o incubare prelungita determina reactii nespecifice). Portiunea dreapta evidenteaza degradarea glucozei cu eliberare de gaz (vireaza culoarea mediului in galben si apar bule de gaz). Portiunea inclinata evidenteaza degradarea lactozei, zaharozei (vireaza culoarea mediului in galben). H2S se evidenteaza prin innegrirea mediului. H2S – evidentiaza prezenta enzimei care descompune aminoacizii cu sulf. Daca bacteria are enzima pentru sulf, descompune acetatul de plumb in sulfura de plumb (inegreste mediul).

- MILF (mobilitate – indol – lizindecarboxilaza - fenilalanina). Mediul se insamanteaza utilizand o ansa fara bucla care incarcata cu produsul de analizat se introduce steril in eprubeta cu mediu executandu-se o intepatura unica si verticala a coloanei de mediu pana in profunzimea acestea. Se incubeaza la 37°C timp de 24h (o incubare prelungita determina reactii nespecifice).Rezultate si criterii de interpretare:- mobilitatea se evidenteaza prin cresterea bacteriei in interiorul mediului (mobilitate (+) = opacitate, mobilitate (-) =

mediul transparent), reactie fals negativa daca s-a realizat o incalzire excesiva a culturii si astfel este denaturant flagelul bacterian.

- lizina (+) se evidenteaza prin virarea culorii mediului de la violet deschis la violet intens, lizina (-) se modifica culoarea mediului virand de la violet deschis la galben. Lizina evidenteaza prezenta lizindecarboxilazei.

- fenilalanina – se evidenteaza prin adaugarea a 2-3 picaturi de clorura ferica 10% si formarea unui inel verde in maxim 2-3 minute de la adaugarea solutiei. Evidenteaza fenilalanindezaminazei. Tesul pozitiv de fenilalanina trebuie sa fie interpretat imediat dupa agaugarea reactivului deoarece culoarea verde se stinge rapid. O interpretare fie negative, fie pozitiva trebuie facuta in primele 5 minute. Rotirea reactivului de FeCl 3 pe suprafetele insamantate contribuie la obtinerea unei reactii mai rapide cu o culoare mai pronuntata. Reactivul se pastreaza in flacoane la intuneric si la temperatura de sub 30°C, pana la expirarea termenului de valabilitate.





- Citrat Simonns - mediul cu citrat. Mediul se insamanteaza utilizand o ansa fara bucla care incarcata cu produsul de analizat se descarca pe portiunea inclinata a mediului. Se incubeaza la 37°C timp de 24h (o incubare prelungita determina reactii nespecifice).Daca bacteria utilizeaza citratul (are sistem de transport) vireaza culoarea mediului de la verde la albastru.

- Uree. Mediul se insamanteaza utilizand o ansa fara bucla care incarcata cu produsul de analizat se introduce steril in eprubeta cu mediu executandu-se o intepatura unica si verticala a coloanei de mediu pana in profunzimea acestea. Se incubeaza la 37°C timp de 24h (o incubare prelungita determina reactii nespecifice). Mediul cu uree arata daca bacteria produce ureaza, aceasta modifica indicatorul de pH, iar mediul isi schimba culoarea din galben in roz-rosu.

Tabelul urmator prezinta principalele caracteristici biochimice ale enterobacteriaceaelor:





Bacili Gram negativi nefermentativiDintre bacilii Gram negativi nefermentativi Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic) este specia izolată cel mai frecvent în laboratorul de bacteriologie.Morfotinctorial Pseudomonas aeruginosa este un bacil fin, Gram negativ, dispus izolat, în perechi sau lanturi scurte, nesporulat, prezentând un cil polar care îi conferă mobilitate.Cultural este un germen nepretentios care poate creste si în apă distilată. Poate creste pe medii simple în strictă aerobioză. Temperatura la care se poate dezvolta variază în limite largi pentru tulpinile patogene: 5 - 42°C. După 24 ore de incubare dezvoltă colonii S, transparente. Atât colonia cât si mediul sunt pigmentate în verde-albăstrui, colonia având reflexe metalice. Cultura emană un miros aromat de tei, salcâm sau iasomie. Pe geloza-sânge cultura este înconjurată de o zonă largă de hemoliză beta. Pe medii lactozate coloniile sunt lactozo-negative.Biochimic Pseudomonas aeruginosa nu atacă fermentativ zaharurile,este oxidazo-pozitiv, descompune gelatina, nu produce indol, H2S si urează.Pentru identificare este suficient aspectul coloniilor, prezenta de pigment, mirosul caracteristic, oxidaza pozitivă, hemoliza beta. De retinut că 5-10% din tulpini nu poduc pigment iar 1% produc pigment rosu sau negru.

Reactia Oxidazei – se executa pe benzi de hartie de filtru tip cromatografic impregnate intr-o solutie apoasa de N,N,N,N tertramethyl, 1-4 phenylendiammonium dichloride, care permite determinarea prezentei oxidazei.

Benzile sunt recomandate pentru diferentierea germenilor oxidazo-pozitivi de cei oxidazo-negativi.

A. majoritatea bacteriilor gram pozitive sunt oxidazo-negativeB. bacilii gram negative, alti decat enterobacteriaceele sunt variabili in activitatea lor oxidazica;C. testul permite diferentierea Pseudiomonadaceelor (oxidaza +)de alti membrii ai entrobacteriaceelor (oxidazo negative);D. permite diferentierea intre genuri si specii conform anexei.Principiul metodei:

Microorganismele care produc oxidaza in prezenta oxigenului atmospheric a citocromului C si a unui reactive oxidazic, oxideaza reactivul conducand la formarea unui compus colorat albastru numit indofenol.

Aspect: carnet cu doua coperti ce contin benzi de culoare indigo.

Mod de lucru:

E. banda impregnata se aplica cu pens ape o lama de sticla si se umecteaza cu cateva picaturi de apa distilataF. colonia izolata se aplica cu ansa pe o suprafata de banda de 2-3 mm urmarindu-se aparitia reactiei de culoare;Citirea si interpretarea rezultatelor:

G. reactie pozitiva – aparitia culorii albastre in 20-30 secunde;H. reactie dubioasa – aparitia culorii albastre in 60 secunde;I. reactie tardiva – aparitia culorii peste 1 minut.Pastrare: in ambalaj original la intuneric si la loc uscat. Benzile pot fi utilizate pana la date expirarii.

Pentru germenii identificati se efectueaza antibiograma conform procedurii de antibiograma. In cazul culturilor negative mediile se lasa la incubare pentru inca 24h. Daca pe mediul Sabouraud s-au dezvoltat colonii de Candida spp. se efectueaza identificarea si testarea sensibilitatii la antifungice conform “Procedurii de efectuare a antifungigramei”.

A treia zi se face citirea antibiogramei pentru cultura pozitiva, se interpreteaza testele biochimice. Pentru culturile negative incubate inca 24h se urmareste dezvoltarea bacteriilor. La citirea probelor se face o cuantificare a germenilor (+, ++, +++, ++++).

a. Efecturea dilutiilor – nu se aplicab. Calcularea si inregistrarea rezultatelor

Nu este cazul calculului.Inregistrarea rezultatelor se efectueaza pe suport informatic prin introducere manuala a rezultatului.

c. Coduri de alarma si defectiuni – nu se aplicad. Validare si transmiterea rezultatului in LIS;

Verificarea rezultatelor se realizeaza de catre seful de departament (medic de laborator). Transmisia si validarea rezultatelor la nivelul SILAB se efectueaza manual- se introduce rezultatul manual in sistemul informatic.

Cunoasterea si respectarea prezentei proceduri este obligatorie pentru tot personalul implicat in examinarea puroiului10/




4. FAZA POSTANALITICA4.1. Raportarea si interpretarea rezultatelor Daca pe mediile utilizate nu se observa nici o crestere dupa 24 de ore, rezultatul se va comunica astfel: “Pe mediile de cultura nu s-a dezvoltat flora microbiana”. Daca se observa cresterea unei flore fara semnificatie patologica, rezultatul se va comunica astfel: “Pe mediile de cultura nu s-a dezvoltat flora microbiana patogena………”.Daca cultura este pozitiva raportarea rezultatului precizeaza atat denumirea germenului, cantitatea in care s-a dezvoltat (+, ++, +++, ++++), precum si sensibilitatea la antibiotice a acestuia.Daca pe mediul Sabouraud nu s-au evidentiat levuri, rezultatul se comunica: “Pe mediul Sabouraud nu s-au dezvoltat colonii de Candida spp.”Daca pe mediul Saboraud s-au dezvoltat colonii de levuri rezultatul va mentiona atat denumirea levurii, cantitatea in care s-a dezvoltat (+,++,+++,++++), precum si sensibilitatea la antifungice.In cazul rezultatelor critice, acestea sunt transmise rapid catre medicul/pacientul respectiv; se respecta Procedura Generala de Raportare a Rezultatelor PG-12.4.2. InterferenteRecoltarea si transportul incorect a probei si tratamentul cu antibiotice pot influenta calitatea rezultatului.La prelucrarea produsului patologic in diferitele etape de lucru, daca nu sunt respectate cu strictete masurile de siguranta biologica (aducerea la incandescenta a ansei, flambarea eprubetelor, evitarea contaminarii incrucisate), pot sa apara erori de diagnostic.Alegerea incorecta a mediilor de cultura poate afecta raportarea rezultatului.Nerespectarea etapelor de lucru (examenul microscopic inaintea culturii) poate afecta deasemenea diagnosticul de laborator.Lipsa datelor clinice sau date clinice incomplete despre pacient si produsul biologic recotat poate afecta diagnosticul de laborator.

4.3. Stocarea si distrugerea probelor dupa prelucrare (Neutralizare/Inactivare)Placile Petri inainte de transportare la incinerator se neutralizeaza prin autoclavare.Materialele infectioase (probe biologice si orice material ce a intrat in contact cu acestea), sunt eliminate in saci galbeni cu inscriptia „Risc biologic”Materialele neinfectioase sunt eliminate in saci negrii/transparenti.Probele sunt ulterior trimise spre incinerare (prin intermediul personalului care efectueaza curatenia si transportul, care asigura eliminarea tuturor deseurilor).

4.4. Arhivarea rezultatelor Arhivarea rezultatelor analizelor: - rezultatele sunt arhivate pe rapoarte de rezultate timp de 1 an, la nivelul departamentului, dupa care sunt trecute in arhiva generala a laboratorului (identificate prin continut, perioada si persoana care a efectuat arhivarea). Arhivarea rezultatelor de control intern se efectueaza pe formularele corespunzatoare.Arhivarea rezultatelor calibrarilor nu este cazul.Fisele de mentenanta sunt arhivate la nivelul departamentului timp de 1 an, dupa care sunt trecute in arhiva generala a laboratorului (identificate prin continut, perioada si persoana care a efectuat arhivarea). 4.5. Potentiale surse de variabilitate (Bugetul de incertitudine)

Componentele incertitudinii

Cauza Metoda de determinare (de estimare) a

incertitudinii: A/B

Ponderea asupra incertitudinii totale a

determinariiModul de recoltare - nerecoltarea corecta a puroiului (recipient) Nu pot fi cuantificabile Mare

Transportul - nerespectarea conditiilor de transport (durata, temperatura)

Nu pot fi cuantificabile Mare

Mediile de cultura - nu se respecta instructiunile de lucru- cantitate variabila la turnare- neasigurarea sterilitatii la turnare- conditiile improprii de pastrare- neetalonarea sticlariei

Nu pot fi cuantificabile

Tip B

MareMicaMare

MareInsamantarea - nerespectarea modului de lucru

- neasigurarea sterilitateaNu pot fi cuantificabile Mare

Mare





Incubare -neetalonarea termostatului (variatii ale temperaturii)- nerespectarea temperaturii si a duratei de incubare

Tip B

Nu pot fi cuantificabile

Mica

Mare

Citire (frotiuri, cultura) - instruirea insuficienta a personalului Nu pot fi cuantificabile MareRepicarea - nerespectarea modului de lucru Nu pot fi cuantificabile MarePrezentarea rezultatelor - necorelarea probei (rezultatului) cu demande-ul

- interpretarea incorecta a rezultatului- nevalidarea sistemului informatic

Nu pot fi cuantificabile MareMareMare

Controlul respectarii procedurii de lucru (PS)

- nerespectarea procedurii de lucru (PS) Nu pot fi cuantificabile Mare

Factorul uman - oboseala- neatentia

Nu pot fi cuantificabile MareMare

4.6. Instruire personal si Responsabilitati4.6.1. Instruire personal: Determinarea germenilor patogeni din secretiile purulente va fi efectuata numai de personal instruit de catre Seful de Departament, respectand procedura si planul de instruire.4.6.2. Responsabilitati: Asistentii de la Departamentul Receptie - Recoltare:- etichetare probe biologice- asezarea in stative pe tipuri de recipiente de recoltare- transporta probele biologice la Departamentul de Microbiologie- verifica criteriile de acceptare ale probelori biologice: probe neidentificate/neetichetate corespunzator; tip de recipient de recoltare

necorespunzator, recipiente degradate- introduce rezultateleAsistentii din Departamentul de Microbiologie - receptioneaza sau transporta probele de la Departamentul Recoltare- verifica criteriile de acceptare ale probelor biologice: recoltarea corecta a materilor fecale (recipient steril), recipiente degradate- efectueaza procedurile de insamantare / testare specifice- inregistreaza rezultateleMedic de laborator:- instruieste personalul - supervizeaza personalul in curs de instruire- intreprinde actiuni corective, preventive si propune imbunatatiri- organizeaza activitatea in cadrul departamentului- este responsabil de actualizarea procedurii- citeste probele insamantate si testele specifice- verifica si valideaza buletinul de rezultate.- adauga comentarii generale, daca este cazul.- dispune repetarea unor determinari sau verificarea aparatelor, daca observa valori neconcordanteSef Laborator:- stabileste metoda de determinare - aproba procedura de determinare- stabileste intervalul de validare automata- este responsabil de respectarea normelor de protectie a muncii- organizeaza activitatea tehnica a laboratorului- este responsabil de asigurarea calitatii rezultatelorManager Laborator:- aproba procedura de determinare- organizeaza activitatea intregului laboratoruluiResponsabil cu Managementul Calitatii/Director Calitate:





- stabileste formatul procedurii- verifica continutul procedurii - efectueaza audituri interne- este responsabil de tinerea sub control a proceduriiResponsabilul metrologic:- efectueaza planul de etalonare si service conform producatorului- este responsabil de contactare si mentinere a legaturii cu firmele autorizate in ceea ce priveste etalonarea aparaturii


(2014) cultura colectie purulenta vs 1.3

Documents