vol_53_2010-1.pdf

206
UNIVERSITATEA  DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ “ION IONESCU DE LA BRAD” IAȘI LUCRĂRI Ș TIINȚIFICE VOL. 53 (12) MEDICINĂ VETERINARĂ PARTEA 1 EDITURA “ION IONESCU DE LA BRAD” IAȘI 2010 

Upload: viorace

Post on 03-Mar-2018

220 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 1/206

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE 

ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

“ION IONESCU DE LA BRAD” IAȘI 

LUCRĂRI ȘTIINȚIFICE VOL. 53 (12) 

MEDICINĂ VETERINARĂPARTEA 1 

EDITURA “ION IONESCU DE LA BRAD” 

IAȘI 2010 

Page 2: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 2/206

COLEGIUL DE REDACȚIE 

Redactor responsabil: 

Prof. univ. dr. Gheorghe SOLCAN 

Redactor adjunct: 

Prof. univ. dr. Octavian Zaharie OPREAN 

Membri: 

Prof. univ.  dr. Corneliu COTEA 

Prof. univ. dr. Vasile VULPE 

Prof. univ. dr. Mihai CARP‐CĂRARE 

Prof. univ. dr. Dan DRUGOCIU 

COMISIA DE REFERENȚI ȘTIINȚIFICI 

Prof. univ. dr. Octavian Zaharie OPREAN 

Prof. univ. dr. Abdelfatah NOUR  – Universitatea   Pudue, SUA 

Prof. univ. dr. H.C. Francois  CRESPEAU  – ENV Alfort, France 

Prof. univ. dr. Gheorghe SOLCAN 

Prof. univ. dr. Liviu MIRON 

Prof. univ. dr. Gheorghe SĂVUȚA Prof. univ. dr. Gabriel PREDOI  – FMV București 

Prof. univ. dr. Ioan Ștefan GROZA  – FMV Cluj Napoca 

Prof. univ. dr. Gheorghe DĂRĂBUȘ ‐ FMV Timișoara 

Prof. univ. dr. Corneliu COTEA 

Prof. univ. dr. Mihai CARP‐CĂRARE 

Conf. univ. dr. Șerban MOROȘAN  – INSERM Paris 

Prof. univ. dr. H.C. Liviu RUNCEANU 

Prof. univ. dr. Tudor PERIANU 

Prof. univ. dr. Ioan COMAN 

Prof. univ. dr. Elena VELESCU 

Volumul a fost editat cu sprijinul financiar al 

Ministerului Educației, Cercetării, Tineretului și Sportului 

ISSN: 1454‐7406 

Page 3: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 3/206

 

CURPINS 

PARTEA I  

ALINA ANTON, GHEORGHE SOLCAN, VASILE BOGHIAN, NICOLAE HAGIU 

BIOCHEMICAL AND HAEMATOLOGICAL PROFILE IN THE ADVANCED GESTATION 

PERIOD OF COPPER DEFICIENT HOLSTEIN AND BROWN SWISS CATTLE 

ATTIA, H.F AND MAZHER, K HISTOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES OF THE BUCK'S PINEAL 

GLAND DURING

 LIGHT

 AND

 DARK

 PERIODS

 

S. BESCHEA‐CHIRIAC 

COMPARATIVE STUDY OF VASCULAR ARTERIAL REACTIVITY AT SEVERAL MAMMAL 

SPECIES:  . THE REACTIVITY OF ARTERIAL SMOOTH MUSCLES AT THE 

VASOCONSTRICTOR AGENTS ANTIDIURETIC HORMONE (VASOPRESSIN) 

BOGHIAN V., MĂLĂNCUŞ R.N., ACATRINEI D., PAȘCA S., ANTON ALINA, SOLCAN GH. MORPHOCLINICAL ASPECTS OF BABESIOSIS IN HORSES 

IOANA BURCOVEANU, I. BURTAN, ROXANA TOPALĂ, L.C. BURTAN, M. FÂNTÂNARIU KERATOPATHIES IN CARNIVORES: CLINICAL SIGNS AND LOCAL PATHOLOGIC 

RESPONSES 

HÉLÈNE HUET  , DELPHINE FRANKO  , CHAKIB DJEDIAT, EVA PEREZ , FRANÇOIS CRESPEAU  , AMAURY DE LUZE 

PATHOLOGICAL EFFECTS AND TISSUE DISTRIBUTION OF MICROCYSTIN‐LR (MC‐LR) 

AFTER 48 HOURS NON INVASIVE EXPOSITION OF NEWLY HATCHED MEDAKA 

(ORYZIAS LATIPES) ELEUTHERO‐EMBRYOS 

GH. DĂRĂBUŞ 

, V. COZMA 

, K. IMRE 

, A. BEJAN 

, M.S.ILIE 

, MIRELA IMRE 

PREVALENCE OF CRYPTOSPORIDIUM SPP. AND OTHER ENTEROPATHOGENS 

INFECTIONS AT CALVES IN WESTERN, CENTRAL AND NORTH‐WESTERN ROMANIA 

GAL A.F. , CATOI C. , BABA AI , MICLAUS V. , BOLFA P. ,  TAULESCU M , TABARAN F. , NAGY A. , MOUSSA R. , COSMINA CUC ASPECTS REGARDING VASCULOGENIC MIMICRY IN CANINE MAMMARY CANCER 

GRECU MARIANA , NĂSTASĂ V. , MAREŞM. , MORARU RAMONA, HRIȚCU LUMINIȚA DIANA , ILIE CORNELIA 

ASSESSMENT OF THE ANTI‐INFLAMMATORY ACTION OF THE CARPROFEN‐BETA 

CYCLODEXTRINS COMPLEX

 ON

 EXPERIMENTAL

 INFLAMMATION

 MODEL

 IN

 RATS

 

13 

20 

26 

30 

36 

44 

49 

60 

Page 4: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 4/206

GROZA I.Ș, GROZA DARIA, PALL EMOKE, CENARIU M., CIUPE SIMONA, LAURA PARLAPAN EVALUATION OF DEGREE OF ENGRAFTMENT IN MOUSE MODEL OF STEM CELLS 

HARVESTED FROM HUMAN PLACENTA 

IONELA HOTEA, GH. DARABUS, C. PACURAR, TATIANA RUGEA, P. MUNTEAN, M.S. ILIE, K. IMRE, MIRELA IMRE, DENISA SORESCU, ADRIAN BALINT, DINU INDRE PRELIMINARY STUDY ON THE PREVALENCE OF TOXOPLASMA

 

GONDII INFECTION IN 

WILD BOARS FROM TIMIS COUNTY 

OLIMPIA C. IACOB,  B.C. Ş Î ŞCĂEPIDEMIOLOGICAL INVESTIGATIONS ON DIGESTIVE PARASITOSIS  IN RACING PIGEONS 

AND THE RISK OF RELEASING PARASITIC ELEMENTS IN FREE AREAS 

MARIANA IONITA  , D.K. HOWE , I.L. MITREA , B. STEVENSON , MICHELLE YEARGAN 

PRELIMINARY DATA CONCERNING OPTIMIZATION OF A PCR‐BASED METHOD FOR 

MOLECULAR DETECTION

 OF

 TICK

‐BORNE

 PATHOGENS

 

ISMAIL, S.F ; ABD AL‐GALIL, A.S.A AND GEHAN, B.A.YOUSSEF PROPOFOL ANAESTHESIA IN DONKEYS IN COMBINATION WITH CHLORAL HYDRATE 

ADINA MARIA MANEA, S. E. GEORGESCU, STELIANA KEVORKIAN, SORINA DINESCU, MARIETA COSTACHE GENOTYPING ESTROGEN RECEPTOR POLYMORPHISM IN PIGS, USING THE PCR‐RFLP 

METHOD 

MICLĂUŞ V ., ANNE CLAUDIA ŞTEFĂNUȚ , ADRIANA MUREŞAN ,  C. OBER , V. RUS 

COMPARATIVE TESTING OF SOME EXPERIMENTAL MODELS OF OXYGEN INDUCED 

RETINOPATHY IN YOUNG RATS. HISTOLOGICAL STUDY. 

MOUSSA RAOUAD.,C CATOI., B SEVASTRE., M TAULESCU., P BOLFĂ., A GAL., ,F.A TABARAN., A.L NAGY.,C CUC. EXPRESSION OF THE VIMENTIN MARKER IN DOG MELANIC CUTANEOUS TUMORS 

S.OANCEA , G.PAVEL , A.V.OANCEA 

ON THE SHAPE OF THE ERYTHROCYTES FROM SOME HERBIVORE MAMMALS 

S.OANCEA 

, S.PADUREANU 

, A.V.OANCEA 

IDENTIFICATION OF PATHOLOGICAL STATES BASED ON RED BLOOD CELL 

AGGREGATION 

OPREAN O.Z.  , GHEBAN DIANA  , FORNA NORINA CONSUELA , ŞINDILAR E.V. , GRĂMADĂ S. 

STRUCTURAL MODIFICATIONS OF THE ORAL MUCOSA AND THE DENTAL APPARATUS 

INDUCED BY  SOME DRUGS IN LABORATORY MICE 

EMOKE PALL , GROZA I. , CENARIU M. , CRISTINA ILEA , OLGA SORITAU , CIPRIAN T ., BERCE C . ISOLATION, CHARACTERIZATION, PHENOTYPIZATION AND DIFFERENTIATION OF STEM 

CELLS FROM RAT PLACENTA 

65 

70 

74 

87 

96 

103 

107 

115 

121 

127 

131 

141 

Page 5: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 5/206

 DUMITRIȚA RUGINA, ADELA PINTEA, ANDREA BUNEA, RALUCA POP, SANDA ANDREI LUTEIN PREVENTS HIGH GLUCOSE INDUCED OXIDATIVE STRESS IN HUMAN RPE CELLS 

TRIF ALEXANDRA

 

, DUMITRESCU EUGENIA  , PETROVICI SNEJANA

 

ALUMINIUM SULPHATE IMPACT ON FUNDAMENTAL BIOMARKERS OF REPRODUCTIVE 

FUNCTIONALITY IN FEMALE RATS (SUCKLING 

PERIOD 

EXPOSURE ) 

WAEL M. EL‐DEEB, S.M. EL‐BAHR IMPROVEMENT OF GLUCOSE CONCENTRATION, LIPOPROTEIN PROFILE AND 

ANTIOXIDANT BIOMARKERS IN BLOOD OF NATURALLY DIABETIC BITCHES 

ADMINISTERED INSULIN WITH VITAMIN C OR VITAMIN E 

WAEL M. EL‐DEEB,  ABD EL‐AZIZ ALMUJALLI,  S. M. EL‐BAHR 

INVESTIGATION OF SELECTED BIOCHEMICAL INDICATORS OF EXERTIONAL 

HABDOMYOLYSIS IN

 ARABIAN

 HORSES:

 PRO

‐INFLAMMATORY

 CYTOKINES

 AND

 

OXIDATIVE STRESS MARKERS 

IHAB EL_ZOGHBY, AHMED KASSAB 

THE PARS DISTALIS (ANTERIOR PITUITARY) IN ONE‐HUMPED CAMEL (CAMELUS 

DROMEDARIUS   )  : A MORPHOLOGICAL STUDY 

IHAB M. EL‐ZOGHBY 

LIGHT AND ELECTRON MICROSCOPE STUDIES OF THE ADRENAL GLANDS OF THE 

EGYPTIAN GEESE ( ALOPOCHEN  AEGYPTIACUS) 

PARTEA II  

GEHAN SAID AHMED AFIFY DETERMINATION OF SOME ANTIMICROBIAL RESIDUES IN CHICKEN MEAT AND 

GIBLETS. 

ADRIANA ANIȚĂ, DRAGOȘ ANIȚĂ, GHEORGHE SAVUȚA RESEARCHES REGARDING THE SEROPREVALENCE OF SWINE HEPATITIS E VIRUS 

INFECTION IN

 THE

 EAST

 OF

 ROMANIA

 

DRAGOȘ CONSTANTIN ANIȚĂ, ADRIANA ANIȚĂ, GHEORGHE SAVUȚA SEROEPIDEMIOLOGICAL STUDY REGARDING INFECTIOUS BOVINE RHINOTRACHEITIS 

IN COUNTIES FROM NORTH OF MOLDOVA REGION 

CRISTINA BULBAŞA (PANAITE), D. DRUGOCIU, DANA DRUGOCIU, PANAITE C.G. USING SOMATIC CELLS COUNT AND BACTERIAL COUNT TO EVALUATE MILK 

PRODUCTION IN ONE DAIRY FARM IN IASSY COUNTRY 

PRIMIANI EDIANINGSIH, JAN ALEX SIWI SELECTION

 RESPONSES

 OF

 ALABIO

 DUCK

 (ANAS

 PLATIRINCHOS

 BORNEO)

 

PRODUCTION IN INTENSIVE MAINTENANCE SYSTEM 

145 

153 

158 

170 

183 

195 

213 

219 

222 

226 

230 

Page 6: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 6/206

EL‐ KOMY. A.A.A, EL‐ZOGHBY. R.R,  ABD‐EL‐AZEM .M.A.TERATOLOGICAL AND PATHOLOGICAL STUDIES OF CEFOPERAZONE IN FEMALE 

ALBINO RATS 

SERGIU EMIL GEORGESCU, MARIA ADINA MANEA, STELIANA KEVORKIAN, MARIETA COSTACHE

 A NEW METHOD FOR ANALYZING THE AGOUTI LOCUS INVOLVED IN THE COAT 

COLOUR OF HORSES 

CRISTINA HORHOGEA, IVONA LAIU, CRISTINA RÎMBU, MIHAI CARP  – CĂRARE FELINE INFECTIOUS PERITONITIS  – CASE PRESENTATION 

STELIANA ELVIRA MARIA KEVORKIAN, S. E. GEORGESCU, MARIA ADINA MANEA, MARIA GEORGIANA GAVRILA, G. HRINCA, MARIETA COSTACHE THE SPIDER LAMB SYNDROME ABSENCE IN FIVE ROMANIAN SHEEP BREEDS 

HENDRONOTO ARNOLDUS WALEWANGKO LENGKEY, LOVITA ADRIANI 

IMPLICATION EFFECT OF PROBIOTIC BACTERIA TO YOGHURT QUALITY AND ENZYME 

ACTIVITIES 

LOVITA ADRIANI, HENDRONOTO A.W. LENGKEY PROBIOTIC BACTERIA AS YOGHURT STARTER AND ITS IMPLICATION EFFECT TO THE 

PATHOGENIC AND NON PATHOGENIC BACTERIA IN MICE GASTROINTESTINAL 

INA IULIANA MACOVEI, S. MANOLESCU, CRISTINA RÎMBU, S. PASCA, G. DRAGAN, GH.SAVUȚA STUDY OF AN OUTBREAK OF FOWL TYPHOID  IN PHEASANTS 

CRISTINA RÎMBU, ELEONORA GUGUIANU, GH. SOLCAN, CRISTINA HORHOGEA, E.V. ȘINDILAR, C‐TIN. PAVLI, C. CARP‐CĂRARE 

CONSIDERATIONS ON THE ASSOCIATION OF PERIODONTAL DISEASE WITH OTHER 

ORGANIC DISEASES IN DOGS AND CATS 

ROOSTITA L. B., CISSY R. P., ERIC F.S., SRI M., HENDRONOTO A. W. L. THE INFLUENCE OF SEASONAL CHANGE TOWARDS THE NUMBER OF OUTBREAKS AND 

POULTRY DEATH RATE CAUSED BY AVIAN INFLUENZA AT BANDUNG DISTRICT 

GH.SAVUȚA , IULIANA ONIȚĂ, ADRIANA ANIȚĂ, D. ANIȚĂ, LUANDA LUDU, BEJANARIU ANA EPIDEMIOLOGICAL INVESTIGATIONS IN THE EAST OF ROMANIA REGARDING THE 

SEROPREVALENCE OF INFLUENTZA A TYPE VIRUSES IN DIFFERENT SPECIES OF 

ANIMALS 

JAN ALEX  SIWI, PRIMIANI EDIANINGSIH AND DUDUNG MULLIADI PERFORMANS GENETIC QUALITATIVE AND QUANTITATIVE OF THIN TAIL SHEEP AND 

PRIANGAN SHEEP 

N. STARCIUC., NATALIA OSADCI., I. SCUTARU., T. SPATARU. 

THE OUTBREAKS

 OF

 INFECTIOUS

 BRONCHITIS

 OF

 CHICKENS

 IN

 PRIVATE

 POULTRY

 

FARM 

236 

246 

249 

254 

259 

262 

267 

271 

278 

282 

286 

294 

Page 7: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 7/206

 

OANA  RALUCA STRUGARU, FILIPPO  TURRINI, ALESSANDRA SCAGLIARINI, ELENA VELESCU THE DETECTION OF ORF VIRUS BY PCR AT THE RUMINANS OF ROMANIA 

ALINA VLAD

 SABIE,

 VIOREL

 FLORI

ŞTEAN,

 CARMEN

 CRE

ȚU,

 MIHAI

 OBAD

Ă, CĂTĂLIN

 CARP‐ CĂRARE, MIHAI CARP‐ CĂRARE DETECTION AND QUANTIFICATION OF SALMONELLA SPP. AND CAMPYLOBACTER 

JEJUNI ON POULTRY CARCASSES 

BY REAL‐TIME PCR 

MOHAMED YOUSEF RAMADAN AND ABLA DESOKY ABDEL‐MAGEID EPIDEMIOLOGICAL STUDY OF ECTOPARASITES IN STRAY DOGS IN  KALUBYIA 

GOVERNORATE OF EGYPT WITH A SPECIAL REFERENCE TO ITS CONTROL IN PUPPIES 

BY DELTAMETHRIN AND IVERMECTIN 

MARIA ZAMORNEA, D. ERHAN, Ş.RUSU, NINA TĂLĂMBUȚĂ, O.CHIHAI, VIORICA COADĂESTIMATION OF VEGETAL EXTRACTS EFFICIENCY IN DOMESTIC BIRDS 

ECTOPARASITOSES TREATMENT AND PROPHYLAXIS 

297 

300 

307 

318 

Page 8: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 8/206

Page 9: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 9/206 

BIOCHEMICAL AND HAEMATOLOGICAL PROFILE IN THE 

ADVANCED GESTATION PERIOD OF COPPER DEFICIENT HOLSTEIN 

AND BROWN SWISS CATTLE 

Alina ANTON, Gheorghe SOLCAN, Vasile BOGHIAN, Nicolae HAGIU 

Faculty of  Veterinary Medicine Iasi 

Alley Mihail Sadoveanu nr.8; Iasi  – 700489, Romania; [email protected] 

10 Holstein and  10 Brown  Swiss  cattle  in advanced  gestation  period,  clinically  healthy,  from  a 

 farm  from Romania were divided  into 2 groups according to breed  (group 1 = Holstein, group 2 = 

Brown  Swiss)  with  the  aim  of   evaluating  the  copper   status  and   correlating  these  status with 

haematological   and   biochemical    profiles.Ceruloplasmin  concentrations  (the   primary   Cu‐

containing 

component  

of  

the 

blood) 

have 

been 

considered  

as 

reliable 

indicators 

to 

copper  

status.During the  protocol, no statistically  significant  differences were noted  in the hematological  

and   biochemical    parameters  in  Holstein  versus  Brown  Swiss  cattle,  remaining  within  their  

 physiological   adult   reference  range,  except    plasma  ceruloplasmin.These  were  below   cattle 

reference range  for  all  20 cattles. 

In our  study, the values of   plasma ceruloplasmin were significantly  increased  (P <  0,05) in Brown 

Swiss  cattle  (54.97   ±  15.62  mg/L)  than  Holstein  cattle  (40.60  ±  5.18  mg/L),  probably   due  to 

genetic  predisposition. 

Keywords: ceruloplasmin, copper, haematology, blood  biochemistry, cattle 

Copper is the rate  –  limiting element  in the synyhesis of  ceruloplasmin, a glycoprotein that is synthetized in the  liver. Ceruloplasmin concentrations (the primary Cu‐containing component 

of  the blood) have been considered as reliable  indicators to copper status (Jain, 1993). Close 

correlation between plasma ceruloplasmine and copper concentration have been reported  in 

many animal species in cluding sheep, cattle and horses (Arthington et al., 1996; Cerone et al., 

1998). 

The aim of  the present study was to determine the copper status and the correlation between 

these status and haematological and biochemical profiles. 

MATERIAL AND METHODS 

The present study was carried out on a private farm from Nord‐East of  Romania. 

Blood  samples  were  collected  from  20  cattle  in  the  advanced  gestation  period  grouped  by 

breeds  (group 1 = Holstein, group 2 = Brown Swiss). The animals were clinically normal and 

free  from any external, and  internal parasites. They were  fed with corn silage, concentrates 

and hay. The animals were supplemented with 250 g/day of  a commercial mineral and vitamin 

mix. The basal diet was analyzed to contain 9 mg of  copper/kg dry matter intake. 

Blood samples were collected from the coccygeal vein into heparinized vacutainers for plasma 

and uncoated vacutainers  for  serum. The  samples were analysed  for glucose, urea nitrogen 

(BUN),  β‐hydroxybutyrate  (β‐OHB),  cholesterol,  calcium  (Ca),  phosphorus  (P),  magnesium 

(Mg),  alkaline  phosphatase  (PA),  total  protein  (Pt),  albumin  (Alb),  globulin  (Gb),  plasma 

ceruloplasmin (Cerlp) and plasma haptoglobin (Hapt). Serum  levels analysis and plasma were performed in an automatic biochemical Cormay Accent 200. 

7

Page 10: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 10/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

About 2 ml blood was sampled into small vacutainers containing a dried anticoagulant (EDTA‐

K) and gently mixed for hematological parameter determinations. 

Haematological analyses included red blood cells (RBC), haematocrit (Htc), haemoglobin (Hb), 

mean cell volume (VEM), mean cell haemoglobin (HEM), mean cell haemoglobin concentration 

(CHEM), white blood cells  (WBC) and number of  platelets. The samples were analysed  in an 

automated  cell  counter  (Animal  Blood  Counter  Vet)  for  complete  blood  count.  Differential 

leukocyte count was performed microscopically on Giemsa stained blood film. 

Statistical  analysis  was  conducted  using  SPSS  16  for  windows.  Breeds  effect  was  examined 

using Student`s t‐Test. Mean values and standard deviations were calculated from  individual 

values.  The  relationship  between  ceruloplasmin  and  haematological  and  biochemical 

parameters was calculated through Pearson correlation test. 

RESULTS AND DISCUSSION 

The values are discussed  in relation with the published reference ranges for adult cattle. The 

mean (SE) values of  RBC, Hb, Htc, VEM, HEM and CHEM at Holstein and Brown Swiss cattle in advanced gestation are  shown  in  table  1. Regarding  RBC, Hb,  Htc, VEM,  the most elevated 

values  were  observed  in  Brown  Swiss  cattle,  but  the  differences  were  not  statistically 

significant  (P >  0.05).  Pregnancy  causes  minor  changes  in  RBC  and  WBC  concentrations.  As 

pregnancy advanced, erythrocyte number increased slightly (Wood and Quiroz‐Rocha, 2010). 

The lowest values of  HEM (16,12 ± 1,23 pg) and CHEM (32,06 ± 1,39 %) have been observed in 

Brown Swiss cattle but  the differences were not statistically significant  (P > 0.05). The same 

situation was observed at number of  platelets when Holstein cattle showed elevated values 

(315 ± 118,21 x 10³/µL) compared with Brown Swiss cattle  (227,4 ± 91,84 x 10³/µL) but  the 

differences were not statistically significant. 

During  the entire  study,  the RBC  , Hb, Htc, VEM, HEM, CHEM and platelets at Holstein and Brown Swiss cattle were placed in physiological limits for adult cattle. 

In the present study, Pearson correlation test did not show an association (P > 0.05) between 

ceruloplasmin values and RBC, Hb, Htc, VEM, HEM and CHEM. 

Table 1. 

Mean (SE) values of  RBC, Hb, Htc, VEM, HEM and CHEM at Holstein and Brown Swiss cattle 

in advanced gestation 

Cattle RBC 

(x 106/µL) 

Hb

(g/dL) 

Htc

(%) 

VEM

(fL) 

HEM 

(pg) 

CHEM

(%) 

Holstein  6,12±0,65  9,98±0,40 29,5±1,47 48,4±3,20 16,38±1,12  33,82±0,85

Brown Swiss  6,53±0,63  10,42±0,3 32,64±1,39 50,2±3,34 16,12±1,23  32,06±1,39

Normal values 

for cattle 

(after Kramer, 

2000) 

5‐10  8‐15  24‐46  40‐60  11‐17  30‐36 

The  mean  (SE)  values  of   WBC,  Lymph  (lymphocytes),  Mon  (monocytes),  Neutroph 

(neutrophils), Eos  (eosinophils) at Holstein and Brown Swiss cattle  in advanced gestation are 

shown in figure1. 

In  the  present  study,  mean  values  of   WBC  were  within  the  adult  reference  range  (4‐12  x 

10³/µL) (Kramer, 2000). 

8

Page 11: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 11/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Regarding the number of  monocytes there were observed higher values (0,38 ± 0,14 x 10³/μL) 

in Holstein cattle, compared with Brown Swiss cattle (0,26 ± 0,08 x 10³/μL), but the differences 

were not statistically significant. 

In the present study, the mean values of   lymphocites were below cattle reference range 2,5‐

7,5 x 10³/μL (Kramer, 2000) for the 2 groups, and the mean values of  neutrophils were higher 

than  cattle  reference  range  0,6‐4,12  x  10³/μL  (Kramer,  2000).  In  the  periparturient  period, 

cows  typically  have  an  stress  leukogram  characterized  by  a  neutrophilia,  lymphopenia, 

eosinopenia, and monocytosis. Several studies have shown shifts  in proportions of  different 

lymphocyte  populations at  the  time  of   parturition. These  changes  may be  partly  related  to 

nutritional status and other health parameters, but pregnancy and  lactation appear  to have 

the primary effect (Torquist and Rigas, 2010) 

Pearson correlation  test did not show an association between ceruloplasmin values and  the 

values of  leukogram. 

Figure 1. Mean (SE) values of  WBC, lymphocytes, monocytes, neutrophils and eosinophils at 

Holstein and Brown Swiss cattle in advanced gestation 

Table 2. 

Mean (SE) values of  GGT, AST, PA, glucose, β‐OHB, BUN and cholesterol at 

Holstein and Brown Swiss cattle in advanced gestation 

Cattle GGT 

UI/L 

AST 

UI/L 

PA

UI/L 

Glucose

mg/dL 

β‐OHB

mmol/L 

BUN 

mg/dL 

Cholesterol

mg/dL 

Holstei

42,12±12,3

9 81,07±07  32,4±17,43  51,28±6,33 

0,82±0,1

13,48±3,0

138,98±27,2

Brown Swiss 

30,38±11,30 

57,20±6,56 

25,04±10,23 

55,16±10,01 

0,98±0,28 

8,73±3,31  118,12±32,53 

Normal 

values 

for 

cattle 

15‐38 

(after 

Smith, 

2009) 

43‐127 

(after 

Smith, 

2009) 

0‐500 

(after 

Radostits, 

2007) 

45‐75 

(after 

Radostits, 

2007) 

0,35‐

0,47 

(after 

Smith, 

2009) 

6‐27 

(after 

Radostits, 

2007) 

65‐220 

(after 

Radostits, 

2007) 

In the present study the levels of  AST, PA, glucose, BUN and cholesterol were consistent with 

the amounts in cattle and the differences between breeds were not statistically significant (P > 

0.05). The mean (SE) values of  GGT, AST, PA, glucose, β‐OHB, BUN and cholesterol at Holstein 

and Brown Swiss cattle in advanced gestation are shown in table 2. The higher values of  GGT 

9

Page 12: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 12/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

in Holstein cattle indicated cholestasis. The higher values of  β‐OHB in Holstein cattle and lower 

values of  glucose may suggest a subclinical ketosis. 

In the present study, Pearson correlation test did not show an association (P > 0.05) between 

ceruloplasmin values and GGT, AST, PA, glucose, β‐OHB, BUN and cholesterol. 

During  the  entire  study,  the  total  protein,  albumin  and  globulin  (figure  2)  at  Holstein  and 

Brown  Swiss  cattle  were  placed  in  physiological  limits  for  adult  cattle  and  the  differences 

between breeds were not statistically significant (P > 0.05). 

In the present study, Pearson correlation test did not show an association (P > 0.05) between 

ceruloplasmin values and Pt, Alb and Gb. 

Figure 2. Mean (SE) values of  total protein (Pt), albumin (Alb) ang globulin (Gb) at 

Holstein and Brown Swiss cattle in advanced gestation 

The mean (SE) values of  Ca, P and Mg at Holstein and Brown Swiss cattle in advanced gestation 

are shown in figure 3. In the present study phosphorus and magnesium at Holstein and Brown 

Swiss cattle were placed in physiological limits for adult cattle. The mean (SE) values of  calcium 

were  lower  for  Holstein  and  Brown  Swiss  cattle,  than  reference  values  and  the  differences 

between  breeds  were  not  statistically  significant  (P  >  0.05).It  has  been  shown  that  plasma 

calcium of  5 mg/dL reduce abomasal motility by 70 % and the strength of  the contraction by 

50 %  (Daniel, 1983). Clearly a reduction  in muscle contractility will  lead to a decrease  in dry 

matter intakes as rumen function decrease, leading to a severe negative energy balance. As a 

consequence, there  is an  increase  in  fat mobilisation that may result  in  fatty  liver syndrome 

and ketosis. An excess of  ketone bodies can further suppress appetite (Grummer, 1996). Thin 

cattle  in a negative energy balance are unable  to perform at maximum capacity  in  the herd 

(Anton  and  Solcan,  2008).  Hypocalcaemia  occurs  when  the  rate  of   calcium  uptake  into  the 

mammary gland  for milk production  is greater  than  that which  is absorbed  from  the diet or 

resorbed from bone (Wilde, 2006) In the present study, Pearson correlation test did not show an association (P > 0.05) between 

ceruloplasmin values and Ca, P and Mg. 

Haptoglobin  (protein  that  increases  in  acute  inflammation)  (figure  4)  was  within  the  adult 

reference range 0‐0,4 g/L (Radostits, 2007). Plasma haptoglobin showed the similar values at 

Holstein and Brown Swiss cattle. Pearson correlation test did not show an association between 

ceruloplasmin and haptoglobin values. 

10

Page 13: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 13/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Figure 3. Mean (SE) values of  calcium (Ca), phosphorus (P) and magnesium (Mg) at 

Holstein and Brown Swiss cattle in advanced gestation 

Figure 4. Mean (SE) values of  haptoglobine (Hapt) at 

Holstein and Brown Swiss cattle in advanced gestation 

In the present study, plasma ceruloplasmin (figure 5) were below cattle reference range 120‐

200 mg/L (Radostits, 2007) for all 20 cattle. The diet containing 9 mg of  Cu/kg of  DM, was near 

by the inferior copper limits for adult dairy cattle (9‐18 ppm) (NRC, 2001). The improvement in 

nutritional status should improve milk production of  the cattle as well as health performance of  the animals (Anton and Solcan, 2008). 

*Significant difference with Holstein cattle sampling. 

Figure 5. Mean (SE) values of  ceruloplasmin (Cerlp) at 

Holstein and Brown Swiss cattle in advanced gestation 

Dashed lines represent reference values for adult cattle 

Plasma  ceruloplasmin activity  is decreased by  copper deficiency,  the  relative activity of   this 

enzyme increases during infection and inflammation (Neve et al. 1988). Large quantities of  Cu 

are deposited in the fetus during late gestation, and this can decrease Cu status of  the dam if  

dietary  Cu  is  low  (Gooneratne  and  Christensen,  1989).  The  lowest  levels  of   plasma 

ceruloplasmin were  found  in Holstein cattle 40,60 ± 5,18 mg/L but the differences were not 

11

Page 14: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 14/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

statistically significant  (P > 0.05) compared to Brown Swiss cattle. The reduction of  digestive 

capacity in advanced gestation may limit copper intake for the cattle and fetus needs. 

Plasma  ceruloplasmin  may  show  a  genetic  difference  in  Cu  absorption  and  metabolism 

postabsorption  between  Holstein  and  Brown  Swiss  breeds.  The  genetic  difference  may  be 

related to the efficiency of  dietary Cu absorption, the excretion of  endogenous Cu, or amount 

of  feed intake (Du et al., 1996). 

CONCLUSIONS 

1)  Pearson  correlation  test  did  not  show  an  association  between  ceruloplasmin  and 

biochemical and haematological measurements in the advanced gestation. 

2)  Copper  deficiency  in  Holstein  and  Brown  Swiss  cattle  was  not  sufficient  to  cause 

hypochromic and microcytic anemia. 

3) The diet containing 9 mg of  Cu/kg of  DM, did not meet the requirements of  Holstein and 

Brown Swiss cattle in advanced gestation. 

4) Plasma ceruloplasmin were below cattle reference range 120‐200 mg/L for all 20 cattle, but the lowest levels of  plasma ceruloplasmin were at Holstein group 40,60 ± 5,18 mg/L. 

REFERENCES 1.  Anton A.,Solcan G., 2008  ‐ Body  condition scoring with Romanian Black  Pie dairy  cow , Scientific 

works, Univ. of  Agr. Sci. And Vet. Med. Bucharest, C series, Veterinary Medicine, 53, p. 12‐15. 

2.  Arthington  J.D.,  Corah  L.R.,  Blecha  F.,  1996  ‐ The  effect   of   molybdenum  induced   copper  

deficiency   on  acute   phase   protein  concentrations,  superoxide  dismutase  activity,  leukocyte 

numbers and   lymphocyte  proliferation  în beef  heifers  inoculated  with bovine herpes virus 1, J. 

Anim. Sci., vol. 74, p. 211‐217. 

3. 

Cerone S.I., Sansinanea A.S., Streitenberger S.A., Garcia M.C., Auza N.J., 1998  ‐ The 

effect  

of  

copper  deficiency  on the  peripheral  blood  cells of  cattle, Vet. Res. Commun, 22, p. 47‐57. 

4.  Du Z., Hemken R.W., Harmon R.J., 1996  – Copper  metabolism of  Holstein and   Jersey  cows and  

heifers  fed  diets high in cupric sulfate or  copper   proteinate, J. Dairy Sci., vol. 79, p. 1873‐1880. 

5.  Gooneratne S.R., Christensen D.A., 1989  –  A survey  of  maternal  copper  status and   fetal  tissue 

copper  concentrations in Saskatchewan bovine, Can. J. Anim., vol. 69, p. 141‐150. 

6.  Grummer R.R., 1996  – Close‐up dry period:  feeding management  for a smooth  transition.  In: 

Proceedings WCDS, Red Deer, Alberta. 

7.  Jain N.C., 1993  – Essentials of  veterinary  hematology , Ed. Lea and Febiger, Philadelphia, p. 173‐

175. 

8.  Kramer  J.W.,  2000  ‐ Normal  hematology  of   cattle,  sheep  and  goats.  In:  Schalm’s  veterinary 

hematology. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, p. 075‐84. 

9. 

National Research Council, 2001  ‐ Nutrient  requirements

 of 

 dairy 

 cattle. 7th rev. ed. Natl. Acad. 

Sci. Washington, D.C., p. 236‐267 

10.  Radostits O.M., Gay C.C., Blood D.C., Hinchcliff  K.W., 2007  ‐ Veterinary  Medicine.  A textbook  of  

the diseases of  cattle, sheep,  pigs, goats and  horses, Ed. Saunders W.B. Co.,Philadelphia, 10th

 

ed ., p. 1707‐1732. 

11.  Smith B.P., 2002  ‐ Large animal  internal  medicine 3th. ed. Mosby, London, Philadelphia, Sydney, 

Toronto, p. 783‐786. 

12.  Wilde D., 2006  – Influence of  macro and  micro minerals in the  peri ‐ parturient   period  on  fertility  

in dairy  cattle, Animal Reproduction Science, vol. 96, p. 240‐249. 

13.  Wood  D.,  Quiroz‐Rocha  G.F.,  2010  –  Normal   hematology   of   cattle,  In:  Schalm’s  veterinary 

hematology. 6th edition, Blackwell Publishing, Iowa, p. 829‐835. 

14. 

Tornquist  S.,  Rigas  J.,  2010   –  Interpretation of 

 ruminant 

 leukocyte

 responses,  In:  Schalm’s 

veterinary hematology. 6th edition, Blackwell Publishing, Iowa, p. 307‐320. 

12

Page 15: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 15/206

 

HISTOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES OF THE 

BUCK'S PINEAL GLAND DURING LIGHT AND DARK PERIODS 

Attia, H.F

 and

 Mazher,

 K

 Department of  Histology and Cytology, Faculty of  Veterinary Medicine, 

Benha and Beni‐Suef  Universities 

Corresponding author: Hossam Attia, Benha University. Egypt.P.O. 13736 

Abstract: the present investigation was conducted on the pineal organs of  12 healthy bucks. Sixth 

samples  collected  during  dark  period  (at mid  night) while  the  other  six  collected  during  light 

period  (at noon).The  samples were processed and prepared  for  light and electron microscopic 

examination. The pineal organ of  bucks was surrounded by a thin fibrous capsule, the pia matter, 

while  the  parenchyma was  supported  by  extensive  reticular  network.The  parenchyma  of   the 

gland was formed of  clusters or groups of  pinealocytes intermingled with astroglia cells. Bundles 

of   unmyelinated  nerve  fibers were  noticed  in  the  organ. During  dark period  the  pinealocytes were  large  in  size with  finely granular  cytoplasm  containing well developed  rER, mitochondria 

and many secretory granules. Long branched cytoplasmic processes arised from the pinealocytes 

to terminate near blood vessels or synapse with a nerve. The pinealocytes reacted positively with 

antimelatonin antibodies. During the light period the pinealocytes appeared smaller in size with 

clear  non  granular  cytoplasm.  The  pinealocytes  ahowed  a  very  slight  reaction  to  the 

antimelatonin antibodies. 

INTRODUCTION 

During  the  last  few  years,  the  study  of   the  pineal  gland  (epiphysis  cerebri)  attracts  the 

attention of  many authors at different aspects of  biological sciences specially the histologists 

and the physiologists. Historically, the  location of  the pineal gland deep  in the brain suggested to the philosophers 

that  it  is a mystery gland with myth,  superstition and metaphysical  theories surrounding  its 

perceived function. Descartes (2002&2003) called it the seat of  the soul. He believed that the 

gland is the point of  connection between the intellect and the body. 

The pineal gland is occasionally associated with the sixth chakra (also called Ajna or third eye 

chakra  in yoga) or sometimes seventh chakra  (crown).  It  is believed  to be a dormant organ 

that can be awakened to enable telepathic communications (Uz, et al , 2003). 

Arendt and Skene (2005) discovered that melatonin, the most potent compound then known 

to lighten frog skin, was present in highest concentration in the pineal body and its production 

is stimulated by darkness and inhibited by light. Histologically, the pineal gland of  rat, pig, fish, bird, rabbit and hamster  is thoroughly studied 

by Ferreira‐Medeiros, et al (2007), Przyblyska‐Gornowicz and Lewczuk (1997), Hafeez (2005), 

Ueck (1973), Romijn (1973) and matsushima, et al  (1990) respectively while that of  goat not 

yet investigated. 

Our study aimed to elucidate the light and electron microscopic pictures of  pineal gland of  the 

buck beside the  immunohistochemical  localization of  melatonin in the gland during dark and 

light periods. 

MATERIALS AND METHODS 

Twelve healthy bucks aging 10‐12 months‐old were subjected to the present investigation. The 

animals were subjected to a photoperiod of  12 hours dark and 12 hours light from rearing up 

to the time of  slaughtering. Six animals were sacrificed at midnight (at 12 O'clock) while  the 

13

Keywords: buck, pineal gland, histology, immunostochemistry

Page 16: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 16/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 other six were sacrificed at noon (at 12 O'clock). The skull  is opened carefully and the whole 

brain  is  taken,  then  the cerebral hemispheres were gently  removed and excluded while  the 

remained  part was  sagitally  sectioned  through  the  pineal  body  then  quickly  put  into  20% 

neutral buffered formalin. After fixation the specimens were processed to obtain histological 

sections of   about 4‐6 micrometers‐thick  to be  stained with hematoxylin  and eosin, Gomori 

reticulin  method,  silver  impregnation  technique  and  indirect  immunoperoxidase 

antiperoxidase  PAP  unlabelled  antibody method  using  STAT  polyclonal  kits  from  diagnostic 

Products  Corporation,  Los  Angelos,  USA.  The  above  mentioned  methods  were  applied  as 

outlined by Drury and Wallington (1980) and Bancroft and Steven (1995). 

For  electron microscopic  examination,  small  pieces  1mmX1mm  of   the  collected  specimens 

were fixed in 3% glutraldhyde in 1M phosphate buffer (pH=7.3) for 24 hours then post fixed in 

1M cold phosphate buffered 1% osmium tetroxide (pH=7.3) for 3 hours, rinsed  in phosphate 

buffer  then  dehydrated  (Hayat,1986).  Ultra  thin  sections  were  obtained  and mounted  on 

cupper  grids  then  stained  with  uranyl  acetate  and  lead  citrate  (Reynolds,  1965)  to  be 

examined by Joel 100 CX transmission electron microscope in the unit of  electron microscopy, 

Assuit University. 

RESULTS 

The pineal gland was covered by a thin fibrous capsule, the pia matter, from which very short 

septa  penetrate  the  gland.  Extensive  network  of   reticular  fibers  were  noticed  among  the 

parenchymatous elements (Fig.1). The parenchymal cells were arranged  in clusters, columns, 

rows or  irregular groups permeated by many blood  capillaries  (Fig.2). Pineal  sands,  a  small 

calcified dark patches, also noticed in the pineal parenchyma. Bundles of  unmyelinated nerve 

fibers  run  in  different  directions  in  the  parenchyma  of   the  gland  supported  by  glia  cells 

(Figs.3&4). 

The parenchymal cells took different characteristic features according to light or dark periods. 

During dark period (at midnight) 

The gland appeared highly vascularized and  the blood vessels became engorged with blood. 

The  pinealocytes  appeared  large  polyhedral  cells  with  faintly  stained  and  finely  granular 

cytoplasm  (Fig.5). The nuclei appeared  large spherical, vesicular and somewhat eccentrically 

situated with a prominent nucleolus. 

The  pinealocyte  showed  multiple  (4‐6)  branched  cytoplasmic  processes  which  either 

terminated in flattened dilatations adjacent to blood capillaries or synapses with nerve fibers 

(Fig.6). The pinealocyte appeared large and slightly electron dense cell containing a large euchromatic 

nucleus  with  a  prominent  nucleolus.  The  cytoplasm  contained  a  well  developed  rough 

endoplasmic  reticulum,  Golgi  complex,  many  rounded  and  filamentous  mitochondria  and 

numerous  free  ribosomes.  Secretory  granules  of   variable  shapes  and  sizes  as  well  as  fat 

droplets were also noticed (Fig.7). 

By  using  indirect  immunoperoxidase  technique  the  pinealocytes  showed  a  strong  positive 

reaction to the antimelatonin antibodies (Fig.8). 

The  astroglial  cells  appeared  elongated  or  oval  cells  irregularly  distributed  between  the 

pinealocytes. They had oval darkly stained centrally situated nuclei in a scant cytoplasm (Fig.5). 

These cells possessed numerous short and branched cytoplasmic processes (Fig.6). 

14

Page 17: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 17/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 During the light period (at noon) 

The  pinealocytes  became  smaller  in  size  ,  polyhedral  in  shape  and  the  cytoplasm  became 

lighter  in stain and non granular  (Fig.9). The nuclei  remain spherical, vesicular and eccentric 

with a prominent nucleolus. The blood vessels became  smaller  in  caliper and not engorged 

with blood. 

The pinealocytes appeared more electron lucent, free from secretory granules and the nucleus 

became  slightly  irregular  in  outline.  The  profiles  of   the  other  organelles  remained  as  the 

previous stage (Fig.10). 

By using the indirect immunohistochemical technique the pinealocytes showed a very faint or 

slight reaction to the antimelatonin antibodies (Fig.11). 

DISCUSSION 

The  epiphysis  cerebri  has  a  very  interesting  histological  structure  based  on  its  unique 

anatomical  position.  It  is  generally  accepted  that  the  pineal  body  develop  as  an  upward 

growth from the diencephalon to which it is connected by a short stalk (Ferreira‐Medeiros et 

al. 2007 and Borregon et al. 1997). 

The  gland  under  investigation was  covered  by  a  thin  fibrous  capsule,  the  pia matter,  from 

which short septa penetrate the gland as mentioned by Hafeez (2005); Kus et al.  (2004) and 

Reus et al. (1990). The parenchymatous elements of  the gland were supported by an extensive 

network  of   reticular  fibers  (Borregon  et  al.  1997).  Beside  its  role  as  a  protective  coat,  the 

fibrous stroma carry blood vessels, lymph and nerve supply of  the gland (Kus etal. 2004). 

There  is a general agreement  that  the histological picture of   the pineal parenchyma differs 

according  to  light  or  dark  period  to  which  the  individual  exposed  (Ferreira‐Medeiros  et 

al.2007;  Kus  et  al.  2004  and  Matsushima  et  al  1990).  The  authors  stated  that  the  gland 

becomes well developed with a pronounced proliferation and activity of  its parenchymal cells during dark  period while during  light,  the  activity of   the  gland  is  greatly decreased.  In  this 

respect, our study  revealed  that  the pinealocytes of   the glands collected during dark period 

showed a marked proliferation as  they become  larger  in size with  finely granular cytoplasm 

together  with  a  marked  congestion  of   the  pineal  blood  vessels.  The  above  mentioned 

histological signs  indicate a higher activity of  the organ  (Macchi and Bruce 2004). Moreover, 

the  pinealocytes  showed  a well  developed  rough  endoplasmic  reticulum, Golgi  complex  as 

well as many mitochondria as mentioned by Ueck (1973) and Oksche et al. (1972). The authors 

explained the role of  each of  these organelles in the secretory activity of  the cell. The presence 

of  electron dense secretory granules as well as lipid droplets in the cytoplasm of  pinealocytes 

of  buck at dark periods  is an absolute sign of  the  increased secretory activity of  the gland as explained by Uria et al.  (1992) and Owman and Rudeberg  (1970). The pinealocytes of  buck 

showed  long and branched cytoplasmic processes which either  terminate  in a  flat dilatation 

adjacent to blood capillaries or synapses with unmyelinated nerve. Similar observations were 

also reported by Reuss et al. (1990) and Oksche et al. (1972). The latter explained the role of  

cytoplasmic processes in the secretion on the other hand Mutsushima et al. (1990) explained 

them  as  stimuli  receivers.  Both  opinions  could  be  met  in  the  buck  pineal  where  the 

cytoplasmic processes  joining blood capillaries play a role in secretion while that synapses with 

nerve act as stimuli receivers. 

The  immunohistochemical  reaction  in our study augments  the electron microscopic  findings 

and  indicates  that  the buck pinealocytes produce considerable amount of  melatonin during 

darkness as stated by most researchers studying the pineal gland. Alexandr (1970) and Moore 

et al. (1967) mentioned that the production of  melatonin by the pineal gland is stimulated by 

15

Page 18: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 18/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 darkness and inhibited by light. Photosensitive cells in the retina detect light and directly signal 

the suprachiasmatic nucleus and extending  it  to  the 24 hours clock. Fibers  from SCN  to  the 

paraventricular  nucleus  which  relay  the  circadian  signals  to  the  spinal  cord  and  out  via 

sympathetic  system  to  the  superior  cervical  ganglia  and  from  these  to  the  pineal  gland. 

Barrenefxe et al.  (2004) and Ekstron and Meissl  (2003) stated  that melatonin  is synthesized 

from  amino  acid  tryptophan within  the pinealocytes during darkness  and  it  is  said  to have 

neurological properties for resynchronization of  sleep and circadian rhythms disturbances.  In 

the  periphery,  melatonin  is  also  involved  in  the  regulation  of   several  complex  cycles  as 

seasonal  reproduction, body weight and  energy balance. Arendt  and  Skene  (2005) decided 

that  exogenous  melatonin  has  sleeping‐inducing  and  temperature‐lowering  effects  during 

biological daytime and when  suitably  timed  it will shift  the phase of  human  circadian  clock 

(sleep, endogenous melatonin, core body temperature and cortisol) to earlier (advance phase 

shift) or later (delay phase shift) times. 

As mentioned by Borregon et al.  (1993)  the astroglial cells appeared oval or elongated with 

short and branched cytoplasmic processes. The authors suggest a supportive role of  the glial 

cells while Ekstron and Meissl (2003) explained the role of  these cells in transmission of  nerve 

impulses between pinealocytes. 

The presence of  calcified dark patches of  variable quantities  is also recorded  in most species 

especially at the age of  puberty till senility and called corpora arenacea (Baconnier et al. 2002). 

Chemical  analysis  of   these  patches  shows  that  they  are  composed  of   calcium  phosphate, 

calcium  carbonate,  magnesium  phosphate  and  ammonium  phosphate  (Bocchi  and  Valdre 

1993). 

The pinealocytes of  the samples collected during  light periods showed a marked decrease  in 

cell  size  and  absence  of   secretory  granules  which  reflected  on  the  very  weak 

immunohistochemical reaction as stated by Barrenefxe et al. (2004), Ekstron and Meissl (2003) 

and Alexandr  (1970). The  latter  refers  to  the pineal gland during  light as a gland  in  resting stage. The similarity of  the cytoplasmic organelles between the pinealocyte of  dark and  light 

samples  indicate  that  the pinealocyte  in  light  is  an active  cell but wait a nerve  stimulus  to 

synthesize and secrete melatonin (Matsushima et al. 1990). 

REFERENCES 

Alexandr,J., 1970: The pineal gland. Endeavour. 29(108): 144‐148. 

Arendt,J. and D.Skene, 2005: Melatonin as a chronobiotic. Sleep Med. Rev. 9(1): 25‐39 

Baconnier,S.,  S.  Lang,  M.  Polomska,  B.  Hilczer,  G.  Bekcovic  and  G.  Meshulam,  2002:  Calcite 

microcrystals in the pineal gland of  the human brain (physical and chemical studies). Bioelectromagneticc 

23(7): 488‐495. 

Bancroft and Steven, 1996: Theory and practice of  histological techniques. 4th Ed., Churchill‐Livingstone, 

Edinburgh, London, Melborne, New York 

Barrenefxe,J., P. Delagorange and J.Martinez, 2004: Physiological and metabolic functions of  melatonin. 

J. Physiol. Biochem. 60(1): 61‐72 

Bocchi,G.  and  G.Valdre,  1993:  Physical,  chemical  and  mineralogical  characterization  of   carbonate‐

hydroxyapatite concretions of  the human pineal gland. J. Inorg.. Biochem. 49(3): 209‐220. 

Borregon,A.,  J. Boya, L. Calvo and F.  Lopez‐Munoz, 1993:  Immunohistochemical  studies of   the pineal 

glial cells in the postnatal development of  the rat pineal gland. J. Pineal Res. 14(2): 78‐83 

Descartes, R., 2002: The Passion of  The Soul" excerpted  from  "Philosophy of  The Mind" Chalmers, D. 

New York: Oxford University Press, Inc. 

Descartes, R.,

 2003: Treatise of  Man. New York, Prometheus books.ISBN. 

Drury R. and E. Wallington, 1980:Carleton's histological technique. 4th Ed. Oxford Univ. Press. London, 

New York and Toronto. 

16

Page 19: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 19/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 Ekstrom,P.  and  H.  Meissl,  2003:  Evolution  of   photosensory  pineal  organs  in  new  light:  the 

fateneuroendocrine photosensors.Philos.trans.Soc. Lond. Biol.Sci. 358(1438): 1679‐1700. 

Ferreira‐Medeiros,M., C. Mandarim  and E. Correa‐Gillieron, 2007: Pineal gland postnatal growth in rat 

revisited. Anat. Histol. Embryol. 36(4): 284‐289. 

Hafeez,M., 2005: Light microscopic studies on the pineal organ in teleost fishes with special regard to its 

function. J. Morph. 134(3): 281‐313 Hayat, M,  1986:  Basic  techniques  for  transmission  electron microscopy.  1

st  Ed.  Academic  press,  Inc. 

Florida 

Kus,I., M.  Sarsilmaz, O. Ozen, A. Turkoglu, H. Pekmez, A. Songur and H. Kelestimur, 2004: Light and 

electron microscopic examination of  pineal gland in rats exposed to constant light and constant darkness. 

Neuroendocrinol. Lett. 25(2). 

Macchi,M. and J. Bruce, 2004: Human pineal physiology and functional significance of  melatonin. Front. 

Neuroendocrinol. 25 (3‐4): 177‐195 

Matsushima,S.,  Y.  Sakia  and  Y.  Hira,  1990:  Effect  of   photoperiod  on  pineal  gland  volume  and 

pinealocyte size in the chinease hamster (cricetulus griseus). Am. J. Anat. 187(1): 32‐38 

Moore,R., A. Heller, R. Wurtman and  J. Axelrod  1967: Visual pathway mediating pineal  response  to 

environmental llight. Science, 155(759): 220‐223. 

Osche,A.,  H.  Kirschstein,  H.  kobayashi  and  D.  Farner,  1972:  Electron microscopic  and  experimental 

studies  on  the  pineal  organ  of   white  crowned  sparrow,  Zonotrichia  leucophrys  gambelii. 

Z.Zellforsch.Mikrosk. Anat. 124(2): 247‐274 

Owman,C. and C. Rrudeberg, 1970:  light,  fluorescence and electron microscopic studies on  the pineal 

gland  of   pike,  Esox  lucius  L,  with  special  regard  to  5‐hydroxytryptaminase.  Z.Zellforsch.Mikrosk. 

Anat.107(4): 522‐550. 

Przyblyska‐Gornowicz,B.  and  B.  Lewezuk,  1997:  cytoplasmic  dense  bodies  in  pig  pinealocyte  during 

postnatal development: Quantitative and ultrastructural study.Folia Morphol. (Warsz). 56(1): 13‐21. 

Reus,S.,  C.  Spies, H.  Shroder  and  L.  Vollrath,  1990:  The  aged  pineal  gland:  reduction  in  pinealcyte 

number and adrenergic innervation in male rats. Exp. Gerontol. 25(2): 183‐188 

Reynolds, E., 1965: The use of   lead citrate at high pH as an electron opaque  in electron microscopy. J. 

Cell Biol., 26: 208‐215 Romijn,H., 1973: Structure and  innervation of   the pineal gland of   the  rabbit, An electron microscopic 

investigation. Z.Zellforsch.Mikrosk. Anat. 141(4): 545‐560. 

Ueck,M., 1973: fluorescence and electron microscopic studies of  the pineal body in different species of  

birds. Z.Zellforsch.Mikrosk. Anat. 137(1): 37‐62 

Uria,H.,  I. Antolin, D. Tolivia, M. Rodrigues  and P. Menendes, 1992: the pineal gland of  the trumpet‐

tailed rat (Octodon degus).J. pineal Res. 13(4): 174‐183. 

Uz,T., M. Akhisaroglu, R. Ahmed  and H. Manev, 2003: The pineal gland is critical for circadian period 1‐

expression in striatum and for circadian cocaine sensitization in mice. Neuropsychopharmacology 28(12): 

2117‐23. 

LIST 

OF 

FIGURES 

Figure  (1)  : A photomicrograph of  the pineal gland of  a buck showing  a  thin capsule © and extensive 

network of  reticular fibers supporting the pineal parenchyma. Gomori reticulin method, X 400 

Figure (2) : A photomicrograph of  the pineal gland of  a buck showing  pinealocytes arranged in clusters or 

irregular groups permeated by blood vessels (V). Note, the pineal sand (arrow). Hx&E stain, X, 200 

Figure (3) : A photomicrograph of  the pineal gland of  a buck showing  bundles of  unmyelinated fibers (F) 

run in different directions. Hx&E stain, X,200 

Figure (4) :An electron micrograph of  the pineal gland of  a buck showing cross sections of  unmelinated 

axons (F). Uranyl acetate and lead citrate stain, X10000 

Figure (5) : A higher magnification  of  the pineal gland of  a buck during dark period showing pinealocyte 

(arrow)  is  large  polyhedral  cells  containing  large  oval  to  spherical nucleus.  The  gland  contains  blood 

vessels (V) engorged with blood. Hx&E stain, X1000 

Figure (6)

 : A photomicrograph of  the pineal gland of  a buck during dark period showing  pinealocyte (P) 

with its long and branched cytoplasmic processes which terminate in blood vessel (V) or synapsed with a 

17

Page 20: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 20/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 nerve  (N). Note astroglia  (A) with  its  short processes. Silver  impregnation  technique  (Cajal's method). 

X1000 

Figure (7) : An electron micrograph of  the pinealocyte of  a buck during dark period showing numerous 

endoplasmic  reticulum  ®, mitochondria  (M),  secretory  granules  of   variable  shapes  (arrow)  and  lipid 

droplets (V). Uranyl acetate and lead citrate stain, X10000 

Figure (8)

 : A photomicrograph of  the pineal gland of  adult a buck dark period showing  a strong reaction 

(dark brown) in the pinealocytes. Indirect  immunoperoxidase technique. X400 

Figure (9) : A photomicrograph of  the pineal gland of  a buck during  light period showing  pinealocytes 

(arrow) with clear non granular cytoplasm. Hx&E stain, X1000 

Figure  (10)  :An electron micrograph  of   the pinealocyte of  a buck during  light period  showing  many 

mitochondria  (M),  endoplasmic  reticulum  ®,  and  lipid  vacuoles  (V).Note  the  absence  of   secretory 

granules. Uranyl acetate and lead citrate stain, X10000 

Figure  (11)  : A photomicrograph of   the pineal  gland of  a buck during  light period  showing  very  faint 

reaction in the pinealocyte. In direct  immunoperoxidase technique. X400 

18

Page 21: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 21/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

19

Page 22: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 22/206

 

COMPARATIVE STUDY OF VASCULAR ARTERIAL REACTIVITY AT 

SEVERAL MAMMAL SPECIES: 

1. THE REACTIVITY OF ARTERIAL SMOOTH MUSCLES AT THE VASOCONSTRICTOR AGENTS ANTIDIURETIC HORMONE 

(VASOPRESSIN) 

S. Beschea‐Chiriac 

University of  Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Iasi 

Faculty of  Veterinary Medicine 

Vascular  reactivity   is one of   the three  pillars on which  lies the  regulation of  arterial   pressure  in 

living organisms.  Arterial   pressure is one of  the main determinants of  the activity  state of  various 

organs and  systems both  in healthy  and   in  pathologically ‐altered  states. The  present  study  aims 

toward   identifying  similarities  and   differences  between  the  resistance  arteries  belonging  from 

various mammal  species that  are most  involved  in veterinary   practice: rats, cats, dogs and  horses. 

The  arterial    fragments   prelevated    from  animals  dead   due  to  various  clinical   and   traumatic 

conditions unrelated  to vascular   pathology  were normalized  using a newly ‐introduced  system of  

quantification, the  force  index  system. This has been calculated  using the wet ‐weight   parameter  

and   the   force  generated   after   administration  of   various   pharmacological   agents  that   cause 

vasoconstriction.  The  artery    fragments  were   fitted   in  organ  baths  using  the  Krebs‐Henseleit  

saline,  thermostated   at   37°   C   and   bubbled   with  a  mixture  of   95%  O2  and   5%CO2.  Vascular  

endothelium was either  kept  or  removed  using gentle rubbing with moist   filter   paper. Control  of  

endothelial  removal 

 was

 made

 both

  functionally,

 using

 carbachol 

 (synthetic

 derivative

 of 

 

acetylcholine)  and   microscopically,  after   testing.  The   force  generated   was  measured   using 

isometric  force  transducers coupled   to a computerized  acquisition system. The  pharmacological  

vasoconstricting  agents  used   were   phenylephrine  (synthetic  derivative  of   epinephrine),  KCl  

(potassium chloride 40‐80 mM, as depolarizing agent) angiotensin II, and  vasopressin. The results 

were statistically  investigated  using the t ‐test  and   ANOVA testing. The  preliminary  results show  a 

dependence of  the  force generated  an the amount  of  muscle  present  in the various species  from 

which  the  arteries  were  taken,  a  specifically   increased   response  of    feline‐derived   arteries  to 

angiotensin and  a specifically  increased  response of  canine‐derived  arteries to vasopressin. These 

results  will   be  used   as  controls  for   further   testing  in  various  pathological   conditions  and   for  

various  other    pharmacological   agents  used   in  the  therapy   of   vascularly ‐induced    pathological  

states. 

Key  words: vascular, reactivity, arterial, vasoconstrictor  agent  

The  aim of   this  study  is  to  investigate  the most  common modifications encountered  in  the 

veterinary practice in the vascular arterial reactivity that could be involved in the pathogenesis 

of  various animal species. We also wish to make a comparative  investigation of   the vascular 

reactivity  at  the  arterial  segments  collected  from  different mammal  species  the  veterinary 

pathology has most frequently to deal with, segments which are histologically and functionally 

similar. 

The investigation of  the methods that are at the basis of  the arterial tonus adjustment and of  

the metabolism of  the arterial smooth muscle fiber relied in the last two decades on the very 

well known isometric transducers pattern and on that of  the annular preparation of  different 

arteries. The arterial duct of  election used for these types of  investigations is the rat aorta, as 

20

Page 23: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 23/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

it  combines  most  of   the  stability,  accessibility,  disposability  and  controllability  conditions 

required for a trustworthy investigation. The price is also an important criterion in this matter. 

Although  the above mentioned pattern  is  so  very well  known,  still,  the  rat  is not a perfect 

model in what the cardiovascular modeling is concerned; it is not similar with the human being 

and even less with other mammals. This experimental model was used in studies as from half  

century ago [3]. 

Thus  fragments of  arteries collected  from dogs, cats and horses were used as subject  to an 

experimental  comparative  investigation  with  standardized  thoracic  aorta  rings  taken  from 

Wistar rats. 

MATERIALS AND METHOD 

The reactivity of  the arterial rings was measured in terms of  both absolute force, measured as 

force  index  (the  force  in mN  of   the  preparation  reported  at  its weight  in mg)  and  relative 

reaction  towards a standardized witness. Also, where possible  (considering  the preparations 

availability) curves dose/effect were made,  involving the majority of  the known vasorelaxing and vasoconstrictor substances that are pharmacologically well characterized. 

The comparative study was made on similar arteries in what their dimensions are concerned, 

being  part  of   the  resistance  segment,  in  this  situation  branches  from  the  gastric  coronary 

artery or the superior mesentery which had similar dimensions: maximum length: 2 mm,  = 1 

mm, weight 10‐15 mg. The  force of   contraction was quantified  in N/mg wet weight.(4) The 

organ parts were taken from the Medical Clinique and the Surgery Clinique from the Faculty of  

Veterinary Medicine,  from dead  animals  that were not  subject of   legal  euthanasia nor had 

affections with vascular implications. [8] 

After dissection  the  vessels were exsanguinated, washed  in  a  solution of  physiological  salt, 

sectioned  in  fragments  of   5‐10  cm  and  then  put  into  Krebs‐Henseleit  serum  (prepared according  to  the  formula)  and  transported  in  maximum  30  minutes  to  the  place  of   the 

experiment. 

The  aorta  fragments were  fixated  through  a metallic  serfina on  the bottom of   the  isolated 

organ baths, and the ring tensioned through the verniers of  the tensiometrical stamps to an 

initial tension of  100 mN. 

The vascular endothelium was  removed by gentle  rubbing with damp  filter paper whenever 

the  experimental  characteristics  required  it.  The  presence  of   the  functioning  vascular 

endothelium was pharmacologically verified using carbachol and through direct microscopy. 

The aorta rings were set  in organ baths containing 4 ml of  Krebs‐Henseleit physiological salt, 

(composition (mN): NaCl 118; KCl 4.7; 2.52; MgSO4 1.64; NaHCO3 24.88; KH2PO4 1.18; glucose 5.55),  thermostated at  37°C and bubbled with carbogen  (a mixture of  95% oxygen and 5% 

carbon dioxide). 

Isometric  force  transducers  connected  to  a  computerized  system  for data  acquisition were 

used for detecting the contractions of  the vascular smooth muscles ... 

The preparations were allowed  to equilibrate  for 60‐90 minutes under a  rest tension of  100 

mN. 

The aorta rings were afterwards precontractated with phenylephrine (10‐7  – 10

‐6)M and K

+ (40‐

70 mM)  and  treated with  carbachol  (10‐6M)  for  releasing  endothelial NO  [6].  The  absolute 

magnitude of  the contractions was of  175 ± 25 mN for the phenylephrine (10‐6 M) and K

+ (40‐

70 mM) 

21

Page 24: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 24/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

RESULT AND DISCUTION 

The effects of  administering antidiuretic hormone  (Vasopressin) on  the contractility of   the 

arterial preparations 

The  ADH  hormone,  also  known  as  Vasopressin,  is  an  essential  neuropeptide  for  the 

cardiovascular  homeostasis.  Vasopressin  was  among  the  first  peptide  hormones  ever 

described  and  it  is  clinically  used  for  more  than  five  decades,  especially  in  treatment  of  

diabetes  insipidus  and  of   upper  gastrointestinal  bleeding  due  to  esophageal  varices. 

Vasopressin is also more and more often used in therapeutic management of  shock, whether 

it is septic or vasodilator due to different reasons. 

The ADH  is a nonapeptide having a disulfide bridge between two cysteinic amino acids.  It  is 

synthesized in the paraventricular and supraoptic nucleuses of  the hypothalamus, transported 

coupled to the neurophysins along the hypothalamohypophyseal tract to the neurohypophysis 

and stored in granules. 

The effect of  this hormone is achieved through two types of  receptors, V1, found in the blood 

vessels  (on  the vascular smooth muscle) and which mediates  the vasoconstriction  through a cascade of  mediators involving phospholipase C and release of  calcium ions from intracellular 

stores through the inositol‐phosphate system. 

The V2 receptors are located in the distal renal tubule and kidney collecting tube. Their effect 

is  to  stimulate  the  expression  of   aquaporines  (water  channel  proteins)  in  the  tubule,  thus 

allowing re‐uptake of  water and antidiuretic effect. 

In  normal  conditions, AHA  has  little  effect  on  arterial  pressure  and  the  doses  at which  its 

vasoconstrictor effect becomes noticeable are at least 10 times higher than normal plasmatic 

concentrations. However,  in conditions of  hypotension,  its plasmatic concentration  increases 

greatly  and  its  vasoconstrictor  effect  allows  keeping  a  high  arterial  pressure  in  the  initial 

period. 

1500

1550

1600

1650

1700

1750

1800

1850

1900

1950

2000

3300 3800 4300 4800 5300

timp (sec)

   F  o  r   t  a   (  m  g   F   )

 Figure no. 1  – Characteristic aspect of  vasopressin contraction on the rat aorta 

But as the ADH neurohypophyseal reserves  lessen,  its plasmatic concentration decreases and 

its  benefic  effects   –  those  of   keeping  the  arterial  pressure  at  quasi‐physiological  levels  are fading. 

22

Page 25: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 25/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

The  administrations  in  isolated  preparations  were  made  using  the  Desmopressin  Acetate 

(Ferring) preparation in form of  ampoules of  4 μg/mL. The preparation is a synthetic analogue 

of   the  natural  8‐arginine‐vasopressin  hormone,  under  the  form  of   arginine‐vasopressin‐

monoacetate‐trihydrate. The doses were administered starting from 10‐12 M to 10‐8 M. 

In the rat aorta preparations and  in splanchnic arteries from cat, dog and horse, vasopressin 

produced a tonic contraction, with the appearance of  a descending plateau over a period of  

10‐15 minutes (Fig. 1). 

The force indices obtained at the vasopressin contraction are presented in Table no. 1 

Table no. 1 

Force index after administration of  ADH 10‐8 M 

Animal  FI

Rat  3,9 ± 1,25

Cat  4,1 ± 0,75

Dog  6,5 ± 1,5Horse  7,1 ± 0,89

 

Regarding  the  force  produced,  this  is  the  most  powerful  of   all  preparations 

administered, except for the  ‐adrenergic agonist phenylephrine. From the dose‐effect curve 

configuration (Fig. no 32) it can be seen that very low doses (10‐12 M   – physiological) produce 

little  contractile  effects,  while  with  higher  (pharmacological)  doses,  from  10‐10

  M,  the 

contractile  effects  are  close  to  maximum,  having  a  curve  with  biphasic  aspect.  The  curve 

aspect suggests the presence of  quantum effects at the V1‐type receptors. 

Figure no. 2  –Vasopressin dose‐effect curve in endothelized preparations 

from various species 

Vasopressin contraction has a number of  particular features concerning the dynamic. 

The  contractile  plateau  lasts  for  only  10‐15  minutes  and  after  that  it  ceases  and  a  new 

administration no longer produces the original effect (possibly tachiphylactic phenomena). 

0

1

2

3

4

5

6

7

8

12 11 10 9 8

Vasopressin log dose

   F   I   (  m   N   /  m  g   )

Rat 

Cat 

Dog 

Horse 

23

Page 26: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 26/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Figure no. 3  –Vasopressin contraction force after administration of  10‐10

 M desmopresin. The 

differences between endothelized and de‐endothelized preparations do not exhibit statistic 

significance 

It also should be said that  in dog’s case, the effect was significantly stronger, considering the 

fact that the thickness of  the muscular layer was smaller than that of  the horse’s, which leads 

to the assumption that dogs have a particular reactivity  in what the vasopressin mediation  is 

concerned (Fig. no 3). 

CONCLUSION 

1.  Vasopressin reactivity produces the highest force, except for the  ‐adrenergic agonist 

phenylephrine. 

2.  From the dose‐effect curve configuration it can be seen that very low doses (10‐12 M 

 – physiological) produce little contractile effects, while with higher (pharmacological) 

doses, from 10‐10

 M, the contractile effects are close to maximum, having a curve with 

biphasic aspect. The  curve aspect  suggests  the presence of  quantum effects at  the 

V1‐type receptors. 

3.  In  dog’s  case  the  effect  was  significantly  stronger,  considering  the  fact  that  the 

thickness of  the muscular  layer was smaller than that of  the horse’s, which  leads to 

the  assumption  that  dogs  have  a  particular  reactivity  in  what  the  vasopressin mediation is concerned. 

BIBLIOGRAPHY 

1.  Armstead WM, Lippton HL, Hyman AL, Kadowitz PJ., 1984 ‐ Analysis of  adrenergic responses 

in the mesenteric vascular bed of  the cat; evidence that vascular beta 2‐adrenoceptors are 

innervated. Can J Physiol Pharmacol. 62(12):1470‐8. 

2.  Beşchea Chiriac Sorin, Serban DN., 2001 ‐ Mechanisms involved in the vascular action of  

phenamyl, Lucr. St. vol. 44., USAMV Iaşi, p. 151‐159; 

3.  Beznak M., 1956 ‐ Hemodynamic changes following aortic constriction in normal and in 

hypophysectomized rats. ‐ Can J Biochem Physiol., 34(4):791‐8. 

4.  Guimarães S. Moura D., 2001 ‐ Vascular Adrenoceptors: An Update ‐ Pharmacol Rev. 53: 319‐356. 

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1 2 3 4

   F   I 

Rat 

Cat 

Dog 

Horse 

24

Page 27: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 27/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

5.  Haulica I, Bild W, Mihaila CN, Ionita T, Boisteanu CP, Neagu B., 2003 ‐ Biphasic effects of  

angiotensin (1‐7) and its interactions with angiotensin II in rat aorta. ‐ J Renin Angiotensin 

Aldosterone Syst. 4(2):124‐8 

6.  Jiang H, Halayko AJ, Rao K, Cunningham P, Stephens NL., 1991 ‐ Normalization of  force 

generated by canine airway smooth muscles. ‐ Am J Physiol. 260(6 Pt 1):L522‐9. 

7.  Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A., 1991 ‐ Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev., 43: 109‐142 

8.  Rozenfeld V, Cheng JW., 2000 ‐ The role of  vasopressin in the treatment of  vasodilation in 

shock states ‐ Ann Pharmacother. 34(2):250‐4. 

9.  * * * LEGE nr.471 din 9 iulie 2002  – Buletinul Oficial al României, privind aprobarea Ordonantei 

Guvernului nr. 37/2002 pentru protectia animalelor folosite        în scopuri stiintifice sau        în alte 

scopuri experimentale. 

10.  Holmes Cheryl, Patel B. M., Russell J. A. Walley K.R., 2001 ‐ Physiology of  Vasopressin Relevant 

to Management of  Septic Shock  – Chest. 120;989‐1002 

25

Page 28: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 28/206

 

MORPHOCLINICAL ASPECTS OF BABESIOSIS IN HORSES 

Boghian V., Mălăncuş R.N., Acatrinei D., Pașca S., 

Anton Alina, Solcan Gh. Faculty of  Veterinary Medicine Iasi 

Alley M. Sadoveanu no. 8 

[email protected] 

Abstract: 

In 7  horses with clinical  signs of  cortical  syndrome in the inhibition  phase, subicter  and  dark  urine 

were  performed   blood   counts  (HLG),  cytomorphological   examination  of   the  blood   smear   (May  

Grunwald   Giemsa  stained),  biochemical    profile  and   macroscopic  examination  of   the  internal  

organs. Blood  count  revealed  normochromic normocytic regenerative anemia with a low  number  

of   red   blood   cells  (5.3   x103/mm3).  Blood   biochemical   examination  revealed   hepato‐biliary  

insufficiency  (ALT 

 = 88.9

 IU

  / 

 L,

  ALP

 = 222.7 

 IU

  / 

 L)

 and 

 renal 

 insufficiency 

 (BUN

 = 35.7 

 mg

  / 

 dl 

 = 

2.8 mg CRTN  /  dL). 

Disease  has  been  confirmed   by   observing  endoglobular   merozoits  of   B.  equi   and   in 

morphopathological  examination were  found  bleeding  points in the heart  and  splenomegaly. 

Keywords: babesiosis, equine, B. equi  

Babesiosis  is  a  hemosporidiosis  also  called  piroplasmosis  produced  by  sborozoa  from 

Babesiidae family disseminated by hematophagous mites from Ixodidae family, also known as 

tick. Each species of  Babesia species corresponds to a tick. In horses the disease is caused by B. 

equi,  B.  cabali,  Nutallia  equi  and  newer  by  B.  canis.  The  disease  is  characterized  by  the 

modified general  condition, anemia and nervous manifestations predominantly  represented 

by cortical inhibition, which leads to death unless etiological treatment is applied. (3, 4). 

In this paper we present some morphoclinical  aspects of  babesiosis in horses that are useful 

to guide diagnosis, so etiotropic treatment can be applied. 

MATERIAL AND METHOD 

Observations were made on seven horses (4 stallions, two mares and a horse) aged between 

two and eight years presented to the Medical Clinic of  the Faculty of  Veterinary Science from 

Iași. Diagnosis was established by  collating data obtained at  clinical examination with  some 

laboratory  data.  Such  was  performed  blood  counts  (CBC),  biochemical  profile,  and 

cytomorphological blood smear examination using May Grunwald Giemsa staining. After the 

performed  treatment,  6  animals  were  cured  and  one  died  because  of   complications 

(pulmonary edema). In this animal was performed a macroscopic examination of  the internal 

organs. 

RESULTS AND DISCUSSION 

Guideline the diagnosis to babesiosis started  from a similar clinical environment  in all seven 

cases: loss of  appetite, signs of  cortical inhibition (tolerance, adynamie, drowsiness) and rectal 

temperature exceeding the upper limit of  reference (39.50 C). The mucous membranes had a 

subicteric character, cyanotic appearance and the urine was brown (fig. 1) 

26

Page 29: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 29/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 1. 

The subicteric mucous membrane and brown urine 

Haematological examination results are shown in Table 1 and 2. 

Table 1. 

Haematological parameters in horses with babesiosis 

Blood 

Paramet

ers 

Erythro

cytes Hb  Ht 

Leu

co‐

cyte

Blood smear 

Mat

ure 

neut

ro‐

phils 

You

ng 

neut

ro‐

phils 

Eosi

no‐

phils 

Baz

o‐

phi

ls 

Mono

cyte 

Limpho

cyte 

Measure

ment 

units 

mil/μl g/

dl % 

mii/

μl %  %  %  %  %  % 

Referenc

e 6‐12 

10

18 

32

48 

6‐

12 

30‐

75 0‐1  1‐10  0‐3  1‐8  25‐60 

Horses 

with 

babesios

is (n=7) 

5,3 20

,4 

49

,2 5,0  76,0  2,0  4,0  1,0  2,7  21,3 

Table 2. 

Derived blood constant in horses with babesiosis 

Blood 

parameters VEM  HEM  CHEM 

Measurement 

units μ

3  picograme (pg)  g/dl 

Reference  34‐58  13‐19 31‐37 

Horses with 

babesiosis 

(n=7) 

47,0  16,6  35,2 

Haematological examination  revealed  the existence of  an  anemic  syndrome, normochromic 

normocytic regenerative anemia with a low number of  red blood cells (5,3 mil/μl). 

27

Page 30: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 30/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

We also observed a low number of   leucocytes (5.0 thousand / ml). Increased hemoglobin (Hb 

= 20.4 g / dL) and hematocrit (Ht = 49.2%) showed the presence of  dehydration. 

Biochemical profile results are presented in Table 3. 

Table 3. 

Biochemical profile in horses with babesiosis 

Biochemical 

Profile 

Hepatic profile Renal profile

 

TP  AST  ALT ALP GGT TBIL DBIL BUN  CRTN

Measuremen

t units 

g/d

l UI/L  UI/L  UI/L  UI/L 

mg/d

mg/d

mg/d

mg/d

Reference 5,7‐

7,9 

116

287 

2,7‐

21 

70‐

227 

2,7‐

22 

0,3‐

3,0 ‐

10,4‐

25,0 

0,9‐

2,0 

Horses with 

babesiosis 

(n=7) 

6,3  31,3 88,

222,

23,

9 3,3  0,5  35,7  2,8 

As seen  in Table 3 there exists an hepatobiliary failure: ALT (alanine amino transferase)=88.9 

IU/L,  ALP  (alkaline  phosphatase)=222.7  IU/L,  GGT  (gamma‐glutamyl‐transferase)=23.9  IU/L, 

TBIL  (total  bilirubin)=3.3  mg/dL  and  renal  failure:  BUN  (blood  urea  nitrogen)=35.7  mg/dL, 

CRTN (creatinine) = 2.8 mg/dL. 

Cytomorphological examination of   the blood smear  stained May Grunwald Giemsa  revealed 

the existence of  Babesia equi endoglobular merozoits and intense hemolysis (fig. 2). 

Fig. 2.Babesia equi merozoits and hemolysis 

Fig. 3.Splenomegaly and bleeding points in the heart base 

28

Page 31: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 31/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Macroscopic  examination  of   internal  organs  from  an  animal  died  due  to  complications 

revealed splenomegaly and bleeding points in the heart base (Fig. 3). 

Cause of  death was acute pulmonary edema and hemolytic anemia due  to heavy parasitism 

(Fig. 4.) 

Fig. 4.Acute pulmonary edema and tick parasitism 

From the peripheral blood smear stained May Grunwald Giemsa were identified endoglobular 

parasites in all cases fact that confirmed the diagnosis. 

The treatment with Berenil  in a dose of  0.0035 g/kg 7% extemporaneus prepared solution or 

Imizol  in a dose of  4 ml/100 kg  led to remission of  clinical signs starting with the second day 

and  clinical  cure  in  6  cases  after  about  3  days  in  which  symptomatic  treatment  was  also 

performed. 

CONCLUSIONS 

1.  Diagnosis  of   babesiosis  has  gone  from  a  common  hemosporidiosis  clinical  framework: cortical syndrome cortical in inhibition phase, subicter and dark urine. 

2. Blood count revealed normochromic normocytic regenerative anemia, with a low number of  

red blood cells (5.3 x103/mm3). 

3. Blood biochemical examination revealed hepato‐biliary insufficiency (ALT = 88.9 IU / L, ALP = 

222.7 IU / L) and renal insufficiency (BUN = 35.7 mg / dl = 2.8 mg CRTN / dL). 

4. Morphopatological were found bleeding points in the heart and splenomegaly. 

5.  The  diagnosis  of   babesiosis  was  confirmed  by  eidentification  of   B.  Equi  endoglobular 

merozoits. 

BIBLIOGRAPHY 

1.  BOGHIAN V.,  SOLCAN GHE.,  LUMINIȚA DIANA HRIȚCU, BEŞCHEA‐CHIRIAC S.  I., 2003, Particularități 

morfoclinice ale babesiozei  canine, al  IX‐lea Congres Național de Medicină Veterinară,  Iaşi, Rev. Rom. 

Med. Vet., vol. 13, nr. 3‐4, p.288  şi Lucr.  Şt. USAMV  Iasi, Medicina Veterinara, vol. 46, p. 362‐364,  ISSN 

1454‐7406. 

2.  MORAILLON R., FOURRIER P., LEGEAY Y., LAPEIRE C., 1997, Dictionnaire pretique de  therapeutique 

canine et feline, 4e ed, Masson, Paris. 

3.  DULCEANU N., CRISTINA TERINTE, MITREA L.I., CARMEN POLCOVNICU, 2000, Dicționar enciclopedic 

de parazitologie, Ed. Academiei Române, Bucureşti. 

4. 

DULCEANU N., CRISTINA TERINTE, 1994, Parazitologie veterinară, vol. 1, Ed. Moldova, Iaşi. 

5. 

THE MERCK VETERINARY MANUAL, 1998, eighth edition, Merck & Co.,  Inc. Whitehouse Station, NJ USA. 

29

Page 32: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 32/206

 

KERATOPATHIES IN CARNIVORES: CLINICAL SIGNS AND LOCAL PATHOLOGIC RESPONSES 

IOANA BURCOVEANU, I. BURTAN, ROXANA TOPALĂ, L.C. BURTAN, M. FÂNTÂNARIU 

[email protected] 

The cornea  is  the  perfectly   transparent, avascular, anterior  component  of   the  fibrous, 

outer  coat  of  the eye, along with the opaque,  posterior  sclera. Corneal   pathology  varies 

 from  congenital   disorders  to  tumors,   primary   or   by   extension.  Keratitis  define  the 

inflammation of  the cornea, that  may  have numerous causes, like trauma, noninfectious 

(physical,  chemical)  or   infectious  (bacterial,  viral,   fungal,  parasitic)  agents,  immune 

reactions.   Acquired   corneal    pathology   may   be  categorized   as  ulcerative  or  

nonulcerative, infectious or  noninfectious,  or  by  cause, topography, depth, etc. 

Clinical  signs can also vary  greatly. Generally, we observe blepharospasm,  photophobia, 

hyperemic conjunctiva, epiphora, serous or  mucopurulent  discharge  that  clings  to  the 

ocular  surface. Because of  its compact  construction,  pathologic reactions in the cornea 

tend  to evolve differently, regarding their  speed  of  onset  and  recovery. The majority  of  

clinically   important   keratopathies  develop  one  or   more  of   the  following  local   signs: 

edema,  vascularisation,   pigmentation,  cellular   infiltrates,  accumulation  of   lipid   or  

mineral  material  in the stroma and  corneal   fibrosis, with scar   formation. 

Optimal  aetiologic diagnosis and  clinical  management  require knowledge of  the clinical  

signs listed  above. Key words: cornea, keratopathies, symptoms, carnivores 

The cornea  is the perfectly transparent, anterior component of  the eye, playing the role of  a 

convex ‐concave  lens.  It  has  no  blood  vessels  or  pigments,  its  thickness  varying  in  animals 

from 0,56 to 1 mm (0.5  – 0.8 mm) (5), becoming  less thicker at the perifery  in dogs and cats 

(4). The posterior part of  the outer, fibrous coat of  the eye is the sclera. The point at which the 

cornea and sclera merge is called the limbus (1, 3, 4, 5). The cornea plays many roles, such as: 

mechanical, optical, immunological and tissue healing. (4) 

From  outside  to  inside,  the  cornea  has  5  layers:  epithelium,  its  basement  membrane 

(Bowman), stroma, Descemet’s membrane, endothelium (posterior epithelium). It is avascular and it has no pigments, but it has a sensitive innervation, provided by nasociliary nerves of  the 

ophthalmic  branch  of   the  trigeminal  nerve  (cranial nerve V)  (3, 5).  The  density  of   terminal 

nerves is higher in the center and lesser at the periphery of  the cornea. 

The cornea  is  the  first barrier of   the globe, being exposed  to exogenous disorders  (trauma), 

endogenous factors (corneal dystrophies, which are inherited) or to the extension from other 

ocular tissues (anterior lens luxation, uveitis, neoplasia). 

The  present  paper  resumes  the  symptoms  of   clinically  important  keratopathies: 

blepharospasm, epiphora, conjunctival hyperaemia, as well as the major pathologic responses: 

corneal  edema,  vascularisation,  fibrosis  (scar  formation),  melanosis,  accumulation  of   an 

abnormal substance within the cornea (lipid, mineral), stromal malacia. 

30

University of  Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Iasi 

Page 33: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 33/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

MATERIAL AND METHOD 

Research has been achieved on the number of  cases presented for ophthalmic examination at 

the Faculty of  Veterinary Medicine in Iasi, the Surgical Clinic, throughout the years 2007‐2010 

and  at  the  Alfort  Veterinary  University  Hospital  Centre  (Centre  Hospitalier   Universitaire 

Vétérinaire  Alfort  –  Ecole Nationale Vétérinaire  Alfort  (CHUVA‐ENVA), Maisons‐ Alfort, France), 

in mars‐april 2010.  From the total number of  carnivores, we collected those presented for an 

ophthalmic disorder, especially that of  the cornea. A relevant and thorough history, completed 

by an orderly and extended ocular examination, give a correct diagnosis and the possibility of  

successful clinical results. 

RESULTS AND DISCUSSIONS 

The general symptoms of  keratopathies, that first draw the owner’s attention and after that of  

the veterinarian, are the ocular pain, translated by the blepharospasm, photofobia, epiphora, ocular discharge. Blepharospasm can be present at one eye or at both eyes, depending on the 

nature of  the aetiological agent  (virus, bacteria,  immune complexes)  (photos 1‐3). Discharge that accompany different corneal diseases can be serous or mucopurulent (photos 4‐6). 

1. Bilateral blepharospasm  2. Right blepharospasm  3. Right blepharospasm 

4.  Unilateral epiphora  5.  Mucopurulent discharge  6. Diffuse conjunctival hiperaemia, 

mucopurulent discharge 

The healthy cornea  is completley  transparent, due  to  the  lack of  blood vessels or pigments, 

but when pathologic disorders appear, we can observe some local pathologic changes that are 

important for the clinician. 

Clinically, the  loss of  corneal transparency  is translated by corneal edema. Normally, corneal structures  fight  against  water  entry,  especially  the  endothelium  and  the  epithelium.  The 

endothelium extracts water form the stroma, maintaining a relative dehydration. Any lesion of  

those two components of  the cornea results in edema. 

Accumulation of  water between the stromal colagen fibers gives the cornea a blue coloration, 

which becomes opaque. Corneal edema can be  localized or diffuse, epithelial or endothelial, 

the latter being more intense and diffuse. (photos 7, 8). 

CHUVA‐ENVA

CHUVA‐ENVA 

31

Page 34: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 34/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

7. Diffuse corneal edema  8. Localized corneal edema 

When  it  appears,  corneal  vascularization  is  always  pathological.  Blood  vessels  can  be superficial, deep or both. Superficial neovascularisation are „treelike” vesseles, originating  in 

conjunctival  circulation.  They  occur  whenever  there  is  a  lesion  in  the  epithelium  or  the 

anterior  stroma.  Deep  vessels  are  short,  parallel,  „hedgelike”,  originating  in  the  cilliary 

circulation. The depth of  new formed vessels is a good indicator of  the depth of  the initiating 

lesion.  In  cases  of   persistent  or  complicated  lesions,  a  granulation  tissue  can  occur.  The 

dinamic of  corneal neovascularisation is presented in photos 9‐14. 

9.Superficial neovascularisation, cat.  10.Superficial vessels, cat.  11. Superficial vessels, dog. 

12. Granulation tissue, dog.  13. Granulation tissue, cat  14.Deep vascularisation, dog. 

Corneal  vascularisation  is generally beneficial  in  stromal  repair. Blood vessels advance  from 

the  limbus, until  they  invade  the  lesion,  corneal healing and  regain of   transparency starting 

from  the  limbus, as  it can be seen  in photo 9. Keeping  in mind  those  facts, although blood vessels can result in influx of  pigments and inflammatory cells, easing corneal fibrosis, control 

if  neovascularisation with the use of  steroids is not always indicated. 

Corneal pigmentation is also called pigmentary keratitis. These terms ignore the possibility of  other  pigments,  like  hemoglobin  or  the  soluble  pigment  in  corneal  sequestra  in  cats,  than 

melanin to cause corneal opacity. Nevertheless, it must not be used as a diagnosis, for it is only 

a  sign  of   chronic,  persistent  corneal  irritation,  that  may  have many  causes,  each  with  a 

different treatment. Melanin is deposited in the epithelium and the anterior stroma, migrating 

along with blood vessels, during the inflammatory process. 

Corneal melanosis is a sign of  chronic irritation, as seen in cases of  eye exposure due to facial nerve paralysis, lagophtalmos, frictional irritation (distichiasis, entropion) (photo. 15), tear film 

CHUVA‐ENVA 

CHUVA‐ENVA 

CHUVA‐ENVA

CHUVA‐ENVA CHUVA‐ENVA 

CHUVA‐ENVA

CHUVA‐ENVA 32

Page 35: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 35/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

abnormalities (keratocojunctivitis sicca) (photo 16), chronic immunologic stimulation (pannus) (photos 17, 18). 

15.Ventral corneal pigmentation, dog.  16.Diffuse corneal pigmentation, dog. 

17.Lateral corneal pigmentation, dog.  18. Ventral and lateral corneal melanosis, dog. 

Corneal fibrosis appears as a consequence of  the stromal repair process, when collagen fibrils don’t  order  themselves  in  a  parrallel manner,  thus  interfering with  light  transmission.  The 

opacity  is  localised  in  the stroma,  the epithelium being  intact, with  some new vessels being 

able to persist. Meanwhile, the scar can become clear, but will not disappear completely. The 

tendency to clear is greater in young animals and more often in cats. Scar melanosis and lipid 

accumulation often occurs  in dogs. As  it develops, the scar can be named nubecula, macula, 

albugo and leukoma. If  iris fibers are attached to the corneal endothelium, the scar is named 

an adherent leukome, with an anterior synechia (photos 19‐23). 

19.Macula, dog.  20, 21.Adherent leukoma, cat  – profile, face. 

22, 23.Adherent leukoma, cat, profile and face. 

Lipid  or  mineral  accumulations  appear  as  sparkly,  white  deposits  in  the  corneal  stroma, situated underneath the epithelium. This type of  lesion can be a primary disease in breeds like 

Beagle, Boxer, Airedale Terrier, Caniche, Cocker, Doberman (photos 24‐26). 

CHUVA‐ENVA 

CHUVA‐ENVA 

CHUVA‐ENVA 

CHUVA‐ENVA 

CHUVA‐ENVA 

33

Page 36: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 36/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

24.Corneal lipid dystrophy  25.Lipid‐calcium degeneration,  26.Lipid‐calcium in a Beagle.  dog.  degeneration, dog. 

Lipid dystrophy evolves bilaterally, it is not painful, with minimum implications on the animal’s 

sight and requires no treatment. Lipid degeneration  is associated with signs of   inflammation 

(keratitis, scleritis, uveitis), having the possibility to be the result of  corneal ulcers or corneal 

traumatisms  having  scarred with  lipid  accumulation.  In  some  animals, we may  notice  high 

levels  of   cholesterol  in  the  blood,  or  other metabolic  disorders,  such  as  diabetes mellitus, 

hypothyroidism, hyperadrenocorticism or primaryhyperlipidemia. 

Stromal  malacia  or  „melting”  occurs  when  collagenase,  the  enzyme  responsible  of  collagenolysis, is liberated by cells, especially neutrophils. The cornea becomes soft, due to its 

loss of  rigidity (loss of  collagen structure). The process is followed by developement of  a deep 

corneal ulcer or descemetocele (photo 27). 

27.Stromal melting, dog. 

CONCLUSIONS 1.

 

The cornea is the perfectly transparent, anterior component of  the eye, playing the role of  

a convex ‐concave  lens, having no blood vessels or pigments. 

2. 

The general  symptoms of  keratopathies,  that  first draw  the owner’s attention and after 

that of  the veterinarian, are the ocular pain, translated by the blepharospasm, photofobia, 

epiphora, ocular discharge. 3.  The majority of   keratopathies develop one or more of   the  following  local  signs:  corneal 

edema, vascularisation, pigmentation, cellular  infiltrates, accumulation of   lipid or mineral 

material in the stroma and corneal fibrosis, with scar formation. 

4.  Clinically,  the  loss  of   corneal  transparency  is  translated by  corneal  edema, when water accumulates in the corneal stroma. Edema can be diffuse or localised. 

5. 

Corneal  vascularization  is  always  pathological. Blood  vessels  can  be  superficial,  deep  or 

both. It has caracteristic aspects, indicating the depth of  the initial lesion. 

6.  Corneal melanosis  is not a diagnosis, but a  sign of   chronic  irritation. Although  it doesn’t 

require  a  treatment,  we  must  determine  the  cause  of   irritation,  to  prevent  further 

extension of  pigmentation. 

CHUVA‐ENVA CHUVA‐ENVA 

34

Page 37: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 37/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

7. 

Lipid or calcium can accumulate in the superficial part of  the stroma, without affecting the 

corneal epithelium. 

8.  Corneal  fibrosis appears as a  consequence of   the  stromal  repair process, when collagen fibrils don’t order themselves in a parrallel manner, thus interfering with light transmission. 

Corneal scars are called: nubecula, macula, albugo and leukoma (simple or adherent, with 

iris participation). 

REFFERENCES 

1. Burtan I., 2000  – Chirurgie veterinar ă regional ă, ed. Ion Ionescu de la Brad, Iaşi; 

2. Cernea P., Dumitrache L., 1986  – Fiziologie ocular ă, ed. Medicală, Bucureşti; 3. Cotea C., 2003  – Histologie special ă, ed. Tehnopress, Iaşi; 4. Ionaşcu Iuliana, Miclăuş I., 2009  – Oftalmologie veterinar ă din Tratat de Medicină Veterinară, vol. V., 

coordonator Constantin N., ed. Tehnică, Bucureşti; 

5. Maggs D.J., Miller  P.E., Ofri  R.,  2008  –  Slatter’s  Fundamentals  of   Veterinary  Ophthalmology,  4th 

edition, ed. Saunders Elsevier, Missouri; 

35

Page 38: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 38/206

 

PATHOLOGICAL EFFECTS AND TISSUE DISTRIBUTION OF 

MICROCYSTIN‐LR (MC‐LR) AFTER 48 HOURS NON INVASIVE 

EXPOSITION OF NEWLY HATCHED MEDAKA 

(ORYZIAS 

LATIPES) ELEUTHERO

‐EMBRYOS

 

Hélène Huet 1, Delphine Franko 

2, Chakib Djediat 

2, 

Eva Perez2, François Crespeau

1 , Amaury de Luze

1 Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort (France) 

2 Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris (France) 

Abstract 

Medaka  fishes  eulethero‐embryos were  submitted  at  48 hours period of   immersion  in MC‐LR 

containing media at 1, 5, 10, 15 and 20 µg/ml concentration. Significant mortality (>10%) is only 

observed for higher MCLR concentration (20µg/ml) in medium. 

Microscopic pathological effects after 48 hours  immersion  in MC‐LR solution were searched on 

transverse  sections  of   paraffin  embedded  embryos  fixed  in  formaldehyde.  Histopathologic 

studies of  paraffin embedded embryos shows, from 10 µg/ml MC‐LR concentration, with variable 

intensity, vacuolization of  enterocytes and hepatocytes, degenerative and necrotic changes. 

On same material, immuno‐labeling with specific monoclonal antibodies against MC‐LR was also 

performed and appeared  constantly and strongly positive  in  intestine  (enterocytes and  lamina 

propria),  liver  (hepatocytes  and  probably  macrophagic  cells  along  sinusoids  border).  A  faint 

labeling was  also  characterized  in  kidneys  epithelial  cells,  pancreas  and  yolk  vesicle  epithelial 

border. No  labeling was observed  in skin, gills, oral epithelium, esophagus and  stomach, heart 

and vascular system, muscles, nervous central system… 

Ultramicroscopic  pathological  effects  after  48  hours  immersion  in  MCLR  solution  were  also 

searched on ultrathin  sections of   embryos  fixed  in paraformaldehyde and embedded  in  resin. From 10 µg/ml MC‐LR concentration, transmission electronic microscopy clearly shows disruption 

of   intercellular   junctions  in  enterocytes  and  hepatocytes,  some  cytoplasmic  vacuolation  of  

enterocytes, alteration of  hepatocytes membrane with regression of  microvillous cell border with 

reduction of  Disse space length and abnormal biliary canaliculi border. 

INTRODUCTION 

Microcystins  (MCs)  are  a  family  of   hepatotoxic  cyclic  heptapeptides  comprising  at  least  80 

variants and congeners. All toxic microcystin variants contain a unique hydrophobic amino acid 

3‐amino‐9‐methoxy‐10‐phenyl‐2,6,8‐trimethyl‐deca‐4(E)‐dienoic  acid  (ADDA)  (kongsuwan  et 

al., 1988). The prototype compound  is MC‐LR, which have Leucine (L) and arginine (R) at the 

two  hypervariable  positions  in  the  ring  structure  (Rinehart  et  al.,  1988;  Carmichael,  1992). 

These toxins are produced by a wide variety of  planktonic cyanobacteria, which are one of  the 

most primitive and worldwide distributed  families of  photosynthetic organisms (Brock, 1973, 

Ueno et al., 1998). 

MCs  represent potential environmental  fresh water  toxins, mainly when  climatic  conditions 

promote blooms of  cyanobacteria in pools, pond or lakes. 

The primary toxic effect of  microcystins  is inhibitory reversible binding at the catalytic site of  

protein  phosphatases  1  and  2A.  This  interaction  involved  principally  the  ADDA  group.  The 

presence of  the methyl‐dehydro‐alanine (Mdha) inducted an irreversible inhibition by covalent 

linkage  to  the cystein  sulphur on  the phosphatases PP1 and PP2A  (MacKintosh et al., 1995; Runnegar et al., 1995). Direct  injection of  MCLR  in mammals  induced protein phosphatases 

36

Page 39: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 39/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

inhibition, hyperphosphorylation of  membrane cellular proteins  including  the hepatocellular 

cytoskeleton and  loss of  cell‐cell contacts  in  intrahepatic necrosis and hemorrhage. Death  is 

due to hypovolemic shock (Hooser et al., 2000, Beasley et al., 2000). After administration, MCs 

cellular  uptake  is  performed  via  specific  organic  anion  transport  proteins  (Runnegar  et  al., 

1991, 1995). MCs exhibit a predominantly hepatic organotropism, althought mesenteric and 

even dermal effects have been demonstrated. 

In  fish  as  in  mammals,  gavage,  intraperitoneal,  intravascular  or  intravitellin  injection  of  

purified MC‐LR are all  invasive approaches corresponding  to acute exposure and  lethal toxic 

effects  (Phillips  et  al.,  1985,  Raberg  et  al.,  1991,  Tencalla  et  al.,  1994,  Bury  et  al.,  1997). 

However there are few indications of  whether and how fish are sensitive to purified MC‐LR by 

in vivo immersion (Oberemm et al., 1999). 

Our studies were designed  in view to develop a rapid sub‐lethal bioassay allowing not only a 

general assessment on uptake and tissue distribution of  MC‐LR, but also  indicating potential 

whole  body  external MC‐LR‐induced  developmental  abnormalities.  Thus,  our  experimental 

studies was mainly realized  in view to set up a  low cost, sensitive and reproducible bioassay 

with some degree of  the certainty on the absorption, distribution and effects of  MC‐LR in fish after natural exposure. In these animals, the less invasive experimental approach to study MC‐

LR  effects  is  after  natural  immersion  and  the  duration  of   our  experimental  procedure 

correspond to a short and acute exposure of  two days. 

Medaka  fish  eleuthero‐embryos  (Balon,  1975)  could  be  contaminated  by  MC‐LR  only  via 

environmental water  intake or by absorption of  the purified toxin by skin or gills.  Immersion 

also  represents  the most  current way  of   exposure  among  human  and  animal  populations 

having contact with cyanobacterial contaminated water (Funari and Testai, 2008). 

MATERIAL AND METHODS 

Products 

According  to  the  recommendation  of   the manufacturer  ( Alexis,  Switzerland ),  dissolution  of  

purified MC‐LR  in water  is  always  incomplete;  in  absolute  ethanol  dissolution  of  MC‐LR  is 

complete. A mixed procedure was used in our study: MC‐LR was first dissolved in four volume 

absolute ethanol, followed by addition of  1 volume of  water. Ethanol was totally evaporated in 

a  speedvac  (37°C) during 4 hours and  the mixture  completed with water at  the end of   the 

procedure  to  a  final  concentration  of   0.2  µg/ml  (stock  solution).  A  control  solvent  stock 

solution was performed using the same procedure. 

Medaka 

breeding 

and 

experimental 

procedure 

Medaka (Oryzias latipes) progenitors of  the inbred cab strain were kept in 8‐L glass aquaria at 

26‐28°C under artificial  reproductive cycle  (14h  Light‐10h Dark cycle). Fertilized egg clusters 

were carefully removed from the  female progenitors and 100‐200 post‐fertilized (pf) eggs of  

medaka  fishes were  collected  and  gathered  in  Petri  dishes  containing  Yamamoto’s  embryo 

rearing medium  (Yamamoto, 1975). The embryos were maintained  in an  incubator  (XBR125, 

France  Etuve) at 25°C with  a photoperiod  (L:12h‐D:12h).  The  rearing medium was  changed 

every day until the hatching period, beginning at the tenth day. 

Eleuthero‐embryo exposures and assessment 

All  embryos  hatching  during  the  24  hours  interval  of   the  tenth  and  eleventh  day  post 

fertilization were termed J0 embryo and used for experimental purpose in our acute eleuthero 

fish embryo test. During this interval of  time and under our rearing condition, the percentage 

37

Page 40: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 40/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

of  hatched embryos  represented approximately 60%  (45  to 75%) of   the collected eggs. The 

vesiculated eleuthero‐embryos were transferred in 12 wells microplates (5 eleuthero‐embryos 

in  2ml medium/well). Negative  controls  and MCLR media were not  changed  during  the  48 

hours experimental procedure. The vesiculated fish larvae being fully autotrophic, no food was 

given during  the  time  course of   the 48h experimental period. Non‐invasive observations of  

eleuthero‐embryos  behavior  were  performed  and  eleuthero‐embryos  were  handled  in 

accordance  with  European  Union  regulations  concerning  the  protection  of   experimental 

animals. 

Histopathology process 

At the end of  the  immersion experiment, surviving hatched embryos treated or not (control) 

with MC‐LR were  fixed  in buffered  formaldehyde solution 10%  (v/v)  for 24h. Fixed embryos 

were then clarified and dehydrated in successive baths of  ethanol (70% and 95%) and butanol, 

and finally transferred into baths of  liquid paraffin at 56°C. They were individually oriented and 

embedded into blocks of  paraffin wax. Transverse sections (3,5µm thickness) were hydrated in 

successive baths of  ethanol (100% and 95%) and routinely stained with Hematoxyline‐Eosine‐Saffron (HES, Sigma‐Aldrich, France). Microphotograph observations of  histological transverse 

sections were carried out with an Axio‐Imager Z1 Zeiss microscope at various magnifications. 

The all embryo being cut, an constant anatomical level was chosen in the pectoral fin region to 

perform observations on intestine and liver. 

Immunohistochemistry process 

Sections of  paraffin‐embedded tissues were deparaffined in toluene and hydrated gradually in 

ethanol  (100%  and 95%), washed  in distilled water  and  then  in 10mM phosphate buffered 

saline (PBS, Sigma‐Aldrich, France). Tissue sections were microwaved  in 10mM citrate buffer, 

pH  6.0  for  30min  (350w  microwave  oven).  Two  different  primary  anti‐MCLR  monoclonal antibodies  ( Alexis  Biochemicals,  Switzerland )  were  tested:  AD4G2  which  recognizes  all 

microcystins  because  of   its  Adda  specification  and  MC10E7  which  recognizes  all  4‐Arg 

microcystins.  The  immunoassay was  routinely  performed with  the NexES  system  (Ventana, 

Tucson, USA). As positive control, we choose an adult medaka fish liver, which proceeded from 

a  gavage  experiment  with  MCLR  (Mezhoud  and  al,  2008),  and  tissue  sections  proceeded 

without primary antibody were chosen as negative control. 

Transmission electron microscopy 

Embryos  were  preserved  in  0.5%  glutaraldehyde  in  2%  paraformaldehyde  solution  for 

transmission  electron microscopy  study  during  24  hours  and  then, washed  three  times  in Sorensen phosphate buffer  (0.1M, pH 7.4)  in  three  successive 10min baths;  finally embryos 

were dehydrated in ethanol (50°, 70°, 90° and 100°) by three baths at each step of  dehydration 

and the embedded in a epoxy mixture (Spur). Medium and ultrathin sections were sliced with 

diamond knives  (Diatome) on a Reichert‐Jung Ultracut microtome. Ultrathin sections on grid 

were  then  observed by  transmission  electronic microscope  (Hitachi H  700S) with  a  camera 

(LCD, Hamamatsu) at various magnifications. 

38

Page 41: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 41/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

RESULTS 

1) Pathological effects of  MCLR in eleuthero‐embryos medaka after 48 hours toxic exposure 

by immersion 

The  intestine wall  of   control  eleuthero‐embryo medaka  fish  is  organized  in  folds  lined  by 

simple  columnar  epithelium  composed  of   enterocytes  and  not  associated with  any  kind  of  

mucosal or submucosal glands; MC‐LR treatment appears to  induce a slight reduction of  the 

intestinal folds associated with a moderate enlargement of  the  intestinal  lumen and variable 

degree of  vacuolization of  enterocytes with,  sometimes,  focal  cleavage between epithelium 

and lamina 

 propria. 

In  liver,  the  normally  dense  network  of   hepatocytes  and  vascular  sinuses  is  observed  in 

control.  In  treated  embryos,  degenerative  more  or  less  megalocytic  hepatocytes  with 

sometimes anisocytosis, anisocaryosis and nucleus pycnosis are clearly observed; furthermore 

some necrotic hepatocytes are also apparent in 20µg MC‐LR/ml treated embryos. 

In  some  embryos,  vacuolization  of   kidney  epithelial  is  sometimes  observed.  Another 

happening modification concerns yolk vesicle  seeming  to have  late  regression without clear lesions of  syncytial epithelial cells at photonic microscopic observation level. 

No significant  lesions are observed  in other tissues or organs: skin, gills, oral and esophagus 

mucous membrane, nervous system  tissue, muscle, spleen, cardiovascular system, pancreas, 

esophagus… 

1) 

Immuno‐localization of  MCLR 

Using MCLR specific antibodies as described supra, a strong labeling is observed at 48 hours in 

eleuthero‐embryos treated by MCLR in intestinal mucous membrane (enterocytes and lamina 

propria)  and  liver  (hepatocytes  and  probably  sinusoidal  border  associated  macrophages). 

Labeling  is  more  intense  in  20µg  than  in  10µg  MCLR/ml  treated  embryos.  No  labeling  is observed  in  other  organic  structures  (nervous  tissue,  other  mucous  membranes,  spleen, 

muscle, skin and gills, cardiovascular organs….) but in yolk vesicle epithelial membrane where 

very light labeling is sometimes observed. 

2) 

Ultra structural observation 

Ultrastructural  analysis  performed  on  surviving  eleuthero‐embryos  indicated  in  enterocytes 

and hepatocytes of  treated animals, a complex set of  changes on cytoskeletal structures with 

no  clear  changes  of   nuclear  chromatin,  Golgi  apparatus  or  mitochondria.  In  the  liver, 

endothelial cells appeared normal but a  reduction of   length of  Disse's space was noticed  in 

treated  fishes,  due  to  reduction  of   the microvillus  border  of   hepatocyte  vascular  faces.  A reduction of  microvillus hepatocyte border was also noticed at the biliary surface of  these cells 

(in  biliary  canaliculi).  Disjunction  between  hepatocytes  was  also  observed  and  some 

vacuolization  of   the  cytoplasm.  In  enterocytes,  a  clear  dissociation  of   the  apical   junction 

complex was noticed, associated to vacuolization of  the cytoplasm. 

39

Page 42: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 42/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

DISCUSSION 

Immersion  in elevated MC‐LR concentrations had apparently no significant external effect  in 

fish  and  amphibian,  in  contrast  to  the  lethal  observations  performed  after  intra‐peritoneal 

injection  and oral  application  (gavage) of  MC‐LR  (Phillips et  al., 1995,  Tencella et  al., 1994, 

Oberemm, 1999). 

However,  in  fish eleuthero‐embryos species  transferred  in  toxin‐free media after embryonic 

development  and  hatching pre‐exposure  to MCs, usually malformations, embryonic  growth 

inhibition and hepatocellular toxicity occurred (Zhang et al., 2008, El Ghazali et al., 2009) with 

apparently weak desire for food (Zhang et bal., 2008). 

Medaka fish at the eleuthero‐embryo stage are fully autotroph during the first four days after 

hatching.  In  our  experience,  these  vesiculated  larvae  expressed  no  significant  external  and 

histopathological effects when exposed by immersion during 48 hours in medium containing 1 

to 10 µg MC‐LR/ml. 

Significant mortality  (>10%)  during  the  experimental  period  (48  hours) was  only  observed when vesiculated embryos were immersed at the highest concentration of  MC‐LR (20µg/ml). 

Our observation agrees Oberemm et al. data (1999) who did not observed any effect of  MCLR 

at concentration as high than 0.1, 1 and 5 µg/ml in zebrafish eleuthero‐embryos (Danio rerio) 

after 48 hours exposure. However, the same embryos showed, at the dose of  10µg MCLR/ml, 

pectoral edema and enlarged and opaque yolk after 24 hours exposure. Similarly, no effect on 

morphological development or  survival during 10 days exposure were noticed during  larval 

development (tailbud stage) in the toad (Bufo 

arenarum) at concentrations of  1‐20mg MC‐LR 

/l (Chernoff  et al., 2002). Nevertheless, one study showed during embryonic and larval stages 

of   loach  (Misgursuns 

mizolepis)  a  very  high  sensitivity  to  MC‐LR  exposure,  resulting  in 

pericardial edema and  tubular heart, bradycardia, poor yolk absorption,  small head,  curved body and tail, and abnormal hatching. Heart and liver were found to be primary targets of  MC‐

LR in this later study (Liu et al., 2002). Therefore, the loach (Misguruns mizolepsis) appears the 

most sensitive fish species tested. 

In  our  medaka  eleuthero‐embryos  toxic  test,  using  available  commercially  monoclonal 

antibodies,  we  could  clearly  immunolocalize MC‐LR, mainly  in  intestine  and  liver whereas 

some faint localization of  MC‐LR was also detected in pancreas, kidney and yolk vesicle. 

At  histological  examination  (paraffin  embedded  tissue  with  trichromic  stain),  lesions  of  

enterocytes and hepatocytes were clearly detected; mainly vacuolization but also variation of  

size  cells  with  anisocytosis  and  anisocaryosis  and  necrotic  changes  with  pycnosis  in 

hepatocytes.  At  ultrastructural  level,  one  of   the main  observed  effects  of  MC‐LR  was  the rupture  of   the  junction  systems  on  the  latero‐apical  side  of   the  enterocytes  and  between 

hepatocytes; these observations are in good agreement with Wang’s publication (Wang et al., 

2005) describing loss of  blastomere coherence by interfering the distributions of  β‐catenin and 

cadherines in zebrafish embryo after MC‐LR microinjection. 

During our 48 hours  toxic assay,  immunolocalization of  MC‐LR  could be obtained mainly  in 

intestine and  liver,  likely  indicating uptake and binding of  MC‐LR by enterocytes and transfer 

and bioaccumulation into the liver (hepatocytes and probably local macrophages). 

MCLR was also labeled with lighter intensity in pancreas and kidneys epithelial cells. 

In contrast, oral, esophagus and stomach mucosa did not show any sign of  MC‐LR fixation or 

accumulation. No other labeling was observed in skin, gills, heart and vascular system, central 

nervous tissue or muscle. Furthermore, no rupture of   intercellular  junction complex or other 

significant lesions were observed in these organs and tissues. 

40

Page 43: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 43/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Nevertheless, we  are  interested  in  tracing MC‐LR  in  epithelial  syncytia  cells  of   yolk  vesicle 

(data not shown) and some further studies are required during the early time of  immersion to 

precise the toxico‐dynamic of  MCLR uptake. 

Normal  liver  tissue  in  fish  is  organized  in  a  tubulo‐sinusoidal  pattern  and  differs  from  the 

lobular  pattern  characteristic  of   mammalian  liver.  Medaka  liver  consists  of   sheet‐like 

arrangements of  parenchymal cells with  interlacing sinusoids and  few bile ducts and caniculi 

(Hinton  and Couch, 1998; Boorman et  al., 1997). The  fenestrated endothelium of   sinusoids 

acts as a sieve, preventing passage of  blood cells in the Disse’s space, but allowing some blood 

proteins and  small  lipoproteins  to pass  through.  Indeed, microvilli of  hepatocyte membrane 

increase the exchange surface of  these cells along the Disse’s space border and also along the 

bile  canaliculi  border. Ultrathin  sections  observations  using microscopy  approach  indicated 

that  medaka  fish  embryos  exposed  to  10  or  20µg MC‐LR/ml  showed  a  clear  reduction  of  

membrane hepatocyte microvilli on  the Disse’s  space  and on  the biliary  canaliculi  surfaces. 

These  clear  ultrastructure  changes  certainly  results  in  a  reduced  exchange  efficiency  in 

hepatocyte of  MC‐LR‐treated medaka eleuthero‐embryos. Microcystin is known to cause liver 

damages in fish (Philipps et al., 1985, Rabergh et al., 1991, Tencalla and Dietrich, 1997) and to affect the bile acid transport system  involved  in MC‐LR transport  in hepatocyte (Runnegar et 

al., 1995). 

Controversial  data  are  found  depending  of   the  species  in  the  literature  concerning  the 

bioaccumulation of  MC in the liver following gill membrane absorption of  MC (Casenave et al., 

2005,  Xie  et  al.,  2005)  whereas  others  studies  suggest  that  epithelia  of   gills  and  skin  of  

freshwater  fish  form  a  barrier  to MC  transport  (Tencalla et  al.,  1994, Bury  et  al.,  1995).  In 

contrast to others studies (Gaete et al., 1994, Bury et al., 1995, Zambrano and Canelo, 1996) 

no  gills  damaging  was  observed  in  our  study  whatever  was MC‐LR  concentrations  of   the 

medium. 

Finally,  histopathological  and  immuno‐histopathological  studies  permit  to  have  better comprehension  of   MCs  toxicity  and  better  knowledge  about  ways  of   penetration,  tissue 

repartition and pathological effect of  this important class of  natural environmental toxins. 

Bibliography 

1.  Azevedo  SM,  Carmichael WW,  Jochimsen  EM,  Rinehart  KL,  Lau  S,  Shaw  GR,  Eaglesham  GK 

(2002). Human  intoxication by microcystins during  renal dialysis  treatment  in Caruaru‐Brazil. 

Toxicology . 181‐182:441‐6. 

2.  Balon, E. K. J Fish Res Board Canad 1975, 32, 1663  1670 

3. 

Beasley VR, Lovell RA, Holmes KR, Walcott HE, Schaeffer DJ, Hoffmann WE, Carmichael WW. 

2000.  MCLR  decreases  hepatic  and  renal  perfusion,  and  causes  circulatory  shock,  severe hypoglycemia,  and  terminal  hyperkalemia  in  intravascularly  dosed  swine.   J  Toxicol   Environ 

Health  A. 61(4):281‐303 

4. 

Brock TD. 1973. Lower pH limit for the existence of  blue‐green algae: evolutionary and 

5.  ecological implications. Science. 179(72):480‐3. 

6. Bury, N. R.; McGeer, J. C.; Eddy, F. B.; Codd, G. A. J Fish  Diseases 1997, 20, 209  215. 

7. Carbis, CR, Rawlin, GT, Grant, P, Mitchell, GF, Anderson, JW, McCauley, I (1997) A study of  feral 

carp,  Cyprinus  carpio  L.,  exposed  to Microcystis  aeruginosaat  Lake Mokoan,  Australia,  and 

possible implications for fish health. JFish Dis 20: 81‐91 

8.  Carmichael  WW.  1992.  Cyanobacteria  secondary  metabolites—the  cyanotoxins.   J   Appl  

Bacteriol . 72: 445–59 

9. 

Carmichael WW, Azevedo SM, An  JS, Molica RJ,  Jochimsen EM, Lau S, Rinehart KL, Shaw GR, Eaglesham GK. 2001. Human  fatalities  from  cyanobacteria: Chemical and biological evidence 

for cyanotoxins. Environ Health Perspect. 109:663‐68 

41

Page 44: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 44/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

10.  Chernoff  N, Hunter ES 3rd, Hall LL, Rosen MB, Brownie CF, Malarkey D, Marr M, 

11.  Herkovits J. 2002. Lack of  teratogenicity of  microcystin‐LR in the mouse and 

12.  toad.  J  Appl  Toxicol. 22(1):13‐7 

13.  Donnan GA, Fisher M, Macleod M, Davis SM (2008). "Stroke". Lancet  371 (9624): 1612–23. 

14.  Funari E, Testai E.  (2008) Human health risk assessment related to cyanotoxins exposure. Crit 

Rev Toxicol.. :38(2):97‐125 15.  Hindman SH, Favero MS, Carson LA, Petersen NJ, Schonberger LB, Solano JT. 1975. Pyrogenic 

reactions during haemodialysis caused by extramural endotoxin. Lancet . 2: 732–34 

16.  Hooser  SB.  2000.  Fulminant  hepatocyte  apoptosis  in  vivo  following  microcystin‐LR 

administration to rats. Toxicol  

Pathol . 28(5):726‐33 

17.  Kungsuwan  A,  Noguchi  T,  Matsunaga  S,  Watanabe  MF,  Watabe  S,  Hashimoto  K.  (1988) 

Properties  of   two  toxins  isolated  from  the  blue‐green  alga  Microcystis  aeruginosa.  Toxicon. 

26(2):119‐25. 

18.  Liu Y, Song L, Li X, Liu T. 2002. The toxic effects of  microcystin‐LR on embryo‐larval and  juvenile 

development of  loach, Misguruns mizolepis Gunthe. Toxicon. 40(4):395‐9 

19.  Magalhães VF,  Soares RM, Azevedo  SM.  (2001)‐ Microcystin  contamination  in  fish  from  the 

Jacarepaguá  Lagoon  (Rio  de  Janeiro,  Brazil):  ecological  implication  and  human  health  risk. 

Toxicon, 39(7):1077‐85 

20.  MacKintosh  RW,  Dalby  KN,  Campbell  DG,  Cohen  PT,  Cohen  P,  MacKintosh  C.  1995.  The 

cyanobacterial  toxin microcystin binds  covalently  to  cysteine‐273 on protein phosphatase  1. 

FEBS Lett . 371(3):236‐40. 

21.  Mezhoud K, Bauchet AL, Château‐Joubert S, Praseuth D, Marie A, François JC, Fontaine JJ, Jaeg 

JP, Cravedi  JP, Puiseux‐Dao S, Edery M.  (2008)‐ Proteomic and phosphoproteomic analysis of  

cellular responses  in medaka  fish  (Oryzias  latipes)  following oral gavage with microcystin‐LR  . 

Toxicon.;51(8):1431‐9 

22.  Mezhoud  K,  Praseuth  D,  Puiseux‐Dao  S,  François  JC,  Bernard  C,  Edery  M.  (2008)‐ Global 

quantitative  analysis  of   protein  expression  and  phosphorylation  status  in  the  liver  of   the 

medaka  fish  (Oryzias  latipes)  exposed  to microcystin‐LR  I.  Balneation  study.  Aquat  Toxicol.; 

86(2):166‐75. 23.  Mezhoud K, Praseuth D, Francois JC, Bernard C, Edery M. (2008)Global quantitative analysis of  

protein phosphorylation status in fish exposed to microcystin.  Adv Exp Med Biol; 617:419‐26 

24.  Phillips, M. J.; Roberts, R. J.; Stewart, J. A.; Codd, G. A. J. Fish Diseases 1985, 8, 339  344. 

25. 

Rabergh, C. M. I.; Bylund, G.; Eriksson, J. E. Aquat Toxicol  ̊1991, 20, 131‐146 

26.  Rinehart  KL,  Harada  K‐I,  Namikoshi M,  Chen  G,  Harvis  C, Munro MHG,  Blunt  JW, Mulligan 

PE,Beasley  VR,  Dahlem  AM,  Carmichael  WW.  1988.  Nodularin,  microcystin  and  the 

configuration of  ADDA.  J  Am Chem Soc 110:8557‐58 

27.  Runnegar M,  Berndt N,  Kong  SM,  Lee  EY,  Zhang  L.  (1995a).  In  vivo  and  in  vitro  binding  of  

microcystin to protein phosphatases 1 and 2A. Biochem Biophys Res Commun. 216(1):162‐9 

28.  M.T. Runnegar, R.G. Gerdes and  I.R. Falconer, The uptake of   the  cyanobacterial hepatotoxin 

microcystin by isolated rat hepatocytes, Toxicon 29 (1991), pp. 43–51. 29.  M. Runnegar, N. Berndt and N. Kaplowitz, (1995b) Microcystin uptake and inhibition of  protein 

phosphatases:  effects  of   chemoprotectants  and  self ‐inhibition  in  relation  to  known  hepatic 

transporters, Toxicology  and   Applied  Pharmacology  134 (1995), pp. 264–272 

30.  Soares  RM,  Yuan M,  Servaites  JC,  Delgado  A, Magalhães  VF,  Hilborn  ED,  Carmichael WW, 

Azevedo SM (2006). Sublethal exposure from microcystins to renal insufficiency patients in Rio 

de Janeiro, Brazil. Environ Toxicol. 21(2):95‐103 

31.  Tencalla, F. G., Dietrich, D. R. and Schlatter, C. (1994) Toxicity of  Microc~stis aeruginosa peptide 

toxin to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss).  Aquatic toxic. 30, 215‐224. 

32.  Tencalla,  F.  and  Dietrich,  D.,  1997.  Biochemical  characterization  of   microcystin  toxicity  in 

rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Toxicon 35, pp. 583–595. 

33.  Ueno Y, Nagata S, Suttajit M, Mebs D and Visconcelos V.1998. Immunochemical survey 

34. 

of  microcystins in environmental water in various countries. Eds.M Miragala, H van Egmond, C 

Brera and J Gilbert.  In. Mycotoxins and  Phycotoxinsdevelopments  in chemistry, toxicology  and  

42

Page 45: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 45/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 food  safety . Alaken Inc. Fort Collins, Colorado. 

35.  Watanabe MF, Oishi S. 1985 Effects of  environmental factors on toxicity of  a 

36.  cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.  App Environ 

37.  Microbiol . 49: 1342‐44 

38.  Wiegand, C., Pflugmacher,  S., Oberemm, A., Meems, N., Beattie, K.A.,  Steinberg, C.E.W. and 

Codd, G.A., 1999. Uptake and effects of  microcystin‐LR on detoxication enzymes of  early  life stages of  zebrafish (Danio rerio). Environ. 

43

Page 46: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 46/206

 PREVALENCE OF CRYPTOSPORIDIUM  SPP. AND OTHER 

ENTEROPATHOGENS INFECTIONS AT CALVES IN WESTERN, 

CENTRAL AND NORTH‐WESTERN ROMANIA Gh. DĂRĂBUŞ1, V. COZMA2, K. IMRE1, A. BEJAN2, M.S.ILIE1, MIRELA IMRE1 

1  – Faculty of  Veterinary Medicine Timişoara, Calea Aradului, nr. 119 

2 ‐ Faculty of  Veterinary Medicine Cluj‐Napoca, Calea Mănăştur, nr. 3‐5 

e‐mail: [email protected] 

Summary: The aim of  the research was to reveal  the most   important  enteropathogen agents  in 

calves  in the  first  months of  life and  to establish their   prevalence in Western, Central  and  North‐

Western Romania. The  study  was carried  out  on 370 calves, with or  without  diarrhea,  in  seven 

Counties. 

Based   on  the  copro‐ELISA  test,  infections  with  Cryptosporidium  (41.4%),  rotavirus  (16.2%), 

coronavirus  (10.3%) and  Escherichia  coli  F5 (K99) enteropathogen  (1.08%), were  identified. The 

most  common association was semnalated  between Cryptosporidium spp. and  coronavirus (5.9%) 

 followed  by  Cryptosporidium spp. ‐ rotavirus (5.4%) mixed  infection. 

Higher    prevalence  observed   in  monoinfections  (38.4%)  compared   with  associated   infections 

(14.3%), may  suggest  a  possible competition  for  the same biotope. 

Key words: Cryptosporidium spp; rotavirus; coronavirus; Escherichia coli  F5. 

Discovered  in  1907  by  Tyzzer  in  the  gastric  glands  of   mice,  protozoans  to  the  genus 

Cryptosporidium are present in many domestic animals, humans and other vertebrates, having 

large  host  specificity.  In  the  last  decades,  given  the  pathological  and  zoonotic  implications, interest  in  studying  this  parasite  has  increased  enormously,  many  knowledge  being 

accumulated on biology, epidemiology, diagnosis and  control  of  this parasitosis  (3, 4,  10, 11, 

12, 17, 18, 19, 31). 

In  mammals,  especially  in  calves,  in  uncomplicated  infections  with  microbial  agents, 

cryptosporidiosis causes an increased morbidity but generally, low mortality. Calves, especially 

during the first month of  life, are most frequently affected by Cryptosporidium, which is one of  

the major enteropathogens involved in neonatal diarrhea. Infection with Cryptosporidium spp. 

is often associated with coronavirus, rotavirus and Escherichia coli  F5 (K99) (1, 8, 9, 13, 14, 27, 

30). 

As the diarrheal disease syndrome in calves is very important, conventional diagnosis methods were  improved  with  immunological  methods,  for  detection  of   oocysts  and  other 

enteropathogens in faeces (22, 28). The sensitivity and specificity of  immunological methods is 

undoubtedly (21, 22, 26). 

The  aim  of   this  study  was  to  determine  the  prevalence  of   cryptosporidiosis  and  other 

infections with three enteropathogen agents,  in calves,  in  the  first  month of   life, using ELISA 

test in Western, Central and North ‐ Western Romania. 

MATERIALS AND METHODS 

The study was carried out in Western, Central and North‐Western Romania in seven Counties (Arad, Bihor, Caraş‐Severin, Timiş, Cluj, Mureş and Satu Mare). A number of  370 calves, aged 

44

Page 47: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 47/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

between  1‐30  days,  with  or  without  diarrhea,  were  examined  between  January  2008  and 

December  2009.  Faecal  samples  were  collected  directly  from  the  rectum  in  sterile  plastic 

bottles. Recipients were stored at 4°C and the samples were processed using a coproantigen‐

ELISA test within 24 hours. 

The ELISA kit used were: BioX Easy‐Digest (BIO K 151) and BioX Duo Digestive ELISA Kit (BIO K 

083) according to the manufacturer’s instructions. 

RESULTS AND DISCUSSIONS 

The prevalence of  infection with Cryptosporidium and other enteropathogens in calves, in the 

first month of  life, in investigated areas from Romania, are summarized in table 1. 

Table 1 

Infections with enteropathogens in calves, in the first months of  life, in Western, Central and 

North‐Western Romania 

Infection with 

Investigated areas

Total 

(n=370) Western Romania 

(n=315) 

Central and North‐

Western Romania 

(n=55) 

number of  positive samples (%) 

Cryptosporidium spp.  140 (44.4) 13 (23.6) 153 (41.4)

Rotavirus  52 (16.5) 8 (14.5) 60 (16.2)

Coronavirus  33 (10.5) 5 (10) 38 (10.3)

E. coli  F5 (K99)  4 (1.3)  0  4 (1.08) 

Negative  86 (27,3)  29 (52.7)  115 (31.08) 

Legend: n = number of  animals investigated. 

On the whole, the prevalence of  Cryptosporidium spp. infections was 41.4%. The investigations 

carried  out  in  Western  Romania  revealed  a  significant  higher  prevalence  (p<0,05)  for 

Cryptosporidium infection compared with Central and North‐Western Romania. 

Rotavirus  infections  were  located  in  the  second  place,  as  weight  (16.2%).  Infections  with 

coronavirus had a prevalence of  10.3% and E. coli  F5 (K99) was found in 1.08 percent. On the 

whole,  in  the  investigated  areas,  31.08%  from  the  processed  samples  were  negative  for  the 

enteropathogens tested. In the table 2 the prevalence of  Cryptosporidium spp. and other  enteropathogens, unique or 

associated/concurrent infections is presented. 

Overall, infections diagnosed (with Cryptosporidium, rotavirus, coronavirus and E. coli  F5 (K99) 

had  a  prevalence  of   52.7%.  Monoinfections  ordered  by  prevalence  were  Cryptosporidium 

(27.8%), rotavirus (8.4%), coronavirus (1.9%) and E. coli  F5 (K99) (0.3%). Cryptosporidium was 

found  in associated  infections  in a proportion relatively close, with rotavirus and coronavirus 

although prevalence was higher as a single pathogen. 

The aim of  the research was to find the most important intestinal pathogens from calves aged 

between one day and 30 days, and to determine their prevalence. 

It was concluded that, in Western, Central and North‐Western Romania, the calves aged up to 

one  month,  the  most  important  pathogen  is  Cryptosporidium  followed  by  rotavirus, 

coronavirus  and  E.  coli   F5 (K99).  The  prevalence  of   infection  with  Cryptosporidium  (41.4%) 

45

Page 48: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 48/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

found  in  calves  in  this  study  is  close  to  that  obtained  from  De  la  Fuente  et  al.  (1998b)  in 

Central  Spain  (52.3%)  which  also  made  epidemiological  investigations  in  young  cattle  in  the 

first month of   life. Similarly,  in Germany, Otto et al. (1995), found  in calves,  in the first three 

weeks of  life, a prevalence of  Cryptosporidium infection of  52.5%. 

Table 2 

Prevalence of  infection with enteropathogens in calves in the first months of  life in 

investigated areas of  Romania 

Infection(s) with  Positive samples (%) (n=370)

Cryptosporidium alone 103 (27.8) 

Rotavirus alone  31 (8.4) 

Coronavirus alone  7 (1.9) 

E. coli  F5 (K99) alone  1 (0.3) 

Cryptosporidium + Coronavirus  22 (5.9) 

Cryptosporidium + Rotavirus  20 (5.4) 

Cryptosporidium +E. coli  F5 (K99  2 (0.5) 

Coronavirus + Rotavirus  3 (0.8) 

Cryptosporidium + Rotavirus + Coronavirus 5 (1.3) 

Cryptosporidium + Rotavirus + Coronavirus

+E. coli  F5 (K99) 1 (0.3) 

Total  195 (52.7) 

Legend: n = number of  animals investigated 

The  second  enteropathogen  agent,  as  prevalence  (16.2%),  was  rotavirus.  It  is  however  less 

prevalent than reported by other authors  in  Israel (41.4%), Spain (42.7%),  Ireland (38.9%) (6, 

15,  16).  Values  close  to  those  reported  by  us  were  reported  by  Abraham  et  al.  (1992)  in 

Ethiopia (16.7%), Garcia et al. (2000) in Spain (20.4%) and Pérez et al (1997) in Costa Rica (7%). 

Coronavirus  infection  prevalence  in  calves  (10.3%)  found  in  the  investigated  areas  are 

comparable to that found by Akam et al. (2004) in Algeria (7.5%). 

Lower  prevalence  of  E.  coli   F5 (K99)  infection  found  in  our  study  may  be  a  consequence  of  

reduced  sensitivity  of   tetravalent  ELISA‐kit,  fact  reported  in  a  paper  by  de  Fuente  et  al. 

(1998a). 

Mixed  infections  were  found  in  14.3%  of   the  investigated  calves.  The  most  common 

association  observed  was  between  Cryptosporidium  and  coronaviruses  (5.9%)  followed  by 

Cryptosporidium  – coronavirus association (5.4%). This fact is in contradiction with the results 

published  in the majority of  studies worldwide, who sustained that the most common mixed 

infection is with Cryptosporidium and rotaviruses (6, 13, 16, 20). 

The  four  pathogen  agents  identified  by  ELISA,  evoluated  as  unique  infections  and  lass  as 

associated  infections.  This  may  suggest  a  competition  between  different  enteropathogen 

agents for the same biotope. 

CONCLUSIONS 

  The  epidemiological  screening  carried  out  using  ELISA  double‐sandwich  technique  at 

young  calves,  in  the  first  month  of   life,  from  Western,  Central  and  North‐Western  Romania 

revealed  a  prevalence  of   41.4%  for  cryptosporidiosis,  10.3  for  coronavirosis,  16.2%  for rotavirosis and 1.08% for enterotoxigen E. coli  F5 infection. 

46

Page 49: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 49/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

The  most  common  association  was  semnalated  between  Cryptosporidium  spp.  and 

coronavirus (5.9%) followed by Cryptosporidium  spp. ‐ rotavirus (5.4%) mixed infection. 

 

Higher  prevalence  observed  in  monoinfections  (38.4%)  compared  with  associated 

infections (14.3%), may suggest a possible competition for the same biotope. 

ACKNOWLEDGEMENTS 

The current research was based on grant (51‐034/2007 PN II  ‐ Parteneriate) obtained by Prof. 

Dărăbus from CNMP. 

REFERENCES 

1.  ABRAHAM,  G.,  ROEDER,  P.L.,  ROMAN,  ZEWDU,  1992.  Agents  associated  with  neonatal 

diarrhoea in Ethiopian dairy calves.  J. Trop.  Animal  Health and  Production., 24: 1573‐1589. 

2.  AKAM  A.,  KHELEF,  D.,  KAIDI  R.,  LAFRI,  M.,  RAHAL,  KH.,  CHIRILA,  F.,  COZMA  V.,  2004. 

Frequency of  Cryptosporidium  parvum, Escherichia coli  K99 and Salmonella spp.  isolated from calves in six breeding farms from Mitidja, Algeria, Bull. USAMV  Cluj  Napoca, Seria. Med  Vet . 61: 

287‐290. 

3.  AKIYOSHI, D.E., FENG, X., BUCKHOLT, M.A., WIDMER, G., TZIPORI, S., 2002. Genetic analysis of  

a Cryptosporidium  parvum human genotype 1 isolate passaged through different host species. 

Infect. Immun., 70: 5670‐5675. 

4.  AL‐BRIKAN, F.A., SALEM, H.S., BEECHING, N., HILAL, N.,  2008.  Multilocus  genetic  analysis  of  

Cryptosporidium isolates from Saudi Arabia.  J. of  Egyptian Society  of  Parasitol., 38: 645‐658. 

5.  ANGUS, K.W.,  1987.  Cryptosporidiosis  in  domestic  animals  and  humans.  In  Practice,  March., 

47‐49 

6.  BRENNER,  J.,  ELAD, D., MARKOVICS, A., GRINBERG, A.,  TRAININ,  Z.,  1993.  Epidemiological 

study of  neonatal calf  diarrhoea in Israel‐a one‐year survey of  faecal samples. Isr.  J. Vet. Med., 

48: 113‐116. 

7.  CHERMETTE,  R.,  BOUFASSA,  S.,  1988.  Cryptosporidiose:  une  maladie  animale  et  humaine 

cosmopolite, O.I.E., Série Technique, Nr. 5 

8.  CHINSANGARAM, J., SCHORE, C.E., GUTERBOCK, W., 1995. Prevalence of  group A and group B 

rotaviruses  in  the  feces  of   neonatal  dairy  calves  from  California.  Com.  Immunol. Microbiol. 

Infect. Dis., 18: 93–103. 

9.  CLARK, M.A., 1993. Bovine coronavirus. Br. Vet.  J., 149: 51–70. 

10. CURRENT, W.L., 1988. The biology of  Cryptosporidium.  A. S. M. News., 54: 605‐611. 

11. DĂRĂBUŞ, GH.,  1996.  Criptosporidioza:  cercetări  privind  etiologia,  epidemiologia,  patogenia, 

diagnosticul  şi tratamentul  în infecțiile naturale  şi experimentale. Teză de doctorat, Facultatea 

de Medicină Veterinară ‐Timişoara. 

12. 

DĂRĂBUŞ, GH., 1997. Criptosporidioza la om şi animale. Ed. Brumar , Timişoara. 13. DE  GRAAF,  C.D.,  VANOPDENBOSCH,   E.,  ORTEGA‐MORA,  L.M.,  ABBASSI,  H.,  PEETERS,  J.E., 

1999.  A  review  of   the  importance  of   cryptosporidiosis  in  farm  animals.  Int.  J. Parasitol .,  29: 

1269‐1287. 

14. DE LA FUENTE, R., GARCIA, A., RUIZ‐SANTA‐QUITERIA, J.A., LUZON, M., CID, D., GARCIA, S., ORDEN,  J.A., GOMEZ‐BAUTISTA, M., 1998. Proportional  morbidity  rates  of   enteropathogens 

among diarrheic dairy calves in central Spain. Prev. Vet. Med., 36: 145‐152. 

15. DE LA FUENTE, R., LUZON, M., RUIZ‐SANTA‐QUITERIA, J.A. GARCIA, A., CID, D., ORDEN, J.A., GARCIA, S., SANZ, R., GOMEZ‐BAUTISTA, M., 1998. Cryptosporidium and concurrent infections 

with other major enteropathogens in 1 to 30‐Zile‐old diarrheic dairy calves in central Spain. Vet. 

Parasitol ., 80: 179‐185. 

16. FAGAN,  J.G.,  DWYER,  P.J., QUINLAN,  J.G.,  1995.  Factors  that  may  affect  the  occurence  of  

enteropathogens in the faeces of  diarrhoeic calves in Ireland. Irish Vet.  J., 48: 17‐21. 

47

Page 50: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 50/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

17. FAYER, R.,  2008.  The  general  biology  of   Cryptosporidium,  p.  1‐41.  In  R.  Fayer,  L.  Xiao,  (ed), 

Cryptosporidium and cryptosporidiosis. CRC  Press, Inc., Boca Raton, Fla. 

18. FAYER, R., MORGAN, U., UPTON, S. J.,  2000.  Epidemiology  of  Cryptosporidium:  transmission, 

detection and identification. Int.  J. Parasitology., 30: 1305‐1322. 

19. FAYER, R., UNGAR, B.L.P.,  1986. Cryptosporidium  spp.  and  Cryptosporidiosis. Microbiol. Rev ., 

50: 458‐483. 20.

 GARCIA, A., RUIZ‐SANTA‐QUITERIA,  J.A., ORDEN,  J.A., CID, D., SANZ, R., GOMEZ‐BAUTISTA, M.,  FUENTE,  R.,  2000.  Rotavirus  and  concurrent  infections  with  other  enteropathogens  in 

neonatal diarrheic dairy calves  in Spain. Comp. Immun. Microbiology  &  inf. Diseases., 23: 175‐

183. 

21. GRACZYK,  T.K.,  CRANFIELD,  M.R.,  FAYER,  R.,  1996.  Evaluation  of   commercial  enzyme 

immunoassay  (EIA)  and  immunofluorescent  antibody  (IFA)  test  kits  for  detection  of  

Cryptosporidium  oocysts  of   species  other  than  Cryptosporidium  parvum.  Am.  J.  Trop. Med. 

Hyg., 54: 274‐279. 

22.  IMRE, K., DĂRĂBUŞ, GH.,  ILIE, M.S., MIRELA PALCA,  TAMASY  L.,  2008.  Evaluation  of   some 

diagnosis  methods  in  cryptosporidiosis.  Scientific Works  ‐ Veterinary  Medicine  C   Series.,  53: 

269‐276. 

23. 

IMRE, K., MATOS OLGA, DĂRĂBUŞ, GH., NARCISA MEDERLE, OPRESCU, I., MORARIU, S., ILIE, M., IONELA HOTEA, MIRELA IMRE, 2009. First genetic identification of  Cryptosporidium spp. in 

cattle in Romania. Lucr ări  Ştiinț ifice Medicină Veterinar ă , 52:26‐30. 

24. OTTO, V.P., ELSCHNER, M., GÜNTHNER, H., SCHULZE, F., 1995. Vergleichende Untersuchungen 

yum  nachweis  von  Rotaviren,  Coronaviren,  Kryptosporidien  und  enterotoxigen E.  coli   im  Kot 

durchfallkranker Kälber. Tierärztl  Umschau., 50: 80‐86. 

25. PÉREZ, E., KUMMELING, A., JANSSEN, M.M.H., JIMÉNEZ, C., ALVARADO, R., CABALLERO, M., DONADO, P., DWINGER, R.H.,  1997.  Infectious  agents  associated  with  diarrhoea  of   calves  in 

the canton of  Tilárán, Costa Rica. Prev. Vet. Med., 33: 195‐205. 

26. RODAK,  L.,  BABIUK,  L.A.,  ACRES,  S.D.,  1982.  Detection  by  radioimmunoassay  and 

enzymelinked  immunosorbent  assay  of   coronavirus  antibodies  in  bovine  serum  andlacteal 

secretions.  J Clin Microbiol., 16: 34–40. 27. SCHLAFER, D.H., SCOTT, F.W., 1979. Prevalence of  neutralizing antibody to the calf  rotavirus in 

New York cattle. Cornell. Vet ., 69: 262–71. 

28. SMITH, H.V.,  2007.  Diagnostics  p.  173‐203.  In  Fayer,  R.,  Xiao,  L.  (ed.),  Cryptosporidium  and 

cryptosporidiosis. Second Edition. CRC  Press and  IWA Publishing., Boca Raton, Fla. 

29. SNODGRASS, D.R., TERZOLO, H.R., SHERWOOD, D., CAMPBELL, I., MENZIES, J.D., SYNGE B.A., 1986. Aetiology of  diarrhoea in young calves. The Veter. Record ., 119: 31‐34. 

30. TORRES‐MEDINA, A., SCHLAFER, D.H., MEBUS, C.A., 1985. Rotaviral and coronaviral diarrhea. 

Vet. Clin. North.  Am. Food.  Anim. Pract ., 1:471–93. 

31. XIAO, L., FENG, Y., 2008. Zoonotic cryptosporidiosis. FEMS Immunology  and  Medical  Microbiol., 

52: 309‐323. 

48

Page 51: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 51/206

 

ASPECTS REGARDING VASCULOGENIC MIMICRY IN CANINE 

MAMMARY CANCER 

GAL A.F.1, CATOI C.

1, BABA AI

1, MICLAUS V.

2, BOLFA P.

1, 

TAULESCU M1, TABARAN F.

1, NAGY A.

1, MOUSSA R.

1, Cosmina CUC 

1Department of  Pathology, Necropsy and Forensic Medicine 

2Department of  Histology 

Faculty of  Veterinary Medicine Cluj‐Napoca, 3‐5 Mănăştur Street, Romania, 

[email protected]

Abstract:  This  article  describes  and  investigates  intratumor  angiogenesis  in  canine 

mammary  tumors,  respectively  the  presence  of   vasculogenic  mimicry  pattern  of  

angiogenesis in canine mammary cancer. Vasculogenic mimicry suppose the forming of  blood  flowing  channels  in  continuation  of   existing  vessels  especially  in  fast  growing 

tumors  with  extended  hypoxic  areas.  The  channels  are  lined  directly  by  tumoral  cells 

that  generate  a  PAS  positive  material  to  the  inner  part  of   the”vessel”.  Mammary 

tumors  had  been  provided  by  corps  or  tumor  biopsies  originated  from  different  dog 

breeds and age. Detection and monitoring of  intratumor angiogenesis and especially of  

blood  flowing  channels  was  evaluated  using  immunohistochemical  LSAB  reaction 

or/and  double  reaction,  respectively  immunohistochemical  and  PAS  reactions. 

Elaborated work analyzed eight canine mammary tumors, respectively one benign and 

seven malign tumors. The occurrence of  blood flowing channels was higher in vicinity of  

intratumor  necrotic  areas,  knowing  that  hypoxia  stimulate  angiogenesis.  Vasculogenic 

mimicry  was  notified  more  frequent  in  tumors  with  reduced  stroma  and  numerous 

cancerous  cells  (compact  mammary  cancer),  and  in  poorly  differentiated  canine 

mammary cancers. Some peculiarities of  some blood flowing channels was represented 

by discreet immunohistochemical reaction that often was restricted only to a region of  

vascular wall not to all vessel’s circumference. 

Key words: angiogenesis, immunohistochemistry, PAS reaction, vasculogenic mimicry. 

INTRODUCTION 

Vasculogenesis  is  a  complex  multistage  process  characterized  by  formation  of   new  vessels 

from preexisting ones (1, 5, 7). Angiogenesis  is essential for tumoral growing and metastasis, 

that’s  why  in  more  aggressive  tumors  the  angiogenesis  is  more  intense  due  to  increased 

demands  for  newly  formed  structure.  There  are  three  main  theories  regarding  intratumor 

angiogenesis, respectively (I) The theory of  multistage angiogenesis, (II) The theory of  cooption 

of  preexisting vessels by the tumor, and (III) The theory of  vasculogenic mimicry (1). 

Angiogenesis is a complex process that leads to generation of  new capillaries from preexisting 

vascular network (multistage angiogenesis), or by forming of  blood flowing channels delimited 

directly  by  tumoral  cells  (vasculogenic  mimicry).  Endothelial  cell  proliferation  is  30‐40  folds 

higher in tumor structure comparing from normal tissues. Multistage angiogenesis begin with 

degrading of  the basal membrane, followed by proliferation and migration of  endothelial cells outside from the vessel structure. These cells are organizing into a tubular structure that forms 

49

Page 52: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 52/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

some vascular buds originated in existing vessels. Finally, there it is formed a new blood vessel 

that  supply  a  territory  from  tumor.  Regarding  the  second  theory  of   angiogenesis,  the  tumor 

entity subdue preexisting vessels, especially that ones from the periphery of  tumor (1). 

The  vasculogenic  mimicry  pattern  of   angiogenesis  shows  the  plasticity  and  increased 

adaptability  of   tumoral  cells  to  some  injurious  conditions  such  as  hypoxia.  This  model  is 

characterized by  the  formation  of   some  PAS  positive  channels  lined directly  by  tumoral  cells 

not  by  endothelial  cells,  contributing  in  this  manner  to  intratumor  blood  flow.  Vasculogenic 

mimicry  was  firstly  described  in  uveal  melanoma,  malignant  astrocytoma,  breast  cancer, 

osteosarcoma, etc (21). 

There  are  many  reports  concerning  intratumor  angiogenesis  and  its  importance  in  cancer 

progression  and  development.  The  vasculogenic  mimicry  pattern  of   tumor  angiogenesis  was 

and  is an  interesting  idea that suggests the abilities of  tumoral cells to avoid necrosis  due to 

hypoxia.  Vasculogenic  mimicry  was  noticed  also  in  cell  cultures  originated  from  aggressive 

melanomas; the cells had the abilities to form PAS positive channels without endothelium (4). 

Furthermore,  some  studies  proved  that  presence  of   vasculogenic  mimicry  is  related  with 

unfavorable  prognosis.  Initially  was  thought  that  blood  flowing  channels  are  generated  by stromal cells originated  in fibrovascular septa (3, 6, 18), but subsequent was noticed that the 

channels  are  bordered  directly  by tumoral cells,  which generate  PAS  positive  material  to the 

channel’s lumen (19). 

MATERIAL AND METHODS 

Mammary tumor formations had been provided by corps or tumor biopsies reached to 

Pathology  department  from  the  University  of   Agricultural  Science  and  Veterinary  Medicine, 

Faculty  of   Veterinary  Medicine  Cluj‐Napoca,  Romania.  There  were  utilized  7  malign  and  1 

benign  tumors  provided  by  different  bitch  breeds,  such  as:  Cocker  (3  subjects),  Teckel  (2 subjects), Amstaff  (1 subject), German Sheppard (1 subject) and Mioritic Sheppard (1 subject). 

The mammary tumors are from 8 bitches, with the age of  2‐13 years. 

Had  been  recorded  several  dates  from  anamnesis  and  tumoral  characteristics  (tumor 

size, consistence, gross section aspect, lymph nodes state). From the tumors and lymph nodes 

were  harvested  samples  for  histological  exam  avoiding  tumoral  necrotic  or  cystic  areas, 

samples  being  immersed  in  buffered  10%  formalin,  and  then  process  by  paraffin  technique. 

Slides were stained by usual techniques, respectively tricrom Masson and hematoxylin eosin. 

Mammary  tumors  were  framed  conformal  to  WHO  classification  for  mammary  tumors  and 

graded  into  three  types  (from  grade  I‐less  aggressive,  to  grade  III‐high  aggressivity).  To 

establish  histological  grading  was  quantified  the  following:  nuclear  grade,  mitotic  index  and extending of  tubular structures in tumoral mass. 

Detection  and  monitoring  of   intratumor  angiogenesis  and  especially  of   blood  flowing 

channels  was  evaluated  using  immunohistochemical  LSAB  reaction  or/and  double  reaction, 

respectively  immunohistochemical  and  PAS  reactions.  Immunohistochemical  reaction  used 

CD31  monoclonal  antibody  (Dako  –  clone  JC70A,  izotype  IgG1  kappa).  Histological  slides  had 

about  5  μm  thicknesses  and  were  fixed  on  silanized  slides  (Dako)  during  24  hours  in  37°C, 

followed  by  deparaffination  in  xylen.  Antigen  retriever  had  been  made  using  a  pressurized 

cooker  in  citrate  solution,  pH=6.0  (Dako);  endogenous  peroxidase  was  inactivated  by 

peroxidase blocking reagent (Dako ‐ Peroxidase and PA blocking reagent 3%) during 5 minutes 

at  the  room  temperature.  Primary  monoclonal  antibodies  (anti‐CD31)  were  maintained 

overnight,  during  18  hours  at  4°C,  using  a  dilution  of   1:30  (Dako  antibody  diluent).  The 

visualization  of   immunological  reaction  was  performed  using  Universal  LSAB+Kit/HRP, 

50

Page 53: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 53/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Rb/Mo/Goat  (DAB+)  system  (Dako);  the  counterstaining  was  performed  by  Mayer 

hematoxylin.  To  evaluate  the  antibody  specificity  were  used  negative  control  (replacing  the 

primary  antibody  with  antibody diluent)  and  internal  positive tissue  control  (immunolabel  of  

large vessels). Using PAS reaction may be highlighted mucopolysaccharides, which are present 

toward  the  inner  part  of   the  blood  flowing  channels.  Double  staining  procedure 

(immunohistochemical  and  PAS  reactions)  had  been  realized  at  the  end  of  

immunohistochemical  staining,  before  staining  with  Mayer  hematoxylin.  The  slides  were 

immersed  in  periodic  acid  (aqueous  solution  0,5%)  and  Schiff   reactive  (30  minutes).  Slides 

were rinsed with tap water and counterstained with Mayer hematoxylin. 

To  evaluate  the  microvessel  number,  perimeter  and  aria,  we  used  a  semiautomatic 

computerized analysis technique (Olympus Soft imaging solutions Cell B). There were analyzed 

5  microscopic  fields  on  every  tumor,  magnified  of   200x.  The  microscopic  images  were 

obtained by Olympus BX51 microscope, connected to a photo digital camera (Olympus DP‐25). 

Total  vascular  aria  (total  intratumor  area  expressed  in  µm2/image  area,  and  its  percentage; 

average vessel area for each tumor), total vascular perimeter (average perimeter expressed in 

µm/image  area),  and  the  microvessel  number  were  related  to  microscopic  image  area (144352,00  μm

2).  Any  isolated  but  immunohistochemically  labeled  endothelial  cell  (vessels 

without lumen) was quantified as distinct microvessel. 

PAS positive blood flowing channels from different canine mammary tumor types were 

examined  by  monitoring  all  clear  spaces  bordered  PAS  positive  material  and/or  directly  by 

tumoral  cells.  The  occurrence  of   vasculogenic  mimicry  pattern  was  evaluated  as  follow: 

relatively frequent encountered (++), rarely met but present (+), and absent (‐). 

RESULTS 

AND 

DISCUSSIONS 

In 1948 in human pathology Willis et al. (1948) showed that some tumors with a fast growing  rate  presents  some  channels  similarly  in  structure  with  blood  vessels  but  without 

endothelium (20). The author mentions the bordering of  the channel directly by tumoral cells. 

Later this feature was termed vasculogenic mimicry, being encountered  in several aggressive 

tumors  (1,  3,  4,  6,  14,  19,  21).  Nasu  et  al.  (1999)  describe  a  similar  type  of   intratumor 

angiogenesis, describing some non‐endothelial channels where endothelial cells are scattered 

and  without  PAS  positive  material.  The  author  considers  these  non‐endothelial  channels 

something  different  from  vasculogenic  mimicry  (15).  Elaborated  work  analyzed  eight  canine 

mammary tumors, respectively one benign and seven malign tumors originated from different 

dog breeds of  different age (2‐13 years). Tumor size varied from 0,35 cm until to 20 cm. There 

were  elected  several  histologic  types  of   malignant  tumors,  such  as:  more  differentiated mammary  tumors  and  highly  aggressive  mammary  tumors;  it  is  known  that  vasculogenic 

mimicry is more frequent in poorly differentiated cancers. 

Regarding  intratumor  angiogenesis,  there  were  studied  the  main  parameters  which 

indicate  angiogenic  profile  of   a  tumor,  such  as:  microvessel  number/microscopic  field  area, 

total  vascular  area  and  perimeter,  average  vascular  area  and  perimeter,  the  structure  of  

vascular  walls,  intensity  of   immunohistochemical  reaction  in  vessel’s  wall.  All  of   these  were 

monitored  to  detect  blood  flowing  channels  and  to  debate  intratumor  angiogenesis.  Double 

staining  procedure  (immunohistochemical  and  PAS  reaction)  made  possible  evidence  of  

aspects regarding vasculogenic mimicry almost  in all poorly differentiated tumors (cases 1, 2, 

4, 5, 6, 7). Blood flowing channels were more obvious using this method comparing with the 

other  CD31‐immunolabeling  method.  There  should  be  mentioned  that  numerous  blood 

51

Page 54: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 54/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

flowing  channels  without  endothelium  were  noticed  in  vicinity  of   intratumor  necrotic  areas 

(case 5), being known that hypoxia is a stimulus for angiogenesis. 

The location of  blood flowing channels occur in both, connective tissue stroma (cases 

2, 4, 7) and between neoplastic cells in the case of  compact tumors with scattered sustaining 

stroma  and  numerous  tumoral  cells  (cases  5,  7).  In  blood  flowing  channels  without 

endothelium  from  sustentacular  connective  tissue,  the  misinterpretation  of   some  empty 

spaces  to  be  considered  blood  channels  is  minimal  using  double  staining  procedure.  Also, 

there  can  be  noticed  blood  flowing  channels  in  which  immunohistochemical  reaction  is 

discreet  or  more  often  restricted  to  a  limited  portion  of   the  vessel  wall  not  to  all  vessel 

circumference how  is normal  in blood vessels with continuous endothelium (cases 4, 5, 6, 7). 

This  aspect  was  also  encountered  by  Nasu  et  al.  (15).  The  PAS  reaction  highlights 

mucopolysaccharidic structure that line these channels, which don’t have endothelium (4, 14, 

21). In many situations red blood cells can be seen into the channel’s lumen aiding with their 

notification. 

Fig.1. Carcinoma in benign mixed tumor, grade II (case 8); double staining ‐ IHC 

anti‐CD31 and  PAS reactions, counterstaining with Mayer’s hematoxylin x400. 

52

Page 55: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 55/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 2. Compact carcinoma, grade II (case 1.); blood vessel with discreet immunohistochemical 

reaction (arrow), labeling being not present to all circumference of  the vessel; IHC reaction 

anti‐CD31, counterstaining with Mayer’s hematoxylin x400. 

Fig. 

3. Cystic papillary mammary carcinoma, grade I (case 4)  – presence of  blood flowing 

channel (arrow), discreet IHC reaction anti‐CD31 (black arrow); counterstaining with Mayer’s 

hematoxylin x 400. 

53

Page 56: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 56/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 4. Cystic papillary mammary carcinoma, grade I (case 4)  – presence of  blood flowing 

channel in continuity of  blood vessel positive to IHC anti‐CD31; counterstaining with Mayer’s 

hematoxylin x200. 

Fig. 5. Solid anaplastic mammary carcinoma, grade III (case 7)  – presence of  blood flowing 

channel with red blood cells in lumen (light arrow) and of  blood vessels with intense IHC 

reaction (black arrows); IHC reaction anti‐CD31; counterstaining with Mayer’s hematoxylin 

x400. 

54

Page 57: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 57/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

In  tumors  with  reduced  sustaining  connective  tissue,  vasculogenic  mimicry  pattern 

may  be  easily  recognized.  In  this  tumor  types,  between  malignant  cells  are  obvious  PAS 

positive  channels  from  which  some  of   them  presents  a  discreet  immunolabel  of   the  wall, 

during  some  others  have  only  mucopolysaccharides  that  line  the  channel  (cases  5,  7).  There 

are scattered fibroblasts (which can also produce these mucopolysaccharides),  indicating this 

material  is  generated  directly  by  tumoral  cells  lining  the  “sanguine  vessels”  without 

endothelium.  Described  aspect  is  known  in  the  literature  as  vasculogenic  mimicry,  showing 

once again the plasticity and adaptability of  malignant cells. This feature reveals the ability of  

malignant tumor to find “solutions” to minimize or to avoid intratumor necrosis. 

The  presence  or  not  of   vasculogenic  mimicry  was  correlated  with  histologic  grade, 

and  also  with  vascular  parameters  (intratumor  microvessel  density,  average  microvascular 

area  and  perimeter).  The  presence  of   blood  flowing  channels  was  directly  related  with 

histologic  grade,  such  as:  the  pattern  is  more  frequent  encountered  (++)  in  grade  II  and  III 

canine mammary cancers (cases 5, 6, 7), and less extended in (+) in grade I mammary tumors 

(cases  2,  4)  and  in  some  of   poorly  differentiated  (grade  II)  mammary  tumors  (case  1); 

vasculogenic  mimicry  wasn’t  encountered  in  benign  mammary  tumor  (case  3)  and interestingly  in  one  grade  II  malign  mammary  cancer  (case  8).  Described  aspects  show  that 

vasculogenic  mimicry  is  more  prevalent  in  poorly  differentiated  canine  mammary  cancers 

(grade II and III tumors) and  less frequent or absent  in more differentiated ones or  in benign 

tumors. 

Regarding  the  incidence  of   vasculogenic  mimicry  depending  of   histologic  type  of  

canine mammary tumor, the prevalence  is higher  in solid carcinomas (cases 1, 5, 7  – 37,5%), 

followed  by  carcinoma  in  benign  mixed  tumor  (case  2   –  12,5%),  simple  tubule‐papillary 

carcinoma (case 6  – 12,5%), and papillary‐cystic carcinoma (case 4  – 12,5%). 

Fig. 6. Solid mammary carcinoma, grade III (case 5)  – presence of  numerous blood flowing 

channels with PAS positive material toward the lumen missing IHC reaction (light arrow), and 

numerous isolated IHC positive endothelial cells into tumor mass (black arrows); double 

staining  – IHC anti‐CD31 and PAS reactions, counterstaining with Mayer’s hematoxylin x200. 

55

Page 58: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 58/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 7. Solid mammary carcinoma, grade III (case 5)  – presence of  numerous blood flowing 

channels with PAS positive material toward the lumen missing IHC (arrows); tumoral cells 

border direcly the channels; double staining  – IHC anti‐CD31 and PAS reactions, counterstaining 

with Mayer’s hematoxylin x400. 

By comparing the relation between vasculogenic mimicry and intratumor microvessel 

density  (IMD),  blood flowing  channels have  a  higher occurrence  in  tumors  with  an  increased 

number  of   microvessels/microscopic  field  (cases  1,  6).  Thus,  blood  flowing  channels  without 

endothelium were more frequent prevalent in malignant tumors with IMD between 18,2‐49,2 

(cases 1, 2, 4, 5, 6, 7). The bibliography rapports indicate an association between an increased 

intratumor microvessel density and a faster development of  the tumor, being also correlated 

to  a  reduced  survivor  rate  (13,  16,  17).  On  the  other  hand  there  are  some  reports  where, 

statistically, weren’t find correlations between IMD and tumoral aggressivity (8‐11). 

Regarding  the  other  vascular  parameters  (total  microvascular  area  and  perimeter), 

there  weren’t  established  interrelations  with  vasculogenic  mimicry.  Despite  of   that,  a  quite 

interesting thing was noticed as follow: in mammary cancers that had numerous vessels with 

reduced  perimeter  and  area  (average  vascular  perimeter  and  area)  vasculogenic  mimicry 

occurrence  is  higher.  Also,  it  was  observed  that  mammary  tumors  where  predominate 

microvessels with small caliber (implicitly with reduced vascular perimeter and area) had the most numerous blood flowing channels without endothelial lining (cases 5, 6, 7). By increasing 

the  values  of   average  vascular  area  and  perimeter,  the  frequency  of   vasculogenic  mimicry 

pattern  is  rarely  encountered  (cases  1,  2,  4).  Domination  of   newly  formed  microvessels  of  

reduced  caliber  indicates  an  increased  intratumor  angiogenesis  and,  on  the  other  hand,  an 

increased risk for tumoral growing. 

56

Page 59: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 59/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Table 1. General aspects regarding intratumor angiogenesis in different canine mammary 

tumors. 

Cas

nr. 

Histologic 

diagnose 

Histologi

c grade 

Mitoti

index 

Intratumor angiogenesis 

V

IMD TM

(%) 

MP Sum 

Average MA 

Average MP 

1  Solid 

carcinoma 

II  19 27 5.81 2492.5

310.93  92.32  +

2  Tubule‐

papillary 

carcinoma  in 

benign  mixed 

tumor 

I  5 18.2 5.36 2013.4

425.89  110.63 +

3  Adenoma  ‐ ‐   14.8 2.26 1140.7

221.20  77.08  ‐

4  Cystic‐

papillary 

carcinoma 

I  14 22.6 6.07 2250.7

388.17  99.59  +

5  Solid 

carcinoma 

III  24 24.4 2.34 1540.1

166.76  63.12  ++

6  Tubulopapillar

y carcinoma 

II  33 49,2 5,40 3085,6

158,72  62,72  ++

7  Solid 

anaplastic 

carcinoma 

III  13 22.3

3.28 1760.9

212.56  78.85  ++

8  Carcinoma  in 

benign  mixed 

tumor 

II  12 18,8 4,10 1876.2

314,96  99,80  ‐

IMD: Intratumor microvessel density (microvessel number)/area of  microscopic image. 

TMA:  Total  microvascular  area  (%)/area  of   microscopic  image  –  average  value  obtained  by 

monitoring five microscopic fields magnified of  media 200x. 

MA: Microvascular area (μm2)  ‐ average value obtained by monitoring five microscopic fields 

magnified of  media 200x. 

MP:  Intratumor  microvessel  perimeter  (μm)  ‐ average  value  obtained  by  monitoring  five 

microscopic fields magnified of  media 200x. 

The new findings regarding angiogenesis deliver some important and useful dates not 

only about growing rate and prognosis, but also to improve antitumoral therapeutic protocols 

some of  them involving the destruction of  blood vessels which supply the neoformation. Anti‐

angiogenic  therapies  may  be  realized  using  natural  or  synthetic  inhibitors  of   angiogenesis, 

such  as  angiostatin,  endostatin,  tumtatina,  etc.  Endothelial  cells  were  and  are  considered, 

genetically,  more  stable  structure  than  cancerous  cells.  This  genomic  stability  confers  an 

advantage  in  elaboration  of   antitumoral  therapies  that have  as  target  endothelial  cells  using 

anti‐angiogenic  agents.  Because  of   that,  endothelial  cells  may  represent  ideal  targets  for 

antitumor  therapy.  Nevertheless,  antitumor  therapheutic  protocols  using  antiangiogenic agents  (targeting  vascular  endothelium)  may  be  useles  for  cancerous  areas  where  the 

vascularisation occur using vasculogenic mimicry, which don’t have endothelium. 

57

Page 60: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 60/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

CONCLUSIONS 

1.  Utilizing  either  double  staining  procedure  (immunohistochemical  anti‐CD31  and  PAS 

reactions)  or  single  immunohistochemical  anti‐CD31  technique  made  possible  notification  of  

vasculogenic  mimicry  in  highly  aggressive  tumors,  such  as  grade  II  and  III  canine  mammary 

cancer.  Nonendothelial  blood  channels  were  less  extended  to  differentiated  tumors, 

practically being absent in benign tumor. 

2. The occurrence of  blood flowing channels was higher in vicinity of  intratumor necrotic areas 

knowing that hypoxia stimulate angiogenesis. 

3.  Vasculogenic  mimicry  was  notified  less  frequent  in  sustaining  connective  tissue  and  more 

frequent  in  tumors  with  reduced  stroma  and  numerous  cancerous  cells,  such  as  compact 

carcinomas and simple carcinomas. 

4.  Some  peculiarities  of   some  blood  flowing  channels  were  represented  by  discreet 

immunohistochemical reaction that often was restricted only to a region of  vascular wall not 

to  all  circumference of   the  vessel. This  indicates that  some  vessels  are  incompletely  lined by 

endothelial cells, the rest of  the vessel’s lumen being bordered by tumoral cells. Furthermore, PAS reaction highlighted mucopolysaccharides which lined the channels without endothelium. 

5.  Occurrence  of   blood  flowing  channels  was  higher  in  tumors  with  increased  microvessel 

density/microscopic  field,  and  in  tumors  that  had  numerous  microvessels  with  reduced 

caliber, both features indicating increased intratumor angiogenesis and alert tumor growth. 

BIBLIOGRAPHY 

1. Baba A.I., Cătoi C., 2007  – Comparative Oncology, Romanian Academy Ed, pg. 423 ‐ 447. 

2. Blood  C.H.,  Zetter  B.R.,  1990  ‐ Tumor  interaction  whit  the  vasculature:  angiogenesis  and  tumor 

metastasis. Biochim. Biophys. Acta., 1032, 89‐118. 3. 

Clarijs R., Otte‐Holler I., Ruiter D.J., de Waal R.M., 2002  ‐ Presence of  a fluid‐conducting meshwork  in 

xenografted cutaneous and primary human uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sd.;43:912‐918. 

4. Folberg R., Hendrix M. J. C., Maniotis A. J., 2000  ‐ Vasculogenic Mimicry and Tumor Angiogenesis, Am. 

J. of  Pathology, vol. 156, No. 2. 

5. 

Folkman J., 1995 ‐ Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med, 1:27‐31. 

6. Foss  A.J.,  Alexander  R.A.,  Hungerford  J.L.,  Harris  A.L.,  Cree  I.A.,  Lightman  S.,  1997  ‐ Reassessment  of  

the PAS patterns in uveal melanoma. Br J Ophthalmol, 81:240–246. 

7. Fox S.B., Gatter K.C., Harris A., 1996 ‐ Tumour angiogenesis. J. Pathol., 179, 232–237. 

8. Gal  A.,  C.  Cătoi,  I.  Iulia  Robu,  Baba  A.I.,  Miclaus  V.,  Rus  V.,  Taulescu  M.,  Bolf ă P.,  2009  –  Correlation 

between  intratumor  microvessel  density  and  Ki‐67  malignancy  marker  in  bitch  mammary  cancer, 

Buletin USAMV‐CN, 66 (1)/2009, ISSN 1843‐5270: 55 ‐ 62. 

9. 

Gal A., C. Cătoi, I. Rus, M. Taulescu, P. Bolf ă, I. Lakatos, A.I. Baba, 2008  – The study of  vascularisation in 

bitch mammary tumors, Buletin USAMV‐CN, 65 (1)/2008, ISSN 1843‐5270: 388 ‐ 394. 

10. Gal A., C. Cătoi, I., A.I. Baba, V. Miclaus, Daniela Cerbu, I. Lakatos, 2009  – Relationship between PCNA 

proliferating  marker  and  Angiogenesis  in  bitch  mammary  cancer,  Buletin  USAMV‐CN,  66  (1)/2009, 

ISSN 1843‐5270: 490. 

11. Gal  A.,  Hener  Adriana,  A.I.  Baba,  C.  Catoi,  I.  Rus,  2007   –  Prognosis  significance  of   intratumor 

microvessel density in bitch and cat mammary tumors, Bulletin USAMV‐CN, vol. 64 (1‐2): 151, print 

ISSN 1843‐5270, electronic ISSN 1843‐5378. 

12. 

Hashizume  H.,  Baluk  P.,  Morikawa  S.,  McLean  J.W.,  Thurston  G.,  Roberge  S.,  Jain  R.K.,  McDonald 

D.M.,  2000  ‐ Openings  between  defective  endothelial  cells  explain  tumor  vessel  leakiness.  Am  J 

Pathol, 156:1363‐1380. 

13. 

Luong  R.H.,  Baer  K.E.,  Craft  D.M.,  Ettinger  S.N.,  Scase  T.J.,  Bergman  P.J.,  2006  ‐ Inttratumoral microvessel density and canine STS, Vet. Pathol., 5‐43. 

58

Page 61: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 61/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

14. Maniotis A.J., Folberg R., Hess A, Seftor E.A., Gardner L.M., Pèer J., Trent J.M., Meltzer P.S., Hendrix 

M.J., 1999  ‐ Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic 

mimicry.  Am  J Pathol , 155:739‐752. 

15. Nasu  R.,  Kimura  H.,  Akagi  K.,  Murata  T.,  Tanaka  Y.,  1999  ‐ Blood  flow  influences  vascular  growth 

during tumour angiogenesis. Br J Cancer, 79:780–786. 

16. 

Page  D.,  Jensen  R.,  1995  ‐ Angiogenesis  in  human  breast  carcinoma;  what  is  the  question?  Hum. Pathol., 26: 1173‐1174. 

17. Restucci B., De Vico G., Maiolino P., 2000  ‐ Evaluation of  angiogenesis in canine mammary tumors by 

quantitative  platelet  endothelial  cell  adhesion  molecule  immunohistochemistry.  Vet.  Pathol.,37: 

297‐301. 

18. Ruiter  D.,  Bogenried  T.,  Elder  D.,  Herlyn  M.,  2002  ‐ Melanoma‐stroma  interactions:  structural  and 

functional aspects. Lancet Oncol.3:35‐43. 

19. Wei‐Ying  Y.,  Zhong‐Ping  C.,  2005  ‐ Does  Vasculogenic  Mimicry  Exist  in  Astrocytoma?,  J  Histochem 

Cytochem 53:997–1002. 

20. Willis R.A., 1948 ‐ Pathology of  Tumours. London, Butterworth & Co., Ltd., p 136. 

21. Zhenhong  X.;  Yongwei  J.;  Xuansong  C.;  Jiong  M.;  Liming  C.;  Guangrong  Y.,  2008  ‐ Vasculogenic 

Mimicry  in  Osteosarcoma  :  Histomorphologic  Studies  in  Vivo  and  in  Vitro;  Tang  Ruyong 

Bioinformatics and Biomedical Engineering, Page(s): 915  – 918. 

59

Page 62: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 62/206

 

ASSESSMENT OF THE ANTI‐INFLAMMATORY ACTION OF THE 

CARPROFEN‐BETA CYCLODEXTRINS COMPLEX ON EXPERIMENTAL 

INFLAMMATION MODEL IN RATS 

GRECU Mariana1, NĂSTASĂ V.

1, MAREŞM.

1, MORARU Ramona

1, 

HRIȚCU Luminița Diana1, ILIE Cornelia2 

1USAMV Iassy, Faculty of Veterinary Medicine

2Institute of Physical Chemistry “Ilie Murgulescu” Bucharest

[email protected]

Abstract:The  main  aim  was  the  comparative  testing  of   the  carprofen  and  carprofen‐β

cyclodextrin using an experimental  inflammation model  in  rats. The  improvement of  carprofen 

bioavailability  was  tested  by  complexing  it  with  β‐cyclodextrin,  as  carrier  molecules,  in  the 

conditions  of   dosage  reduction  to  limit  the  side  effects  that  are  common  in  NSAIDs  therapy 

(dyspepsia,  gastritis,  ulcerations  etc.).  The  obtained  results  sustain  a  higher  therapeutical 

efficacy/non‐inferiority of  carprofen‐beta cyclodextrins over carprofen only. 

Key words: carprofen, β‐cyclodextrin, experimental model, inflammation, rat 

INTRODUCTION 

The efficacy of  many active ingredients is limited by their capacity to reach the target 

site.  In most of   the  cases, only a  small quantity of   the administered dose  reaches  this  site, 

while  the  rest of   the dosage  is distributed  throughout  the body, depending on  the physico‐

chemical and biochemical properties of  the molecule (2). 

Most  of   the  molecules  in  the  active  ingredient,  such  as:  non  ‐ steroidal  anti  ‐

inflammatories  (NSAIDs),  antifungals,  antiparasitic  drugs  etc.,  are  insoluble  in  a  aqueous 

environment,  which  leads  to  a  major  problem  in  their  conveyance  and  absorption. 

Furthermore, these molecules are showing a high toxicity degree towards the major structures 

of   the  body  (especially  towards  the  digestive  system,  liver  and  kidney).  To  avoid  these drawbacks,  the  use  of   some  carrier   molecules,  that  can  improve  the  bioavailability  of   the 

active  ingredients  and  reduce  the  side  effects,  has  been  considered  necessary.  Therefore, 

during  the  last  years,  there  has  been  a  rise  in  interest  towards  the  interactions  between 

different active substances and ciclodextrines  – natural polymers ( 1, 3, 4), that could enhance 

the drugs’ therapeutical properties, lowering as much as possible their toxicity and rising their 

efficiency. 

In this study, we have observed and evaluated the effectiveness of  the combination 

carprofen   –  β cyclodextrin  compared  to  the  administering  of   carprofen,  in  a  model  of  

experimental inflammation. 

60

Page 63: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 63/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

METHODS AND EQUIPMENT 

The study used 18 young male white rats, Wistar, weighting 200 ± 10 grams, acquired 

from  the Cantacuzino  Institute, Bucharest,  that have been bred  in a germ‐free environment 

and to whom has been induced a plantar inflammation, in the hind right paw, by injecting an aqueous  suspension  of   kaolin  10%,  intraplantary,  0.15ml  per  rat.  The  animals  were  then 

divided in 3 groups, with 6 rats in every group (n = 6), group A  – the control group, group B, in 

which  carprofen  has  been  administered  per  os,  in  a  dose  of   5mg/kg,  and  group  C  whose 

individuals were administered, per os, 2.5mg/kg of  the carprofen  –  β cyclodextrine complex, 

both  substances  being  administered  once  a  day,  with  a  feeding  tube,  for  two  days.  The 

carprofen  –  β cyclodextrine  complex  has  been  prepared  at  the  Macromolecular  Chemistry 

Institute „Petru Poni” in Iassy, through lyophillization. 

Before  inducing  the  inflammatory  process,  every  rat’s  hind  right  paw  has  been 

marked near the point where the paw was completely  immersed  in the measuring cell. After 

marking,  the  paw  diameter  has  been  measured  and  calculated,  using  pletysmography;  the 

procedure was repeated after inducing the inflammation after 1, 3, 6, 9, 12, 24 and 48 hours, 

following  the dynamics of  the  inflammatory process and evaluating through pletysmography 

the differences between the groups. 

After 9  – 12 hours since the inducing of  the inflammation, blood was collected in vials 

containing clot activators, for determining the C reactive protein (CRP), an important marker in 

acute  inflammatory processes. The samples have been placed  in  the centrifuge at 8000  rpm 

for 2 minutes and then were placed in the refrigerator at a temperature of  +4˚C for 48 hours, 

because the analyze of  CRP requires stable serum samples. 

All  the  experimental  procedures  used  in  this  study  have  been  in  accordance  to 

international  ethical  regulations  regarding  the manipulation  and  use  of   laboratory  animals, 

using  the  method  recommended  by  OECD  guidelines  for  the  Testing  of   Chemicals 

425/17.12.2005. 

RESULTS 

When measuring the paw diameter, before administering the substances, the values 

obtained were 1.0  – 1.1 cm3, with minor variations between the rats from the 3 groups. 

The inflammation had a rapid onset and course, so that 9 hours after the exposure to 

the inflammatory stimulus, considered the peak moment of  inflammation, paw diameters had 

increased greatly  in the control group rats and those treated with carprofen and  less  in  rats 

treated with carprofen + β cyclodextrin complex (image 1). 

61

Page 64: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 64/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Figure 1. Dynamic of  the inflammatory process at 9 hours 

a  b 

Figura 2. Diameter of  path at 9 hours: a)   control;  b) group treated with 

carprofen; c) group treated with cu carprofen + β ciclodextrină

These values were maintained  in a plateau period of  several hours  ‐ between 9 and 

12 hours since the exposure  – then the inflammatory edema began regressing with ease, at a 

slow pace,  in comparison with  its appearance speed,  immediately after  the stimulus  trigger. 

Clinical symptoms were manifested by marked congestion of  the paws, the local temperature 

and  increased  pain  sensitivity,  keeping  a  suspended  position  of   the  member,  functional 

impotence,  and were correlated with marked impairment of  general status of  rats (image 2). 

At 24 hours after  induction of   inflammation  in group C  treated with  carprofen  +  β

cyclodextrin, when measuring the paw diameter through pletysmography, the result showed a 

significant regression of  the edema and also a decrease  in congestion, the  local temperature and  pain  sensitivity,  animals  resumed  their  daily  activities  ‐ grooming,  food  and  water 

62

Page 65: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 65/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

consumption.  In  group  B,  treated  with  carprofen,  the  rate  of   the  edema  reduction  was 

moderate,  but  significantly  faster  compared  to  the  rats  in  the  control  group,  where  paw 

edema was prominent and had a slow regression (Figure 2). 

After  48  hours,  the  inflammation  was  still  present  in  the  control  group,  the 

pletysmographic measurements showing a 60% decrease of  the edema (Figure 2). 

Figure 2. Dynamic of  the inflammatory process at 48 hours 

The results showed a significant difference between control group and groups of  rats 

treated with NSAIDs, especially  for the group treated with carprofen +  β cyclodextrin, where 

the  complex  efficacy  was  observed  through  the  rapid  inhibition  of   paw  edema.  Anti‐

inflammatory  effect  of   the  complex  was  found  to  be  maximum  at  6‐8  hours  after 

administration,  producing  an  inhibition  of   the  occurrence  of   the  inflammation  in 

approximately 40% of   the  individuals,  compared  to  20%  of   rats  showing  a  response  in  the 

group treated with carprofen and no evident response in the control group. 

For  detecting  C  reactive  protein  (CRP),  the  latex  agglutination  test  was  used. 

Determination of  protein C results  in our study showed positive results  in a small number of  

animals from the three batches (only eight positive samples from a total of  18 rats), especially 

in  the  control group where  there was evidence of   serum agglutination  in all  six  rats.  In  the 

group  treated with  carprofen, positive  results were evident only  in  two  rats,  the  remaining 

samples  being  negative,  and  in  group  C  which  received  carprofen  complexed  with  β

cyclodextrin, in all 12 rats the CRP results were negative. 

Serum  samples  that  gave  positive  results  in  qualitative  screening  evidencing 

agglutination  presence  after  two  minutes  since  the  homogenization  of   the  mixture,  were 

taken to determine titres, taking the quantitative variant of  the test. Thus, in samples from the 

rats in control group the agglutination was observed as far as the dilution ¼, the titer being 24 

mg/l  CRP,  and  the  positive  samples  from  the  rats  in  group  treated  with  carprofen, 

agglutination  was  observed  as  far  as  the  dilution  ½,  value  titer  being  12  mg/l  CRP.  Thus, 

63

Page 66: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 66/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

elevated  titres  in  test  ‐ detectable  CRP  is  an  argument  towards  the  presence  of   high 

concentrations of  proteins pertaining the inflammatory process in serum. 

The pletysmography measurements used  in our experimental studies have allowed, 

as  much  as  possible,  accurate  and  sensitive  measurements  of   plantar  edema.  Using  this 

modern  method  has  particularly  proved  the  influence  that  carprofen  complexed  with cyclodextrin have on acropodium edema in rats after intraplantary injections with kaolin, 10% 

aqueous  suspension. The  results are  consistent with  literature data  (5), which  is considered 

encouraging  for  using  this  protocol  in  order  to  validate  the  test  method  inflammatory 

products. 

CONCLUSIONS 

1. Experimental models of   inflammation  induction gave significant results  to assess 

the effectiveness of  NSAIDs, both complexed with beta cyclodextrin and simple. 

2.  It was noted  that  in  this model of  plantar  inflammation,  rats have  a  clear  local 

reaction that is  significant from pharmacokinetic and pharmacodynamic point of  view. 

3.  Experimental  studies  have  confirmed  the  efficacy  of   carprofen  ‐ cyclodextrin 

complex, even if  the dose was lower (2.5 mg) compared with the group that was treated with 

carprofen at a dose of  5 mg / kgcorp. 

BIBLIOGRAPHY 

1. 

Fu‐An  Chen,  An‐Bang  Wu  and  Chau‐Yang  Chen,  2003  ‐  Inclusion  Complex   of   Carprofen  with Hydroxypropyl ‐β‐cyclodextrin  Journal  of   Inclusion  Phenomena  and  Macrocyclic  Chemistry  46: 

111–115. 

2.  Goodman and Gilman's, 2006  ‐ "The  pharmacological  Basis of  Therapeutics", 11th ed., (Laurence 

L. Brunton, John S. Lazo, Keith L. Parker); Mc Graw ‐ Hill, New  – York, Saint Louis, San Francisco, p. 

671‐685,687‐705. 

3.  Jicsinszky L., Petrikovics I., Petro M., Horvath G., Szejtli J., Way JL., 2007  ‐ Improved  drug delivery  

by   conjugation  with  cyclodextrins.  Proceedings  of   14th  European  Carbohydrate  Symposium, 

September 2–7, Lubeck, Germany. 

4.  Thorsteinn  Loftsson,  Dominique  Duch,  2007  ‐ Cyclodextrins  and   their    pharmaceutical  

applications. International Journal of  Pharmaceutics 329,  1–11. 

5. 

Vlase  E.,  Coman  C.,  Szegli  G.,  Lupu  Andreea‐Roxana,  Cremer  Lidia,  Barzu  Natalia  Simona, Badulescu  Maria‐Mihaela,  Calugaru  Ana,  Ionescu  G.,  2008  ‐  „Pletismometria  computerizat ă –  

metod ă  performant ă de măsurare  a  edemului   inflamator   acut   indus  la  şoarece  prin  injectarea 

intraplantar ă de  Carrageenan” ,  Sepsis  Granada,  Spania,  19‐22  Nov.2008  si  Sesiunea  de 

Comunicari Stiintifice a INCDMI Cantacuzino, ianuarie 2009. 

64

Page 67: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 67/206

 

EVALUATION OF DEGREE OF ENGRAFTMENT IN MOUSE 

MODEL OF STEM CELLS HARVESTED 

FROM HUMAN PLACENTA 

Groza I.Ș, Groza Daria, Pall Emoke, Cenariu M., Ciupe Simona, Laura 

Parlapan 

University of  Agricultural Science and Veterinary Medicine, 

Cluj‐Napoca, 3‐5 Manastur street, Cluj‐Napoca, 

[email protected] 

Abstract: Recent interest  in stem cell biology and its therapeutic potential has led to the search 

for accessible new sources of  stem cells. Fetal stem cells from umbilical cord blood and placenta 

are  less  ethically  contentious  than  embryonic  stem  cells  and  their  differentiation  potential 

appears  greater  than  adult  stem  cells.  Fetal  stem  cells  represent  powerful  tools  for  exploring 

many  aspects  of   cell  biology  and  hold  considerable  promise  as  therapeutic  tools  for  cell 

transplantation.  In  this  study, we  established  a mouse model  for  in  utero  transplantation  of  

human placental mesenchymal stem cells (hPMCs) to investigate if  these cells would affect long‐

term, organ‐specific engraftment. 

KEYWORDS:  placenta, mesenchymal stem cells, engraftment, prenatal diagnosis 

Early  prenatal  diagnosis  and  in 

utero  therapy  of   certain  fetal  diseases  have  the 

potential  to  reduce  fetal morbidity  and mortality.  The  intrauterine  transplantation  of   stem 

cells provides  in  some  instances a  therapeutic option before definitive organ  failure occurs. 

Clinical experiences show that certain diseases, such as immune deficiencies or  inborn errors 

of   metabolism,  can  be  successfully  treated  using  stem  cells  derived  from  bone  marrow. 

However, a  remaining problem  is  the  low  level of  engraftment  that can be achieved. Efforts 

are made in animal models to optimize the graft and study the recipient’s microenvironment 

to  increase  long‐term  engraftment  levels.  It  is  known  that  some  diseases,  such  as 

haemoglobinopathies  (Fanconi’s  anaemia,  thalassaemia),  immunological  defects  (SCID)  or 

certain inborn errors of  metabolism can be treated by transplantation of  stem cells (Shapiro E. 

et  al., 2000).  If   the  stem  cell  transplantation  is performed before  symptoms of   the disease 

occur,  organ  function  can  be  preserved  (Newsome  P.N.  et  al.,  2003).  However,  if  

transplantation  is  performed  after  delivery  of   the  baby,  intensive  immunosuppression  and 

myoablation have to be used to minimize the risk of  Graft‐versus‐host disease and to empty the bone marrow. 

Cells of  different origins have been used for  in utero transplantation  in a number of  

models. Human bone marrow‐derived mesenchyamal stem cells have been transplanted  into 

fetal  sheep  and  shown  to persist  for as  long  as13 months with multilineage differentiation 

potential (Liechty et al., 2000). 

In  this study, we established a mouse model  for  in utero  transplantation of  human 

placental mesenchymal stem cells to  investigate  if  these cells would affect  long‐term, organ‐

specific engraftment. 

65

Page 68: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 68/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

MATERIALS AND METHODS 

Biological  material,  clinically  normal  human  term  placentas  (37–  40  weeks  of  

gestation, n =3) were collected after Cesarean section. Placentas were obtained after informed 

consent of   the women, and all experiments were approved by  the ethics  committee of   the 

University  of   Medicine  and  Pharmacy  Iuliu  Hatieganu  Cluj‐Napoca.  Term  placentas  from 

healthy  donor  mothers  were  obtained  with  informed  consent  approved  according  to  the 

procedures  of   the  institutional  review  board.  The  harvested  pieces  of   tissue were washed 

several  times  in  phosphate‐buffered  saline  (PBS)  and  then  mechanically  minced  and 

enzymatically  digested  with  0.25%  trypsin‐EDTA  (Gibco)  for  30  min  at  37°  C.  After 

centrifugation the cell suspension was filtered to eliminate undigested fragments. For lysis the 

erythrocytes,  cells suspensions were  treated with FACS Lysing Solution 10x  (BD Biosciences) 

for  15 min.  The  suspension  pelleted  by  centrifugation  (1500  rpm/7 min)  and  suspended  in 

propagation  medium,  which  consist  of   Dulbecco’s  Modified  Eagle’s  medium  (Gibco) 

supplemented by 10 % fetal calf  serum (FCS), 100 U/ml penicillin‐streptomycin (Gibco). 

Cultures were maintained in DMEM with 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, USA) at 37

° C with 5% CO2. Approximately 2  – 3 weeks later, some colonies consisting of  fibroblast‐

like cells were observed. These cells were trypsinized and replated for expansion. In order to 

obtain single cell‐derived hPMC clones, cells were serially diluted in 96‐well culture plates (BD 

Biosciences) at a final density of  60 cells/ plate. Colonies that grew with homogeneous bipolar 

morphology were expanded. 

Identification of  cell phenotypic markers by FACS (Fluorescence‐Activated Cell Sorter) 

passage 5. After the second passage, the cells were trypsinised (0.25% trypsine EDTA), washed 

twice with PBS and stained according  to  the  recommendation of   the manufacturer with  the 

monoclonal  antibodies,  FITC‐CD44,  examined  with  a  FACS  CantoII  Apparatus  (Becton–

Dickinson).  For  in 

utero  transplantation  of   mesenchymal  stem  cells  from  placentas,  were prepared single cell suspensions. On day 13.5 after mating, pregnant mice were anesthetized 

with avertin. Under aseptic conditions, the uterine horns were exposed, and donor cells were 

injected  through  a  glass  micropipette  (inserted  through  the  uterine  wall  and  into  the 

peritoneal  cavity of   each  fetus under direct  visualization. The  injection  consisted of  1  x 106 

hPMCs in 5 µl of  PBS.  The abdominal incision was closed in two layers using 4‐0 silk, and the 

mice were allowed to complete pregnancy to term. 

On E20, a low abdominal midline incision was made and the number of  live fetuses in 

each uterine horn was recorded. Then, placenta, fetal blood and fetal organs  including brain, 

heart, lung, liver, spleen and bone marrow were collected. To obtain single cell suspension as 

chopped tissues were processed by the Medimachine device. For evidence of  placental stem 

cells  in mice organs the samples were treated with 20 µl fluorescent antibody  (anti  ‐ human 

CD45 PE‐Cy5 antibody  (PE‐Cy5: phycoerythrin‐Cy5),  (FITC:  fluorescein  isothiocyanate), anti  – 

human CD34‐FITC antibody (FITC: fluorescein isothiocyanate) and anti‐ human CD44 antibody). 

Have prepared  two samples  for each antibody  in  the  study: a sample and a sample  labeled 

with antibody as blank unmarked. For positive control were used MSCs isolated from placenta 

and CD34 + cells from cord blood. 

RESULTS AND DISCUSSION 

To show that hPMCs injected in utero on E13.5 engrafted in fetal organs, we collected 

fetal organ samples at E20. Most  fetal  tissues had demonstrable hPMC engraftment at E20. 

Although  the  distribution  pattern  and  numbers  of   cells  in  individual  fetuses  varied,  hPMCs 

66

Page 69: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 69/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

were detectable in more than 60% of  the fetus. The first experiment conducted fetal loss rate 

was  high:  93.75%  most  likely  due  to  lack  of   experience  in  producing  labor  in  utero 

transplantation.  Engraftment  analysis  was  done  using  FACS  Diva  software  and  results  are 

presented as histograms. We assessed the presence of  hPMCs  in various fetal mouse tissues 

(fig.1, 2, 3, 4). 

Figure 1  – Flow cytometric analysis of  hPMCs in the mouse fetus after in utero transplantation 

of  hPMCs 

Figure 2  – Histogram representation of  engraftment 

67

Page 70: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 70/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Figure 3  – Histogram representation of  engraftment of  human mesenchymal stem cells 

Figure 4  – Histogram representation of  engraftment in negative and positive control 

Trans  species  animal  models  have  been  widely  used  in  the  study  of   stem  cell migration and engraftment  (Liechty et al., 2000; Saito et al., 2002).  It has been  shown  that 

human cord blood‐derived cells can differentiate into hepatocytes in the mouse liver without 

evidence of  cellular  fusion  (Newsome et al., 2003). Human microchimerism was observed  in 

various organs and tissues at 4 months after transplan‐tation of  human amnion and chorion 

mesenchymal  progenitors  in  neo‐natal  swine  and  rats  (Bailo  et  al.,  2004).  Human 

mesenchymal stem cells colonized multiple fetal sheep tissues for as  long as 13 months after 

in utero  transplantation  (Liechty et al., 2000). Differences observed  in  cell numbers may be 

due to colonization efficiency  in different tissue environments or the rate of  cell turnover  in 

each organ  (Krause et al., 2001). Our  study adds  to  this body of  work by establishing an  in 

utero (E13.5) model of  xenogeneic hPMC transplantation in immunocompetent mice. 

68

Page 71: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 71/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

CONCLUSIONS 

Mesenchymal stem cells  (MSCs) are widely distributed  in a variety of   tissues  in  the 

adult human body (e.g., bone marrow, kidney, lung, and liver). These cells are also present in 

the fetal environment (e.g., blood, liver, bone marrow, and kidney). However, MSCs are a rare 

population  in  these  tissues.  The most well  studied  and  accessible  source  of  MSCs  is  bone 

marrow, although even in this tissue the cells are present in a low frequency. 

The human placenta  is an attractive new source of  mesenchymal stem cells (MSCs), 

but  the biological characteristics of  placenta‐derived MSCs have not yet been characterized. 

Our  results show  that mesenchymal stem cells are present  in the human  term placenta and 

may  be  a  potential  source  of   cells  for  transplantation  therapy.  Using  routine  cell  culture 

techniques,  placental  derived  mesenchymal  stem  cells  can  be  successfully  isolated  and 

expanded in vitro. 

Mesenchymal  stem  cells are mainly derived  from bone marrow  (Orlic et al., 2001), 

but  it may be difficult  to obtain  sufficient autologous  cells  from  some patients, particularly 

those who are older or who have malignancies. Therefore, alternative sources are needed.  It appears  that  hPMCs  from  an  allogeneic  donor  might  constitute  such  a  source.  A  further 

potential benefit  is the exposure of  the fetus to allogeneic cells, inducing tolerance such that 

future treatment. 

BIBLIOGRAPHY 

1.  Bailo M, Soncini M, Vertua E, Signoroni PB, Sanzone S, Lombardi G, Arienti D, Calamani F, Zatti D, 

Paul P et al. Engraftment potential of  human amnion and chorion cells derived from term placenta. 

Transplantation 2004;78:1439  – 1448: 

2.  Carolyn Troegera,  Daniel Surbeka, Andreina Schöberleina, Stephan Schatt, Lisbeth Dudlera, Sinuhe 

Hahna,  Wolfgang  Holzgreve,  In  utero  haematopoietic  stem  cell  transplantation,  SWISS  MED 

WKLY2006;136:498–503 

3.  Krause DS, Theise ND, Collector MI, Henegariu O, Hwang S, Gardner R, Neutzel S, Sharkis SJ. Multi‐

organ, multi‐lineage engraftment by a  single bone marrow‐derived  stem  cell. Cell 2001;105:369– 

377 

4. 

Liechty KW, MacKenzie  TC,  Shaaban AF, Radu A, Moseley AM, Deans R, Marshak DR,  Flake AW. 

Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site‐specific differentiation after in utero 

transplantation in sheep. Nat Med 2000;6:1282  – 1286: 

5.  Liechty  KW,MacKenzie  TC,Shaaban  AF,  Radu  A,Moseley  AM,  Deans  R,  Marshak  DR,  Flake  AW. 

Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site‐specific differentiation after in utero 

transplantation in sheep. NatMed 2000;6:1282–1286. 

6. 

Newsome PN, Johannessen I, Boyle S, Dalakas E, McAulay KA, Samuel K, Rae F, Forrester L, Turner ML, Hayes PC et al. Human cord blood‐derived cells can differentiate into hepatocytes in the mouse 

liver with no evidence of  cellular fusion. Gastroenterology 2003;124:1891  –1900; 

7.  Orlic D, Kajstura  J, Chimenti  S,  Jakoniuk  I, Anderson  SM,  Li B, Pickel  J, McKay R, Nadal‐Ginard B, 

Bodine DM et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001;410:701– 705; 

8.  Saito T, Kuang JQ, Bittira B, Al‐Khaldi A, Chiu RC. Xenotransplant cardiac chimera: immune tolerance 

of  adult stem cells. Ann Thorac Surg 2002;74: 

9.  Shapiro  E,  Krivit  W,  Lockman  L,  et  al.  Long‐term  effect  of   bone‐marrow  transplantation  for 

childhood‐onset cerebral X‐ linked adreno‐leukoldystrophy. Lancet 2000;356:713–8. 

69

Page 72: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 72/206

 

PRELIMINARY 

STUDY 

ON 

THE 

PREVALENCE 

OF 

TOXOPLASMA 

GONDII  

INFECTION 

IN 

WILD 

BOARS 

FROM 

TIMIS 

COUNTY 

Ionela HOTEA¹, Gh. DARABUS¹, C. PACURAR², Tatiana RUGEA², P. MUNTEAN², M.S. ILIE¹, K. IMRE¹, 

Mirela IMRE¹, Denisa SORESCU¹, Adrian BALINT¹, Dinu INDRE¹ 

¹ Faculty of  Veterinary Medicine, No. 119, Calea Aradului, Timisoara, Romania 

² DSVSA Timis, No. 4, Surorile Martire Caceu, Timisoara, Romania 

[email protected] 

Abstract:  52  blood   samples   from  wild   boars  were  studied   to  determine  the  seroprevalence  of  

Toxoplasma  gondii   infection.  The  animals  came   from  different   animals  hunting  areas   from  Timis 

County.Serum  samples were  examined  by   ELISA method. Of   the  52  samples  from wild  boars, 49 of  

them (94.23%)

 had 

 anti 

‐Toxoplasma

 Ig

 G

 antibodies.

 

Key words:  Toxoplasma gondii, wild boars, prevalence, Timis County 

Toxoplasmosis  is  one  of   the most  common  parasitosis  in  humans  and  animals,  it  being 

placed  on  the  top  three  global  spread  (4).  The  cat  is  the  key  element  in  the  epidemiology  of  

toxoplasmosis  (6).  For  toxoplasmosis  transmission,  a  very  important  role  it  have  raw  meat 

consumption. In pigs, infection occurs by eating kitchen scraps unsterilized or rodents.  In certain 

circumstances, pigs become cannibals biting their  tails or ears. T. gondii   tissue cysts of  wild boar 

meat are considered sources of  infection for humans (9). 

Necropsy diagnosis  in  the  slaughterhouse,  it  is  very difficult  to done, because  very  small 

necrotic  lesions  are  difficult  to  observe.  Serological  diagnosis  is  possible  to  made  in  the 

slaughterhouse, but is not warranted in our economic Country's conditions (3). 

Reporting an  increased  incidence of   toxoplasmosis  in humans and animals worldwide and 

the small number of  bibliographic data in our Country about Toxoplasma infection, motivates our 

study. 

MATERIALS AND METHODS 

The 52 blood samples collected from wild boars, between 2008‐2009, were sent by AJVPS 

representatives (County Association of  Hunters and Fishermen Sports) Timis at DSVSA (Department 

Veterinary and Food Safety) for other types of  analysis. The animals were hunted in Timis County, in different localities (FV  – hunting areas), as follows: 

  3 wild boars  – Buzias, 

  3 wild boars  – Brestovat, 

 

5 wild boars  – Surduc, 

  4 wild boars  – Buzias, 

  3 wild boars ‐ Ohaba Lunga, 

  4 wild boars  – Paniova, 

  6 wild boars ‐ Sacosu Mare, 

  5 wild boars ‐ Cheveresu Mare, 

  3 wild boars ‐ Racovita, 

 

4 wild boars  – Secas,   4 wild boars  – Culina, 

70

Page 73: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 73/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

  5 wild boars  – Zolt, 

  3 wild boars ‐ Topolovatu Mare. 

Collected blood was  left  to express serum and  it was kept  in a  freezer until  the month of  

November  2009 when  samples were  processed  in  the  laboratory  of   Parasitology  and  Parasitic 

Diseases of  Faculty of  Veterinary Medicine of  Timisoara. 

Serum samples were examined by  indirect ELISA method using  ID Screen Multi‐species kit (ID.VET.,  France)  for  anti‐Toxoplasma  specific  Ig  G  antibodies,  resulting  from  infection  with 

Toxoplasma gondii . Kit can be used for determination of  anti‐Toxoplasma specific  Ig G antibodies 

from sera of  ruminants, pigs and cats. We respect technology manufacturing indicates by producer 

company. 

The  S/P  values  above  200%  were  considered  strongly  positive,  between  50  and  200% 

samples were considered positive, between 40% and 50% were doubtful, while values below 40% 

were considered negative. 

RESULTS AND DISCUSSIONS 

From Timis County were collected and examined 52 serological samples from wild boars. 

Of  processed serum samples from wild boars, 49 of  them (94.23%) had anti‐Toxoplasma Ig 

G  antibodies. Antibody  titre  values were  between  36.24  and  133.18,  and  the  positive  samples 

values were between 68.25 and 133.18 (Table 1). 

For studied Counties, information obtained are particularly important as they are the first 

reported data on Toxoplasma infection in the area. 

High  prevalence,  approaching  100%,  obtained  from wild  boar  shoot  the  alarm  on  the 

infestation degree of  the environment with oocysts and massive infestation of  wild animals (Fig. 1). 

This should scare us more considering to consumption, quite frequently, of  game meat, especially 

wild boars meat. 

The study found the absolute need to best practice animal husbandry and food to reduce the risk of  transmission of  infection with T. gondii  in humans and other animals. 

By  indirect  immunofluorescence,  the Czech Republic has a prevalence of  26.2%  in wild 

boars and the Slovak Republic, 8.1% (1, 2). In Spain, the prevalence of  Toxoplasma gondii  infection 

in wild boars was 38.4% and in Japan ranged from 5.6% in 1999 to 0% in 2006 (5, 7, 8). 

Toxoplasma infection of  pigs in Timis County matters both because of  neonatal death can 

occur in pigs, and the possibilities of  disease transmission to humans through inadequately cooked 

meat. 

Insufficiently  cooked  pork  meat  is  an  important  source  for  the  T.  gondii  infection 

transmission  to  humans.  It would  be  necessary  to  implement  programs  for  disease  control  as 

among animals, from cats and continuing with farm animals to reduce the infestation degree of  the 

environment and thus, economic losses in animal products and in people, especially those engaged 

in the highest risk category, ie pregnant women and immunosuppressed persons. 

CONCLUSIONS 

‐Wild boars showed Toxoplasma seroprevalence of  94.23%, with variations between 50 and 100%. 

‐Not  having  sufficient  information  about  examined  animals  can't  refer  to  the  distribution  of  

prevalence by age or gender. 

ACKNOWLEDGMENTS 

This work was supported by CNCSIS, Bd, grant No. 87/2008 obtained by Ionela Hotea and by CNMP, grant PC No. 51‐013/2007. 

71

Page 74: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 74/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 1. Geographical distribution of  Toxoplasma gondii  infection positive wild boars, in 

Timis County 

Table 1. 

Prevalence of  Toxoplasma gondii  infection in wild boars in Timis County 

No.  No examinated wild boars 

No. 

positive 

samples  (%) 

The 

minimum 

and maximum titres 

values 

Total 

prevalence 

1. 3 wild boars ‐ Buzias 3 (100%) 124.87‐133.18

2. 3 wild boars ‐ Brestovat 3 (100%) 112.39‐126.86

3. 5 wild boars ‐ Surduc 5 (100%) 80.01‐103.26

4. 4 wild boars ‐ Buzias 4 (100%) 95.06‐99.22

5. 3 wild boars ‐ Ohaba Lunga 3 (100%) 89.45‐129.75

6. 4 wild boars ‐ Paniova 2 (50%) 36.24‐98.67

7.  6 wild boars ‐ Sacosu Mare  5 (83.33%)  31.05‐92.81 

8. 5 wild boars ‐ Cheveresu Mare 5 (100%) 101.64‐130.71

9. 3 wild boars ‐ Racovita 3 (100%) 68.25‐99.41

10. 4 wild boars ‐ Secas 4 (100%) 75.68‐121.72

11. 4 wild boars ‐ Culina 4 (100%) 96.35‐127.27

12. 5 wild boars ‐ Zolt 5 (100%) 92.08‐110.85

13. 3 wild boars ‐ Topolovatu 

Mare 3 (100%)  120.38‐132.40 

Total 52 49 94.23 %

Brestovat

100%

Surduc

100%

Ohaba

Lunga 100%

Cheveresu

Mare100%

Buzias 100%

Paniova 50%

Sacosu Mare

83.33%

Racovita 100%

Secas

100%

Culina

100%

Zolt 100%

Topolovatu

Mare 100%

72

Page 75: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 75/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

REFERENCES: 

1.  Antolova D, Reiterova  K, Dubinsky  P.,  2007.  Seroprevalence  of   Toxoplasma  gondii   in wild 

boars (Sus scrofa) in the Slovak Republic.  Ann.  Agric. Environ. Med., 14, 71‐73. 

2.  Bartova  E.,  Sedlak  K.,  Literak  I.,  2006.  Prevalence  of   Toxoplasma  gondii   and  Neospora 

caninum antibodies in wild boars  in the Czech Republic. Veterinary 

 Parasitology , 142, 150  – 

153. 

3.  Chitimia, Lidia, Cosoroaba, I., Cozma, V., 2007. Toxoplasmoza. Prevenirea transmiterii  la om 

prin alimente de origine alimentara, Rev. Rom. Med. Vet., 3, 11‐30. 

4.  Darabus, Gh., Oprescu, I., Morariu, S., Mederle, Narcisa, 2006. Parazitologie si boli parazitare, 

Ed. Mirton, Timisoara. 

5. 

Gauss CB, Dubey JP, Vidal D, Ruiz F, Vicente J, Marco I, Lavin S, Gortazar C, Almería S., 2005. 

Seroprevalence  of   Toxoplasma  gondii   in  wild  pigs  (Sus  scrofa)  from  Spain.  Veterinary  

Parasitology , 131, 151‐156. 

6.  Hotea  Ionela, Darabus Gh., Mederle Narcisa,  Ilie M.S.,  Imre  K.,  Balint A.,  Indre D.,  2009. 

Prevalenta  infectiei cu Toxoplasma 

gondii   la pisici  in  judetul Arad. Lucrari stiintifice  Iasi, 52, 587‐592. 

7.  Nogami S., Tabata A., Morimoto T., Hayashi Y., 1999. Prevalence of  anti‐Toxoplasma gondii  

antibody  in wild boar  (Sus scrofa  riukiuanus) on  Iriomte  Island.  Japan, Veterinary  Research 

Communications, 23, 211  – 214. 

8.  Omata,  Y, Murata, K.,  Ito, K.,  Ishiguro, N., 2005. Antibodies  to  Toxoplasma gondii   in  free‐

ranging wild  boar  (Sus  scrofa  leucomystax )  in  Shokoku,  Japan.  Japan.  J.  of   Zoo  and  Wild. 

Med ., 10, 99‐102. 

9.  Tenter,  A.M.,  Heckeroth,  A.R.,  Weiss,  L.M.,  2000.  Toxoplasma  gondii :  from  animals  to 

humans, Internat. J. for  Paras., 30, 1217‐1258. 

73

Page 76: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 76/206

 EPIDEMIOLOGICAL INVESTIGATIONS ON DIGESTIVE PARASITOSIS 

IN RACING PIGEONS AND THE RISK OF RELEASING PARASITIC 

ELEMENTS IN FREE AREAS Olimpia C. IACOB,  B.C. Ş Î ŞCĂ

Faculty of  Veterinary Medicine Iasi Abstract Investigations were conducted during March 2008  ‐ May 2009 on some  lofts of   racing pigeons 

(464 pigeons) from six private property holdings, located in different locations (four in area B and 

two in area I), in order to study the digestive parasitosis and to reveal the epidemiological role of  

racing  pigeons  in  dissemination  and  transmission  of   parasitic  diseases  in  free  areas  during 

training or competition flights. 

Farms  have  optimal  growth  conditions  ensuring  the  comfort  of   pigeons  to  achieve maximum 

results  in competitions. Excessive sensitivity of  pigeons  in stress conditions calls attention  from pigeon fanciers to ensure housing conditions, feeding and water consumption, administration of  

medicinal preparations, sanitary and medical preventive measures, a specialist being required in 

exceptional  cases;  sometimes  the  faulty  intervention  led  to  expensive  loss  by  death  or  by 

compromising pigeons next flying season. 

Regular investigations revealed that digestive parasitosis were within 10% of  all illnesses. Among 

the  digestive  parasitosis  that  developed  were  trichomonosis,  ascaridiosis  in  adult  birds  and 

intestinal  Eimeriosis  in  squabs  confirming  the  source  of   invasive  elements  (Eimeria  oocysts, 

Trichomonas  trofozoits,   Ascaridia  and  Capillaria  eggs),  not  only  for  pigeons  from  other 

geographic areas but also for other susceptible birds, given the impressive distances traveled by 

pigeons during training and racing. In cases of  severe episodes of  illness in the loft of  pigeons, the 

pigeon fanciers practice the ”stamping out” method thus limiting the diffusibility of  the illnesses. 

Keywords: racing  pigeons, digestive  parasites,  flights, epidemiological  risk  

INTRODUCTION 

The beauty, gentleness and delicacy of   the pigeons and also  their sports skills have 

definitely captured man. Great interest into the racing pigeons, their movement and sporting 

events, calls for greater attention from the pigeon fanciers and an  increased wariness on the 

part of  veterinary medical personnel (1, 4). 

Digestive  based  parasitosis  (Trichomonosis,  Eimeriosis,  Toxoplasmosis, 

Echinostomosis,  Cestodosis,  Ascaridiosis,  Capillariasis,  Trichostrongyliasis,  Tetramerosis, Acuariosis etc..) affects both young and adult pigeons, given the  location of  many species of  

parasites from the mouth up to cloaca. Epidemiological surveillance prevents transmission of  

parasitosis  both  to  the  loft  of   pigeons  and  to  other  susceptible  birds  and  not  least,  the 

transmission of  disease to man (Toxoplasmosis, Psittacosis, Pseudotuberculosis, Salmonellosis, 

Paramyxovirosis, etc.). (2) 

The  emergence  and  evolution  of   parasitosis  in  pigeons  are  conditioned  by 

environmental factors, interrelations between ecosystems, microorganisms and parasites, the 

interdependence  between  them,  the  emergence  of   new  bacterial,  viral  or  parasitic  strains. 

Adult pigeons contracts generally mild forms, asymptomatic, that sometimes pass unnoticed, 

thus becoming carriers and eliminators of  invasive elements transported over long distances in 

74

Page 77: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 77/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

free  areas.  Squabs  and  the  young  pigeons  are  extremely  vulnerable  to  failure  to  the 

antiparasitic and antiinfectous prophylaxic measures and often end in death. (3, 5). 

Racing pigeons,  through all their qualities, continue to provide services  to humanity 

even  in  the  century of   cosmic  flights, maintaining  their quality of  outstanding  carrier under 

certain circumstances. (1, 4) 

The aim of  the paper Investigations were  conducted  in  order  to  study  the  digestive  parasitosis  in  racing 

pigeons  and  to  reveal  the  epidemiological  role  in  the  transmission  and  dissemination  of  

parasitic elements  in the free areas and / or their contamination with new  invasive elements 

at their return to the farm after sporting events. 

MATERIAL AND METHOD 

The epidemiological  study was  conducted during March 2008  ‐ May 2009,  through 

investigation of  six racing pigeons farms situated in different locations and long distance (four 

located  in  city B and 2  located  in  the  city  I). Number of  pigeons  in  these  farms was of  434 pigeons  in peak  season,  including all age groups  (from 10 days  to 18  to 20 years) and both 

sexes, pairs  and unpaired.  Since pigeons are highly  sensitive  to  stress, access  to  farms was 

periodically or only when the owners have announced cases of  disease. 

The epidemiological  investigation recorded: the placement of  the  farm,  the housing 

spaces,  the material used to build shelters, the surface  reported  to  the pigeons density,  the 

division of  housing space, the lighting and ventilation level that each shelter gives. 

There have been analyzed the epidemiological history regarding the emergence and 

evolution  of   diseases  in  farms  of   racing  pigeons,  their  incidence, morbidity  and mortality, 

immune status, the presence of  a register or record book where  is recorded the situation of  

pairs,  spawns  date,  the  hatching,  squabs  in  nests,  effectively  applied  immunoprophylaxis measures, etc. 

There have been  investigated the administration of  food, quantity and content of  the 

diet,  how  the  food  is  stored  (in warehouses  or  storage), watering  system  used  in  farming, 

water source and frequency of   its use, method of  manure disposal and discharge  frequency, 

collection  and  disposal  of   residues  resulting  from  mechanical  cleaning,  the  conduct  of  

decontamination and the materials used for this purpose in each farm. 

If   participating  in  competitions,  the  investigations  recorded  the  pigeons  training 

mode,  the  frequency  of   competitions,  transportation  to  the  place  of   shipment,  the  vehicle 

used, mode of   shipment  and  transportation  to  launch  site,  food  rations  and  structure.  The 

recovery protocol has also been analyzed  for  the pigeons  returning home after 3‐4 days of  

flight, period of  time they have been exposed to contamination with  infectious and parasitic 

elements. 

It has been also investigated the specialized veterinary assistance and the prophylaxia 

measures  adopted,  looking  at  the  mode  of   administration  and  dosage  of   medicinal 

preparations,  the  time  of   treatment  and  results,  immunological  situation  of   the  loft, 

mandatory  vaccinations  (Influenza,  Pseudopesta,  Paramixovirosis,  Salmonellosis  etc.).  and 

more. The mode of  vaccination, type of  vaccine used (fluid/oil,  live attenuated /  inactivated) 

type of  strain, the date of  vaccination and training protocol that preceded the operation has 

also been investigated. 

The results were classified  in tables and expressed graphically, and the  images were 

taken with a digital camera. 

75

Page 78: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 78/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

RESULTS AND DISCUSSIONS 

Monitored  farms  are  organized  on  pigeon  fanciers  principles,  built  and  equipped 

properly to provide optimum comfort conditions to the lofts of  pigeons (80‐100 pigeons each). 

The dimensions of  the shelters are variable and between 4‐12 m  long, 2‐4 m wide and 3.2 m 

high.  Some  farms  have  shelters  suspended at  a height of  2‐3 m above  the  ground  (Fig. 1), 

others are on the ground, facing south or southwest. The roof  is normaly made from asbestos 

or tiles, and the walls of  wood or hardboard. The facade consists of  windows, net access door 

and  flap  doors  for  pigeons  entering  and  leaving.  Access  is  through  a  system  of   ”needles”, 

metal  rods  sliding  towards  the  entrance or  exit.  In  general,  the  shelters present  aviaries  in 

front. 

Fig. 1. Farm 1‐ pigeons in aviaries 

Inside,  the  shelters  are  divided  for  each  age:  squabs,  young  pigeons,  for  flight, 

breeding, ensuring feeding and watering devices, accommodation and recreation or nests (Fig. 

2, 3, 4). 

Feeding is carried by each pigeon fancier regarding the posibilities and goal, based on 

a  mixture  of   grain,  to  varying  degrees  depending  on  the  period  of   growth  and  training, 

supplemented  with  vitamins  and minerals.  Breeding material  is  domestic  or  from  import: 

Janssen, Aarden, Wim Muller, van Roy, van der Weggen. Predominant colors are red, scaly and 

black, dark, genetically dominant.  In most  farms pigeons have performance  results  in  fond, 

semifond  or marathon  competitions.  Prevention measures  are  applied  rigorously,  since  on 

their outcome depends the participation in competitions. On return from the race pigeons are 

receiving  vitamin‐mineral  supplements  purchased  from  specialized  companies,  antiparasitic 

treatments and preventive antiinfectous drugs. 

76

Page 79: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 79/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 2. Farm 1.  Flying pigeons compartment with pigeons in boxes and paired 

Fig. 3. Farm 2.Young pigeons compartment 

77

Page 80: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 80/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 4. Farm  6. Flying pigeons compartments 

The  incidence  of   diseases  in  racing  pigeons  from  the  six  farms  has  been  analyzed 

periodically,  revealing the different aspects. Pigeons examination results  from  January 2008 

are listed in Table 1. 

Table 1. 

The structure of  the flock of  pigeons and the suspected cases of  ilness in January 2008 

Farm (F) 

Number of  adult 

pigeons 

Number of  squabs 

Examined 

Suspected of  ilness

 Adults  Squabs   Adults  Squabs 

1.  28  0  4 0 0  0

2.  70  0  2 0 0  0

3.  62  0  6 0 0  04.  110  4  8 4 0  2

5.  72  0  6 0 0  0

6.  66  0  8 0 0  0

Total  408  4  34  4  0  2 

Analyzing  the data  in Table 1, note  that  in  January,  the  loft of  pigeons  in  the study 

totalize  a number of  408 pigeons, of  which four were squabs that appeared accidentally in F 

4. Clinically examined were 34 adults and four squabs suspected with Trichomonas columbae 

infestation. Of  the four squabs, two were positive infestated with T. columbae (F 4). 

78

Page 81: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 81/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

All specimens examined showed signs of   irregularity, mild  loss of  appetite and the 4 

squabs manifested additional symptoms as diarrhea, prostration, and difficulty  in swallowing 

or horiplumation. The dynamics of  disease incidence within these six farms in January 2008 is 

shown in Fig. 5. 

Fig. 5. The dynamics of  pigeons ilness within the six studied farms in January 2008 

Pigeons examination results in April, 2008 are included in Table 2. 

Table 2. 

The structure of  the flock of  pigeons and the suspected cases of  ilness in April 2008 

Farm (F) 

Number of  adult 

pigeons 

Number of  squabs 

Examined 

Suspected of  ilness

 Adults Squabs Adults  Squabs

1.  28  16  2  6  0  2 

2.  70  32  6  12  1  4 

3.  60  45  12  16  0  2 

4.  104  36  8  4  0  1 

5.  72  26  6  12  1  2 

6.  62  27  2  8  0  0 

Total  396  182  36  58  2  11 

Analyzing  the  data  in  Table  2,  it  is  observed  that  in  April  breeding  is  already 

underway, with a total of  182 offspring, thus totaling 578 actual specimens older than 10 days. 

Clinically examined were 36 adult pigeons  two of   them being  suspected of  disease 

and 58 squabs, of  which 11 were suspected, totalizing 13 pigeons with altered state. Pigeons 

had diarrhea,  irregularity, mild  loss of  appetite,  the  clinical signs being more pronounced  in 

79

Page 82: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 82/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

squabs, in addition being found and dull plumage. It is noted that the number of  birds affected 

is higher  in F 2  (5 pigeons, about 39% of   total), where pigeon  fancier started breeding  first 

from all other six fanciers  (March 6). The dynamics of  disease incidence in pigeons within the 

six studied farms in April is depicted in Fig. 6. 

Fig. 6. The dynamics of  pigeons ilness within the six studied farms in April 2008 

Pigeons examination results in August 2008 is included in Table 3. 

Table 

3. 

The  structure of   the  flock of  pigeons and  the  suspected  cases of   ilness  in August 2008 

Farm (F) Number of  

adult pigeons 

Number of  squabs 

Examined 

Suspected of  ilness

 Adults  Squabs   Adults  Squabs 

1.  18  29  4  12  1  2 

2.  52  46  6  16  1  4 

3.  48  34  12  10  2  3 

4.  68  42  10  8  2  5 

5.  64  32  9  6  1  2 

6.  52  34  8  5  0  1 

Total  302  217  49  57  7  17 

In  Table  3  it  can  be  observed  the  decrease  in  the  number  of   adults  because  the 

competion season is in full swing, and the increase in the number of  young pigeons seeking to balance the  loft. There were clinically examined 106 specimens from the age of  10 days and 

80

Page 83: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 83/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

were  identified as suspicious of  disease 24 pigeons. Symptoms were typical  for nematodosis 

and  intestinal  trichomonosis  characterized  by  digestive  syndrome,  weakness,  difficulty  in 

swallowing,  the  presence  of   fibrinous  deposits  in  the  mouth,  prostration,  left  wing.  The 

dynamics of  disease incidence in pigeons within the six studied farms in April is depicted in Fig. 

7. 

Fig. 7. The dynamics of  pigeons ilness within the six studied farms in August 2008 

Pigeons examination results in December is included in Table 4. 

Table 4. 

The structure of  the flock of  pigeons and the suspected cases of  ilness in December 2008 

Farm (F) 

Number of  adult 

pigeons 

Number of  squabs 

Examined 

Suspected of  ilness

 Adults Squabs Adults  Squabs

1.  22  16  6  6  0  0 

2.  54  22  10  8  1  2 

3.  50  20  16  12  0  1 

4.  54  18  12  8  0  0 

5.  60  22  18  6  1  0 

6.  48  24  9  8  0  2 

Total  288  122  71  48  2  5 

In Table 4  is observed that the number of  adult birds decreased compared with the 

summer  season:  in August,  adult birds were  sorted  through  competitive  stages  (marathon, 

national contests),  through sales, or  losses and youth has also been sorted  through  training flights and squabs trials. 

81

Page 84: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 84/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

There have been 119 pigeons clinically examined of  which five pigeons had digestive 

disorders. The symptoms presented by the sick pigeons were similar to those described above, 

specifying that in this case they had a common character regardless of  pigeons age. Reduced 

incidence  of   cases  of   disease  can  be  explained  because  there  were  applied  prevention 

measures  in  farms  in  September‐October and the youth through growth have strengthened 

their immune status, the lofts reaching an immunological uniformity. 

The dynamics of  disease incidence in pigeons in December 2008 is depicted in Fig. 8. 

Fig. 8. The dynamics of  pigeons ilness within the six studied farms in December 2008 

Examination result for the flocks of  pigeons in March 2009 is contained in Table 5. 

Table 5. 

The  structure  of   the  flock  of   pigeons  and  the  suspected  cases  of   ilness  in  March 2009 

Farm (F) 

Number of  adult pigeons 

Number of  squabs 

Examined 

Suspected of  ilness

 Adults  Squabs   Adults  Squabs 

1.  38  0  4 0 0  0

2.  74  0  2 0 0  0

3.  72  0  6 0   1  0

4.  70  0  2 0 0  0

5.  94  0  7 0 0  0

6.  69  12  10 8   3  2

TOTAL  417  12  35  8  4  2 

In  Table  5  can  be  observed  that  in March  2009  pigeons  examination  included  a 

reduced  number  of   pigeons,  35  adults  four  of   them  being  suspected  of   disease  and  eight 

squabs  in  which  two  suspected.  During  this  time most  farms  applied  spring  prophylactic 

82

Page 85: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 85/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

measures with positive results on lofts of  pigeons and reduce cases of  disease. The dynamics 

of  disease in lofts of  pigeons in March 2009 is depicted in Fig. 9. 

Fig. 9. The dynamics of  pigeons ilness within the six studied farms in March 2009 

Following further demands expressed by other pigeon fanciers, was conducted clinical 

examination  of   pigeons with  impaired  health who  presented  polymorphic  symptoms. Note 

that in June and September 2008 were examined 20 cases, in April 2009, 34 cases and in May 

2009, 12 cases (Table 6). 

Table  6. 

The incidence of  the supplementery demands of  examination for the pigeons that expressed 

impaired health from the six studied farms, March 2008  – May 

Pigeon

s Farm 

Examined pigeons (March 2008‐May 2009) 

Mar  May  Jun  Jul  Sep  Oct  Nov  Jan  Feb  Apr  May 

1.  2  0  0  0  6   0 0 0   5  0  5

2.  0  4  0  0  0 0   11   0 0  9  0

3.  0  0  8  0  14   0 0 0 0  0  0

4. 

12 

0   6   0 0 0 

7

5.  0  6  0  0  9   0 0 0 0  13  0

6.  4  0  0  0  0 0 0 0 0  12  0

TOTAL  6  10  20  0  20  6  11  0  5  34  12 

In Table 6  it appears that following the additional claims arised from the occurrence 

of  morbid states, were clinically examined a number of  124 racing pigeons of  all ages and both 

sexes  stressing  that  regular  examinations  were  not  sufficient.  The  dynamics  of   disease  in 

pigeons with polymorphic symptoms indicated by additional requests in 2008‐2009 is shown in Fig. 10. 

83

Page 86: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 86/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 10. The dynamics of  the supplementary examinations in pigeons from the six studied farms in March 2008  – May 2009 

The  incidence  of   digestive  parasitic  diseases  detected  in  pigeons  that  were 

supplemetary examined during March 2008‐May 2009 is contained in Table 7. 

Table 7. 

The incidence of  the digestive parasitosis suspected cases after the supplementary 

examinations of  pigeons in March 2008  – May 2009 

Pigeon

s Farm 

Pigeons suspected of  digestive parasitosis 

Mar 

May 

Jun 

Jul 

Sep 

Oct 

Nov 

Jan 

Feb 

Apr 

May 

1.  0  0  0  0  1  0  0  0  1  0  1 

2.  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0 

3. 

4.  0  0  2  0  0  0  0  0  0  0  3 

5.  0  0  0  0  0  0  0  0  0  2  0 

6.  2  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0 

TOTAL  2  0  3  0  3  0  0  0  1  2  4 

In Table 7  is observed  the  incidence of  disease cases  in pigeons examined  following 

additional requests and, based on the clinical picture were suspected of  an ongoing digestive 

parasitosis,  the  ratio  beetween  the  number of   examined pigeons  (124)  and  the number  of  

suspects (15) being relatively low. The dynamics of  digestive parasitosis suspected in the lofts of  pigeons examined following additional requests is depicted in Fig. 11 

84

Page 87: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 87/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 11. The dynamics of  the digestive diseases incidence in pigeons from the six studied farms in March 2008  – May 2009 

The monitoring of  the six farms of  racing pigeons has been regularly made and added 

the  supplementary  investigations  for defining  the  intensivity and extensivity of   the  invasive 

elements and their  transmission to free areas or contamination of  pigeons during training and 

competitions with new parasitic elements and their dissemination at the return to nest. The 

medical history reveals that four of  the six pigeon fanciers use the”stamping‐out'' method  in 

case of  severe disease, removing the specimens from the farm or isolating them in quarantine 

boxes and applying appropriate treatment measures in order to reduce or block the horizontal 

transmission of  disease. Housing spaces for ground holdings (and those suspended uncleaned 

and unsanitized), are a spore‐starting  favorable environment  for the oocysts of  Eimeria, and 

preservation of  eggs of   Ascaridia, and Capillaria eliminated by adult carrier pigeons and  the 

infestation of  the squabs or young pigeons. Any parasitic aggression exerted on the digestive 

tube has direct consequences for the harmonious development of  pigeons, flight capacity and 

also reduce sports performance. Permanent epidemiological surveillance represents the basis 

to prevent the occurrence of  morbid states of  parasitic, infectious, nutritional origin in lofts of  

pigeons and to limit the risk of  transmission of  zoonoses in humans. 

CONCLUSIONS 

Epidemiological  investigations were  conducted during  January 2008  ‐ May 2009 on 

some  lofts  of   racing  pigeons  from  six  private  farms  to  highlight  the  presence  of   invasive 

parasitic elements and the risk of  their dissemination during flight in free areas. 

Of  all cases studied (464 pigeons), 80% were suspected as bacterial or viral diseases, 

10% were suspected as digestive parasitosis (46 pigeons) and 10% as other disorders. 

The clinical expression of  the morbid states was reduced during January‐March 2008, then from April until August, there was an upward curve of  disease which peaked in June. 

85

Page 88: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 88/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

In  the monitored  farms  the  flight was  performed  and  the  pigeons  were  selected 

based  on  their  sports  performance  and  not  their  phenotypic  characters;  the  studies  have 

shown  that  following  sports season,  several pigeons are  lost or  suffering  from  the  insidious 

nature diseases that determine a decrease in resistance to stress and sustained exercise. 

It was noted  the  important  role of  hygiene, proper nutrition, preventive measures 

and  compliance with density, but  above all,  vigilance  and  knowledge of   the most  common 

parasitic diseases  to  intervene  in  time and  to minimize  the  future economic and emotional 

losses. 

During training and sports competitions pigeons fly huge distances (thousands of  km) 

increasing  the  risk  of   disseminating  invasive  elements  (and  not  only)  in  areas  free  of  

infestation followed by the infestation of  other lofts of  pigeons or responsive gallinaceae and 

also  their  contamination when  travelling  endemic  areas  and  infestation  of   the  loft  at  their 

return. 

Pigeons are meant to fly free and  for racing pigeons to return to their nest regardless 

of   where  they  are  released,  requiring  constant  epidemiological  surveillance  and  a  real 

collaboration between fanciers and veterinary service. 

BIBLIOGRAPHY 

1. Bilius, M., 2000 ‐ ,,Paranormal sau intuiție la porumbelul călător’’, Revista Voiajorul. 

2. Iacob, Olimpia, 2002  – Parazitologie  şi clinica bolilor parazitare‐ Protozooze. Ed. “Ion  Ionescu de la Brad” Iaşi pag. 66‐69; 102; 135‐143. 

3. Iacob Olimpia, 2006‐ Parazitologie şi clinica bolilor parazitare la animale  –Helmintoze. Ed. “Ion Ionescu de la Brad” Iaşi pag. ; 344‐ 347; 396‐398; 402‐407 

4. Iftode, Ghe., Georgiana Iftode, Cristina Iftode, Mirela Iftode, 2006  – Porumbeii de agrement şi sport din România. Ed. Lidana, Suceava 

5. Severeanu, I., F. I., Ivana, 1991 ‐ ,,Bolile porumbeilor’’ Ed. Ceres, Bucureşti pag.177‐206 

86

Page 89: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 89/206

 

PRELIMINARY DATA CONCERNING OPTIMIZATION 

OF A PCR‐BASED METHOD FOR MOLECULAR DETECTION 

OF TICK‐BORNE PATHOGENS 

Mariana IONITA 1, D.K. HOWE

2, I.L. MITREA

1, B. STEVENSON

3, Michelle YEARGAN

1UASVM Bucharest, Faculty of  Veterinary Medicine, Splaiul Independentei 105, sector 5, 

050097, Bucharest, Romania, [email protected] 2Department of  Veterinary Science, Gluck Equine Research Center, University of  Kentucky, 

Lexington, KY 40546‐0099, USA; 3Department of  Microbiology, Immunology, and Molecular 

Genetics, College of  Medicine, University of  Kentucky, Lexington, KY 40536‐0298, USA 

Tick‐borne zoonotic infections are among the most diffuse vector borne diseases. Approximately 

10%  of   the  currently  known  867  tick  species  act  as  vectors  of   a  broad  range  of   pathogens (protozoa, rickettsia, spirochaetes and viruses) of  domestic animals and humans, and a significant 

number of  these pathogens are agents of  emerging infectious diseases. One of  the first step for 

tick‐borne risk assessment is the detection of  these pathogens in their vectors. PCR amplification 

of  pathogen DNA using  species‐specific primers  is now  the standard  for pathogen detection  in 

ticks. 

In  this paper are presented  some preliminary data of  our  trials on optimizing  the general and 

particular conditions of  a PCR‐based RLB assay for molecular detection of  Borrelia burgdorferi  – 

the agent of  Lyme disease, one of  the most important tick‐borne zoonotic disease. We used the 

23S‐5S rRNA spacer region of  B. burgdorferi sensu lato as the target for PCR and determined the 

genomic group of  B. burgdorferi sensu stricto (B31 strain) by hybridization of  the PCR product to 

four genomic‐specific oligonucleotide probes  immobilized on a membrane. The PCR was shown 

to be species specific;  in RLB assay the anticipated genomic group  ‐ B. burgdorferi sensu stricto 

was  identified  in  all  positive  samples.  No  cross  hybridization  with  other  genomic  group  were 

registered  in  RLB  assay.  The  genomic  group  was  confirmed  also  by  DNA  sequencing,  and  in 

consequences the  method was validated. 

Key words: ticks, pathogens, detection, Borrelia burgdorferi, PCR, RLB hybridization 

Vector‐borne  diseases  are  currently  considered  a  major  health  risk,  not  only  in 

tropical and subtropical regions, but in temperate regions as well, where climate change could 

create  conditions  suitable  for outbreaks  of   a  such diseases. Predicting  the effects  of  global 

warming on health requires an examination of  the current incidence and distribution of  major 

vector‐borne diseases. Ticks are considered, after mosquitoes, the most important vectors for 

infectious diseases worldwide. Ticks transmit a greater variety of  pathogenic microorganisms 

(protozoa, rickkettsiae, spirochaetes and viruses) than any other arthropod vector group, and 

a significant number of  these pathogens are agents of  emerging infectious diseases (Jongegan 

and Uilenberg, 2004). 

Tick‐borne  zoonotic  infections  are  among  the  most  diffuse  vector  borne  diseases 

(Sambri et al., 2004). Approximately 10% of  the currently known 867 tick species act as vectors 

of   a  broad  range  of   pathogens  of   domestic  animals  and  humans  (Jongejan  and  Uilenberg, 

2004), which cause diseases such as anaplasmosis, babesiosis, ehrlichiosis, Lyme borreliosis, 

and  rickettsiosis  (Estrada‐Pena and  Jongegan, 1999). Lyme borreliosis  is  the most significant 

vector‐borne disease in Europe and the United States. One of  the first step for tick‐borne risk 

assessment is the detection of  these pathogens in their vectors. PCR amplification of  pathogen 

87

Page 90: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 90/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

DNA using species‐specific primers is now the standard for pathogen detection in ticks (Parola 

and Raoult, 2001; Sparagano et al., 1999). 

Tick‐borne  pathogens  (protozoa,  rickettsia or  viruses)  can  co‐exist  in  the  same  tick 

vector or be carried by different tick species, and it is difficult to identify a pathogen in carrier 

animals  or  ticks  which  are  carrying  low  level of   infection.  In  this  situation, molecular  tools, 

particularly amplification of  specific markers using the polymerase chain reaction (PCR) have 

revolutionized detection and identification of  pathogenic organisms (Sparagano et al., 1999). 

Although many useful species‐specific PCR assays have been developed  to detect a 

particular tick‐borne pathogen, however, PCR assays can be  time‐consuming,  labor‐intensive 

and expensive, particularly when testing for multiple pathogens in a large number of  samples. 

For this purpose,  it  is  recommended the use of  a test where  it  is possible  to simultaneously 

detect and differentiate all protozoan and ehrlichial parasites that could possibly be present in 

a vector  ticks or  in  the blood of  an  infected host  (Sparagano et al., 1999). Reverse  line blot 

(RLB)  hybridization,  where  multiples  samples  can  be  analyzed  against  multiple  probes  to 

enable simultaneous detection, fulfils these criteria. 

In  this  paper  we  presented  some  preliminary  data  of   the  trials  on  optimizing  the general and particular conditions of  the PCR‐based RLB assay for molecular detection of  some 

tick‐borne  pathogens,  such  as  Borrelia  burgdorferi    –  the  agent  of   Lyme  disease.  Borrelia 

burgdorferi   sensu  lato,  the  causative  agent  of   the  zoonosis  Lyme  borreliosis  (LB),  is 

transmitted by ticks of  the genus Ixodes (Burgdorfer et al., 1982). The infection may affect the 

nervous system, cause arthritis, or result in a chronic cutaneous manifestation, acrodermatitis 

chronica athrophicans  (Steere, 1989). B. brugdorferi   sensu  lato has been divided  into  three 

groups on the basis of  DNA relatedness: B. burgdorferi  sensu stricto, B. garinii , and B. afzelii  

(Baranton et al., 1992, Canica et al., 1993). 

In  the  study  described here,  we  used  the  spacer  region between  the 5S‐23S  rRNA 

genes  (rDNA) of  Borrelia 

burgdorferi  

sensu  lato as  the  target  for PCR. The 23S and 5S  rRNA genes are tandemly duplicated in the order 23s‐5S‐23S‐5S in B. burgdorferi  sensu lato, and this 

arrangement has not been found in other members of  the genus Borrelia or other eubacteria 

(Schwartz et al., 1992). In the second step, we determined the genomic group of  B. burgdorferi  

sensu  stricto  (B31  strain)  by  hybridization  of   the  PCR  product  to  four  genomic‐specific 

oligonucleotide probes  immobilized on a membrane, testing different conditions,  in order to 

optimize the method for further molecular studies. 

MATERIALS AND METHODS 

Ticks and bacterial strains.  Ixodes  ricinus  ticks were collected  from natural  infested 

cattle  from  some  regions  in  North‐East  of   Romania.  Immediately  after  collection,  the  ticks 

were immersed in 70% ethanol and stored. 

The genomic group of  Borrelia burgdorferi  sensu stricto ‐ B31 strain was used for testing 

the specificity of  PCR and RLB hybridization, in order to optimize the particular conditions for the 

methods. 

Preparation of  DNA extracts from ticks. Ticks were processed as described Schouls et 

al. (1999). Briefly, the ticks were taken from the 70% ethanol solution, air dried, and boiled for 

20 min  in 100  μl of  0.7 M ammonium hydroxide to free the DNA. After cooling, the vial with 

the lysate was  left open for 10 min at 90°C to evaporate the ammonia. The tick lysate either 

was used directly for PCR or was stored at ‐20°C until use. 

PCR amplification. The polymerase chain reaction (PCR) amplification was carried out in a 25‐μl reaction volumes. For the amplification of  Borrelia burgdorferi  sensu lato DNA, each 

88

Page 91: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 91/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

reaction mixture contained the primers 23SN2 and 5SCB (Table 1), and 5μl aliquots of  the B. 

burgdorferi  s.s. DNA and tick extracts. To minimize nonspecific amplification  a touchdown PCR 

program was used: 3 min at 94°C, two cycles of  20 s at 94°C, 30 s at 67°C, and 30 s at 72°C, and 

then  two  cycles  with  conditions  identical  to  the  previous  cycles  but  with  an  annealing 

temperature  of   65°C.  During  subsequent  two  cycles  sets  the  annealing  temperature  was 

lowered by 2°C until  it reached 57°C. Then, an additional 40 cycles each consisting of  20 s at 

94°C, 30 s at 57°C, and 20 s at 72°C, followed the touchdown program, were performed. The 

PCR was ended by an extra incubation for 7 min at 72°C. 

Reverse Line Blot Hybridization. The reverse  line blotting technique was performed 

as  described  by  Schouls  et  al.  (1999).  For  species  identification, Borrelia  PCR  product  were 

hybridized with probes for B. burgdorferi  sensu  lato, B. burgdorferi  sensu stricto, B. afzelii, B. 

garinii . 

DNA  sequencing. The PCR products  from  samples with positive  signal  in RLB assay 

were used  for DNA sequencing  in order to confirm the genotype of  Borrelia burgdorferi  and 

implicit  for validation of  methods. 

RESULTS AND DISCUSSIONS 

For  determining  the  specificity  of   PCR  were  tested  range  of   B.  burgdorferi   sensu 

stricto  (B 31 strain) DNA concentrations: two samples diluted  in water, one pooled with tick 

lysate.  The  last  one  samples  was  added  in  order  to  check  the  potential  presence  of   tick 

inhibitors  for PCR amplification.  In  the PCR were  included also  three different samples with 

tick lysates from Ixodes ricinus, which were not positive in previously PCRs. 

89

Page 92: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 92/206

 

     T    a      b      l    e     1

     O     l     i    g    o    n    u    c     l    e    o    t     i     d    e    p    r     i    m    e    r    s    a    n     d    p    r    o     b    e    s    u    s    e     d     i    n     P     C     R    a    n     d     h    y     b    r     i     d     i    z    a    t     i    o    n    a    s    s    a    y

 

     O     l     i    g    o    n    u    c     l    e    o

      ‐

    t     i     d    e    n    a    m    e

     O     l     i    g    o    n    u    c     l    e    o    t     i     d    e    s    e    q    u    e    n    c    e

     T    a    r    g    e    t    o    r    g    a    n     i    s    m

     T    a    r    g    e    t    g    e    n    e

     N    u    c     l    e    o    t     i     d

    p    o    s     i    t     i    o    n

     R    e     f    e    r    e    n    c    e

     P    r     i

    m    e    r

     5     S     C     B

     2     3     S     N     2

     5     ’     b     i    o    t     i    n

      ‐     G     A     G     A     G     T     A

     G     G     T     T     A     T     T     G     C     C     A     G     G     G

     A     C     C     A     T     A     G     A     C     T     C     T     T     A

     T     T     A     C     T     T     T     G     A     C     C     A

     B    o    r    r    e      l     i    a      b    u    r    g      d    o    r      f    e    r     i    s    e    n    s    u     l    a    t    o

     B    o    r    r    e      l     i    a      b    u    r    g      d    o    r      f    e    r     i    s    e    n    s    u     l    a    t    o

     2     3     S

      ‐     5     S    s    p    a    c    e    r

     2     3     S

      ‐     5     S    s    p    a    c    e    r

     2     4     3

      ‐     2     6     3

     4     6     9

      ‐     4     4     4

     R     i     j    p     k    e    m    a

    e    t    a     l ,     1     9     9     5

     P    r    o

     b    e    s

     S     L     S     S     G     A     A     F  

     5     ’      ‐    a    m     i    n    o

      ‐     C     T     T     T     G     A

     C     C     A     T     A     T     T     T     T     T     A     T     C     T     T     C     C     A

     5     ’      ‐    a    m     i    n    o

      ‐     A     A     C     A     C     C

     A     A     T     A     T     T     T     A     A     A     A     A     A     C     A     T     A     A

     5     ’      ‐    a    m     i    n    o

      ‐     A     A     C     A     T     G

     A     A     C     A     T     C     T     A     A     A     A     A     C     A     T     A     A     A

     5     ’      ‐    a    m     i    n    o

      ‐     A     A     C     A     T     T

     T     A     A     A     A     A     A     T     A     A     A     T     T     C     A     A     G     G

     B    o    r    r    e      l     i    a      b    u    r    g      d    o    r      f    e    r     i    s    e    n    s    u     l    a    t    o

     B    o    r    r    e      l     i    a

      b    u    r    g      d    o    r      f    e    r     i

    s    e    n    s    u

    s    t    r     i    c    t    o

     B .    g    a    r     i    n     i     i

     B .    a      f    z    e      l     i     i

     2     3     S

      ‐     5     S    s    p    a    c    e    r

     2     3     S

      ‐     5     S    s    p    a    c    e    r

     2     3     S

      ‐     5     S    s    p    a    c    e    r

     2     3     S

      ‐     5     S    s    p    a    c    e    r

     4     5     3

      ‐     4     3     0

     3     2     2

      ‐     2     9     9

     3     2     2

      ‐     2     9     8

     3     0     5

      ‐     2     7     8

     R     i     j    p     k    e    m    a

    e    t    a     l ,     1     9     9     5

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

90

Page 93: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 93/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

From  each  PCR  reactions,  5  μl  were  subjected  to  electrophoresis  on  ethidium 

bromide‐stained 1% agarose gel and visualized under UV transillumination (fig. 1). 

In all samples with B. burgdorferi  DNA (B 31 strain non‐diluted, diluted in water) the 

intergenic 23S‐5S spacer gene was amplified, obtaining a visible band of  226 bp (Fig. 1). No any 

differences of  PCR amplification for diluted sample were registered. Also, the sample with B. 

burgdorferi  DNA pooled with tick lysate was amplified in the PCR. This finding, emphasizes that 

there were not tick inhibitors which could affect the amplification reactions in the PCR. 

The three tick lysate samples were not amplified by PCR the B. burgdorferi  intergenic 

23S‐5S spacer gene. 

Fig. 1. Amplificarea specifică (PCR) a spațiatorului intergenic 23S‐5S a rDNA (226 bp) 

‐ Borrelia 

burgdorferi : 1,2,3‐tick lysate; MW‐molecular weight marker; 4‐B. burgdorferi  DNA 

non‐diluted; 5‐B. burgdorferi  DNA diluted in water; 6‐B. burgdorferi   pooled with tick lysate; 7‐

negative control (water) 

Only the intergenic 23S‐5S amplicons were subjected to the RLB assay. For optimizing 

the  conditions  for  RLB  assay,  different  oligonucleotidic  probe  concentrations  were  used, 

ranging  from  10  pmol  to  800  pmol  (Table  2).  In  the  RLB  hybridization,  a  negative  control 

(water),  was  included,  too.  Hybridization  of   PCR  products  to  species‐specific  probes  was 

revealed by chemiluminescence using Super‐Signal substrate (Pierce, Rockford, IL), and images 

were documented with a FluorChem 8800 imaging system (Alpha Innotech, San Leandro, CA). 

MW   4   5   6 7 81  2  3

226

 bp

91

Page 94: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 94/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Table 2 

Oligoprobe 

 final  

concentrations 

tested  

in 

the 

RLB 

assay  

Oligoprobes  Final concentration 

(c‐pmol) 

References 

B. burgdorferi  SL (sensu lato)  100 Schouls et al., 1999

B. afzelii  (AF)  800 Schouls et al., 1999

B. garinii  (GA)  800 Schouls et al., 1999

B. burgdorferi  SS1 (sensu stricto)  100 Schouls et al., 1999

B. burgdorferi  SS2 (sensu stricto)  50 Schouls et al., 1999

B. burgdorferi  SS3 (sensu stricto)  25 Schouls et al., 1999

B. burgdorferi  SS4 (sensu stricto)  10 Schouls et al., 1999

 

Fig. 2. Reverse line blot  hybridization assay  analyses  for  the detection and  identification of  B. 

burgdorferi. The oligonucleotide probes are attached to the membrane in the horizontal 

direction. and the PCR samples applied perpendicularly in the vertical direction. The PCR 

amplicons derived from: 1‐B. burgdorferi  non‐diluted DNA; 2‐B. burgdorferi  DNA diluted in 

water; 3‐negative control (water); 4‐6B. burgdorferi   pooled with tick lysate 

 B. burgdorferi SL

 B. burgdorferi SS3  B. burgdorferi SS4

 B. burgdorferi SS2  B. burgdorferi SS1 

 B. garinii

 B. afzelii

   O   L   I   G   O   N   U   C   L   E   O   T   I   D   E

   P   R   O   B   E   S

PCR Products

1 2  3  4  5  6 

92

Page 95: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 95/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

The PCR was shown to be species specific, and in RLB assay the anticipated genomic 

group ‐B. burgdorferi  sensu stricto was identified in all positive samples. 

The optimal concentration of  the B. burgdorferi  SS oligoprobe was 10 pmol. No cross 

hybridization with other genomic group were registered in RLB assay. 

Three of  the PCR amplicons which have shown positive hybridization in the RLB assay 

were  subjected  to DNA  sequence  analysis,  in  order  to  confirm  the  genomic  group,  and  to 

validate the method. Sequences were determined in both directions  (using the same primers 

individually as  for  the PCR). Sequences were subjected  to National Center  for Biotechnology 

Information  (NCBI)  BLAST  analysis  for  the  homology.  NCBI  BLAST  analysis  revealed  99% 

homology with Borrelia burgdorferi  (strain B31) sensu stricto internal transcribed spacer DNA 

sequences available in Genbank (accession numbers: L30127.1  GI:508388) (fig. 3). 

Therefore, results of  the trials described in this study, confirmed the genomic group, 

and validated the optimal conditions of  the PCR‐based RLB hybridization method, for further 

studies for molecular detection of  tick‐borne pathogens in Romania. 

RLB  was  originally  developed  for  the  identification  of   Streptococci   serotypes 

(Kaufhold  et  al.,  1994).  The  assay  has  been  used  also  for  molecular  identification  of   some parasites such as equine small strongyle species  (Traversa et al., 2007, Cernaska et al., 2009, 

Ionita et al., 2010). 

The first application of  RLB for the detection and differentiation of  pathogens in ticks 

was  developed  for  Borrelia  spirochetes  (Rijpkema,  1995),  for  simultaneously  identify  the 

genomic groups of  B. burgdorferi  sensu lato in ticks collected in the field. The results showed 

that  10  to  35%  of   the  Ixodes  ricinus  ticks  from  The  Netherlands  were  infected  with  B. 

burgdorferi  genospecies. Subsequently, RLB was combined with Ehrilichia spp. (Schouls et al., 

1999), confirming  the previously  findings; on  the other hand,  it  showed, also a high  rate of  

infection with Ehrlichia species (45%), and coinfection with Ehrlichia and two genospecies of  B. 

burgdorferi  RLB  was  then  successfully  applied  for  the  detection  and  differentiation  of   all  known 

Theileria  and  Babesia  species  (Gubbels  et  al.,  1999),  for  the  characterization  of   Babesia 

divergens  in humans (Centeno‐Lima et al., 2003), and novel Theileria and Babesia species were 

discovered through the application of  RLB (Nijhov et al, 2003). Furthermore, RLB was used  for 

detection and differentiation of  many Babesia and Theileria spp. occurring  in  small  ruminants 

(Schnittger et al., 2004). PCR and RLB were used, also to detect and identify B. burgdorferi  sensu 

lato,   Anaplasma  and  Ehrlichia  species,  and  spotted  fever  group  rickettsiae  in  ticks  from 

Southeastern Europe (Christova et al., 2003). Prevalence data for pathogens in ticks can be used 

to assess the risk of  tick‐borne diseases for public health. 

In conclusion, RLB  is a versatile diagnostic tool, which sensitively and simultaneously 

detects and differentiates pathogens  in ticks, blood or tissue. RLB combine PCR amplification 

followed by a hybridization step, resulting in sensitivity up to 100 fold or higher than PCR only. 

CONCLUSIONS 

1. The optimal conditions of  a PCR‐based RLB assay for molecular detection of  Borrelia 

burgdorferi   – the agent of  Lyme disease, one of  the most important tick‐borne zoonotic disease, 

were established. 

2. Amplification and hybridization of  the 23S‐5SrDNA intergenic spacer region provide an 

accurate and rapid method of  determining the presence of  the genomic groups of  B. burgdorferi  

sensu lato. 

93

Page 96: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 96/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

3. The PCR was shown  to be species specific;  in RLB assay  the anticipated genomic 

group ‐B. burgdorferi  sensu stricto was identified in all positive samples. No cross hybridization 

with other genomic group were registered in RLB assay. 

4. The genomic group was confirmed by DNA sequencing; the optimal conditions for 

the  PCR‐based  RLB  hybridization  method  were  validated  for  further  studies  for  molecular 

detection of  tick‐borne pathogens in Romania. 

ACKNOWLEDGEMENT 

This  work  was  supported  by  CNCSIS  –  UEFISCSU,  project  number  PNII  –  IDEI  code 

729/2007, director Mariana Ionita, Lecturer, PhD, DVM. 

REFERENCES 

1. 

Baranton G, Postic D, Saint Girons I, Boerlin P, Piffaretti JC, Assous M, Grimont PA., 1992. 

Delineation of  Borrelia burgdorferi  sensu stricto, Borrelia

 garinii  sp. nov., and group VS461 

associated with Lyme borreliosis. Int J Syst Bacteriol.;42(3):378‐83. 

2. 

Burgdorfer  W,  Barbour  AG,  Hayes  SF,  Benach  JL,  Grunwaldt  E,  Davis  JP.,  1982.  Lyme 

disease‐a tick‐borne spirochetosis?. Science. 18;216(4552):1317‐9. 

3.  Canica M.M., Nato F., du Merle L., Mazie  J.C., Baranton G., Postic D., 1993. Monoclonal 

antibodies  for  identification  of   Borrelia  afzelii   sp.  nov.  associated  with  late  cutaneous 

manifestations of  Lyme borreliosis. Scand J Infect Dis.;25(4):441‐8. 

4. 

Centeno‐Lima S, do Rosário V, Parreira R, Maia AJ, Freudenthal AM, Nijhof  AM, Jongejan 

F.,  2003.  A  fatal  case  of   human  babesiosis  in  Portugal:  molecular  and  phylogenetic 

analysis. Trop Med Int Health.;8(8):760‐4. 

5. 

Cernaska,  D.,  Paoletti,  B.,  Kral’ova‐Hromadova,  I.,  Iorio,  R.,  Cudekova,  P.,  Milillo,  P., Traversa, D., 2009. Application of  a  reverse  line blot hybridisation assay  for  the species‐

specific  identification  of   cyathostomins  (Nematoda,  Strongylida)  from  benzimidazole‐

treated horses in the Slovak Republic. Vet. Parasitol. 160, 171–174. 

6.  Christova  I,  Van  De  Pol  J,  Yazar  S,  Velo  E,  Schouls  L.,  2003.  Identification  of   Borrelia 

burgdorferi  sensu  lato,  Anaplasma  and  Ehrlichia  species,  and  spotted  fever  group 

Rickettsiae in ticks from Southeastern Europe. Eur J Clin Microbiol Infect Dis.;22(9):535‐42 

7. 

Estrada‐Pena  A.,  Jongejan  F.,  1999.  Ticks  feeding  on  humans:  a  review  of   records  on 

human‐biting  Ixodoidea  with  special  reference  to  pathogen  transmission.  Exp  Appl 

Acarol.;23(9):685‐715. 

8. 

Estrada‐Pena  A.,  2009.  Tick ‐borne   pathogens,  transmission  rates  and   climate  change. 

Front Biosci., 1;14:2674‐87 

9. 

Gubbels JM, de Vos AP, van der Weide M, Viseras J, Schouls LM, de Vries E, Jongejan F., 

1999. Simultaneous detection of  bovine Theileria and Babesia species by reverse line blot 

hybridization. J Clin Microbiol.; 37(6):1782‐9. 

10. 

Ionita M, Howe DK, Lyons ET, Tolliver SC, Kaplan RM, Mitrea IL, Yeargan M., 2010. Use of  a 

reverse  line  blot  assay  to  survey  small  strongyle  (Strongylida:  Cyathostominae) 

populations  in horses before and after  treatment with  ivermectin. Vet Parasitol.;168(3‐

4):332‐7 

11.  Jongejan  F,  Uilenberg  G.,  2004.  The  global  importance  of   ticks.  Parasitology.  2004;129 

Suppl:S3‐14 

94

Page 97: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 97/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

12.  Kaufhold A., Podbielski  A., Baumgarten  G., Blokpoel  M.,  Top  J.,  Schouls  L.,  1994.  Rapid 

typing of  group A streptococci by the use of  DNA amplification and non‐radioactive allele‐

specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiol letters; 119(1‐2):19‐25 

13. 

Nijhof  A.M., Penzhorn B.L., Lynen G., Mollel J.O., Morkel P., Bekker C.P., Jongejan F., 2003. 

Babesia bicornis  sp. nov. and Theileria bicornis  sp. nov.:  tick‐borne parasites associated 

with mortality in the black rhinoceros (Diceros bicornis). J. Clin Microbiol, 41(5):2249‐54 

14. 

Parola P, Raoult D., 2001. Tick‐borne bacterial diseases emerging in Europe. Clin Microbiol 

Infect.; 7(2):80‐3. Review. 

15.  Rijpkema  S.G.,  Molenboer  M.J.,  Schouls  L.M.,  Jongejan  F.,  Schellekens  J.F.,  1995. 

Simultaneous detection and genotyping of  three genomic groups of  Borrelia burgdorferi 

sensu  lato  in  Dutch  Ixodes  ricinus  ticks  by  characterization  of   the  amplified  intergenic 

spacer region between 5S and 23S rRNA genes. J. Clin Microbiol, 33(12):3091‐5 

16.  Schnittger L, Yin H, Qi B, Gubbels MJ, Beyer D, Niemann S, Jongejan F, Ahmed JS., 2004. 

Simultaneous  detection  and  differentiation  of   Theileria  and  Babesia  parasites  infecting 

small ruminants by reverse line blotting. Parasitol Res.; 92(3):189‐96 

17. 

Schouls L.M., Van De Pol I., Rijpkema S.G., Schot C.S., 1999. Detection and identification of  Ehrlichia, Borrelia burgdorferi sensu  lato, and Bartonella  species  in Dutch  Ixodes  ricinus 

ticks. J Clin Microbiol., 37(7):2215‐22 

18. 

Schwartz JJ, Gazumyan A, Schwartz I., 1992. rRNA gene organization  in the Lyme disease 

spirochete, Borrelia burgdorferi. J Bacteriol. ; 174(11):3757‐65. 

19.  Sparagano  OA,  Allsopp  MT,  Mank  RA,  Rijpkema  SG,  Figueroa  JV,  Jongejan  F.,  1999. 

Molecular detection of  pathogen DNA in ticks (Acari: Ixodidae): a review. Exp Appl Acarol.; 

23(12):929‐60. 

20. 

Steere AC., 1989., Lyme disease. N Engl J Med.; 321(9):586‐96. 

21. 

Traversa, D., Iorio, R., Klei, T.R., Kharchenko, V.A., Gawor, J., Otranto, D., Sparagano, O.A., 

2007.  New method  for  simultaneous  species‐specific  identification of  equine  strongyles (Nematoda,  Strongylida) by  reverse  line  blot hybridization.  J. Clin. Microbiol. 45, 2937–

2942. 

95

Page 98: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 98/206

 

PROPOFOL ANAESTHESIA IN DONKEYS IN COMBINATION 

WITH CHLORAL HYDRATE 

Ismail, S.F

 ; Abd

 Al

‐Galil,

 A.S.A

 and

 Gehan,

 B.A.Youssef 

 

Dept. of  Surgery, Anaesthesiology and Radiology, Faculty of  Veterinary Medicine 

Benha University.Egypt 

Abstract 

The anesthesia characterized by bad quality  induction with  strong nervous manifestation after 

chloral hydrate injection. Nearly all body reflexes disappeared after propofol infusion. . 

Complete  analgesia  and  sedation was  achieved  at  4 minutes  after  injection where  the  animals 

showed no responses to any painful stimuli. 

The  heart  rate  in  this  group  showed  gradual  increase  while  the  respiratory  rate  and  body 

temperature were showed significant decrease. 

The recovery of  the animals characterized by both of  the pedal and anal reflexes appeared at 39 minutes after propofol injection .Complete recovery of  the animals occurred at 95 minutes with 

tinny smooth recovery without any signs of  nervous manifestation 

INTRODUCTION 

Propofol  is  an  alkyl  phenol  derivatives  (  2,  6  di‐iso‐propyl‐phenol).  Only  slightly 

soluble in water and commercially present as an aqueous emulsion containing propofol ( 10mg 

/ ml  ), glycerol  (100mg/ml), soya bean oil  ( 22.5 mg/ml), egg  lecithin  (12mg/ml) and sodium 

hydroxide to adjust PH. (Branson and Gross, 1994). 

Propofol  is non barbiturate and relatively non cumulative  intravenous anesthetic agent with rapid  onset  and  recovery.  It  produce  smooth  induction with  possibility  of  maintenance  by 

intermittent injection ( Muir et al.,2007) 

Its  effects  are  similar  to  that  of   Sodium  Pentothal.  It  provides  no  analgesia.  Yet  in  some 

studies, when patients  receive propofol compared to  inhalation agents  for anesthesia, post‐

operative pain is less after propofol. 

Propofol is a potent hypnotic currently formulated as oil in water emulsion. Propofol is a short 

acting,  rapidly  metabolized  intravenous  agent  characterized  in  man  by  virtual  lack  of   any 

cumulative  effect  and  by  rapid  recovery  after  its  administration  in  a  bolus  dose  or  by 

continuous infusion (Branson and Gross, 1994) 

Propofol is highly protein bound in vivo and is metabolized by conjugation in the liver. Its rate 

of  clearance exceeds hepatic blood flow, suggesting an extra‐hepatic site of  elimination as well 

as  It  has  several  mechanisms  of   action,  (Vanlersberghe  and  Camu  ,2008)  both  through 

potentiation  of   GABA‐A  receptor  activity,  thereby  slowing  the  channel  closing  time,  ( 

Krasowski, Hong , Hopfinger and Harrison ,2002) and also acting as a sodium channel blocker 

(Haeseler and Leuwer ,2003) 

( Haeseler , Karst , Foadi , Gudehus , Roeder , Hecker , Dengler and Leuwer, 2008) 

Recent research has also suggested the endocannabinoid system may contribute significantly 

to propofol's anesthetic action and to its unique properties.( Fowler, 2004) 

Propofol  is a short acting hypnotic unrelated to other general anesthetic agents. Propofol  is 

provided  in  sterile glass ampoule  contains no preservatives;  there  fore  the  formulation will 

support microbial growth and end toxin production (Arduino, Bland

 and

 Allister,

 1991). Those 

96

Page 99: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 99/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

authors added that, because of  the microbial growth and the risk of   infection and sepsis any 

unused propofol should be discarded at the end of  the anesthetic procedure. 

Propofol is oil at room temperature and insoluble aqueous solution. The concentration of  

propofol is 10% each 1ml containing  l0 mg of  the active principle. Hui‐Chn lin, Ram and Tom 

(1997). Chloral hydrate presented as colorless translucent crystals and has penetrating odor. It 

metabolized by  liver  into  (tri‐chloro‐ethyl  alcohol), which  in  a  less potent hypnotic.  Chloral 

hydrate  is  a  good  hypnotic  but  a  poor  anesthetic  and  the  amount  needed  to  produce 

anesthesia  approach  the  minimal  lethal  dose  (Reid  ,  Nolan  and  Welsh  (1993)  .  El‐Sayad 

(2006), stated  that  the  injection of  chloral hydrate  in donkeys  followed by propofol  infusion 

lead  to  rapid  induction of  anesthesia. also added  that  chloral hydrate  followed by propofol 

induce long time anesthesia and smooth recovery. 

MATERIALS AND METHODS 

The present  study was  carried out on 20 donkeys. Collected  from  the  suburban of  

kalyobia governorates were used as experimental model .The animals were apparently healthy 

and  their ages  and body weights were  ranged  from 3‐4  years  and 120‐150  kg  respectively. 

These animals were  collected  to  investigate  the pilot efficacies of  propofol alone as well as 

propofol  combination  with  other  anesthetic  drugs,  according  to  their  physiological, 

hematological, and neuromuscular effects. 

All  animals  were  fasted  for  about  12  hours  and  freely  given  water  before  being 

investigated. These investigations were classified into two main parts 

Before each injection, the  jugular vien was cannulated on disinfected clipped skin, the weight 

of  the animal was estimated and the dose of  each anesthetic drug was calculated. 

The  clinical  signs  of   the  anesthetic  regimen  including:  assessments  of   its  analgesic  effect, 

duration of  its action as well as the time of  its recovery were recorded. The effect of  the regimen on the heart and respiratory rates as well as the body temperature 

were also measured and tabulated. They were recorded before each  injection (0.0 time) and 

at 5, 10, 20, 30, 60, 120, 180 minutes after injection. 

The anesthesia of  each regimen was maintained for 30 minutes and the animals were 

put under observation  recording  the physiological and  the clinical changes until  the animals 

become in the sternal and then in the standing position. 

A catheter was inserted in the other  jugular vein for blood sampling. The blood samples were 

obtained before injection of  each regimen (0.0 time) and at 15, 30, 60 minutes and at 24 hours 

for the estimation of  blood picture, as well as for liver and kidney function tests. 

The animals were injected slowly with 10% chloral hydrate solution in a dose of  5 mg/ 50  kg body weight  then  the anesthesia was maintained by  intravenous  infusion of  0.2mg  / 

kg/minute propofol diluted in 5 % dextrose in a ratio of  1:4 respectively. 

RESULTS 

The  anesthesia  characterized  by  bad  quality  induction,  all  animals  of   this  group 

showed  strong  nervous  manifestation  after  chloral  hydrate  injection  (5  mg/  50  kg  body 

weight) with tremors in the muscles of  the limbs, head, neck and the back of  the animals. The 

animals let down on the ground 3 minutes after injection. 

Nearly all body reflexes disappeared after propofol  infusion. No anal or perennial reflexes by 

using strong stimuli. The eye reflexes disappear but the eye pupil reflex persist for 4 minutes 

97

Page 100: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 100/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

then disappeared. Complete analgesia and sedation was achieved at 4 minutes after  injection 

where the animals showed no responses to any painful stimuli. 

The heart rate  in this group showed gradual  increase  from the preanesthetic value up to 20 

minutes (Peak) then returned to normal 2 hour after injection as shown in table (1) 

The  respiratory  rate showed significant decrease 20 minutes after  injection  (without apnea) 

then returned back 3 hour after injection as shown in table (1) The body  temperature  showed  significant decrease  throughout  the  time of   the anesthesia, 

this decrease of  the body temperature was evidenced by shivering of  the animals especially 

during the recumbancy period as shown in table (1) 

The  recovery of  the animals of  this group characterized by shivering of   the animals, both of  

the pedal and anal reflexes appeared at 39 minutes after propofol injection, long recumbancy 

period,  the  animal  raise  its  head but  still  recumbent  and  finally  the  animal  became  in  the 

standing position after several trails to stand, then complete recovery of  the animals occurred 

at 95 minutes with tinny smooth recovery without any signs of  nervous manifestation. 

Blood 

analysis: 

Blood analysis of  the animals given propofol/ chloral hydrate was shown in table 2and 3. 

Haemogram: 

The  red blood  cells  (RBCs)  in  this group  showed non  significant  changes  (7.70 ±1.82) when 

compared  to  the  base  line  value  (7.75  ±1.75) while  the white  blood  cells  (WBCs)  showed 

gradual decrease (7.87 ±0.90) when compared to the base line value (8.30 ±0.92), as shown in 

table 8 and figure 36 and 37 respectively . 

The hemoglobin  (Hb)  showed non  significant  changes  (12.34 ±0.85) when  compared  to  the 

base  line  value  (12.78 ±1.11) while  the packed  cell  volume  (PCV)  showed gradual decrease 

(44.67 ±2.08)when compared to the base line value (46.33±2.52), as shown in table (2) . 

GPT  showed gradual decrease  (64.33 ±11.15) when compared  to  the base  line value  (69.00 

±11.14) while GOT showed non significant changes (64.00 ±38.97) when compared to the base 

line value (64.00 ±43.59), as shown in table (3) 

The  cholesterol  showed  sudden  increase  15 minutes  after  injection  then  gradual  decrease 

(143.00 ±15.87) when compared to the base  line value (148.67 ±15.53) and the total protein 

showed  gradual  decrease  (5.87  ±0.78) when  compared  to  the  base  line  value  (6.03  ±0.80) 

while the glucose level showed abrupt increase 15 minutes after injection then returned back 

to gradual  increase  (99.67 ±2.89) when compared  to  the base  line value  (73.33 ±10.97), as 

shown in table (3) 

The creatinine showed gradual decrease (1.44 ±0.25) when compared to the base  line value 

(1.52 ±0.36) while the urea concentration showed  increase (24.67 ±5.13) when compared to the base line value (22.67 ±5.03), as shown in table (3) 

The  albumin  showed non  significant  changes  (2.64 ±0.36) when  compared  to  the base  line 

(2.76 ±0.30) while the A/G showed gradual increase (0.91 ±0.10) when compared to the base 

line (0.85 ±0.04), as shown in table (3) 

98

Page 101: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 101/206

 

    T    i   m   e

     p   a   r   a   m   e    t   e   r

   s

      0

      5

      1    0

      2    0

      3    0

      6    0

      1    2    0

      1    8    0

 

    H   e   a   r    t   r   a    t   e

 

    6    3

    ±    5 .    2

    9

    6    4 .    6

    7    ±

    1    8 .    1

    5

    6    7

    ±    1    8 .    3

    6

    6    8

    ±    1    6 .    8

    2

    6    4 .    6

    7

    ±    1    3 .    8

    0

    6    6 .    6

    7

    ±    1    3 .    3

    2

    5    8 .    3

    3

    ±    6 .    8    1

    5    8 .    6

    7

    ±    7 .    6

    4

    R   e   s   p    i   r   a    t   o   r

   y

 

    1    8 .    6

    7

    ±    2 .    0

    8

    1    4    ±

    2 .    6

    5

    1    3

    ±    2 .    6

    5

    1    2 .    6    7

    ±    2 .    5

    2

    1    4 .    6

    7

    ±    1 .    1

    5

    1    5 .    6

    7

    ±    1 .    5

    3

    1    5 .    6

    7

    ±    2 .    0    8

    1    6 .    3

    3

    ±    0 .    5

    8

    T   e   m   p   e   r   a    t   u

   r   e

 

    3    7 .    4

    7

    ±    0 .    6

    4

    3    6 .    0

    7    ±

    0 .    1

    2

    3    6 .    2

    ±    0 .    5

    2

    3    6 .    1    7

    ±    0 .    3

    8

    3    6 .    2

    3

    ±    0 .    2

    5

    3    6 .    5

    7

    ±    0 .    3

    1

    3    6 .    6

    ±    0 .    6    9

    3    6 .    7

    7

    ±    0 .    4

    9

 

    T   a    b    l   e     (    1     )   :    S    h   o   w    i   n   g    t    h   e   c    h   a   n   g   e   s    i   n    t    h   e    h   e   a   r    t ,

   r   e   s   p    i   r   a    t   o   r   y   r   a    t   e   a   n    d    b   o    d   y    t   e   m   p   e   r   a    t   u   r   e

 

    T   a    b    l   e     (

    2     )   :    E    f    f   e   c    t   o   n    b    l   o   o    d   p    i   c    t   u   r   e   s   a   m   p    l   e   s     (    R    B    C   s ,    W    B    C   s ,    H    b   a   n    d    P    C    V     )

 

    T    i   m

   e

      P   a   r   a   m

   e    t   e   r   s

    0

    1    5

    3    0  

    6    0  

    2    4    h

 

    R    B    C   s

    (   m    i    l    l    i   o

   n     /   c   m   m    )

    7 .    7

    5

    ±    1 .    7

    5

    7 .    6

    4

    ±    1 .    5

    8

    7 .    7

    0

    ±    1 .    8

    2

    7 .    4

    7

    ±    1 .    3

    9

    7 .    6

    4

    ±    1 .    6

    8

    W    B    C   s

    (   c   e    l    l     /   c

   m   m    )

    8 .    3

    0

    ±    0 .    9

    2

    7 .    9

    3

    ±    1 .    0

    1

    7 .    8

    7

    ±    0 .    9

    0

    8 .    2

    0

    ±    0 .    6

    6

    8 .    4

    0

    ±    0 .    7

    0

    H    B

    (   g   m     /    d

    l    )

    1    2 .    7

    8

    ±    1 .    1

    1

    1    2 .    5

    1

    ±    0 .    7

    1

    1    2 .    3

    4

    ±    0 .    8

    5

    1    2 .    1

    1

    ±    0 .    8

    8

    1    2 .    0

    0

    ±    0 .    6

    6

    P    C    V    %

    4    6 .    3

    3

    ±    2 .    5

    2

    4    6 .    0

    0

    ±    1 .    0

    0

    4    4 .    6

    7

    ±    2 .    0

    8

    4    3 .    6

    7

    ±    3 .    2

    1

    4    7 .    0

    0

    ±    3 .    6

    1

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

99

Page 102: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 102/206

 

    T   a    b    l   e     (    3     )   :   e    f    f   e   c    t   o   n    l    i   v   e   r   a   n    d    k    i    d   n   e   y

    f   u   n   c    t    i   o   n   s   o    f   a   n    i   m   a    l   s   g    i   v   e   n   p   r   o   p   o    f   o    l     /

   c    h    l   o   r   a    l    h   y    d   r   a    t   e

 

    T    i   m   e

      P   a   r   a   m   e    t   e   r   s

    0

    1    5

    3    0

    6    0

    2    4    h

 

    G    P    T

 

    (   u     /    L    )

    6    9 .    0

    0

    ±    1    1 .    1

    4

    6    6 .    0

    0

    ±    1    2 .    4

    9

    6    4 .    3

    3

    ±    1    1 .    1

    5

    6    1 .    6

    7

    ±    9 .    5

    0

    6    6 .    0

    0

    ±    1    3 .    8

    9

    G    O    T

 

    (   u     /    L    )

    1    4    8 .    6

    7  

    ±    1    5 .    5

    3

 

    1    5    4 .    3

    3 

    ±    1    4 .    3

    6

 

    1    4    3 .    0

    0 

    ±    1    5 .    8

    7

 

    1

    4    7 .    6

    7 

    ±    1    6 .    0

    4

 

    1    2    8 .    3

    3  

    ±    1    1 .    8

    5

 

    C    h   o    l   e   s    t   e   r   o    l

    (   m   g     /    d    l    )

    6    4 .    0

    0

    ±    4    3 .    5

    9

    6    2 .    3

    3 

    ±    3    5 .    2

    8

    6    4 .    0

    0

    ±    3    8 .    9

    7

    6    3 .    0

    0

    ±    4    0 .    7

    1

    5    9 .    0

    0

    ±    3    6 .    3

    9

 

    C   r   e   a    t    i   n    i   n

    (   m   g     /    d    l    )

    1 .    5

    2

    ±    0 .    3

    6

    1 .    4

    8

    ±    0 .    3

    3

    1 .    4

    4

    ±    0 .    2

    5

    1 .    2

    5

    ±    0 .    1

    6

    1 .    3

    9

    ±    0 .    0

    2

    T   o    t   a    l   p   r   o    t   e    i   n

    (   m   g     /    d    l    )

    6 .    0

    3

    ±    0 .    8

    0

    5 .    8

    5

    ±    0 .    7

    5

    5 .    7

    8

    ±    0 .    7

    8

    5 .    8

    1

    ±    0 .    8

    6

    5 .    9

    0

    ±    0 .    7

    9

    G    l   u   c   o   s   e

    (   m   g     /    d    l    )

    7    3 .    3

    3

    ±    1    0 .    9

    7

    1    0    1 .    6

    7

    ±    1    1 .    0

    2

    9    9 .    6

    7

    ±    2 .    8

    9

    8    6 .    3

    3

    ±    1    2 .    7

    0

    9    4 .    3

    3

    ±    1    0 .    2

    6

    U   r   e   a

    (   m   g     /    d    l    )

    2    2 .    6

    7

    ±    5 .    0

    3

    2    4 .    6

    7

    ±    3 .    7

    9

    2    4 .    6

    7

    ±    5 .    1

    3

    2    5 .    6

    7

    ±    5 .    1

    3

    2    3 .    6

    7

    ±    4 .    1

    6

    A    l    b   u   m    i   n

    (   g   m     /    d    l    )

    2 .    7

    6

    ±    0 .    3

    0

    2 .    6

    6

    ±    0 .    4

    0

    2 .    6

    4

    ±    0 .    3

    6

    2 .    7

    6

    ±    0 .    3

    3

    2 .    5

    9

    ±    0 .    3

    8

    A     /    G    %

    0 .    8

    5

    ±    0 .    0

    4

    0 .    8

    3

    ±    0 .    0

    7

    0 .    8

    4

    ±    0 .    0

    6

    0 .    9

    1

    ±    0 .    1

    0

    0 .    7

    9

    ±    0 .    1

    1

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

100

Page 103: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 103/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

DISCUSSION 

In  this  group  we  avoid  the  adverse  effect  of   high  induction  dose  of   propofol  by 

injection  of   chloral  hydrate  for  induction  of   anesthesia,  and  then  the  maintenance  of  

anesthesia was done by propofol infusion at rate of  0.2 mg/kg/minute. 

Chloral  hydrate was  relatively  good  hypnotic  but  poor  analgesic  as  stated  by  Reid , et

 al.

 (1993) and this showed agreement with our results . 

The  induction of  anesthesia in this group after  injection of  chloral hydrate was rapid 

with severe nervous manifestation as vigorous struggling, tremors and stiffness in head, neck 

and limbs. These finding were agreed with that recorded by Silverman and Muir (1993) , Field 

(1993) and El‐Sayad (2006). 

In this group, the induction of  anesthesia with chloral hydrate produced a bad quality 

induction, so the use of  sedative tranquilizer to improve the bad condition of  the induction of  

anesthesia as reported by (Silverman and Muir (1993). 

The anesthesia was deep  in all animals of  that group and the duration of  anesthesia 

was  longer than that of  propofol alone. This result supported by Silverman 

and 

Muir 

(1993), 

Field (1993) and El‐Sayad (2006). 

The  adverse  effect  of   high  induction  dose  of   propofol was  avoided  by  injection  of   chloral 

hydrate, so  the marked changes  in cardio  respiratory parameters were not observed, as  the 

heart rate showed non significant increase in this group. This finding was similar to that stated 

by El‐Sayad (2006) in donkeys. 

The respiratory rate in this group showed significant decrease at the first 20 minutes 

then  returned back by  time  to  the base  line  level. This  result showed agreement with Field 

(1993) who added that the respiratory depression occurred in horses anesthetized with chloral 

hydrate. 

The body  temperature  in  this group  showed  significant decrease and  this decrease 

was evidenced by shivering of  all animals of  this group, this similar to the finding of  El‐Sayad

 

(2006) in donkeys. 

In  this  group  the  recovery  from  combination  of   chloral  hydrate  and  propofol was 

prolonged  than  that  of   propofol  alone  and  this  showed  agreement  with  the  results  of  

Silverman  and  Muir  (1993),  Field  (1993)  and  El‐Sayad  (2006)  in  horses  and  donkeys 

respectively. 

Those authors added that the main disadvantage of  chloral hydrate is that the dose required 

for inducing general anesthesia causes prolonged recovery. 

The  duration  of   recovery  in  this  group  was  95  minutes.  The  animal  take  long 

recumbancy  time  then  begin  to  response  to  external  stimuli,  then  raise  the  head  but  still 

recumbent,  then  attend  to  stand  and  complete  recovery  at  95 minutes. No  nervous  signs recorded.  This  was  augmented  by  Silverman  and  Muir  (1993),  Field  (1993)  and  El‐Sayad 

(2006) in horses and donkeys respectively. 

The  use  of   chloral  hydrate  as  induction  drug  with  propofol  infusion  in  donkeys 

produce  bad  quality  induction  anesthesia,  but  the  anesthesia  was  deep  with  prolonged 

recovery. However the uses of  chloral hydrate reduce the high induction dose of  propofol, so 

reduce the adverse effect and the high cost of  using propofol. 

101

Page 104: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 104/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

REFERENCES 

Arduino M. J., Bland L. A. and McAllister S. K. (1991): Microbial growth and endotoxin production  in the intravenous 

anaesthetic of  propofol .Intec Control Hosp Epidem, 12: 535‐539. 

Branson  K, R and M, E. Gross (1994): Propofol in veterinary medicine; J. Am .Vet. Med. Assoc,; 1292  ‐

1246. 204(12): 1888‐1890. El‐Sayad, A. M. M. (2006): Using of  propofol as a general anesthetic in equine in comparison with other 

anesthetics. M.V.Sc.Thesis. Tanta univ. Kafr‐El‐ sheikh branch 

Field, Sc.  (1993): Cardiovascular and  respiratory effects of  propofol administration  in hypovolemic dogs. 

Am.J. Vet. Res.; 53: 2323 ‐2327. 

Fowler,  CJ.(2004):  "Possible  involvement  of   the  endocannabinoid  system  in  the  actions  of   three 

clinically used drugs." Trends Pharmacol. Sci. Feb;25(2):59‐61. 

Haeseler G, Karst M,  Foadi N, Gudehus  S, Roeder A, Hecker H, Dengler R,  Leuwer M.(2008):  High‐

affinity blockade of  voltage‐operated skeletal muscle and neuronal sodium channels by halogenated 

propofol analogues. British Journal of  Pharmacology. Sep;155(2):265‐75. 

Hui‐Chu

 Lin.;Ram,BC,

 And

 Tom,TA.

 (1997): Anesthesia in sheep with propofol or with xylazine  ‐ ketamine 

followed by halofhane. Veterinary Surgery; 26: 247‐252. 

Haeseler G, Leuwer M. (2003): High‐affinity block of  voltage‐operated rat IIA neuronal sodium channels 

by  2,6  di‐tert‐butylphenol,  a  propofol  analogue.  European  Journal  of   Anaesthesiology. 

Mar;20(3):220‐4. 

Krasowski  ,  Hong  X.,  Hopfinger  A.J,  Harrison  N.L.  (2002):  Analysis  of   a  set  of   propofol  analogues: 

mapping  binding  sites  for  an  anesthetic  phenol  on  the  GABA(A)  receptor.  Journal  of   Medicinal 

Chemistry. Jul 18;45(15):3210‐21. 

Muir W.W.,Hubell J.A., Bednarski R.M. and Sharda R.T. (2007): Hand Book of  Veterinary Anesthesia: 4th 

Edn. Chap3. Mosby. An Affiliate of  Elsevier Inc. Usa, PP: 140‐163. ISBN: (13‐978‐0‐323‐04678‐7), (10: 

0‐323‐046789‐9). DOI. 987654321.URL.WWW.elsevier.com. 

Reid,  J.; Nolan AM.  and Welsh, E.  (1993): Propofol as  induction agent  in  the goat: a pharmacokinetic 

study. J. Vet. Pharmacol. Ther. 16 (4): 488‐493. 

Silverman, K. and Muir, M. (1993): Complications associated with general anesthesia of  the horses. Vet. 

Clin. North Am; 3:45‐60. 

Vanlersberghe C, Camu F. (2008): Propofol. Handbook of  Experimental Pharmacology. ;(182):227‐52. 

102

Page 105: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 105/206

 

GENOTYPING ESTROGEN RECEPTOR POLYMORPHISM IN PIGS, 

USING THE PCR‐RFLP METHOD 

Adina Maria MANEA, S. E. GEORGESCU, Steliana KEVORKIAN, 

Sorina DINESCU, Marieta COSTACHE 

University of  Bucharest, Department of  Biochemistry and Molecular Biology, Spl. 

Independentei 91‐95, sector 5, Bucharest 

Abstract 

The  efficiency  of   livestock   production  is highly   influenced  by   reproductive  success, especially   in 

multipara  species.  In  the  case  of   the   pig,  litter   size  is  a  basic  economic   factor.  Estrogen  is 

intimately   involved  with  pregnancy  and   its  function  is mediated   through  the estrogen  receptor, 

therefore, ER was chosen as a candidate gene to study  litter  size in  pigs. The goal  of  our  study  was 

to 

genotype 

the 

T1665C  

 polymorphism 

in 

Landrace, 

Large 

White, 

Pietran 

and  

Mangalitza 

breeds 

using the PCR‐RFLP method. Our  results showed  that, by  using this technique, it  is easy  to identify  

the homozygous (TT  or  CC), and  heterozygous swine. The method   presented  above is reliable,  fast  

and  cost ‐effective, and  can be successfully  applied  in the marker ‐assisted  selection of  the  pigs. 

Keywords: swine, estrogen receptor gene, polymorphism, PCR‐RFLP. 

INTRODUCTION 

Reproductive traits are of  primary  interest  in  livestock because they play a major role  in the 

efficiency of  production.  Selection  for  increased number of  offspring has been employed  in 

model species like mice (Nielsen, 1994), pigs (Ollivier and Bolet, 1981; Lamberson et  al., 1991; 

Bidanel et  al., 1994) and sheep (Elsen et 

 al., 1994) with only limited success because of  the low 

heritability and the sex‐limited nature of  reproductive traits. 

Steroid  hormones  and  their  receptors  play  an  important  role  in  reproductive  processes 

(O'Malley,  1990).  Cells  in  target  tissues  have  receptor  proteins  that  specifically  bind  the 

hormone during the  initial stage  in  its action. Estrogen  is  intimately  involved with pregnancy 

and its function is mediated through the estrogen receptor (ER). Mutations in this protein have 

been  implicated in spontaneous abortion and in human breast cancer (Lehrer et  al ., 1990). It 

has  been  recently  shown  that  transgenic  mice  containing  a  nonfunctional  ER  gene  have 

considerable  phenotypic  changes  in  the  reproductive  system  (Korach,  1994).  Therefore,  ER 

was chosen as a candidate gene to study litter size in pigs. 

The  first association between  the estrogen  receptor gene and  litter  size was established by Rothschild et  al   in 1996. He highlighted a restriction fragment length polymorphism (RFLP) in 

the  α‐estrogen  receptor gene, T1665C, a polymorphism associated with  reproductive  traits, 

mainly litter size. The results obtained by Rothschild et  al  were later confirmed by Short et  al  

(1997)  and  Chen  et   al   (2000).  In  all  three  studies  a  positive  association  between  allele  B 

(C1665C) and litter size was highlighted. 

Our  goal  was  to  genotype  this  polymorphism  in  the  Landrace,  Large  White,  Pietran  and 

Mangalitza breeds using the PCR‐RFLP method. 

MATERIALS AND METHODS 

We used blood  samples  from 75 pigs of   the  Landrace, Large White, Pietran and Mangalitza 

breeds, (S.C. Romsuintest Periş, S.C. Suinprod S.A. Roman), preserved  in EDTA anticoagulant. 

103

Page 106: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 106/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

The  isolation of   genomic DNA  from  fresh blood was performed with Wizard Genomic DNA 

Extraction Kit (Promega). 

The  PCR  was  performed  using  a  GeneAmp  9700  PCR  System  (AppliedBiosystems).  The 

reactions were carried out  in 25‐μl  final volume containing PCR Buffer, MgCl2, 800μM dNTP, 

0.48  μM  of   each  primer  (F‐CCCTCTATGACCTGCTGCTG;  R‐TCAGATTGTGGTGGGGAAGTC),  0.5 

units  of  AmpliTaq Gold DNA  Polymerase,  diluted DNA  and  nuclease‐free water.  PCRs were 

performed  in 0.2 ml  tubes by 40  cycles with denaturation  at 95ºC  (30s), annealing  at 59°C 

(30s) and extension at 72°C (60s). The first denaturation step was of  10 minutes at 95ºC and 

the last extension was of  10 minutes at 72°C. 

PCR  products  were  detected  by  electrophoresis  in  2%  agarose  gel  stained  with  ethidium 

bromide and then digested with restriction endonuclease  AvaI at 37°C for 3 hours. Restricted 

products were analyzed by electrophoresis in 3.2% agarose gel stained with ethidium bromide. 

For sequencing, we used the same conditions as  in the case of  PCR. The amplified fragments 

were sequenced by ABI Prism 310 Genetic Analyzer, using the ABI Prism ® BigDye Terminator 

Cycle  Sequencing Reaction Kit after purification with  the Wizard  System Kit  (Promega). The 

sequences were processed using DNA  Sequencing Analysis 5.1  Software  (AppliedBiosytems) and the nucleotide sequences were aligned with the BioEdit program (Hall, 1999) and refined 

manually. 

RESULTS AND DISCUSSIONS 

For  the  identification of   the T1665C SNP we used  the PCR‐RFLP method. The set of  primers 

was  designed  to  amplify  only  a  185bp  fragment  from  the  α estrogen  receptor  gene  that 

contains  the  T(1665)C  SNP.  This  polymorphism  creates  a  new  recognition  site  for   AvaI 

restriction  endonuclease  (C(T/C)TG(A/G)→C↓(T/C)CG(A/G)).  The  185pb  contains  another 

restriction site  for enzyme  AvaI, at this site there  is no other polymorphism and the enzyme 

will be cut at this level regardless of  the animal genotype. We consider this site as a digestion control site. 

The PCR conditions were selected  in such a way that the two primers could amplify the DNA 

from homozygote (TT or CC) and heterozygote animals. 

Successful amplification and digestion with  AvaI yielded one, two, three or four fragments of  

47, 60, 78 and 107 bp depending on the homozygote and heterozygote animals analyzed. For 

homozygoteTT  pigs  in  the  1665  position we  obtained  two  bands  of   107  and  78bp  and  for 

homozygoteCC pigs we obtain three bands of  47, 60 and 78bp. In the case of  a heterozygote 

animal, after the digestion with  AvaI restriction endonuclease and electrophoresis, we obtain 

four bands of  47, 60, 78 and 107pb. 

In  our  study we  identified  homozygote  (TT  and  CC)  and  heterozygote  animals  for  the  SNP 

T1665C (Figure 1). 

Figure 1: Electrophoresis pattern of   αestrogen receptor gene fragment after digestion with 

the  AvaI  enzyme. Lines 1, 3, 5, 6  – two fragments of  78 and 107pb, indicate homozygous TT 

pigs; Line 2  – four fragments of  47, 60, 78 and 107pb indicate heterozygous pigs; Line 4  – 

three fragments of  47, 60 and 78pb indicate homozygous CC pigs; Line 7  ‐uncut PCR product; 

Line 8  ‐molecular size marker‐50bp (Promega). 

104

Page 107: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 107/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

To confirm our results we sequenced the 185bp fragment from the α‐estrogen receptor gene. 

Figures 2 and 3  illustrate the profiles of  the homozygous TT and CC pig from the region that 

contains the T1665C SNP. 

Figure 2: The sequence of  the region from the PCR product that contains the SNP T1665C 

inside the recognition site for  AvaI  for a homozygousTT pig. 

Figure 3: The sequence of  the region from the PCR product that contains the SNP T1665C 

inside the recognition site for  AvaI  for a homozygousCC pig. 

The  sequence  alignment  between  a  region  of   the  α‐estrogen  receptor  gene  and  our  PCR 

products from the homozygous (TT and CC) pigs (figure 4) was done using BioEdit programme. 

Figure 4: BioEdit fragment sequence alignment of  a region of  the estrogen receptor gene and 

our PCR products from homozygous (TT and CC) pigs. 

CONCLUSIONS 

The major  focus of   this  study was  to  genotype  the  T1665C polymorphism  from  α‐estrogen 

receptor gene in the Landrace, Large White, Pietran and Mangalitza breeds using the PCR‐RFLP 

method. This method could help breeders in their forward selection strategy especially in the 

marker‐assisted selection. 

Our results showed that, by using this technique, it is easy to identify the animals which have 

the  favorable allele  for reproduction. The method presented above  is reliable,  fast and cost‐

effective,  and  can  be  successfully  applied  in  the  wide‐scale  screening  of   different  pig 

populations. 

105

Page 108: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 108/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

REFERENCES 

Nielsen MK  (1994)  Selection experiments  for  reproductive  rate  in mice Proceedings  of   the  5th World  

Congress on Genetic  Applied  to Livestock  Production (Univ. of  Guelph, Guelph, ON, Canada), 19:219‐

225. 

Ollivier  L and Bolet G  (1981) La  sélection  sur  la prolificité  chez  le porc: Résultats d'une expérience de sélection sur dix générations.  J. Rech. Porcine France 13:261‐268. 

Lamberson WR,  Johnson  RK,  Zimmerman  DR  and  Long  TE  (1991)  Direct  responses  to  selection  for 

increased litter size, decreased age at puberty, or random selection following selection for ovulation 

rate in swine.  J.  Anim. Sci . 69:3129‐3143. 

Bidanel JP, Gruand J and Legault C (1994) An overview of  20 years of  selection for litter size in pig using 

“hyperprolific”  scheme  Proceedings  of   the  5th World  Congress  on  Genetic  Applied  to  Livestock 

Production (Univ. of  Guelph, Guelph, ON, Canada), Vol. 17, pp. 512‐515. 

Elsen JM, Bodin L, Francois D, Poivey JP and Teyssier J (1994) Genetic improvement of  litter size in sheep 

Proceedings of  the 5th World  Congress on Genetic  Applied  to Livestock  Production (Univ. of  Guelph, 

Guelph, ON, Canada), Vol. 19, pp. 237‐243. 

O'Malley  B  (1990)  The  steroid  receptor  superfamily: more  excitement  predicted  for  the  future. Mol. 

Endocrinol ,. 4, 363‐369. 

Lehrer S, Sanchez M, Song HK, Dalton J, Levine F, Savoretti P, Thung SN. & Schachter B (1990) Oestrogen 

receptor  β‐region  polymorphism  and  spontaneous  abortion  in women with  breast  cancer.  Lancet  

335, 622‐624. 

Korach KS.  (1994)  Insights  from the study of  animals  lacking  functional estrogen receptor. Science 266, 

1524‐1527. 

Chen KF, Huang LS, Li N, Zhang Q, Luo M, Wu CX (2000) The genetic effect of  estrogen receptor (ESR) on 

litter size traits in pig. Yi  Chuan  Xue Bao 27:853–857. 

Short TH, Rothschild MF, McLaren DG, Southwood OI, Devries AG, Van der Steen A, Tuggle CK, Helm J, 

Vaske DA, Mileham AJ, Plastow GS (1997) Effect of  the estrogen receptor locus on reproduction and 

production traits in four commercial pig lines.  Journal  of   Animal  Science 75:3138–3142. 

Rothschild MF, Jacobson C, Vaske D, Tuggle C, Wang L, Short TH, Eckardt G, Sasaki S, Vincent A, McLaren D, Southwood O, Van der Steen H, Mileham S and Plastow G (1996) The estrogen receptor  locus  is 

associated with a major gene influencing litter size in pigs. Proc. Natl.  Acad. Sci. USA 93:201‐205 

Hall TA.  (1999) BioEdit: a user‐friendly biological  sequence  alignment editor and analysis program  for 

Windows 95/98/NT. Nucl.  Acids. Symp. Ser . 41:95‐98. 

106

Page 109: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 109/206

 

COMPARATIVE TESTING OF SOME EXPERIMENTAL MODELS OF 

OXYGEN INDUCED RETINOPATHY IN YOUNG RATS. 

HISTOLOGICAL STUDY. 

Miclăuş V1., Anne Claudia Ştef ănuț

2, Adriana Mureşan

3, 

C. Ober1, V. Rus

1FACULTY OF VETERINARY MEDICINE CLUJ‐NAPOCA 

2CLINIC EMERGENCY HOSPITAL CLUJ‐NAPOCA 3UNIVERSITY OF MEDICINE AND PHARMACY 

”IULIU HAȚIEGANU” CLUJ‐NAPOCA, [email protected] 

Abstract: The influence of  O2 concentration on the development  and  maturation of  the retina was 

tested   on  two  groups  of   newborn  rats,  one  group  subjected   to  hyperoxia  and   the  other   to 

variations of 

 the

 concentration

 of 

 O2

 (hyperoxia/hypoxia).

 Results

 were

 assessed 

 on

 histological 

 

sections.  The  occurrence  of   retinal   cytoarchitectural   changes  in  both  experimental   groups  was 

observed, but  with big differences between them. In case of  group with hyperoxia, they  appeared  

only   in some animals  (22%) and  had  regional  character, while  in group with hyperoxia/hypoxia, 

the  procent  was 100% and  tended  to generalize. These aspects demonstrate the negative effects 

of   inadequate  concentration  of   O2  on  retinal   development,  variable  concentration  being  more 

harmful  than a constant  hyperoxia. 

Keywords: rat; retinopathy; histology 

INTRODUCTION 

The newborn rats have an immature visual system and the eyes are closed. After birth, the rat 

visual  system  gradually  matures,  the  eye  opening  can  be  done  after  14  days.  Stage  of  

development  of   retinal  vascularization  in  newborn  rat  is  comparable  to  that  of   an  human 

premature  L4‐5  month  of   gestation  (Gyllensten  and  Hellström,  1954)  and  the  retina  is 

extremely  immature  at birth,  comparable with  that  of   a  human  fetus  of   26 weeks  .  (Ricci, 

1990).  Retinal  vascularization  of   newborn  rats  matures  in  the  first  two  postnatal  weeks 

(Cairns, 1959). Postnatal maturation of  the visual system in rats, make that it can be used as an 

experimental model for diseases that can occur during the final period of  retinal maturation. 

Maturation of  human primary visual system is normally realised on intrauterine life (Dorfman 

et al. 2008). But in premature newborn, the final part of  retinal development and maturation takes  place  extrauterine  (in  incubator)  in  circumstances  that  are  sometimes  different  from 

those optimal, necessary to carry out this delicate process. In some cases, premature humans 

receiving  high  levels  of   O2  in  order  to  compensate  an  unstable  pulmonary  status.  But 

increased  levels of  oxygen, can cause severe vasoconstriction and vaso‐obliteration, followed 

by  an  abnormal  proliferation  of   retinal  vessels  when  it  returned  to  normoxia,  with  the 

occurrence of  oxygen‐induced retinopathy (OIR). Direct relationship between oxygen and OHR 

was  supported  by  several  authors  (Michaelson,  1948,  Campbell  1951, Ashton  et  al.,  1954). 

Dorfman  et  al.  (2008),  confirmed  the  anterior  studies  that  demonstrated  increased 

susceptibility of   the  retina  to hypoxemia  in  the  first week of   life,  saying  that  in addition  to 

vascular  changes which may be  reversible,  cytoarchitectural  irreversible  retinal  changes  can occur.  As  in  human  subjects,  exposure  of   young  rats  to  postnatal  hyperoxia  can  cause 

107

Page 110: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 110/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

apparition of  OIR (Smith et al., 1994; Reynaud et al., 1994; Madan and Penn 2003, Hardy et al., 

2005).  Some  authors  have  argued  that  variation  of   oxygen  concentration  produces  more 

severe  retinopathy  than  just  exposure  to  hyperoxia  (Pennet  al.,  1993,  Penn  et  al.  1995). 

Although there have been numerous  investigations that have attempted to clarify the causes 

for the appearance of  OIR, there are still many questions related to the etiology of  this severe 

disease. 

MATERIALS AND METHODS 

Animals used  in  this study were white rats, Wistar  race,  female with newborns, with a birth 

weight of  about 10g. Experimental study was performed at the Department of  Physiology from 

University  of   Medicine  and  Pharmacy  Cluj‐Napoca.  Three  groups  were  realised:  a  control 

group and two experimental groups. The control group was composed from a female rat and 

her newborn rats(7), which were placed  in an  incubator together with its mother, at 4 hours 

after birth,  in conditions of  normoxia for 21 days. Conditions of   incubation: temperature 23‐

24OC,  cyclic  exposure  12  day/12  darkness,  using  white  artificial  light  200  lux,  feeding  of  

newborn rats being ensured through maternal lactation, ad libitum from the mother. The first experimental group  (hyperoxia group),  consisting  from a  female  rat and  its 9 newborn  rats, 

were placed  in an  incubator  in conditions of  normoxia  for 7 days,  then 5 days of  hyperoxia 

(80%)  and  the  last  9  days,  in  normoxia  conditions  again.The  second  experimental  group 

(hyperoxia/hypoxia group), formed  from a female rat and  its 7 newborn rats, were placed  in 

conditions of  normoxia for 7 days, than then five days in alternating daily periods of  hyperoxia 

(80% for 22  , 5ore) with hypoxia (10% for 1hr), and for hygiene of  the  incubator and mother 

feeding were used 0.5 hours.To achieve hyperoxia, a mobile oxygen concentrator adapted to 

the  incubator was  used,  and  hypoxia was  achieved  by  placing  the  incubator  in  baroroom. 

Slaughter of  the rats was performed on day 21, after a sedation with ketamine 6 mg/kgc (Oana 

et  al.  2006).  The  eye  globes  were  enucleated  for  histopathological  examinations.  An aproximatively  3  mm  incision  was  made  in  the  central  area  of   the  cornea  (to  facilitate 

penetration of   fixative), then eye globes were  fixed  in Stieve mixture  for 24 hours. Then the 

eye  globes  were  sectioned  at  limbus,  under  microscopic  control,  carefully  removing  the 

cornea,  lens and vitreous. The pieces were then dehydrated with ethyl alcohol, clarified with 

butyl alcohol  (n‐butanol) and  included  in paraffin. Serial sections of  5μ thick were obtained, 

then  its were stained with Goldner’s trichrome method. Examination of  stained sections was 

made at an Olimpus BX41 microscope. 

RESULTS AND DISSCUTIONS 

Young  rats  from  the  control  group,  showed  after  21  days  from  starting  the  experiment  a 

normally developed retina, with typical layout  in layers and normal vascularization (Fig. 1). In 

none of  the animals from control group were not identified structural changes, suggesting that 

maintenace  the  rats  under  normoxia  conditions,  ensure  appropriate  conditions  for  normal 

development of   the  retina.  In  case of   rats  from  experimental  group with hyperoxia,  retinal 

structural changes were observed in two of  the nine rats studied. Changes were present in the 

photoreceptor cell layer and had regional character. Were also observed areas where, because 

of   proliferation  of   photoreceptor  cells,  extern  nuclear  layer  presents  regional  thickening, 

resulting in zonal retinal thickening, which appears protruding into the respective area (Fig. 2). 

In other areas, groups of  photoreceptor cells migrated into the internal nuclear  layer (Fig. 3), 

or toward the pigmented layer (Fig. 4) have been identified 

108

Page 111: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 111/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Another situation was observed in the second experimental group, the group with alternation 

hyperoxia  /  hypoxia.  In  this  group  retinal  structural  changes  in  all  animals  studied  were 

identified.They  are  different  regarding  the  extension  from  an  animal  to  another,  observing 

from changes with regional character to the tendency to generalize. Folds more or  less deep 

were also observed, sometimes covering half  of  the thickness of  the retina  (Fig. 5). They are 

formed through zonal separation of  photoreceptor cells,  from  the pigmented  layer.  In other 

areas, polymorphic rossetes both  in shapes and sizes were observed.  (Fig.6.).  In some areas, 

structural disorganisation  is so  important, so that structural components appear mixed, with 

almost complete disappearance of  the characteristic disposition on the layers (Fig.7). The vast 

majority of  structural changes are irreversible. It seems that, largely, these structural changes 

are due to abnormal proliferation of  blood vessels which appear large or very large in optical 

fibers  layer  (Fig. 8). Smaller  vessels are detached  from  these  large vessels, which penetrate 

deeper, where branched  and  appears  to participate  in  structural disorganization, beginning 

with the photoreceptor cell layer, which is partial detached from the pigmented layer. 

Results obtained  in this experiment reveal that prolonged exposure to hyperoxia caused the 

apparition of  regional structural changes, mild or moderate in intensity in some animals taken in  the  experiment.  Beauchamp  et  al.  (2004)  stated  that  continuous  exposure  to  hyperoxia 

favors  vasoconstriction  with  obliteration  and  stop  developing  vessels  towards  the  retinal 

periphery in response to increased levels of  O2. After returning to conditions of  normoxia, an 

exaggerated neovascularization  is unleashed, as a result of   inadequate blood flow, a hypoxic 

one.  (Moore,  1990,  Patz  and  Payne,  1998).  Comparing  with  hyperoxia,  hyperoxia/hypoxia 

alternation  induced severe cytoarchitectural changes having tendency of  generalization, that 

seems to be largely determined by an excessive neovascularization. Somewhat similar results 

were reported by Penn et al. (1993) who said first that variations of  O2 concentration, produce 

a  more  consistent  retinopathy  compared  with  constant  concentrations  (hyperoxia).  In  his 

experimental model  (40/80 O2  concentrations), he obtained  retinopathy  in 66% of   animals studied. By alternating exposure  to O2, 50% one day, next day 10%  in  the  first 14 days and 

then normoxia until day 20, neovascularization was obtained in 100% of  animals taken in study 

(Penn et al. 1994, Berkowitz 1996). Similar results were obtained by Cummingham et al. (2000) 

in their experimental model in which rats were exposed 14 days at alternating concentrations 

of   O2,  followed  by  normoxia,  with  apparition  of   retinopathy  in  100%  of   animals  used  in 

experiments.  Dorfman  (2008)  argued  that  vascular  changes  may  be  reversible,  but 

cytoarchitectural and functional retinal changes are irreversible. 

The  aspects  observed,  confirmed  that  an  inadequate  concentration  of   O2  can  negatively 

influence  the  development  and  maturation  process  of   the  retina.But  these  changes  are 

dependent  on  oxygen  concentration  and  especially  on  its  concentration  variation,  aspects 

good  highlighted  in  the  two  experimental  models  studied.  In  the  group  with  hyperoxia, 

structural  changes  occurred  only  in  some  animals  in  the  study,  but  these  had  a  regional 

character  and  were  not  very  severe.  In  case  of   model  hyperoxia/hypoxia,  retinal 

cytoarchitectural  changes  occurred  in  100%  of   animals  studied,  although  there  were 

differences between  them  in  terms of   extention  and  severity of   injuries. By  comparing  the 

results obtained in two experimental models, the fact that changes in oxygen concentration is 

more harmful than hyperoxia is confirmed. 

109

Page 112: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 112/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

CONCLUSIONS 

1.  Results  obtained  in  this  experiment  confirm  that  an  inadequate O2  concentrations may 

adversely  influence  the  development  and maturation  process  of   newborn  rats  retina, with 

appearance  of   cytoarchitectural  changes, whose  extension  and  severity  are  dependent  on 

oxygen concentration and especially its concentration variations. 

2.  In case of  group exposed to constant hyperoxia, only  in 22% of  animals studied moderate 

severity  structural  changes occurred, with  regional  character,  affecting only  a  small  part of  

photoreceptor cells. 

3.  In  case  of   group  exposed  to  hyperoxia/hypoxia,  in  100%  of   animals  studied  appeared 

cytoarchitectural  bilateral  retinal  changes,  severe  and  in  most  cases  with  tendency  of  

generalization and irreversible trend, with some differences from one animal to another. 

4. By comparing the results obtained  in two experimental models,  is confirmed the  fact that 

variation  of   oxygen  concentration  is  more  harmful  than  hyperoxia,  causing  severe  and 

irreversible cytoarchitectural abnormalities, with retinal functional failure. 

Fig.1. Control group ‐ normal structure (Goldner’s Trichrome ob. 40X) 

Fig. 2. Hyperoxia group (Goldner’s Trichrome ob. 40X ) 

1. 

Regional  thickening

 of 

  photoreceptor 

 cells

 layer 

 

2.  Regional  thickening of  the retina 

1

2

110

Page 113: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 113/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 3. Hyperoxia group (Goldner’s Trichrome ob. 40X ) 

1. 

Group of   photoreceptor  cells migrated  in internal  nuclear  layer  

Fig. 4. Hyperoxia group (Goldner’s Trichrome ob. 40X) 

1. 

Group of 

  photoreceptor 

 cells

 migrated 

 toward 

  pigmented 

 layer 

 

111

Page 114: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 114/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig.5. Hyperoxia/hypoxia group ( Goldner’s Trichrome ob. 40X) 

1.  Deep  folds, 2. Regional  thinness of  the internal  nuclear  layer  

Fig. 6. Hyperoxia/hypoxia group (Goldner’s Trichrome ob. 40X) 

1.  Polymorph rossetes 

2. 

Regional  disasapearance of  the rods and  cones 

3. 

Fig. 7. Hyperoxia/hypoxia group (Goldner’s Trichrome ob. 40X ) 

1. 

Structural  disorganization

 of 

 the

 1‐5 layers

 

2. 

Regional  thinness of  the internal  nuclear  layer  

1

2

1

2

112

Page 115: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 115/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 8. Hyperoxia/hypoxia group (Goldner’s Trichrome ob. 40X) 

1.  Exaggerated  angiogenesis 

2.  Polymorph rossetes 

3. 

Regional  disasapearance of  the rods and  cones 

REFERENCES 

1.  Ashton N, Ward B, Serpell G., Effect of  oxygen on developing retinal vessels with particular 

reference to the problem of  retrolental fibroplasia. Br J Ophthalmol 1954; 38:397‐432. 

2. Beauchamp MH, Sennlaub F, Speranza G, et al. Redox‐dependent effects of  nitric oxide on microvascular  integrity  in oxygen‐induced  retinopathy. Free Radic Biol  Med . 2004;37(11):1885–

1894. 

3.  Berkowitz BA. Adult and newborn rat  inner retinal oxygenation during carbogen and 100% 

oxygen breathing. Invest  OphthalmolVis Sci. 1996;37:2089–2098. 

4.  Cairns  J.E.,  Normal  development  of   the  hyaloid  and  retinal  vessels  in  the  rat”‐Brit.  J. 

Ophthal.1959 43, 385 

5.  Campbell K.,  Intensive oxygen  therapy as a possible  cause of   retrolental  fibroplasia; a 

clinical approach. Med J Aust 1951;2:48‐50. 

6.  Cunningham S, McColm JR, Wade J, Sedowofia K, McIntosh N, Fleck B., A novel model of  

retinopathy of  prematurity simulating preterm oxygen variability in the rat. Invest Ophthalmol Vis 

Sci 2000; 41:4275‐80. 

7. 

Dorfman  A,  Dembinska  O,  Chemtob  S,  Lachapelle  P.,  Early  manifestations  of   postnatal 

hyperoxia on  the  retinal  structure and  function of   the neonatal  rat.  Invest Ophthalmol Vis Sci, 

2008,  49:458–466 

8.  Gyllensten  LJ,  Hellstrom  BE.,  Experimental  approach  to  the  pathogenesis  of   retrolental 

fibroplasia. I. Changes of  the eye induced by exposure of  newborn mice to concentrated oxygen. 

Acta Paediatr Suppl 1954; 43:131‐48. 

9.  Hardy  P,  Beauchamp  M,  Sennlaub  F,  et  al.  New  insights  into  the  retinal  circulation: 

inflammatory  lipid mediators  in  ischemic retinopathy. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 

2005;72(5): 301–325. 

10.  Madan  A,  Penn  JS.  Animal  models  of   oxygen‐induced  retinopathy.  Front  Biosci  2003; 

8:d1030‐43. 

11. 

Michaelson  I.  The mode  of   development of   the  vascular  system of   the  retina with  some observations  on  its  significance  for  certain  retinal  disorders.  Trans  Ophthalmol  Soc  UK 

1948;68:137–80. 

3

113

Page 116: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 116/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

12.  Moore, A.  (1990) Retinopathy of  prematurity Taylor, D eds. Pediatric Ophthalmology 365‐

375 Blackwell Scientific Boston.Patz A.The effect of  oxygen on  immature  retinal vessels.  Invest 

Ophthalmol Vis Sci 1965; 6:4:988‐999. 

13.  Oana  L.,  A.  Timen,  Fl.  Beteg,  Anesteziologie  şi  propedeutică chirurgicală veterinară,  Ed. 

Risoprint, 2006, Cluj‐Napoca. 

14. Patz A, Payne,  JW, Retinopathy of  prematurity  (retrolental  fibroplasia) Tasman, W  Jaegen, EA  eds.  Duane’s  Foundations  of   Clinical  Ophthalmology  ,  (1998)  1‐19  Lippincott  Williams  & 

Wilkins Philadelphia. 

15.  Penn  JS,  Tolman  BL,  Lowery  LA.,  Variable  oxygen  exposure  causes  preretinal 

neovascularization in the newborn rat. Invest Ophthalmol Vis Sci 1993; 34:576‐85. 

16.  Penn  JS,  Tolman BL, Henry MM., Oxygen‐induced  retinopathy  in  the  rat:  relationship  of  

retinal nonperfusion to subsequent neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35:3429‐

35. 

17.  Penn  JS,  Henry  MM,  Tolman  BL.  Exposure  to  alternating  hypoxia  and  hyperoxia  causes 

severe  proliferative  retinopathy  in  the  newborn  rat. Pediatr Res  1994;  36:724‐31.  Erratum  in: 

Pediatr Res 1995; 37:353. 

18.  Reynaud X, Dorey CK., Extraretinal neovascularization  induced by hypoxic episodes  in  the 

neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci.1994;35(8):3169–3177. 

19.  Ricci B., Oxygen‐induced retinopathy in the rat model. Doc Ophthalmol. 1990;74(3):171–177. 

20.  Smith  LE,  Wesolowski  E,  McLellan  A,  Kostyk  SK,  D'Amato  R,  Sullivan  R,  D'Amore  PA., 

Oxygen‐induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35:101‐11. 

114

Page 117: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 117/206

 

EXPRESSION OF THE VIMENTIN MARKER IN DOG MELANIC 

CUTANEOUS TUMORS 

Moussa Raouad.,C Catoi., B Sevastre., M Taulescu., 

P Bolf ă., A Gal., ,F.A Tabaran., A.L Nagy.,C CUC. 

Pathology Department, Faculty of  Veterinary Medicine, 

University of  Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj‐Napoca, Romania, 

Email:[email protected]

Vimentin  is an  intermediate  filament  that  is  expressed  by mesenchymal  and  neuroectodermal 

cells  in  normal  tissues.(4)  Melanoma  showed  positive  staining  of   intermediate  filaments  with 

antibodies to vimentin, with cells containing  large numbers of  melanosomes being stained  less 

strongly  in general. Vimentin  is type  of   intermediate  filaments can distinguish melanoma  from 

undifferentiated carcinoma, but not from lymphoma or sarcoma.(2) 

Methods:  We  investigated  the  immunohistochemical  expression  Vimentin  marker  ,  in  tumour 

tissues  of   4  dog  cutaneous  melanomas  and  2  dog  cutaneous  melanocytomas  as  possible 

evidence  of   marked  cells  by  vimentin  .  In  addition  we  investigated  the  relationship  between 

vimentin expression and macroscopic,microscopic aspect. 

6  cases  were  positive  (2  melanocytoma,  4  melanomas),  ,  6  cases  were  positive 

(2melanocytoma,4melanoma). Percentag of  marked cells by vimentin were between  (65.18%  – 

97.40%).The  high  percentages  of   marked  cells  were  in  melanotic  tumors  no  have  connective 

activity. 

the high percentages were  in melanotic tumors that  localized  in global eye and perineal region 

and  moderate  in  a  buccal  region.  I  did,nt  find  legation  between  percentage  of   vimentin  and 

tumor types (benign or malignant). Conclusions:  the  high  percentage  of   vimentin  immunoreactivity  is  in  perineal  and  global  eye 

region and in melanotic tumors no have connective.the moderate percentage is in buccal region 

and melanic  tumors have a connective activity, and nu exist  legation between  tumor  type and 

percentage of  marked cells. 

Key words: Immunohistochemistry, Vimentin, Melanic Tumors, Dog. 

INTRODUCTION 

Vimentin  (57  kDa)  is  the  most  ubiquituos  intermediate  filament  protein  and  the  first  to  be 

expressed during cell differentiation. All primitive cell types express vimentin but in most non‐

mesenchymal  cells  it  is  replaced  by  other  intermediate  filament  proteins  during 

differentiation.(1‐3) 

Vimentin is expressed in a wide variety of  mesenchymal cell types  fibroblasts, endothelial cells 

etc.,  and  in  a  number  of   other  cell  types  derived  from  mesoderm,  e.g.,  mesothelium  and 

ovarian  granulosa  cells.  However,  in  non‐vascular  smooth  muscle  cells,  vimentin  is  often 

replaced by desmin.  In striated muscle, vimetin  is also replaced by desmin. However, during 

regeneration, vimentin  is reexpressed. Cells of  the  lymfo‐haemopoietic system (lymphocytes, 

macrophages etc.) also express vimentin, sometimes in scarce amounts. ( 3) 

Vimentin  is  also  found  in  mesoderm  derived  epithelia,  e.g.  kidney  (Bowman  capsule), 

endometrium and ovary (surface epithelium), in myoepithelial cells (breast, salivary and sweat 

glands), an in thyroid gland epithelium. In these cell types, as in mesothelial cells, vimentin is coexpressed with cytokeratin. Furthermore, vimentin is detected in many cells from the neural 

115

Page 118: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 118/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

crest.  Particularly  melanocytes  express  abundant  vimentin.  In  glial  cells  vimentin  is 

coexpressed with glial filament acidic protein (GFAP). (3) 

Vimentin  is  present  in  many  different  neoplasms  but  is  particulary  expressed  in  those 

originated from mesenchymal cells Sarcomas e.g., fibrosarcoma, malignt fibrous histiocytoma, 

angiosarcoma, and leio‐ and rhabdomyosarcoma, as well as lymphomas, malignant melanoma 

and schwannoma.(5‐6‐7) 

Melanoma  showed  positive  staining  of   intermediate  filaments  with  antibodies  to  vimentin, 

with cells containing large numbers of  melanosomes being stained less strongly in general.(4) 

This  type  of   intermediate  filaments  can  distinguish  melanoma  from  undifferentiated 

carcinoma, but not from lymphoma or sarcoma.(4) 

The aim of  the present this paper is to use computerized image analysis to measure vimentin 

antibody  in  a  series  of   canine 

melanocytic  tumors  to  assess  density  of   marked  cells  by 

vimentin,  and  to  correlate  percentage  of   marked  cells  by  vimentin  with  macroscopic  and 

microscopic aspect. 

MATERIALS AND METHODS 

●The  material  of   our  investigation  was  constituted  of   cadavers  from  the  discipline  of  

morphopathology and necropsy diagnostic, and also as samples sent  from  the surgery clinic 

and  private  practitioners,  for  diagnostic  purpose.  From  all  cadavers  and  samples  examined 

between  2001–  2010,  6  cases  were  diagnosed  with  4  dog  cutaneous  melanomas  and  2 

melanocytomas. 

● The samples were formalin fixed, then tissue sections  were stained with hematoxylin and 

eosin for histology study. 

●For  Immunohistochemistry  (IHC),  tissue  sections  of   test  samples  were  stained 

for  CD31 

(monoclonal Mouse Anti‐Vimentin Clone Vim 3B4, Code‐Nr.m7020, Dako Denmark A/S) and developed

 with the diaminobenzidine (DAB) chromogen. 

●Percentage of  marked cells was assessed randomly by choosing immunolabeled vessels on a 

400x  field  (40x  objective  and  10x ocular)  and  using  an  automated  image  analysis

 system 

(Olympus cell B). 300 cells per tumor were examined. 

Images were  captured by using a microscope  (Olympus BX51) connected  to a video camera 

(Olympus DP25), stored in the digital memory, and shown on the monitor. Manual

 outlining of  

pecentange of  marked cells were then calculated based on image analysis. 

RESULTS AND DISCUSSIONS 

In  the  period  2001  –  2010  in  the  Pathology  Department,  were  diagnosed  4  dog  cutaneous 

melanoma  and  2  dog  cutaneous  melanocytoma  histological  and  with  vimentin 

immunoreaction see to(Table 1) 

116

Page 119: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 119/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Table 1:Results of  dog cutaneous melanotic tumors ( histological , CD31 immunoreaction) 

Number  81958  81693 78773 81783 81084  75688

HISTOL

GY 

Date  04 ‐02‐

2010 

15‐9‐

2009 

01.07.

2005 

03‐11‐

2009 

15‐11‐

2008 

25‐04‐

2001 

Breed  Irish 

Setter 

Doberm

an 

Metis Tickle Giant 

schnauzer 

M/F… 

age 

F 13 

years 

M  9 

yeas 

F 6 years F 7years M 9 years  ‐

Region  Buccal 

cavity 

Mandibu

lar 

Cutaneous‐

sacral, 

Eye 

global 

Neck in 

dorsal 

face 

Knee

Diagnosti

Amelano

tic 

melano

ma 

Junctoin

al 

dermal 

amelano

tic 

melano

ma 

dermal 

amelanotic 

Melanocyto

ma 

amelano

tic 

melano

ma 

Hyperplas

ia 

melanocy

tes 

(lentigo ) 

benign 

Amelano

tic 

melano

ma 

Cells 

microsco

pic type 

Epithelio

id type Epithelio

id type 

Spindle 

type 

Epithelio

id type 

Spindle 

cells 

Epithelio

id 

Nr  of  

mitosis 

3  14 3   7   No  4 

Lymphoc

yte 

infiltrate 

intense  intense reduced moderat

No  reduced

Necrosis  intense  intense reduced reduced No  reduced

Connecti

ve activity 

Yes  Yes No No Yes  Yes

Clark's 

Clasificati

on 

4  4 4 4   ‐ 4

Vimenti

Percenta

ge of  

marked 

cell 

69.18%  64.012% 93,67% 97.40% 65.18%  77.54%

 

117

Page 120: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 120/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Figure (1): Amelanotic melanocma immunoreactivety with vimentin  that stained  a lot of  cells 

in high‐power Field, black arrow indicates to marked cells by vimentin and white arrow 

indicate to fibroblast cell no marked by vimentin.(400x) 

Figure (2) vimentin immunoreactivity with epithelioid melanoma  that stained a moderate 

percentage of  cells Yellow arrows indicate to marked cells and white arrow indicate to cells no 

marked(400x). 

Figure(3): melanocytoma immunorecativity with vimentin  that marked a spindle type cells, 

arrow indicates to these cells. (400x) 

118

Page 121: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 121/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Figure (4) vimentin immunoreactivity with epithelioid melanoma cells, yellow arrow indicate 

to marked cells while white arrow indicate to fibroblast no marked . (1000x). 

●6 cases were positive (2melanocytoma,4melanoma) 

●Percentag of  marked cells by vimentin were between (65.18%  – 97.40%). 

●The  high  percentages  of   marked  cells  were  in  melanotic  tumors  no  have  connective 

activity(fig1), but  the moderate percentages were  in melanotic tumors  that have connective 

activity (fig 2) . 

The  high  percentages  were  in  melanotic  tumors  that  localized  in  global  eye  and  perineal region (fig 1) But the moderate percentage were in  melanotic tumors that localized in buccal 

region.(fig 2) 

●Vimentin did,nt stain  fibroblast  cells and  this  is  inverse what he  said  (refer‐3): Vimentin  is 

expressed in a wide variety of  mesenchymal cell types  fibroblasts, endothelial cells etc.(3) fig‐

4. 

●I did,nt find legation between percentage of  vimentin and tumor types (benign or malignant). 

CONCLUSIONS 

1. 

In  the  interval  2001  –  2010  six  dogs  were  diagnosed  with  cutaneous  melanocytic 

tumours. 

2.  The affected dogs were between 6 and 14 years old. 

3. 

6 cases were vimentin positive (2 melanocytoma , 4 melanoma ) . 

4. 

The high percentage of  vimentin immunoreactivity is in perineal and global eye region 

and the moderate percentage is in buccal region. 

5.  The  high  percentage  of   vimentin  immunoreactivity  is  in  melanotic  tumors  no  have 

connective(2  cases)  activity  and  the  moderate  percentage  is  in  melanic  tumor  have 

connective tissue(4 cases) 

6. 

Vimentin doesn’t stain fibroblast 

7.  It isn’t exist legation between tumor type and percentage of  marked cells by vimentin. 

119

Page 122: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 122/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

REFERENCES 

1‐ Azumi, N., Battifora, H. 1987‐ The distribution of  vimentin and keratin  in epithelial and nonepithelial 

neoplasms. A comprehensive  immunohistochemical study on  formalin‐ and alcohol‐fixed  tumors. Am  J 

Clin Pathol;88:286‐96. 

2‐ Caselitz J, M Jänner, E Breitbart, K Weber, M Osborn., 1983  ‐ Malignant melanomas contain only the 

vimentin type of  intermediate filaments.  Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 400: 43‐51. 

3‐ Katsumoto T., Mitsushima A., Kurimura T. 1990  ‐ "The role of  the vimentin intermediate filaments in 

rat 3Y1 ):579‐84. 

7‐ Ramaekers FCS, Vroom TM, Moesker O, et al. 1985  ‐ The use of  antibodies to  intermediate filament 

proteins in the differential diagnosis of  lymphoma versus metastatic carcinoma. Histochem J.;17:57.cells 

elucidated by  immunoelectron  microscopy  and  computer‐graphic  reconstruction". Biol  Cell   68  (2):  pp. 

139–46. 

4‐ koenig a,  j. wojcieszyn, b.  r. weeks, AND  J. F. MODIANO.,2001‐ Expression of  S100a, Vimentin, NSE, 

and  Melan  A/MART‐1  in  Seven  Canine  Melanoma  Cell  Lines  and  Twenty‐nine  Retrospective  Cases  of  

Canine Melanoma Vet Pathol 38:427–435 

5‐ Lang SH, Hyde C, Reid IN, Hitchcock IS, Hart CA, Bryden AA, Villette JM, Stower MJ, Maitland NJ. . 2002 ‐ Enhanced  expression  of   vimentin  in  motile  prostate  cell  lines  and  in  poorly  differentiated  and 

metastatic prostate carcinoma. Prostate Sep 1;52(4):253‐63. 

6‐Niveditha  SR,  Bajaj  P.,  2003‐ Vimentin  expression  in  breast  carcinomas.  Indian  J  Pathol  Microbiol 

Oct;46(4). 

120

Page 123: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 123/206

 

ON THE SHAPE OF THE ERYTHROCYTES FROM 

SOME HERBIVORE MAMMALS 

S.OANCEA1 , 

G.PAVEL1 , 

 A.V.OANCEA2 

1University of  Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Iasi, 

lioancea@univagro‐iasi.ro 2“Al.I.Cuza”University, Iasi 

The shape of  a normal  erythrocyte  is a biconcave disc  (discocyte) which represents an 

equilibrium state. Red  cells can easily  undergo shape transformations in vitro under  the 

influence of   certain agents and   these  changes are  reversible by   removal  of   causative 

agents by   the addition of  antagonists. On  the other  hand,  there are  some mammals 

which 

have 

elliptical  

erythrocytes 

as 

an 

adaptation 

to 

the 

environment  

and  

way  

of  

life. 

In 

this 

work  

the 

analysis 

of  

the 

erythrocyte 

shape 

 for  

some 

herbivore 

mammals 

is 

 presented. Our  result  shows that  llama has only  elliptical  erythocytes, the cow  and  the 

sheep 

have 

discocytes 

but  

goat  

has 

 percent  

of  

7.3% 

and  

goat  

kid  

17.5% 

as 

elliptocytes. In addition the erythrocyte eccentricity  has been computed  and  it  is 0.87   for  

llama, 0.73  for  goat  and  0.77   for  goat  kid. 

Key words: mammal blood, RBCs, erythrocyte shape 

INTRODUCTION 

The shape of  a normal erythrocyte is a biconcave disc (discocyte) which represents an 

equilibrium  state.  Red  cells  can  easily  undergo  shape  transformations 

in 

vitro  under  the influence of  certain agents and these changes are reversible by removal of  causative agents by 

the  addition  of   antagonists.  The mechanism  by which mature  red  blood  cells  change  their 

shape under physiological and pathological  conditions has been  the  subject of   considerable 

interest. The dominating interpretation of  shape changes  is explained by differential increase 

in surface area of  the two leaflets of  erythrocyte membrane. 

Several  groups  have  reported  that  drug‐induced  shape  changes  of   erythrocytes  as 

elliptocytes are accompanied by alterations  in  their  flow properties  [1]. These alterations  in 

the erythrocytes could be through direct modification of  the cell geometry (surface to volume 

ratio) or  through associated alteration of  the membrane skeleton. Thus an  inter‐relationship 

exists  between  the  capacity  of   the  cell  for  the  shape  change  and  the  deformability  of   its membrane  [2].  Erythrocytes  in  clinical  conditions  are  associated  with  altered morphology 

leading  to  abnormal  rheological  behaviour,  as  observed  in  several  hematological  disorders. 

The  inability of  the erythrocyte to shape alteration contributes to  its early removal  from the 

circulation. Elliptocytes can be seen  in hereditary disorders, such as hereditary elliptocytosis 

[3], or  in acquired disorders,  such as  iron defiency anemia,  infectious anemias,  thalassemia, 

and  in  newborn  babies.  Hereditary  elliptocytosis  and  its  variants  are congenital  hemolytic 

disorders  in  which  erythrocytes  are  either  elongated  into  a  cigar  or  oval  shape  or  are 

poikilocytic  and  bizarrely  shaped. Its  transmission  has  usually  been  described  as autosomal 

dominant. 

On the other hand, there are animals which have normal erythrocytes with a different shape from discocytes. Therefore bird blood and fish blood contain elliptical erythrocytes [4]. 

121

Page 124: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 124/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

The elliptocytosis was detected a 5‐year‐old dog during the evaluation of   lameness. 

The dog's  erythrocytes had  reduced  cellular deformability  and  erythrocyte membranes had 

decreased  mechanical  stability.  Analysis  of   erythrocyte  membrane  spectrin  revealed  an 

increased amount of  spectrin dimmers and DNA analysis detected a β‐spectrin mutation [5]. 

Other mammals have elliptocytes as an adaptation  to the environment and way of  

life. Therefore  it  is  theorized  that  the  size,  shape and hemoglobin  concentration of   camelid 

erythrocytes  play  a  role  in  increasing  the  oxygen‐carrying  capacity  as well  as  the  ability  of  

erythrocytes  to exchange oxygen. Camelid erythrocytes have a  lower MCV  than most other 

species, but a higher RBC count. PCV’s are similar  to or slightly  lower  than other herbivores 

and total hemoglobin concentration in llama blood is high as compared to cattle. This is due to 

the combination of  a higher concentration of  hemoglobin  in  individual erythrocytes and  the 

higher total RBC counts. The high hemoglobin concentration increases the ability of  the cell to 

carry oxygen while the small size and flattened shape provide increased membrane surface for 

oxygen  exchange  (higher  surface/volume  ratio).  In  addition,  it  appears  that  camelid 

hemoglobin  has  characteristics  that  allow  a  higher  saturation  with  hemoglobin  at  lower 

atmospheric oxygen pressure (left shift  in the oxygen dissociation curve). The elliptical shape of   the  camelid  erythrocytes  also  makes  them  much  more  resistant  to  changes  in  blood 

osmolality. In this work the analysis of  the erythrocyte shape for some herbivore mammals is 

presented. 

MATERIALS AND METHOD 

Samples from peripheral mammal’s blood were operated using May‐Grüwald Giemsa 

colorature. With  the  aid  of   the microscope we  obtained  the  photos  and  using  erythrocyte 

planar  images,  we  count  the  normal  erythrocytes  and  the  elliptocytes.  After  that  the 

eccentricity of  these elliptocytes has been determined using the well known formula: 

2

2

1

a

be   −=  

where a and b are the ellipse semiaxes. 

Fig.1,2,3,4,5  shows  the morphology  of   RBCs  under  normal  conditions  for  blood  of  

some herbivore mammals. We can see that caw and sheep have normal discocytes, llama has 

elliptocytes and goat and goat kid have erythrocytes of  various shapes in their blood. 

Fig.1 Erythrocytes from cow blood 

122

Page 125: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 125/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig.2 Erythrocytes from sheep blood 

Fig.3 Erythrocytes from llama blood 

Fig.4 Erythrocytes from goat blood 

123

Page 126: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 126/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig.5 Erythrocytes from goat kid blood 

RESULTS AND

 DISCUSSION

 

Fig. 6 shows the percentage of  normal erythrocytes, elliptocytes and other shape of  RBCs from 

some herbivore mammals. 

0

20

40

60

80

100

120

cow sheep llama goat goat kid

     %

discocytes

elliptocytes

other shape

 

Fig.6 The percentage of  different shape of  RBCs from herbivore mammals 

0.6

0.65

0.7

0.75

0.8

0.85

0.9

0.95

llama

goat

goat kid

 Fig.7 The eccentricity of  elliptocytes from llama, goat and goat 

kid Error bars are 95% confidence intervals and n=20 

124

Page 127: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 127/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Our  results  are  in  good  accordance with  the  other  authors  for  llama  blood  [6],  as 

figure 8 and 9 show. 

Fig.8 Erythrocytes from llama blood (Azwai et al.) 

0.5

0.55

0.6

0.65

0.70.75

0.8

0.85

0.9

0.95

1

llama-personal results

llama-literature

 Fig.9 Comparison of  the elliptocyte eccentricity from llama. Error bars are 95% confidence 

intervals and n=20 

Our results showed that the cow erythrocytes and sheep erythrocytes have discoidal 

shape, for  llama the RBC are elliptocytes and for goat and goat kid blood appear elliptocytes and other different  shapes. From aur  samples  resulted  that goat blood has a percentage of  

7,3% from cells as elliptocytes and 27% other shape, the rest of  65,7%being normal discocytes. 

For goat kid we obtained a higher percentage for elliptocytes (17,5%) than for goat, the other 

shapes being 11,3%, and discocytes71%. 

From  figure  7 we  can  see  that  the  eccentricity  of   llama  elliptocytes  is  0.87  and  it 

higher  than  the  other  animals  (0.73  for  goat  and  0.77  for  goat  kid).  The mean  elliptocyte 

eccentricity  for  our  samples  is  in  accordance  with  the  literature  data  (for  these  data  we 

obtained a main elliptocyte eccentricity 0.901) 

125

Page 128: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 128/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

CONCLUSION 

Llamoid erythrocytes are elliptical and the elliptocyte eccentricity is higher than those 

in other domestic animals  studied  in  this work. The unique morphological  features of   llama 

erythrocytes play a vital  role  in  their ability  to  transport oxygen  to  the tissue adequately on 

environmental  conditions  of   high  altitude.  The  goats  and  goat  kids  have  also  elliptical 

erythrocytes  they  being  adapted  to  the  special way  of   life  by  comparison  with  the  other 

mammals. 

REFERENCES 

1.  Suwalskya M., Gonzáleza R., Fernando Villenab F., Aguilarc L.F., Sotomayor C.P, Bolognind S., 

Zatta P.,  (2009), Structural effects of   tetrachloroauric acid on cell membranes and molecular 

models, Coordination Chemistry Reviews 253, 1599–1606 

2.  Maeda N, Nakajima T., Izumida Y., Suzuki Y., Tateishi N., Seiyama A., Decreased deformability 

of   red  cells  refractory  anemia  and  the  abnormality  of   the  membrane  skeleton,(1994), 

Biorheology, 31(4), 395‐405. 

3.  Debray  F.G.  ,  Ilunga  S.  , Brichard B.  , Chantrain C.  ,  Scheiff   J.M., Vermylen C.,  (2005), Une 

forme  particulière  d’anémie  constitutionnelle  chez  un  nourrisson  de  deux  mois  : 

l’elliptocytose.A particular hereditary anemia in a two‐month‐old infant: elliptocytosis, Archives 

de pédiatrie, 12, 163–167 

4.  Nash, G B., Egginton S.,  (1993), Comparative rheology of  human and trout  red blood cells, J. 

Exp. Biol., 174 ,109  – 122. 

5.  Di Terlizzi R., Gallagher P.G. , Mohandas  N., Steiner L.A., Dolce K. S. , Guo X. , Wilkerson M.J., 

Stockham  S.L.,  (2008),  Canine  elliptocytosis due  to  a mutant  β‐spectrin, Veterinary Clinical 

Pathology, 38(1), 52  – 58 

6.  Azwai  S.M.,  Abdouslam  O.E.,  Al‐Bassam  L.S.,  Al  Dawek  A.M.,  Al‐Izzi  S.A.L.,  (2007), 

Morphological  characteristics  of   blood  cells  in  clinically  normal  adult  llamas  (Lama 

glama), 

Veterinarski Arhiv,77 (1), 69‐79 

126

Page 129: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 129/206

 

IDENTIFICATION OF PATHOLOGICAL STATES BASED ON RED 

BLOOD CELL AGGREGATION 

S.OANCEA1 , S.PADUREANU 

1 ,  A.V.OANCEA

1University of  Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Iasi, 

lioancea@univagro‐iasi.ro 2“Al.I.Cuza”University, Iasi 

In the  present  study  the aggregation  properties of  cow  RBCs were investigated. For  cow, 

in  physiological  conditions,  the aggregation  is not   present  but   in  pathological  cases a 

hyper  

aggregation 

 process 

can 

be 

seen. 

In 

order  

to 

appreciate 

the 

RBC  

aggregation 

the 

 Aggregate 

Shape 

Parameter  

has 

been 

computed  

using 

 AUTOCAD 

soft  Key words:  RBC aggregability, cow blood, AUTOCAD soft 

INTRODUCTION 

In human blood and for almost all mammals, RBCs are biconcave disks under normal 

physiological conditions, whereas their mean size may differ between species. RBCs  in static 

human blood form large aggregates resembling a stack of  coins but aggregation characteristics 

of  mammalian RBC exhibit a wide range among various species. More investigators are playing 

a good deal of  attention of  research on blood viscosity to clinic, the aggregation of  red blood 

cell may be a more useful parameter of  hemorheology  from point of  view of  pathology and 

diagnostic  [1].  Comparative  animal  studies  showed  the  wide  variation  of   whole  blood  and 

erythrocyte aggregation among different mammalian species  [2]. Horse RBCs aggregation was 

reported by many authors [3] and it is greater than for the other mammalian species. Popel et al. 

data  [4]  showed  that  athletic  species  exhibit  a  consistently  higher  degree  of   red  blood  cell 

aggregation  than  their  sedentary  counterparts.  There  are  different  methods  to  evaluate  this 

complex  process  of   RBC  aggregation  [5],  [6].  In  [7]  the  fractal  analysis  was  used  to  make  a 

quantitative evaluation of  aggregability for horse blood by comparison with the human blood and 

in [8] the same method was used for bovine blood  from pathological point of  view. Traditional 

mechanical and mathematical methods also proved to be insufficient in describing the aggregation 

process [9]. 

In  this  work  the  aggregation  process  of   cow  RBCs  was  investigated.  In  order  to 

appreciate  the  RBC  aggregation  the  Aggregate  Shape  Parameter  has  been  computed  using 

AUTOCAD soft. 

MATERIALS 

AND 

METHOD 

Samples  from  peripheral  bovine  blood  were  operated  using  May‐Grüwald  Giemsa 

colorature. With the aid of  the microscope we obtained the photos. Using erythrocyte planar 

images of  the clusters, obtained with a Nikon microscope, the RBC Aggregate Shape Parameter 

was computed using the formula [10]: 

24

P

 AK    π  =  (1) 

127

Page 130: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 130/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Here A is the projected area of  the aggregate and P is its perimeter. These quantities 

were computed by means of  AUTOCAD 2007 soft. 

RESULTS 

AND 

DISCUSSION 

Fig.1 shows the morphology of  RBCs under normal conditions  for cow blood when the RBCs 

are not aggregated and Fig. 2 shows aggregated erthrocytes. 

Fig.1 Erythrocytes from cow blood 

Fig.2 Aggregated erythrocytes from cow blood 

Our  measurements  for  5  aggregates  (from  5  photos)  on  the  Aggregate  Shape 

Parameter are given in the table 1. 

128

Page 131: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 131/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Table 1 Aggregate Shape Parameter for cow blood 

Nr  A  P K 

1  149974.62 1978.21 0.4813 

2  155554.0 2663.97 0.2753 

3  159709.67 2471.86 0.3283 

4  68678.54 1112.6 0.6968 

5  193315.05 2815.65 0.3062 

Mean  0.4176

Standard deviation  0.1751

Standard error  0.0783

Confidence interval  0.2174

 

The Aggregate Shape Parameter for cow blood in this pathological state is higher than 

the other animals studied in the earlier work [11], as figure 3 shows. 

Fig.3 Comparative aggregation for three mammals 

Fig.3 The Aggregate Shape Parameter for some mammal’s blood. Error bars are 95% confidence 

intervals and n=5 

CONCLUSION 

We can suppose that if  we develop an easy method to measure the RBC aggregation 

in  pathological  states  for  some  mammals  and  we  could  perform  standardization,  we  could 

obtain a method to find the stage of  the disease. 

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

variants

  a  g  g  r  e  g  a   t   i  o  n  s   h  a  p  e  p  a  r  a  m  e   t  e  r

horse

pig

cow

129

Page 132: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 132/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

REFERENCES 

1.  Rampling, M.W., Meiselman, H.J. Neu B., Baskurt O.K, (2004), Influence of  cell‐specific factors 

on red blood cell agregation, Biorheology, 41, 91‐112. 

2.  Kumavarel, M., Singh M., (1995),  Sequential analysis of  aggregation process of  erytrocytes of  

human, buffalo, cow, horse, goat and rabbit, Clinical Hemorheology, 15, 291  – 304. 3.  Baskurt  O.K.,  Farley  R.A.,  Meiselman  H.J.,  (1997),  Erythrocyte  aggregation  tendency  and 

cellular properties in horse, human and rat: a comparative study, Am. J., Physiol., 

273, 

H2604‐

H2612. 

4.  Popel  A.S.,  Johnson  P.C.,  Kameneva  M.V.,  Wild  M.A.,  (1994),  Capacity  for  red  blood  cell 

aggregation  is  higher  in  athletic  mammalian  species  than  in  sedentary  species,  J.  Appl. 

Physiology , 77, 1790‐1794. 

5.  Marton Z., Kesmarky G., Vekasi J., Cser A., Russai R., Horvath B., Toth K.,  (2001), Red blood 

cell  aggregation  measurements  in  whole  blood  and  in  fibrinogen  solutions  by  different 

methods, Clinical Hemorheology and Microcirculation, 24, 75‐83. 

6.  Rapa A., OANCEA S., (2006), Hemoreologie comparata, Editura TEHNOPRESS 

7. 

Rapa 

A., 

OANCEA 

S., 

CREANGA 

D.,(2005), Fractal dimension  in red blood cell, J.of  Veterinary and Animal Science, 29, 1247‐1253. 

8.  Oancea, S.,  (2007),  A  quantitative  analysis  of   red  blood  cell  aggregation  from  bovine  blood, 

Romanian Journal of  Biophysics, 17(3), 205‐209. 

9.  Skalak R., ZHU C.,(1990), Rheological Aspects of  Red Blood Cell Aggregation, Biorheology, 27, 

309‐325. 

10.  Foresto P., D’Arrigo M., Carreras L., Cuezzo R.E., Valverde  J., Rasia R.,  (2000), Evaluation of  

red  blood  cell  aggregation  in  diabetes  by  computarized  image  analysis ,  Medicina  (Buenos 

Aires), 60,  570‐572. 

11.  Oancea  S.,  Oancea  A.V.,  (2010),  Erythrocyte  aggregation  for  two  species  of   mammals, 

Romanian Journal of  Biophysics, in print 

130

Page 133: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 133/206

 

STRUCTURAL MODIFICATIONS OF THE ORAL MUCOSA AND THE DENTAL APPARATUS INDUCED BY SOME DRUGS IN LABORATORY MICE 

OPREAN O.Z.1 , GHEBAN DIANA2 , FORNA NORINA CONSUELA2, 

ŞINDILAR E.V.1,  GRĂMADĂ S.1 1Veterinary Medicine Faculty, Iaşi 

2Dental Medicine Faculty, Iaşi 

e‐mail: [email protected] 

Abstract 

The authors

 aim

 to

 verify 

 and 

 study 

 the

 information

 mentioned 

 in

 speciality 

 literature

 on

 induced 

 side

 

effects, (in mammals) in the oral  cavity, of  3 drugs: Phenytoin, Cyclosporin, Nifedipine. 

The research was conducted  on 36 white laboratory  mice (subfamily  Murinae) distributed  in groups of  

12 animals each  for  each  product, and  a control  group of  5 animals, to which no action was taken. 

The   fundamental    pathological    process  observed   in  histological   examination,  with  no  significant  

differences in the groups, was  fibrocellular  hyperplasia. 

No  relevant   tissue  reaction  differences were  observed   in  animals  injected  with  Azithromycin, well ‐

known antitoxin  for  the three drugs tested. 

Keywords: experiment, Phenytoin, Cyclosporin, Nifedipine,  fibrocellular  hyperplasia. 

The  research  performed  on  experience  animals  suggest  side  effects  of   some  drug 

compounds, very often used in human pathology, consisting of  important structural alterations of  the oral mucosa and  of   the dental apparatus.  We  intend  to  verify and deepen  the  information 

available  in  the  litterature  concerining  side  effects  induced  to  the  oral  cavity  by  the 

overdose/prolonged utilisation of  three chemical compounds: Phenytoin, Cyclosporin, Nifedipine Phenytoin  has  as  main  therapeutic  indications  the  treatment  of   major  epileptic  crises 

(generalised  lonicodonic  crises)  and  of  partial  crises,  especially  jacksonian  ones,  but also  in  the 

prophylaxy of  epileptic crises secondary to neurosurgery. (1,5,9) 

Cyclosporine  (also  known  as  Cyclosporine  A)  is  a  cyclic  polypeptide,  consisting  of   11 

aminoacids,  well  known  as  a  strong  immunosupressive  agent,  which  in  animals  leads  to  a 

prolongement of  the survival of  allogenic skin, heart, kidney, pancreas, bone marrow,  intestin or 

lung transplants, thus having therapeutical indications in transplant protection and in autoimmune 

disease. (2,4,10) Nifedipine  is  a  slow  calcium  channels  blocker;  it  has  an  inhibitor  effect  on  calcium  ions 

flows, especially in myocardic cells and in the cells of  the smooth muscle in the walls of  coronary 

artheries and peripheric blood vessels. It is recommended in the treatment of  pectoral angina and 

in the chronic treatment of  the essential and secondary hypertension. (3,6,7,8) 

Side effects of   these  three drugs, more serious  in children, consist of  dysfunctions of   the 

main internal organs, skin and blood. 

1.  MATERIAL AND METHOD 

36 white laboratory mice were divided in groups of  12 (6+6) animals for each tested drug, 

and marked cromatically according to Table 1. 

131

Page 134: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 134/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Table 1 Repartisation of  experience animals in groups and experiment accomplishment 

*F=Phenytoin; C = Cyclosporine  A; N = Niphedipine; Azy =  Azytromicine 

For each of   the drugs, we also  formed one group  in which  the drug was administered  in 

association  with  Azytromicine,  that  has  a  well  known  role  as  a  moderator  (antitoxic)  for  the  3 

tested drugs. 

We also had a witness group, with 5 congenere animals that did not suffer any intervention. 

Experimental  animals  were  all  20  days  old  males  weighing  30  g  each,  that  had  their 

digestive  flora  supressed  through  two  daily  administrations  per   os  of   0,1ml  peniciline  solution 

40.000 UI/ml, preceeding the experiment. The  drugs  were  administered  through  gavage,  Phenytoine  and  Niphedipine  as  aquous 

solution 2mg/ml, Cyclosporine  A solubilised in saline solution 2mg/ml. 

Mice  in  Lot F1 were administered Phenytoine 20mg/kg/day, for 55 days, and Lot F2 were 

added 10mg/kg/day  Azytromicine. 

Lot C1 received 10mg/kg/day Cyclosporine  A, and Lot C2 10mg/kg/day Cyclosporine  A and 

10mg/kg/day  Azytromicine. 

Lot N1 was administered Niphedypine 150mg/kg/day, for 7 days and 250mg/kg/day, for 13 

days. 

Lot N2 received Niphedypine the same way as N1, associated to 10mg/kg/day  Azytromicine. 

on o important  on otice that in  Lot C1 one animal died, in apparent health, in day 10 of  

the experiment. 

All animals were euthanised at the end of  the experiment, using T‐61 as euthanasia agent. 

2.  RESULTS AND DISCUSSIONS 

Interpretation of  the different deviations from the morphological normal, induced by the 3 

drugs previously described was done accordingl;y to the normal aspect of  the oral mucosa noticed 

in the mice in the witness group. Transverse sections through lateral walls of  the oral cavity (cheek 

area) seveals, on  the  internal side,  the structure of   the oral mucosa, covered with a keratinised 

stratified  pavimentous  epithelium,  resembling  the  one  on  the  exterior  side  of   the  cheeks.  The 

anterior  segment  of   the  oral  cavity  is  less  developped and  the  muscular  support  of   the area  is represented by isolated fascicles of  scheletical muscle fibers. (Fig.1, Fig.2). 

Group Active substance administered* 

Administration period(days) 

Dose (mg/kg/day) 

F1  F  55  20 F2  F + Azy 

F 20 

Azy  10 

C1  C 

35 

10 

C2  C + Azy C  10 

Azy  10 

N1  N 7 150 

13 250 

N2  N + Azy 

7 N 150 

Azy 10 

13 N 250 

Azy 10 

132

Page 135: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 135/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

The superficial epithelium of  the oral mucosa on the  internal side of  the  lips, cheeks and at 

gingival level is a medium keratinised pavimentous epithelium, with a report cornous layer / Malpighi 

layer of  about 1/3 (Fig.3). 

The profound area of  the oral cavity, the submucosa is developped, consisting of  fascicles of  

non‐oriented colagen fibers (Fig.4). 

Toward  the  pharyngian  area,  the  musculosa  is  very  well  developped  and  reaches sometimes the subepithelial space (Fig.5). 

Lingual mucosa presents onits dorsal  side  several papiliform papillae, and  the musculosa 

obviously  predominates  in  the  structure  of   the  tongue,  being  made  of   scheletic  muscle  fibers 

(Fig.6, Fig.7, Fig.8). 

The tooth is made of  two macrostructural segments: the crown is the fragment projected in 

the oral cavity and protected my an enamel layer; the root is the portion implanted in the dental 

alveola and is protected by a cement layer. 

2.1.Changes of  the oral  mucosa 

In all 3 drugs studied we noticed reactive‐inflammatory hyperplasia, with subacute‐chronic 

evolution. 

Necropsic  examination  does  not  evidentiate  relevant  modifications,  histopathological 

examination evidentiate fibro‐cellular prolifferations in all structural segments of  the oral mucosa. 

Superficial epithelium suffers from a moderate hyperplasia of  the Malpighi layer, the report 

keratine/spinous layers becoming about 1/6 (Fig.9). 

In some areas, the hyperplasia of  the spinous layer is produced in a centripete direction, as 

papillae that protrude in the lamina propria (Fig.10). 

In  some  cases  of   mice  injected  with  Cyclosporine  and  Niphedypine  proliferation  of   the 

submucosa  and  of   the  superficial  epithelium  is  associated  in  the  form  of   micropollipes  that 

proeminate on the surface of  the oral mucosa (Fig.11). 

One  animal  in  Lot N1  has  a  hyperplasiated  mucosa  that  sticks  to  the  dental  surface,  as 

papillae reaching the top of  the dental crown (Fig.12, Fig.13). The papillae of  the mucosa are anchored to the surface through a wide base, on which the 

report keratine/spinous layers is about 1/8 (Fig.14). 

The  oral  submucosa  is  affected  by  the  same  fundamental  pathological  process.  The 

hyperplasia,  initally  vasculo‐conjunctive,  becomes  predominantly  fibrous  in  time,  towards  the 

pharyngian  area  of   the  oral  cavity  The  local  mesenchyme  prolifferates  as  thick  unoriented 

colagenic fascicles (Fig.15, Fig.16). 

In  2  cases  we  noticed  tissular  reactions  with  accute‐subacute  evolution,  due  to  local 

irritations or oportunistic bacteria.  In one case we described edematous peridontal  infiltrations, 

and subepithelial necrotic foci (Fig.17, Fig.18). 

2.2.  Alterations of  the dental  apparatus 

Moderate hyperplastic tissular reactions also extend to the dental apparatus. 

Dental alveolae show a fibrous hyperplasia finalised in a band of  conjunctive tissue, dense 

and well vascularised that separates the root from the bone support of  the dental arcade (Fig.19). 

The proximal segment of  the root show areas of  dentine vacuolisation, whereas in the distal 

area of   tooth anchoration shows a conjunctive hyperplasia and a disjunction of   the  root  from  the 

bone structures (Fig.20, Fig.21). 

Structural components of  the tooth also show deviations  from the morphological normal: 

the dentine and the cement appear striated by void canalicles, while dental pulp is the place of  a 

lymphohistiocytic and later fibrous hyperplasia (Fig.22, Fig.23). 

2.3.  Alterations of  the internal  organs 

One mouse of   din Lot C1 died in apparent health in day 10 of  the experiment. Histological examination of  tissular fragments prelevated from the main  internal organs reveal changes dued 

to acute‐subacute toxicosis. 

133

Page 136: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 136/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Low resolution microscopical examination of  the lung evidentiates the ectasy and hematic 

overload  of   small  and  medium  blood  vessels  and  tissular  densifications  lodged  in  interalveolar 

interstitium (Fig.24). 

Thickening  of   the  interalveolar  septum  is  accompanied  by  hyperplasia  of   the  distal 

airwaves, that present 3‐4 rows of  cells (Fig.25). 

The heart  is  the place of  changes with  two  structural  localisations:  interstitial  (vascular) and parenchimatous. 

Vascular, we notice periartheriolar edematous infiltrations that dissociate the blood vessels 

from the cardiac muscle  fibers and enter  the vascular wall, dissectig  the vascular adventice. The 

leyocites  in  the  parietal  media  are  thick  with  inflated  vacuolised  nuclei;  vascular  endothelium 

appears  tumefected,  and  the  nuclei  of   the  endothelial  cells  are  bigger  and  hyperchromatic, 

proeminating in the vascular lumen (Fig.26). 

The parenchyme is the place of  intracellular deposits of  calium ions, with typical aspects of  

localised calcification: intracellular amorpheous surfaces, intensely haematoxylinic in HEA staining; 

calcifications are focalised on oxyfile myocardic areas, specific to tissular devitalisation (Fig.27). 

The  liver  is  affected  by  circulatory  disorders  and  dismethabolies  pretty  unspecific,  but 

which, in association, lead to a common toxic etiology: passive liver congestion and granulo‐lipidic 

hepatosis. 

Passive liver congestion is translated through the ectasy and overload of  centrolobular venulae 

and  dilatation  of   sinusoidal  capillaries  through  erythrocytes  partially  hemolised  and  conglomerates 

(Fig.28). 

Granulo‐lipidic hepatosis consists on one hand of  the tumefaction of  hepatocytes and the 

trubled aspect of  their cytoplasms, and on the other hand of  the spongeous aspect and even the 

apparition of  well circumscribed intracitoplasmatic valuolae (Fig.29). 

Cellular  sufference  is  also  suggested  by  the  aspect  of   the  nuclei  of   the  hepatocytes: 

raspberry  aspect,  corical  hyperchromatosis,  chromatine  condensation  in  hyperchromatic  blocks 

(Fig.30, Fig.31). The  cortical of   the kidneys  show  tumefaction and  intumescence of   the  renoepitheliums  that 

leads  to  the  anullation  of   the  urinifer  tubes,  changes  of   granulas  nephrosis;  we  also  noticed  the 

hyperplasia  of   vascular  areas  of   Malpighi  corpuscles,  that  completely  anullate  glomerular  cavities. 

(Fig.32). 

CHART I 

Fig. 1. Transverse section in cheek area. 

Mouse. HEA, x100 

Fig. 2. Oral mucosa. Mouse. HEA, x400

134

Page 137: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 137/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 3. Oral mucosa, Pavimentous 

stratified keratinized epithelium. HEA, x400 

Fig. 4. Oral cavity. Submucosa. 

Musculosa. HEA, x400 

Fig. 5. Oral cavity, pharingeal area. 

Musculosa. HEA, x400 

Fig. 6. Lingual mucosa, ventral side.

HEA, x400 

Fig. 7. Lingual mucosa, dorsal side. 

Filiform papillae HEA, x400 

Fig. 8. Lingual musculosa. Rabdocytes. 

HEA, x400 

CHART II 

Fig. 9. Superficial epithelium. 

Hyperplasia of  the spinous layer. Ration 

eratinised/spinous layers of  1/6. HEA, x400 

Fig. 10. Superficial epithelium. Centripete 

papillar hyperplasia of  the spinous layer. 

HEA, x400 

135

Page 138: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 138/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 11. Hyperplasia of  the submucosa 

and of  the spinous layer. HEA, x400 

Fig. 12. Periodontal hyperplasia of  the 

mucosa. Premolar. HEA, x40 

Fig. 13. Periodontal pollipe. HEA, x100 Fig. 14. Base of  the periodontal polipe. 

Hyperplasia of  the spinous layer. HEA, x400 

Fig. 15. Colagenised vasculated 

submucosa . HEA, x100 

Fig. 16. Colagenised submucosa, 

Pharyngeal area of  the oral cavity. HEA, x400 

CHART III 

136

Page 139: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 139/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 17. Periodontal edematous 

infiltrations. Col. HEA, x100 

Fig. 18. Subepithelial necrosis. 

HEA, x400 

Fig. 19. Molar. Bifide root. Longitudinal 

section. Colagenization of  the dental alveola. 

HEA, x100 

Fig. 20. Molar. Bifide root. Transverse 

section. Dentine vacuolisation. HEA, x100 

Fig. 21. Molar. Bifide root, profound 

area. Transverse section. Alveola decolation. 

HEA, x100 

Fig. 22. Premolar. Dental crown, Cement 

canalisation. HEA, x400 

Fig. 23. Premolar. Fibrous hyperplasia of  dental pulp. HEA, x400 

Fig. 24. Lung. Tissular condensation with septal hyperplasia HEA, x100 

137

Page 140: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 140/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

CHART IV 

Fig. 25. Lung. Hyperplasia of  bronchiolar 

epithelium. HEA, x400 

Fig. 26. Heart. Artheriole. Leyocite 

tumefaction and of  the vascular endothelium. 

HEA, x1000 

Fig. 27. Heart. Dystriphic calcification area. 

HEA, x400 

Fig. 28. Liver. Passive congestion. HEA, x100 

Fig. 29. Liver. Granulo‐lipidic dystrophy. 

HEA, x100 

Fig. 30. Liver. Hyperchromatic nuclei. 

HEA, x1000 

138

Page 141: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 141/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 31. Liver. Nuclear hyperchromatosis. 

Spongious cytoplasm. HEA, x1000 

Fig. 32. Kidney. Hyperplasia of  renal 

glomerules. HEA, x400 

3. CONCLUSIONS The  testing  of   secondary  effects  with  oral  localisation  of   the  three  drugs:  Phenytoin, 

Cyclosporin, Nifedipine  , on white lab mice revealed the following conclusions: 

1.Necropsic examination did not reveal macroscopical lesions. 

2.The  fundamental  pathological  process  noticed  histologically  was  the  fibrocellular 

hyperplasia, for all groups and at all levels of  the oral cavity. 

3.  The  access  of   the  pathogen  factor  on  the  circulatory  way  leads  to  the  hyperplasia  of  

profound and median structures of  the oral mucosa, while  the superficial keratinized  layer stays 

the same. The spinous layer of  the epithelium thickens up to a ratio of  1/6. Lamina propria and the 

submucosa  are  the  place  of   a  predominantly  fibrous  hyperplasia,  finalised  by  the  thickening  of  

affected  areas  and  replacement  of   glandular  tsructures  through  dense  and  well  irrigated 

connective tissue. Mucosal hyperplasia may lead to formation of  pollipes adherrent to the lateral surfaces of  the tooth. 

4.The  dental  apparatus  is  moderately  affected  by  the  same  predominantly  prolifferative 

phenomena. The dental alveola is colagenised, leading, in profound areas of  the dental root, to its 

disjunction from the bone support of  the region. The dentine and the cement are marked of  fine 

canallicles, while dental pulp suffers a hyperplasia (predominantly cellular, then fibrous). 

5.We did not notice any relevant differences in the animals injected with  Azytromicine. 

6.In  one  case  that  was  administered  CyclosporinaneA  (no   Azytromicine)  and  died  in 

apparent halh in day 10 of  the experiment, we noticed changes due to an acute‐subacute toxicosis, 

and local circulatory disorders due to myocardic calcification. 

7.  In  2  of   the  cases  we  described  edematous  periodontal  infiltrations  and  subepithelial necrotic foci, due to local irritations or opportunistic bacteria. 

BIBLIOGRAPHY 

1. 

Balaji S (October 2004). "Medical therapy for sudden death". Pediatr. Clin. North  Am. 51 

(5): 1379–87; 

2.  Borel JF (2002). "History of  the discovery of  cyclosporin and of  its early pharmacological 

development". Wien.  Klin. Wochenschr.  114  (12):  433–7.  PMID  12422576;Cohn,   J.N., 

Ziesche, S.M., Loss, L.E., Anderson, G.F., si V‐HeFT Study Group, Effect of  felodipine on 

short‐term exercise and neurohormone and long‐term mortality in heart failure: results 

of  V‐HeFT III (rezumat), Circulation, 1995, 92(supl.I), I143; 4.  Dewick, P. (2001) Medicinal Natural Products. John Wiley & Sons, Ltd. 2nd ed.; 

139

Page 142: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 142/206

Page 143: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 143/206

 

ISOLATION, CHARACTERIZATION, PHENOTYPIZATION AND 

DIFFERENTIATION OF STEM CELLS FROM RAT PLACENTA 

Emoke Pall1, Groza I.

1, Cenariu M.

1, Cristina Ilea

1, 

Olga Soritau2, Ciprian T

2., Berce C

1. 

1.University of  Agricultural Science and Veterinary 

Medicine, Cluj‐Napoca,  3‐5 Calea Mănăştur, Cluj‐Napoca, 

[email protected] 

2.Oncology Institute Prof.Dr.Ioan Chiricuta, Cluj‐Napoca 

Abstract: Mesenchymal stem cells have been successfully isolated from human, cat, dog, rabbit, 

rat, chicken, sheep, goat and pig bone marrows thanks to their plastic adherence property. In 

recent years, stem cell biology has sparked considerable interest worldwide in the scientific 

world, and recent developments in stem cell research have opened new perspectives by using 

them in regenerative therapy.  In this study we successfully isolated, cultured and expanded rat 

placenta‐derived mesenchymal stem cells using routine methods. After the initial 3 days of  

primary culture, rat placental mesenchymal stem cells adhered to a plastic surface and presented 

a small population of  single cells with spindle shape. To investigate the mesenchymal mature we 

differentiated the cells into the osteoblastic lineage and also the expression of  certain surface 

marker. 

KEYWORDS: placenta, mesenchymal stem cells, culture expansion, differentiation 

Stem cell research has become an important field of  study for molecular, cellular, and 

clinical biology as well as pharmaco‐toxicology. Indeed, stem cells have a strong proliferative and unlimited self ‐renewal potential and are multipotent (1,4,6,7) 

The mesenchymal  stem  cells  (MSC)  are multipotent  cells  present  in  the  bone marrow  and 

other tissue (3).  The plasticity of  these cells allows them to be used in cell therapy once they 

have the potencial to replicate as undifferentiated cells and could be induced to differentiate 

to  mesenchymal  lineages  (bone,  fat,  cartilage,  tendon,  muscle,  marrow  stroma  etc.)  as 

endodermal and ectodermal  lineages, replacing tissues and organs whose function had been 

harmed. All the species could be benefied using the cell therapy (2,5). 

Rat mesenchymal stem cells  from placenta offer significant promise as a multipotent source 

for  cell‐based  therapies  and  could  form  the  basis  for  the  differentiation  and  cultivation  of  

tissue  grafts  to  replace  damaged  tissue.  Placental  derived 

MSC  therefore  represent  an alternative and more easily obtainable

 and abundant source of  MSC than bone marrow. 

The  aim  of   this  study  was  to  isolate  and  evaluate  the  differential  potential  of  

mesenchymal  stem  cells  from  rats  placentas.  Our  data  demonstrate  that  we  successfully 

isolated, culture‐expanded mesenchymal stem cells from rat placentas. 

MATERIALS AND METHODS 

Biological material placentas were obtained after caesarean section from normal term 

pregnancies  (19‐21D) Pieces of  placenta were excised and washed  in PBS  to  remove excess 

blood. Tissue was  then  incubated  in  trypsin EDTA. After enzymatic digestion, a  cell  strainer was used to obtain a single cell suspension. The resulting cells were

 washed and centrifuged on 

141

Page 144: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 144/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

PBS. Cells were  then cultured  in DMEM with 10% FCS, 1% antibiotics, 1%NEA  (non essential 

amino acid) After 48 hours, non‐adherent cells were removed and the remaining cells cultured 

until almost confluent before passage. Media was changed every 3–4 days. After

 two or more 

passages, the cells were analysed. 

Osteogenic  differentiation  was  induced  by  two  different  culture  medium:  basal 

medium composed of  DMEM (Gibco) supplimented with 10% FCS, 10‐7dexamethasone, 10mM 

β‐glicerophosphate, 1μg/ml  insulin, 50μg/ml ascorbic acid, 10ng/ml BMP2, 2ng/ml TGFβ and 

specific medium for osteoblasts PromoCell Osteoblast Growth Medium. 

To  identify differentiated cells was performed  immunohistochemical analysis of  cell 

cultures at the end of  the experiment. According to the immunohistochemical protocol, initial 

patency was  achieved  by  treating  cells  for  their  intracellular  antigens with  a  solution  0.1% 

TRITON  X‐100  for  5 minutes  and  added  lock  patency  10%  BSA  solution. After  24  hours  of  

keeping  in  contact,  at  4°C were  performed  three  successive washes with  PBS  solution  and 

added primary antibodies: anti‐osteopontin (IgM) anti‐osteonectin (IgG2a). 

RESULTS 

AND 

DISCUSSION 

The  cultures were  observed  daily  by  phase  contrast  invert microscopy  to  examine 

adheretnt cell morphology. In the early days, individual adherent cells appeared in about 60% 

of   the  wells,  40%  of   the  wells  having  no  adherent  cells.  After  examining  cultures  have 

identified two different types of  cells, some were fibroblastic‐like and the others were round 

with  dark  centers  and  transparent  peripheries.  After  4  days  some  fibroblastic  cells 

proliferated, giving  rise  to colonies of   fibroblastic cells. At  the end of  day 8, generally 10‐12 

fibroblastic colonies appeared. By  the end of  week 2  the number of   floating  cells  increased 

within the culture medium  (Fig.1). Passages was made at a 80% confluence to avoid contact 

inhibition. After each passages part of  the cell suspension were frozen for future examination so as  to  investigate multilineage differentiation, proliferation potential and  the presence of  

certain surface markers. 

Figure 1 ‐Microscopic analysis of  cellular morphology 20x 

142

Page 145: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 145/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

In osteoinductive cultures, a  few cells became detached and  floated  in the medium 

during the culture period (Fig.2). 

Figure 2 ‐ Cellular morphology after osteogenic induction and distinct cellular 

colonies with osteogenic nodules 

In  some  areas  of   the  culture  dish,  nodule‐like  structures  of   different  sizes  were observed.  In  cultures  treated with basal medium after 8 days were observed emergence of  

cells with morphology  similar  to  that  of   adipocytes  namely  cell  cytoplasm  filled with  lipid 

droplets (Fig.3). 

Figure 3 ‐ Apparition of  adipocytes in culture  40x 

Differentiation  was  further  demonstrated  by  immunohistochemical  staining  for 

osteopontine  and  osteocalcin. After  21  days  induction  period,  the  level  of   osteocalcin  and 

osteopontine  slightly  increased  (Fig.4).  This marker  did  not  express  in  the  undifferentiated 

mesenchymal stem cells, but  has been produced in the cells after the third week of  induction. 

143

Page 146: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 146/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Figure 4 ‐ Immunohistochemical assay of  osteopontin and 

osteocalcin in cultures differentiated on osteogenic line 20x 

After several passages the cells did not  lose multipotential differentiation potential, 

fibroblastic morphology was maintained during the subculture period. 

CONCLUSIONS 

In  the present  investigation, pure  fibroblastic  cells with multilineage differentiation 

capability were isolated from rat placenta. The isolation on placental cells is far more difficult 

than of  other species due to the unwanted growth of  non‐mesenchymal cells in both primary and  passaged  cultures.  Certain  features  of   the  cells  having  been  isolated  via  our  approach 

convinced us that they were mesenchymal stem cells. The most important properties of  these 

cells were their multilineage mesenchymal differentiation  in culture medium and their ability 

to maintain this potential un to passage 8. 

BIBLIOGRAPHY 

1.  Mark F. P., Alastair M. M., Stephen C. B., Rama K. Jaiswal, Robin D., Joseph D. M., Mark A. M., Donald 

W.  S.,  Stewart  C., Daniel R. M.,  1999, Multilineage  Potential of  Adult Human Mesenchymal  Stem 

Cells, Science,Vol. 284. no. 5411, pp. 143  – 147; 

2. 

Mauro  K., Massimo  F., Giovanni  P., Giuseppe A.,  2007, Mesenchymal  stem  cells:  from  biology  to 

clinical use, Blood Transfus,  5(3): 120–129. 

3.  Ppokratis Pountos, Peter V.Giannoudis, Biology of  mesenchymal  stem  cells,  Injury,Int.J.CareInjured 

(2005) 36S,S8—S12 

4.  Sarah Snykers,  Tamara Vanhaecke,  Vera Rogiers,  2006,  Isolation  of   Rat  Bone Marrow  Stem  Cells, 

Cytochrome P450 Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology 

5.  Shengkun Sun, Zikuan G, Xuren X., Bing L., Xioaodan L., Pei‐Hsien Tang, Ning Mao, 2003, Isolation of  

mouse marrow mesenchymal progenitor by a novel and reliable method, Stem Cells, 21:527‐535 

6.  Yumi F., Hideaki N., Daisuke S., Imiko Hirose, Toshio K., Kohichiro T., 2004, Human Placenta‐Derived 

Cells Have Mesenchymal Stem/Progenitor Cell Potential, Volume 22 Issue 5, Pages 649  – 658; 

7.  Zongning M.,  Jun  J.,  Lei  C.,  Jianzhong  Z.,  Wei H.,  Jidong  Z.,  Hanguang Q.,  Xueguang  Z.,  2006, 

Isolation of  mesenchymal stem cells  from human placenta  : Comparison with human bone marrow mesenchymal stem cells ‐ Cell biology international, vol. 30, n

o9, pp. 681‐687; 

144

Page 147: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 147/206

 

LUTEIN PREVENTS HIGH GLUCOSE INDUCED OXIDATIVE 

STRESS IN HUMAN RPE CELLS 

Dumitrița RUGINA, Adela PINTEA, Andrea BUNEA, Raluca POP, Sanda ANDREI 

University of  Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj‐Napoca, Department of  

Chemistry and Biochemistry, Mănăstur 3‐5 Cluj‐Napoca, 400372, Romania 

E‐mail: [email protected] 

Abstract 

Human  retina  accumulates  two  dietary   carotenoids:  lutein  and   zeaxanthin.  The 

carotenoid   pigments in retina act  as screening  pigments, by  absorbing the damaging blue light, 

but  it  is supposed  that  they  can also contribute to the antioxidant  defence of  retinal  structures. 

Lutein  was  identified   in  several   anatomic  structures  of   the  retina,  including  the  retinal   pigmented  epithelium (RPE).  The aim of  this study  was to investigate the effect  of  lutein on the 

oxidative  status  of  RPE   cultured   cells  in  oxidative  stress  conditions  induced   by  high  glucose 

concentration in culture medium. 

D407  RPE  cells were cultivated  in DMEM medium with 10 % FCS. The cells viability  was 

estimated   by   the MTT   assay   and   the  cytotoxicity   by   LDH  leakage  assay.  The  generation  of  

intracellular  reactive oxygen species (ROS) was determined  by  using a  fluorescent   probe –  DCF ‐

DA,  TBAR’s  by   a   fluorimetric  method   and   reduced  glutathione  by   an  enzymatic  assay. 

 Antioxidant  enzymes: glutathione  peroxidase (GPx). Superoxide dismutase (SOD) and  catalase 

activities were determined  using commercial  kits 

High glucose concentration induced  modification of  oxidative stress markers: changes in antioxidant  enzymes activity,  increased   lipid   peroxidation and   intracellular  ROS generation. 

Lutein  did   not   show   any   cytotoxic  effect   on  RPE   cells  up  to  10  μM  in  culture medium  and  

 protect  them against  induced  oxidation. Lutein  protects RPE  cells by  quenching the intracellular  

ROS generation, by  reducing the lipid   peroxidation and  by  enhancing the activity  of  superoxide 

dismutase  and   glutathione   peroxidase.   Addition  of   lutein  did   not   significantly   influenced  

reduced  glutathione concentration and  catalase activity.  Increased  concentration of   lutein  in 

RPE  cells can contribute to antioxidant  defence in oxidative stress conditions. 

Keywords: Lutein, RPE  cells, high glucose, oxidative stress 

INTRODUCTION 

The Retinal Pigment Epithelium (RPE) is a monolayer of  cells representing the barrier 

between the photoreceptors and the choriocapillaris. It provides oxygen and nutrients to the 

photoreceptors but also remove their debris and metabolites. The loss of  RPE cells is related to 

several eye diseases,  including  age  related  macular degeneration  (AMD).  Retina and  retinal 

pigment  epithelium  (RPE)  represent  an  ideal  environment  for  the  generation  of   reactive 

oxygen species (ROS) and oxidative damages. There are three main sources of  ROS generation 

in  the  RPE:  high  metabolic  rate  and  oxygen  consumption,  high  level  of   irradiation, 

phagocytosis  of   photoreceptors  outer  segments  and  the  presence  of   photosensitizers 

(lipofuscin) (Miceli et al., 1994; Beatty et al., 2000; Winkler et al., 1999; Lu et al., 2006; Qin et al., 2007). The vision  loss  in AMD results  from photoreceptor damages  in  the central retina, 

145

Page 148: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 148/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

and  it  is accepted  that degeneration of  RPE  is  involved  in  first stages of  AMD  (Qin, 2007).  It 

was  demonstrated  that  oxidative  stress  plays  an  important  role  in  the  pathology  of   AMD 

(Kopitz et al., 2004; Qin, 2007; Coleman et al., 2008). Hyperglycemia which occurs in diabetes 

reduces the level of  antioxidants and determines an increase of  reactive oxygen species which, 

in turn produce oxidative damages in different tissues,  including retina.  RPE cells respond to 

acute  high  glucose  level  in  culture  medium  by  modification  of   antioxidant  and  proteolitic 

enzymes activity. Cultured RPE cells exposed to high glucose concentration showed elevated 

level of  glutathione peroxidase, cathepsin B and heat shock protein 27, while  the activity of  

Cu/Zn  SOD  was  decreased  compared  to  control  (Yokoyama  et  al.,  2006).  High  glucose 

concentration also determined a reduction of  permeability  in RPE cultured cells (Villarroel et 

al.,  2009).  Lutein  and  zeaxanthin  are  the  only  dietary  carotenoids  accumulating  in  the 

anatomic  structures  of   human  retina,  including  the  retinal  pigmented  epithelium  (RPE) 

(Khachik et al.,1997; Snodderly et al., 1984a). Xanthophylls act primarily as screening pigments 

in  the  retina  by  absorbing  the  damaging  blue  light  but  they  can  also  contribute  to  the 

antioxidant defence of  retinal structures (Beatty et al., 2000; Wrona et al., 2004; Krinsky and 

Johnson, 2005). Serum carotenoids, including xanthophylls lutein and zeaxanthin, are inversely associated with type II diabetes and impaired glucose metabolism (Coyne et al., 2005). In this 

context  it  is  important  to  know  how  retinal  cells  respond  to  acute  exposure  to  high 

concentrations of  glucose, with or without addition of  antioxidants. 

The aim of  this study was to investigate the effect of  lutein on the oxidative status of  

RPE cultured cells in oxidative stress induced by high glucose concentration in culture medium. 

MATERIAL AND METHODS 

Cell  

culture 

and  

treatment. 

Human  adult  retinal  pigment  epithelial  cells  line  D407  were 

maintained  in  Dulbecco’s  Modified  Eagle  Medium  supplemented  with  10%  fetal  bovine serum, 1 mM  sodium pyruvate, 100 U/ml penicillin, 100  μg/ml  streptomycin, and 2.5  μg/ml 

amphotericin B, at 37◦C, 5% CO2, and 95% relative humidity. The cells were seeded in 25 cm3 

flask  at  a  concentration  of   6  x  105.  After  reaching  90%  confluence,  growth  medium  was 

removed and replaced with medium containing 10 μM xanthophylls during 24 hours. 

Exposure  of   cells  to  high  glucose  concentration.  During  the  first  experiment  cells  were 

cultivated in increasing concentration of  glucose in medium: 25 mM (control cells), 40 mM, 50 

mM, 70 mM and 100 mM.  After 24 h  treatment with carotenoids,  the culture medium was 

removed,  the  cells  were  washed  and  with  PBS  and  specifically  lysed  for  each  enzyme 

determination. 

Viability  

assay . MTT assay was used to asses the cell viability (Mossman, 1983). This method 

uses  the property of   viable  cells  to  reduce  MTT  reagent  into  a  coloured  formazan which  is 

detected by reading the absorbance at 550 nm. Cell viability was expressed as a percentage of  

control (cells incubated in normal medium only). 

 Antioxidant  enzymes activity. Glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD) and 

catalase (Cat) activities were determined using commercial kits provided by Cayman Chemical 

Company,  Michigan,  USA.  The  enzymes  activity  was  expressed  as  IU/mg  protein  and  the 

protein were determined with bicinchoninic acid assay (Sigma, St. Louis, USA). 

Glutathione  assay.  The  GSH  assay  was  performed  using  an  optimized  enzymatic  recycling 

method  with  glutathione  reductase  (Cayman  Chemical  Company,  Michigan,  USA).  Standard 

curve was made with GSSG standard, having the equivalent GSH concentration between 0‐16 

μM. Results are expressed as μmoles GSH/mg protein in cell pellet. 

Intracellular  

reactive 

species 

assay . The determination of  intracellular reactive oxygen species 

146

Page 149: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 149/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

(ROS)  is  based  on  the  oxidation  of   2’,7’‐dichlorodihydrofluorescein  (DCHF)  by  intracellular 

peroxides,  forming  the  fluorescent  compound  2’,7’‐dichlorofluorescein  (DCF)  (Lebel  et  al., 

1992). 

TBAR’S  concentration was determined after  the  reaction with  thiobarbituric acid  by using a 

calibration curve and a fluorimetric method. A micro plate reader HT BioTek Synergy (BioTek 

Instruments, USA) was used for all photometric and fluorimetric assays. 

Statistical  

analysis was done using One‐way analysis of  variance ANOVA, Dunnett's Multiple 

Comparison Test of  Graph Pad Prism version 5.00. Significant differences are designated by 

p<0.05  and  notation  ***extremely  significant,  **very  significant,  *significant.  The  points  or 

bars represent the mean ± SD, calculated from three experimental values 

RESULTS AND DISCUSSION 

D407  RPE  cells are  usually  cultivated  in  medium  containing  25  mM  glucose,  which 

represents a high concentration.  In the first part of  this study we evaluated the  influence of  

different  higher  glucose  concentration  in  culture  medium,  mimicking  hyperglycemia  that occurs in diabetes, on the viability and intracellular reactive oxygen species generation (ROS). 

As  can be observed  in Fig. 1  (a) and  (b),  the  increase of  glucose  concentration had positive 

effects  on  cells  viability  up  to  70  mM  but  determined  a  decrease  of   viability  at  100  mM 

glucose. Very  high  concentration of   glucose  (70 and  100  %)  increased  significantly  the ROS 

generation, as can be seen from the time‐course increase of  fluorescence. Glucose at 50 mM 

was chosen for the further experiments, based on the fact that it has positive effect on the cell 

viability but significantly increase the ROS generation compared with control. 

   2   5   m   M

  4  0   m   M

   5  0   m   M

 

   7  0   m   M

   1  0  0   m

   M

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

**

ns

ns

ns

Glucose concentration (mM)

   A   b  s  o  r   b  a  n  c  e   (  n  m   )

0 35 70 105 140 175 210 245

0

500

1000

1500

2000

250025 mM

40 mM

50 mM

70 mM

100 mM

Time (min)

   D   C   F   f   l  u  o  r  e  s  c  e  n  c  e

 

(a)  (b) 

Fig.1. Viability  of  D407  cells treated  with different  concentration of  glucose (a) and  intracellular  

ROS generation (b). Statistic: one‐way   ANOVA analysis of  variance, Dunnet  test, comparing all  

columns with control  column (25mM),  p<0.05, **‐ very  significant. 

147

Page 150: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 150/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

  C  o  n  t  r  o   l

   L   U   T

  C  o  n  t  r  o   l   g 

   L   U   T  g 

0

50

100

150

   L   D   H  c   i   t  o   t  o  x   i  c   i   t  y   (   %    f  o  r  m   c  o  n   t  r  o   l   )

ns   ns

 

Fig. 2. Lactate dehidrogenase leakage in D407  cells culture medium. 

Control; Control  g –  50 μM glucose; LUT  –  Lutein 10 μM; LUT  g –  Lutein 10 μm + 50 μM glucose 

  C  o  n   t  r  o   l

   L   U   T

  C  o  n   t

  r  o   l -  g 

   L   U   T 

  g 

0

10

20

30

40

50***

**

   A  c   t   i  v   i   t  y   G   P  x  n  m  o   l   /  m   i  n   /  m  g  p  r  o   t  e   i  n

  C  o  n  t  r  o   l

   L   U   T

  C  o  n  t  r

  o   l -  g 

   L   U   T  g 

0

20

40

60

80

100

ns

ns

   C   A   T  n  m  o   l   i   /  m   i  n   /  m  g  p  r  o   t  e   i  n

 

(a)  (b) 

Fig. 3. Glutathione  peroxidase (a) and  catalase activity  (b) in D407cells. Control; Control  g –  50 μM glucose; LUT  –  Lutein 10 μM; LUT  g –  Lutein 10 μm + 50 μM glucose 

Statistic: one‐way   ANOVA analysis of  variance, Tukey  test,  p<0.05, *‐ significant, **‐ very  

significant, ***‐ extremely  significant. 

148

Page 151: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 151/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

In a previous study we demonstrated that cultured RPE cells are able to uptake lutein 

and zeaxanthin  in the range of  1‐10  μM (Pintea et al., 2007).  Lutein at 10  μM concentration 

did not affect the RPE cells viability  in control or high glucose treated cells  (data not shown) 

and did not show any cytotoxic effect in both experimental conditions (Fig. 2). Cells treatment 

with 50 mM glucose  induced a  small but not  significant  increase of  GPx activity but a small 

decrease  of   catalase  activity.  Treatment  with  lutein  for  24  h  resulted  in  a  very  significant 

increase of  GPx activity  in both control and high glucose condition. Catalase activity was not 

significantly  changed  by  addition  of   glucose  or  glucose  and  lutein  (Fig.  3).  It  is  known  that 

catalase acts at high concentration of  hydrogen peroxide while glutathione peroxidase acts at 

lower  level  of   peroxides.  High  glucose  concentration  induced  a  small  but  not  statistically 

significant decrease of  SOD activity. The positive influence of  lutein on SOD activity was more 

evident  in control  cells  that  in high glucose  treated cells  (Fig. 4a). Lutein  in culture medium 

determined an  inhibition of  fluorescence  in ROS assay, significant  in the case of  high glucose 

treated cells, demonstrating  the ability of  carotenoids  to neutralize  the  intracellular  reactive 

oxygen species (Fig. 4b). These results are correlated with a decrease of  MDA concentration in 

cells  treated  with  lutein  at  high  glucose  concentration  (Table  1).  Reduced  glutathione concentration was  lower in high glucose treated cells that in control cells but there were not 

significant changes after addition of  lutein, both in normal and high glucose samples (Table 4). 

Similar results were obtained were xanthophylls (lutein, zeaxanthin and β‐cryptoxanthin) were 

tested in oxidative stress induced by addition of  hydrogen peroxide in culture medium (Pintea 

et al, unpublished data). 

  C  o  n  t  r  o   l

   L   U   T

  C  o  n  t  r

  o   l   g 

   L   U   T  g 

0

5

10

15

20

*

ns

   S   O   D   U   /  m  g  p  r  o   t

  e   i  n

  C  o  n   t  r

  o   l   L   U

   T

  C  o  n   t  r  o   l -  g 

   L   U   T 

  g 

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

   D   C   F   f   l  u  o  r

  e  s  c  e  n  c  e

ns*

 (a)  (b) 

Fig. 4. Superoxide dismutase activity  (a) and  ROS generation in D407  cells. 

Control; Control  g –  50 μM glucose; LUT  –  Lutein 10 μM; LUT  g –  Lutein 10 μm + 50 μM glucose; 

Statistic: one‐way   ANOVA analysis of  variance, Tukey  test,  p<0.05, *‐ significant, **‐ very  

significant, ***‐ extremely  significant. 

Table 1. Lipid   peroxidation (TBAR’S) and  reduced  glutathione (GSH) 

Control  Lutein High glucose  Lutein  high 

glucose 

TBAR’S 

(nmol/mg 

protein) 

0.63 ± 0.09  0.61 ± 0.07 0.76 ± 0.12 0.71 ± 0.07

GSH  (nmol/mg 

protein) 

21.2 ± 3.4  21.5 ± 3.0 18.4 ± 2.4 19.4 ± 2.9

Values are mean ± standard deviation 

149

Page 152: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 152/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Diabetes  is a chronic metabolic disorder manifested by a complex symptomatology. 

Oxidative damages have been reported to be involved in the pathogenesis of  diabetes and of  

other neurodegenerative diseases. Hyperglycemia which occurs  in diabetes reduces the  level 

of  antioxidants and determines an increase of  reactive oxygen species which, in turn produce 

oxidative damages in different tissues, including retina. One of  the complications of  diabetes is 

diabetic  retinopathy, caused by  inefficient control of  blood glucose  levels. Manifestations of  

diabetic  retinopathy  occur  when  the  retina  is  exposed  to  prolonged  high  glucose  level. 

Diabetic retinopathy affects virtually all subjects who suffer from type I diabetes by at least 20 

years and 80% of  those with type II diabetes for the same period. Most of  the effects of  high 

glucose concentration are actually related to increased metabolism. Thus, there is an increase 

in  glycolysis,  in  pyruvate  production,  and  in  oxidative  phosphorylation.  Oxidative 

phosphorylation  is one of  the physiological processes that generate  reactive oxygen species. 

Furthermore,  reactive  oxygen  species  are  also  produced  outside  mitochondria,  in  part  by 

sorbitol oxidation.  It  is also considered that oxidative degradation of  proteins contributes to 

damage of  blood vessels, involved in the pathogenesis of  diabetic microangiopathy (Yokoyama et  al.,  2006).  Several  in  vivo  studies  showed  that  progression  of   diabetic  retinopathy  is 

inhibited by the use of  antioxidants, by lowering the level of  lipid peroxidation, of  oxidatively 

modified DNA, nitrotyrosine and other markers of  oxidative  stress  (Martin‐Gallan, P., et al., 

2005,  Kowluru,  RE  et  al., 2008).  However,  zeaxanthin  did  not prevent  the  decrease  in  GSH 

content  in  the retina of  diabetic rats  (Kowluru et al., 2008). Lutein treatment of  healthy and 

diabetic mice prevented  the oxidative  stress  induced changes on  the  lipid peroxidation and 

GPx activity in retina and hippocampus (Muriach et al., 2006). Lutein was recently reported to 

prevent cortex  lipid peroxidation  in streptozotocin‐induced diabetic  rats  (Arnal et al., 2010). 

Administration of  high concentrations of  glucose  in the culture medium of  RPE cells  (33mm) 

led  to an  increase of  cathepsin‐B expression, glutathione peroxidase and heat  shock protein 27. For Cu/ZnSOD the isoelectric point shifted toward acidic region in response to high glucose 

concentration. Unlike for other enzymes, SOD activity was lower compared with control cells. 

The authors concluded that RPE cells respond to acute pathologically high glucose by elevated 

expression of  antioxidant enzymes  (GPX, Hsp27) and proteolytic enzymes  (Yokoyama et al., 

2006). Cells respond differently to elevated glucose concentrations. Cultured human Schwann 

cells  exposed  to  high  glucose  showed  an  increase  in  superoxide  dismutase  and  catalase 

activity, but a decrease in reduced glutathione concentration (Askwith et al., 2009). 

CONCLUSIONS 

We examined the effect of  high doses of  glucose on the viability and oxidative status 

of  cultured retinal pigment epithelial cells and the effect of  lutein addition on the antioxidant 

status of  cells cultivated in normal and high glucose medium. 

Lutein did not show any cytotoxic effect on RPE cells up to 10 μM in culture medium 

and  protect  them  against  induced  oxidation.  Lutein  protects  RPE  cells  by  quenching  the 

intracellular ROS generation, by reducing the  lipid peroxidation and by enhancing the activity 

of  superoxide dismutase and glutathione peroxidase.  Addition of   lutein did not significantly 

influenced reduced glutathione concentration and catalase activity. Increased concentration of  

lutein in RPE cells can contribute to antioxidant defence in oxidative stress conditions. 

Acknowledgements 

This  work  was  supported  by  CNCSIS–UEFISCSU,  PNII   –  IDEI  code  ID_854,  414/2007.  We 

gratefully acknowledge to Prof. Dr. Horst A. Diehl for providing the D407 RPE cells. 

150

Page 153: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 153/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

REFERENCES 

1.  Arnal,  E.,  Miranda,  M.,  Barcia,  J.,  Bosch‐Morell,  F.,  Romero,  F.J.,  Lutein  and 

docosahexaenoic  acid  prevent  cortex  lipid  peroxidation  in  streptozotocin‐induced 

diabetic rat cerebral cortex, Neuroscience, 2010, 166, 271‐278 

2. 

Asckwith, T., Zeng, W., Eggo, MC, Stevens, MJ, Oxidative stress and dysregulation of  

the  taurine  transporter  in high‐glucose‐exposed human  Schwann  cells:  implications 

for  pathogenesis  of   diabetic  neuropathy,   Am   J  Physiol   Endocrinol   Metab,  2009, 

297(3), 620‐628 

3. 

Beatty S.,  Koh H.H., Phil M., Henson D.,  Boulton M., The role of  oxidative stress  in 

the  pathogenesis  of   age‐related  macular  degeneration,  Survey   of   Ophtalmology , 

2000, 45, 115‐134 

4. 

Coleman,  H.  R.,  Chan,  C.  C.,  Ferris,  F.  L.,  3rd  and  Chew,  E.  Y.,  Age‐related  macular 

degeneration, 2008, Lancet , 372(9652): 1835‐1845 

5.  Khachik  F.,  Bernstein  P.S.,  Garland  D.L.,  Identification  of   lutein  and  zeaxanthin 

oxidation products  in human and monkey  retinas,  Invest  Ophthalmol  Vis Sci ., 1997, 38(9),1802‐1811. 

6.  Kopitz, J., Holz, F.G., Kaemmerer, E., Schutt, F., Lipids and lipid peroxidation products 

in  the pathogenesis of  age‐related macular degeneration, Biochimie, 2004, 86, 825‐

831 

7.  Kowluru,  R.A.,  Menon,  B.,  Gierhart,  D.L.,  Beneficial  Effect  of   Zeaxanthin  on  Retinal 

Metabolic Abnormalities in Diabetic Rats, Invest  Ophthalmol  Vis Sci., 2008, 49, 1645‐

1651 

8. 

Krinsky,  N.I.,  Johnson,  E.J.,  Carotenoid  actions  and  their  relation  to  health  and 

disease, Molec.  Asp. Medicine, 2005, 26, 459‐516 

9. 

LeBel  C.P.,  Ischiropoulos,  H.,  Bondy,  S.C.,  Evaluation  of   the  probe  2',7'‐dichloro‐fluorescin as an  indicator of  reactive oxygen species  formation and oxidative stress, 

Chem Res Toxicol , 1992, 5 (2), 227‐231 

10.  Lu  L., Hacket  S.F., Mincey, A.,  Lai H., Capochiaro P.A., Effects of  different  types of  

oxidative stress in RPE cells,  J. Cell  Physiol., 2006, 206 (1), 119‐125 

11.  Martın‐Gallan,  P.,  Carrascosa,  A.,  Gussinye,  M.,  Domınguez,  C.,  Estimation  of  

lipoperoxidative damage and antioxidant status in diabetic children: relationship with 

individual antioxidants, 2005, Free Radic. Res., 39, 933‐942 

12.  Miceli M.V., Liles M.R., Newsome, D.A., Evaluation of  oxidative processes  in human 

pigment epithelial cells associated with retinal outer segment phagocytosis, Exp Cell  

Res, 1994, 214 (1): 242‐249 

13. 

Mosmann T., Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to 

proliferation and cytotoxicity assays,  J Immunol  Methods, 1983, 65 (1‐2), 55‐63 

14. 

Muriach,  M.,  Bosch‐Morell,  F.,  Alexander,  G.,  Blomhoff,  G.,  Barcia,  J.,  Arnal,  E., 

Almansa,  I., Romero, F.J., Miranda, M., Lutein effect on  retina and hippocampus of  

diabetic mice, Free Radical Biology & Medicine, 2006, 41, 979‐984 

15. 

Pintea Adela, Dumitrița Preda, Cornelia Braicu, Andrea Bunea, Carmen Socaciu, H.A. 

Diehl,  Lutein  and  Zeaxanthin  uptake  in  cultured  retinal  pigmented  epithelial  cells, 

Bulletin USAMV  Cluj  Napoca series MV , 2007, 64(1‐2), 238‐243 

16. 

Qin, S., Oxidative damage of  retinal pigment epithelial cells and age‐related macular 

degeneration, Drug Dev  Res, 2007, 68, 213‐225 

17. 

Snodderly  D.M.,  Brown  P.K.,  Delori  F.C.,  Auran  J.D.,  The  macular  pigment.  I. 

Absorbance  spectra,  localization  and  discrimination  from  other  yellow  pigments  in 

151

Page 154: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 154/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

primate retinas. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 1984a, 25, 660‐673 

18.  Villarroel, M., Garcia‐Ramirez, M., Corraliza, L., Hernandez, C., Simo, R., Effects of  high 

glucose  concentration  on  the  barrier  function  and  the  expression  of   tight  junction 

proteins in human retinal pigment epithelial cells, Exp. Eye Res., 2009, 89, 913‐920 

19.  Winkler, B.S., Boulton, M.E., Gottsch, J.D., Sternberg, P., Oxidative damage and age‐

related macular degeneration, Mol  Vis, 1999, 5: 32 

20. 

Wrona, M., Rozanowska, M., Sarna, T., Zeaxanthin  in combination with ascorbic acid 

or  alpha‐tocopherol  protects  ARPE‐19  cells  against  photosensitized  peroxidation  of  

lipids, Free Radic. Biol. Med., 2004, 36, 1094‐1101 

21. 

Yokoyama,  T.,  Yamane,  K.,  Minamoto,  A.,  Tsukamoto,  H.,  Yamashita,  H.,  Izumi,  S., 

Hoppe, G.,  Sears,  J.E.,  Mishima, H.K., High glucose  concentration  induces elevated 

expression of  anti‐oxidant and proteolytic enzymes in cultured human retinal pigment 

epithelial cells, Exp. Eye Res., 2006, 83, 602‐609 

152

Page 155: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 155/206

Page 156: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 156/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

RESULTS AND DISSCUSIONS 

The results are presented in table 1, 2, and figures 1, 2. 

Table 1. 

Mean sexual cycle duration (days) 

Fig.1. Dynamics

 of 

 sexual

 cycle

 duration

 (days)

 

In  C  group,  sexual  cycle  was  in  physiological  limits  –  4‐5  days  (4),  but  in  exposed 

groups, the duration was significantly (p<0.01) higher than the physiological limits, directly 

correlated  with  the  exposure  level:  E1/C:  +14.72%;  E2/C:  +21.88%;  E3/C:  +25.56;  E2/E1: 

+6.23%, p<0.05; E3/E2: +3.02%, p>0.05; E3/E1:+9.44%, p<0.01 

In C group all sexual cycle stages ranged in physiological limits as duration. 

Percentage  of   proestrus  in  physiological  limits  was  significantly  (p<0.01)  lower 

comparative  to  C  group:  E1/C:  ‐1.89%,  p<0.05;  E2/C:‐5.24%,  p<0.01;  E3/C:  ‐6.12%,  p<0.01, 

and  inversely  correlated  with  the  exposure  level  (E2/E1:  ‐3.41%,  p<0.01;  E3/E2:  ‐0.92%, 

p>0.05; E3/E1:‐4.3%, p<0.01). 

No sexual cyles with absent proestrus were reported. 

Exposure to aluminium determined the appearance of  sexual cycles with prolonged 

proestrus,  increasing  significantly  (p<0.01),  in  direct  correlation  with  the  exposure  level: 

E1/C:  +93%;  E2/C:+257%;  E3/C:  +300%;  E2/E1:  +84.97%,  p<0.01;  E3/E2:  ‐12.04%,  p>0.05; 

E3/E1:+107.25, p<0.01%. 

The  percent  of   sexual  cycles  with  estrus  in  physiological  limits  was  in  E  group 

significantly (p<0.01) lower than in C group. inversely. significantly (p<0.01) correlated with 

the  exposure  level:  E1/C:  ‐5.57%;  E2/C:‐10%;  E3/C:  ‐11.43%;  E2/E1:  ‐4.69%,  p>0.05;  E3/E2:  ‐

1.58%, p>0.05; E3/E1:‐6.20, p<0.01%. 

Exposure  to  aluminium  determined  the  appearance  of   sexual  cycles  with  absent 

estrus in E groups: E1/C: 5.57%/0%; E2/C:10%/0%; E3/C: 11.43%/0%; increasing significantly, 

Group 

X±Sx D.S. C.L. 95%

 

C  4.89±0.09 0.23 0.21 

E1  5.61±0.12 0.32 0.21 

E2  5.96±0.08 0.22 0.21 

E3  6.14±0.12 0.31 0.21 

154

Page 157: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 157/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

in direct correlation with the exposure level E2/E1: +79.53%, p<0.01; E3/E2: +14.3%, p<0.05; 

E3/E1:+105.2%, p<0.01. 

The  percent  of   sexual  cycles  with  diestrus  I  in  physiological  limits  significantly 

decreased  (p<0.01)  in  exposed  groups  comparative  to  C  group:  E1/C:  ‐4%;  E2/C:‐10.54%; 

E3/C:  ‐13.43%,  inverselly, significantly (p<0.01) correlated with the exposure  level: E2/E1:  ‐

6.84%, p<0.01; E3/E2: ‐3.19%, p<0.05; E3/E1: ‐9.82%, p<0.01). 

No sexual cyles with absent diestrus I were reported. 

Exposure  to  aluminium  determined  the  appearance  of   sexual  cycles  with 

prolonged  diestrus  I,  increasing  significantly  (p<0.01),  in  direct  correlation  with  the 

exposure  level:  E1/C:  4%/0%;  E2/C:10.57%/0%;  E3/C:  13.43%/0%;  E2/E1:  +164.25%;  E3/E2: 

+27.05%; E3/E1:+235.75%. 

The  percent  of   sexual  cycles  with  diestrus  II  in  physiological  limits  significantly 

decreased  (p<0.01)  in  exposed  groups,  comparative  to  C  group:  E1/C:  ‐6.71%;  E2/C:‐11%; 

E3/C:  ‐14.14%,  inverselly,  significantly  (p<0.01)  correlated  with  the  exposure  level  E2/E1:  ‐

4.59%; E3/E2: ‐3.52%; E3/E1:‐7.96%. 

No sexual cyles with absent diestrus II were reported. The  precent of  sexual  cycles  with prolonged  diestrus  II was significantly (p<0.01) 

higher  in  E  groups  than  in  C  group:  E1/C:  6.71%/0%;  E2/C:11%/0%;  E3/C:  14.14%/0%; 

directly,  significantly  (p<0.01)  correlated  with  exposure  level:  E2/E1:  +63.93%;  E3/E2: 

+28.54%; E3/E1:+110.73%. 

Figure. 2. Sexual cycle stages dynamics 

Appearance  of   anormal  sexuale  cycles  was  mentioned  by  Agrawald  et  al.,  (1) 

consecutive female exposure from in utero period until sexual maturity. 

No  data  regarding  the  influence  of   exposure  period,  and/  or  duration  (month, 

generations) on sexuale cycle characteristics were found. 

155

Page 158: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 158/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Table 2. Sexual cycle stages (% of  total sexual cycles) 

N  – physiological (as duration) stage 

A‐  absent stage 

P  – prolonged stage 

E1  – 200 ppb Al 

E2  – 400 ppb Al 

E3  – 1000 ppb Al NB: 28 supervised sexual cycles /group (7 individuals/group x 4 supervised sexual cycles)

Sexual cycle stage

  C E1   E2  E3

Proestrus  N  X ± Sx  98± 0.44 96.14±0.51 92.86±0.63  92.00±0.44

S. D.  1.15 1.35 1.68  1.63

C.L:  0.76 0.76 0.76  0.76

A  X ± Sx  0.00± 0.00 0.00±0.00 0.00±0.00  0.00±0.00

S. D.  0.00 0.00 0.00  0.00

C.L:  0.76 0.76 0.76  0.76

P  X ± Sx  2.00± 0.44 3.86±0.01 7.14±0.26  8.00±0.49

S. D.

 1.15 0.01 0.69

 1.29

C.L:  0.76 0.76 0.76  0.76

Estrus  N  X ± Sx  100± 0.00 94.43±1.57 90.00±0.79  88.57±0.87

S. D.  0.00 4.16 2.08  2.30

C.L:  1.18 1.18 1.18  1.18

A  X ± Sx  0.00± 0.00 5.57±0.13 10.00±0.44  11.43±0.37

S. D.  0.00 0.13 1.15  0.98

C.L  1.18 1.18 1.18  1.18

P  X ± Sx  0.00± 0.00 0.00±0.00 0.00±0.00  0.00±0.00

S.D.  0.00 0.00 0.00  0.00

C.L  1.18 1.18 1.18  1.18

Diestrus I  N  X ± Sx  100± 0.00 96.00±0.53 89.43±1.11  86.57±0.53

S.D.  0.00 1.41 2.94  1.40

C.L:  0.89 0.89 0.89  0.89

A  X ± Sx  0.00± 0.00 0.00±0.00 0.00±0.00  0.00±0.00

S.D.  0.00 0.00 0.00  0.00

C.L:  0.89 0.89 0.89  0.89

P  X ± Sx  0.00± 0.00 4.00±0.49 10.57±0.37  13.43±0.48

S.D.  0.00 1.29 0.98  1.27

C.L:  0.89 0.89 0.89  0.89

Diestrus II  N  X ± Sx  100± 0.00 93.29±0.68 89.00±0.31  85.86±0.40

S.D.  0.00 1.80 0.82  1.07

C.L:  0.93 0.67 0.67  0.67

A  X ± Sx  0.00± 0.00 0.00±0.00 0.00±0.00  0.00±0.00

S.D.  0.00 0.00 0.00  0.00

C.L:  0.93 0.67 0.67  0.67

P  X ± Sx  0.00±0.00 6.71±0.42 11.00±0.53  14.14±0.40

S.D.  0.00 1.11 1.41  1.07

C.L:  0.93 0.67 0.67  0.67

156

Page 159: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 159/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

CONCLUSIONS 

Exposure to aluminium sulphate during suckling period determined in female rats at 

sexual maturity: 

 

Significant increase of  sexual cycle duration comparative to control group, over the physiological limits, and in direct correlation to exposure level; 

 

Modification of  sexual stages regularity: 

o significant decrease  of  sexual cycles percentage with proestrus, estrus, diestrus  I 

and  diestrus  II  in  physiological  limits  as  duration  comparative  to  control  group  and 

inversely correlated with the exposure level; 

appearance  of   sexual  cycles  with  absent  estrus,  directly  correlated  with  the 

exposure level; 

appearance  of   sexual  cycles  with  prolonged  proestrus,  diestrus  I  and  II,  directly, 

significantly correlated with exposure level. 

REFERENCES 

1.  Agarwal, S.K., Ayyash, L., Gourlet, C.S., Levy, L., Faber, K., Hughes, C.L.JR. 

Evaluation  of   the  developmental  neuroendocrine  and  reproductive 

toxicology of  aluminium. Food Chem Toxicol. 1996, 34:1: 49‐53. 

2.  Drugă Mărioara  Aluminiul.  Potențialul  poluant  al  industriei  de  prelucrare 

primară şi  secundară.  Impactul  asupra  organismelor  vii,  Teză de 

doctorat,2005, USAMVB Timişoara. 

3. 

Gupta C. Ramesh., Veterinary Toxicology, 2007, Ed. Academic Press U.S.A. 

4. 

Kei‐Ichiro  Maeda.,  Satoshi  Ohkura.,  Hiroko  Tsukamura.,  Physiology  of  

Reproduction, Academic Press, Japan, 2000, pp. 145‐456; 

5. 

***Directiva 86/609 Din 24.11.1986 privind protecția animalelor utilizate  în 

scopuri  experimentale  și   în  alte  scopuri  științifice, 

http://ec.europa.eu/food/fs/aw/aw_legislation/scientific/86‐609‐

eec_en.pdf ; 

6.  ***Legea  205/26.05.2004  privind  protecția  animalelor,  M.  O.  nr. 

531/14.06.2004; 

7.  ***Legea  206/27.05.2004  privind  buna  conduită  în  cercetarea  științifică, 

dezvoltarea tehnologică și inovare, M. O. nr. 505/4.06.2004; 

8.  ***Legea  471/9.07.2002  privind  aprobarea  O.G.  nr.  37/2002  pentru 

protecția  animalelor  folosite   în  scopuri  științifice  sau   în  alte  scopuri experimentale, M. O. nr. 535/23.07.2002; 

9. 

***Legea  9/11.01.2008  pentru  modificarea  și  completarea  Legii  nr. 

205/2004 privind protecția animalelor, M. O. nr. 29/15.01.2008; 

10.  ***Ordin  143/400  pentru  aprobarea  instrucțiunilor  privind  adăpostirea  și 

 îngrijirea  animalelor  folosite   în  scopuri  științifice  sau   în  alte  scopuri 

experimentale, M. O. nr. 697/24.09.2002; 

157

Page 160: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 160/206

 

IMPROVEMENT OF GLUCOSE CONCENTRATION, LIPOPROTEIN 

PROFILE 

AND 

ANTIOXIDANT 

BIOMARKERS 

IN 

BLOOD 

OF 

NATURALLY DIABETIC BITCHES ADMINISTERED INSULIN WITH 

VITAMIN C OR VITAMIN E 

Wael M. EL‐Deeba , S.M. El ‐Bahr

a

(Corresponding author) 

Department  of  clinical  studies, College of  Veterinary  Medicine and  animal  Resources, King 

Faisal  University, Saudi   Arabia,  Al ‐ Ahsa, 31982 

P.O. Box:  1757  

e‐mail: [email protected] 

Department  of  Physiology, Biochemistry  and  Pharmacology, College of  Veterinary  Medicine 

and  animal  Resources, King Faisal  University, Saudi   Arabia,  Al ‐ Ahsa, 31982 

Abstract 

The present work aimed to determine  if  vitamin C or E has any advantage over  insulin therapy 

on  glucose  concentration,  lipoprotein  profile,  antioxidant  activity  and  lipid  peroxidation  in 

naturally diabetic bitches. Therefore, forty bitches were divided  into four groups (10 bitches  in 

each).  The  first  and  second  groups  were  served  as  non  diabetic  and  diabetic  control  group, 

respectively.  Dogs  of   group  2  were  divided  to  3  groups  (10  animals  each)  and  subjected  to 

different three treatment protocols namely group 3, 4 and 5 which treated with  insulin,  insulin 

and ascorbic acid, and  insulin and vitamin E, respectively. Values of  blood glucose, serum total 

cholesterol,  low density  lipoprotein cholesterol (LDL‐c) and high density  lipoprotein cholesterol 

(HDL‐c) were determined.  In addition,  the enzymatic activities of  superoxide dismutase  (SOD), 

catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX) and the values of  malondialdehyde (MDA) were 

measured  in erythrocyte hemolysate as biomarkers of  antioxidation. Results  revealed  that,  in 

diabetic  bitches,  the  values  of   glucose,  total  cholesterol,  LDL‐c  and  MDA  were  significantly 

increased as compared to non diabetic bitches. SOD, CAT, and GPX activities and HDL‐c values of  

diabetic bitches were significantly decreased as compared to normal bitches. In diabetic bitches, 

supplementation  of   examined  dose  of   vitamin  C  or  vitamin  E  with  insulin  was  effective  in 

inhibiting  hyperglycaemia,  hypercholesterolemia,  oxidative  stress  and  lipid  peroxidation  than 

insulin alone. These effects were almost the same whatever the vitamin used. Keywords: Diabetes mellitus, lipoproteins, oxidative stress, vitamin C, vitamin E, bitches 

1.  INTRODUCTION 

Diabetes mellitus  (DM)  is  the most common metabolic disease.  It  is more  likely  that 

long‐term, uncontrolled DM with sustained high blood glucose  levels  is the cause of  glucose 

autooxidation  with  increased  oxidative  stress  (So¨zmen  et  al.,  2005).  Overproduction  of  

reactive oxygen species (ROS) through the electron transport chain has been demonstrated in 

DM. Lipid peroxidation is an important biological consequence of  oxidative cellular damage in 

patients with DM. Serum  lipoperoxidation products such as malondialdehyde (MDA) reflects 

oxidative stress. 

158

Page 161: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 161/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

The  increase  in  ROS  causes  nonspecific  modification  of   nucleic  acids,  proteins,  and 

phospholipids  leading  to  DNA,  RNA,  and  protein  damage  and  alterations  in  antioxidant 

enzyme  levels. All these events result  in cellular and tissue damage. Tissue damage  induced 

by  free  radicals  is  thought  to  be  an  important  factor  in  the  pathogenesis  of   DM  and  its 

complications  (Annunziata  et  al.,  2005).  Experimentally,  streptozotocin  (STZ)  induces  DM, 

probably  through  the  generation  of   ROS,  leading  to  islet  cell  destruction  (Tavridou  et  al., 

1997).  Living  organisms  possess  antioxidant  defense  systems  against  ROS.  These  defense 

systems  include endogen antioxidants, which can be classified as enzymatic  (SOD, GSH) and 

nonenzymatic (vitamin E, vitamin C, uric acid, bilirubin) defense system. Once ROS formed, it 

depletes  antioxidant  defense  systems,  rendering  the  affected  cells  and  tissues  more 

susceptible to oxidative damage. 

Dogs are becoming an  important medical research model because  it shares the same 

environment as humans and develops many of  similar chronic diseases (Kearns et al., 1999, 

and Adams et al., 2000). Much of  their biochemical and endocrine mechanisms are similar to 

humans  (Kararli,  1995,  and  Felsburg,  2002).  DM  is  one  of   the  most  frequently  diagnosed 

endocrinopathies  in cats and dogs. Type 1 diabetes mellitus  (insulin dependent diabetes)  is most  common  in  dogs  (Expert  Committee  on  the  Diagnosis  and  Classification  of   Diabetes 

Mellitus, 1997). At present, there are no internationally accepted criteria for the classification 

of  canine diabetes. No  laboratory test  is readily available to  identify the underlying cause of  

diabetes  in dogs, and diagnosis  is generally made  late  in  the disease  course.  If   the  criteria 

established  for human diabetes are applied to dogs, at  least 50% of  diabetic dogs would be 

classified as type 1, because this proportion has been shown to have antibodies against β‐cells 

(Hoenig and Dawe, 1992; Davison et al., 2003). 

The balance between oxidant and antioxidant species has been proposed to have an 

important role in preventing diabetic complications. Dietary antioxidants play a major role in 

the  maintenance  of   the  oxidative  balance.  Vitamin  C,  vitamin  E,  and  other  micronutrients protect humans DM  (Schwedhelm et al., 2003). Numerous  studies have demonstrated  that 

antioxidant vitamins and supplements can help lower the markers indicative of  oxidant stress 

and  lipid peroxidation  in diabetic  subjects and animals. A number of   studies have  reported 

vitamin  C,  vitamin  E  and  beta‐carotene  deficiency  in  diabetic  patients  and  experimental 

animals (Penckofer, et al., 2002; Naziroglu and Butterworth 2005). 

To  our  knowledge,  up  till  now,  the  publications  concerning  the  effect  of   insulin 

combined with  vitamin C or E  in diabetic bitches are not available. Therefore,  the present 

study aimed to determine the effect of  combined administration of  insulin with vitamin C or 

vitamin  E  on  glucose  concentration,  lipoproteins  profile  and  oxidative  stress  markers  in 

naturally diabetic bitches. 

2.  MATERIALS AND METHODS 

2.1.  Animals 

A  total  of   40  bitches  (5‐8  years  old)  were  used  in  the  present  study.  They  were 

maintained as performed by national guidelines and protocols, approved by  the University 

Animal Ethics Committee. They were divided  into  four groups. Bitches of  the first group (10 

animals)  were  non  diabetic  and  served  as  a  control  non  diabetic  group  (positive  control; 

group 1). Bitches of  the second group (30 animals) were diagnosed as diabetic and served as 

control  diabetic  group  (negative  control;  group  II).  This  group  (group  2)  was  divided  to  3 

groups  (10 animals  each) and  subjected  to different  three  treatment protocols.  For  simple 

presentation  these  groups were named  group 3, 4  and 5. Bitches of   the  third  group were 

159

Page 162: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 162/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

treated with  insulin  in  a dose  rate of   0.5 unite/kg body weight  twice daily. Bitches  of   the 

fourth group were treated with insulin in a dose rate of  0.5 unite/kg body weight twice daily, 

and ascorbic acid supplementation  in a dose  rate of   30 mg/kg body weight and once daily 

(Morgan,  2008).  Bitches  of   the  fifth  group were  treated  with  insulin  in  a  dose  rate  of   0.5 

unit/kg body weight and vitamin E supplementation in a dose rate 800 IU once daily (Morgan, 

2008).  The  insulin  dose  was  stabilized  over  the  time  of   the  experiment.  All  experimental 

groups were presented in Figure 1. 

2.2. Sampling  protocol  

Fasting blood sample was collected one month post treatment from the cephalic vein 

from  all  groups  in  fresh  heparinized  vials  containing  sodium  fluoride  for  the  estimation  of  

glucose. Some blood samples were used for preparation of  serum for determination of  total 

cholesterol,  LDL‐c  and  HDL‐c.  In  addition,  the  activities  of   super  oxide  dismutase  (SOD), 

Catalase  (CAT),  Glutathion  peroxidase  (Gpx)  and  Malondialdehyde  (MDA)  in  erythrocyte 

hemolysate were also determined. 

From ethical point of  view, samples were  taken  from 10 animals of   the group  II and 

served  as  a  diabetic  control  samples.  Afterwards  all  group  II  as  mentioned  before  were treated  by  different  examined  drugs.  This  has  been  done  to  run  the  experiment  without 

depriving any dogs of  treatment. 

2.3. Preparation of  hemolysate 

After collecting blood samples  in heparinized  tubes, centrifugation was performed at 

1000g  for 15 min  to  remove  the buffy coat. The packed cells obtained at  the bottom were 

washed thrice with phosphate buffer saline (0.9% NaCl  in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.4). 

Erythrocytes were lysed with hypotonic phosphate buffer. The hemolysate was obtained after 

removing the cell debris by centrifugation at 3000g for 15 min and used for determination of  

super  oxide  dismutase  (SOD),  Catalase  (CAT),  Glutathion  peroxidase  (Gpx)  and Malondialdehyde (MDA). 

2.4. Determination of  glucose and  lipoprotein  profile 

Blood glucose was estimated by the method of  Dubowski as modified by Sasaki et al., 

(1972). Blood was treated with 10% trichloroacetic acid, mixed and centrifuged at 1000g for 

10 min; the protein free supernatant was then treated with orthotoludine reagent and kept in 

a boiling water bath for 10 min. The color developed was read using spectrophotometer at an 

absorbance  of   640  nm.  Enzymatic  method  of   spinreact  kits  was  used  for  colorimetric 

determination  of   serum  total  cholesterol  (Zak  et  al.,  1954)  according  to  the  manufacturer 

instructions.  Briefly,  the  spectrophotometer  was  adjusted  to  zero  by  distilled  water. Afterwards,  in clean and dry separate test tubes, 10μl of  serum and standard of  cholesterol 

were added to 1ml of  their working solutions. However, the blank was prepared by adding 1 

ml of  the working solution in a separate tube. After mixing, the mixture was incubated for 5 

minutes at 37  °C and  the developed colour was measured  colorimetrically against blank at 

wave length of  505 nm. The value of  cholesterol (mg/dl) were calculated by dividing the value 

of  the absorbance of  the serum sample on that of  the standard and the resultant value then 

multiplied  by  200  (Standard  concentration).  Detection  limit  was  ranged  from  0.6  to  600 

mg/dl. However, the sensitivity was 1 mg/dl. Enzymatic method of  spinreact kit was used also 

for colorimetric determination of  serum HDL‐c (Lopes‐Virella et al., 1977). Briefly, 1 ml of  the 

serum was added to 100 μl of  the precipitating reagent. After mixing, the mixture allowed to 

stand  for  10  minutes  at  room  temperature.  After  centrifugation  (3000g/20  minutes),  the 

supernatant  was  collected  and  the  cholesterol  value  was  estimated  as  mentioned  above. 

160

Page 163: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 163/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

Detection  limit was  ranged  from 1.57  to 275 mg/dl and  the  sensitivity was 1 mg/dl. VLDL‐c 

was calculated by division of  TAG/5 mg/dl while the LDL‐c was calculated as total cholesterol 

 – (HDL‐c + VLDL‐c) = mg/dl (Bauer, 1982). 

2.5. Determination of   Antioxidant  enzymes 

Activity of  superoxide dismutase SOD (inhibition rate percent) was assayed in the RBC's 

cell as described by Nishikimi et al. (1972) using commercial available kits (Bio‐diagnostic, Kit 

number SD2520). The activity of  catalase was assayed in the RBC's cell by the method of  Aebi, 

(1984) using commercial available kits (Bio‐diagnostic, Kit number CA2516). The activity of  the 

enzyme  was  expressed  as  units/mg  of   haemoglobin.  Glutathione  peroxidase  (GPx) 

(EC.1.l1.1.l9)  was  assayed  by  the  method  of   Rotruck  et  al.  (1973).  The  hemolysate  were 

prepared in Tris‐HCl buffer (pH 7.0, 0.4 M). The assay mixture contained EDTA, sodium azide 

(10  mM),  reduced  glutathione  (GSH  0.2  mM),  and  H2O2  (0.2  mM)  and  the  appropriately 

diluted enzyme preparation. A  system devoid of  enzyme served as  the control. The activity 

was determined by measuring the amount of  GSH consumed after carrying out the reaction 

for 10 minutes. 

2.6. Determination of  lipid   peroxidation 

Lipid  peroxidation  was  assayed  by  the  measurement  of   MDA  levels  on  the  base  of  

MDA  reacted with  thiobarbituric  acid  at  532  nm,  according  to  Ohkawa  et  al.  (1979)  using 

commercially supplied kits (Bio‐diagnostic, Kit number MD2529). 

2.7. Statistical  analysis 

The obtained data of  biochemical parameters were compared between groups within 

different  concentrations by using  computer package of   the  statistical analysis  system  (SAS, 

1997). All data are presented as means ± standard deviation (SD). 

3. 

RESULTS 

The data summarized  in Table 1 showed the  level of  blood glucose, total cholesterol, 

LDL‐c and HDL‐c in the control and experimental Bitches. Blood glucose level in insulin treated 

bitches  (Groups  3)  was  significantly  increased  than  the  normal  value  noted  in  the  control 

bitches whereas  its  concentration  in  insulin‐vitamin C and  insulin‐vitamin E  treated bitches 

(Groups 4 and 5 respectively) were comparable to the control group. However, blood glucose 

level in diabetic bitches (Group 2) was significantly (p < 0.01) higher than control and treated 

groups. Administration of  insulin, insulin with vitamin C and insulin with vitamin E to diabetic bitches  decreased  blood  glucose  level  significantly  compared  to  the  diabetic  animals  not 

getting either  compound. Administration of   insulin with  vitamins  (C or  E) was  found  to be 

more effective in lowering blood glucose level than insulin administered alone. 

Serum  total  cholesterol  values  in  insulin,  insulin‐vitamin  C  and  insulin‐vitamin  E 

(Groups 3, 4 and 5 respectively) treated bitches were significantly increased than the normal 

values noted  in  the  control bitches whereas  its concentration  in diabetic bitches  (Group 2) 

was significantly (p < 0.01) higher than control and treated groups. Administration of  insulin, 

insulin with vitamin C and  insulin with vitamin E  to diabetic bitches decreased  the  levels of  

total  cholesterol  concentrations  significantly  compared  to  the  diabetic  animals  not  getting 

either compound. Administration of  insulin with vitamin C was found to be more effective in 

lowering  total  cholesterol  value  followed  by  administration  of   insulin  with  vitamin  E  and 

finally insulin administered alone. 

161

Page 164: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 164/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

LDL‐c  level  in  insulin  treated bitches  (Groups 3) was  significantly  increased  than  the 

normal value noted  in the control bitches whereas  its concentration  in insulin‐vitamin C and 

insulin‐vitamin  E  treated  bitches  (Groups  4  and  5  respectively)  were  comparable  to  the 

control group. However, LDL‐c  level  in diabetic bitches (Group 2) was significantly (p < 0.01) 

higher than control and treated groups. Administration of   insulin,  insulin with vitamin C and 

insulin with vitamin E to diabetic bitches decreased LDL‐c level significantly compared to the 

diabetic animals not getting either compound. Administration of  insulin with vitamins (C or E) 

was found to be more effective in lowering LDL‐c level than insulin administered alone. 

The  concentration  of   serum  HDL‐c  in  bitches  treated  with  insulin  (Groups  3)  was 

significantly  (p  < 0.01)  lower  than  that of   the  control bitches whereas  the  concentration  in 

insulin‐vitamin  C  and  insulin‐vitamin  E  treated  bitches  were  comparable  with  the  control 

group. The concentration of  serum HDL‐c  in diabetic bitches (Group 2) was significantly (p < 

0.01) lower than that of  the control and treated groups. Administration of  insulin, insulin with 

vitamin  C  and  insulin  with  vitamin  E  to  diabetic  bitches  increased  the  levels  of   HDL‐c 

concentrations significantly compared to  the diabetic animals not getting either compound. 

Administration of   insulin with vitamins  (C or E) was  found to be more effective  in elevating HDL‐c level than insulin administered alone. 

The data of  Table 2  included the activities of  SOD, CAT, Gpx and value of  MDA  in the 

erythrocyte hemolysate of  control and experimental Bitches. The activities of  SOD, CAT and 

Gpx in bitches treated with insulin, insulin with vitamin C and insulin with vitamin E (Groups 3, 

4 and 5 respectively) were lower than the control bitches. The activities of  SOD, CAT and Gpx 

in  the  hemolysate  were  lowered  significantly  (p  <  0.01)  in  diabetic  bitches  (Group  2) 

compared  to  the  control  (Group  1).  Administration  of   insulin,  insulin  with  vitamin  C  and 

insulin‐vitamin E simultaneously elevated  the activities of   these enzymes  in  the erythrocyte 

hemolysate of   the diabetic bitches. However,  insulin administered either with vitamin C or 

vitamin E was found to be more effective in elevating the values of  examined enzymes than that of  insulin administered alone. 

The value of  MDA in insulin treated bitches (Groups 3) was significantly increased than 

the normal value noted  in the control bitches whereas  its concentration  in  insulin‐vitamin C 

and  insulin‐vitamin E treated bitches  (Groups 4 and 5  respectively) were comparable  to the 

control group. However, MDA value  in diabetic bitches (Group 2) was significantly (p < 0.01) 

higher than control and treated groups. Administration of   insulin,  insulin with vitamin C and 

insulin with vitamin E to diabetic bitches decreased MDA value significantly compared to the 

diabetic animals not getting either compound. Administration of  insulin with vitamins (C or E) 

was found to be more effective in lowering MDA value than insulin administered alone. 

4. 

DISCUSSION AND CONCLUSION 

Several  features  appear  in DM  including an  increase  in  lipid peroxidation  (Naziroglu 

and Sqimsek 2004; Gumieniczek, 2005), alteration of  the glutathione redox state, a decrease 

in  the  content of   individual natural  antioxidants,  and  finally  a  reduction  in  the  antioxidant 

enzyme  activities.  These  changes  suggest  an  oxidative  stress  caused  by  hyperglycemia 

(Chaudhry et al., 2007). Many defense mechanisms are  involved  in against oxidative  stress. 

Among  these mechanisms,  antioxidants  such as  ascorbic  acid  (vitamin C) and a‐tocopherol 

(vitamin  E)  play  the  role  of   a  free‐radical  scavenger  (Karaoz  et  al.,  2002;  Naziroglu  and 

Sqimsek 2004; Tucker and Townsen 2005). 

The present results showed that, administration of   insulin,  insulin with vitamin C and 

insulin with vitamin E  resulted  in  significant changes  in  the concentration of  blood glucose, 

162

Page 165: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 165/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

total cholesterol, LDL‐c, HDL‐c, SOD, CAT, Gpx and MDA. Literature information indicates that 

natural diabetic dogs are hyperglycemic and have  increased oxidative stress (Comazzi et al., 

2002). Observations  in  this  study also correlate well with  the previous  research  findings,  in 

that  the blood glucose  levels were elevated  significantly  in diabetic bitches  (Comazzi et al., 

2002).  There  were  marked  fall  in  the  blood  glucose  concentration  of   diabetic  bitches 

administered  insulin  alone  or  in  combination  with  either  vitamin  C  or  E.  The  better 

hypoglycaemic effect of  insulin administered with vitamins than that of  insulin alone perhaps 

attributed to one of  two possibilities. The first possibility is that, supplementation of  vitamins 

increased  the  antioxidant  enzymes  expressions  and/or  activities.  Although  pancreatic  beta 

cell  loss  in  diabetes  is  probably  due  to  an  autoimmune  response,  ROS  produced  during 

inflammation  are  considered  as  a  predisposing  factor,  and  increased  mitochondrial  ROS 

production  during  hyperglycemia  may  be  central  to  much  of   the  pathology  of   diabetes 

(Kowluru Renu et al., 2006; Nobuyo et al., 2006; Wagner et al., 2007). The second possibility is 

that, supplementation of  vitamins inactivates the circulating free radicals that quench nitrous 

oxide before it reaches pancreatic beta cells, where induced their damage and/or death (Vina 

et al., 2006). The reported increased level of  total cholesterol and HDL‐c in diabetic bitches comes in 

agreement  with  previous  studies  (Betteridge,  1994;  Naziroglu,  et  al.,  2004).  Studies  have 

shown  that  increased  plasma  triglyceride  and  cholesterol  levels  may  be  a  risk  factor  for 

vascular disease (Kamata and Yamashita 1999; Kamata et al 2001; Shahar et al., 2003). Also 

oxidative  modification  of   LDL  is  an  important  step  in  the  development  of   atherosclerosis 

(Felmeden  et  al.,  2003).  This  oxidation  is  initiated  and  propagated  by  free  radicals  where 

antioxidants become depleted (Young and Woodside, 2001; Kaviarasan et al., 2005). 

In this study, vitamin C or E when supplemented with insulin significantly reduced lipid 

profile  in diabetic bitches compared to  insulin treated diabetic bitches. This  improvement  in 

lipid profile in the present study is supported by previous studies  that vitamin C (Anderson et al., 1999; Kurowska et al., 2000) prevents oxidation of  LDL‐cholesterol; decreases  total and 

LDL‐cholesterol  and  triglyceride;  and  also  raises  HDL‐cholesterol  level.  The  superiority  of  

administration of   insulin with  vitamins  than  insulin alone  reflected  the protective effect of  

vitamins  against  atherogenic  properties  of   insulin.  This  was  underlined  by  the  reported 

increment of  HDL‐c in the respective groups. 

The possible explanation for the hypocholesterolaemic effect of  vitamin C and vitamin 

E  is  that  they  prevents  LDL‐cholesterol  from  oxidative  damage  and  aids  in  degradation  of  

cholesterol. Secondly, it has been suggested that these vitamins are needed by the enzyme in 

the  first  step  of   bile  acid  synthesis  (cholesterol  7α‐hydroxylase)  by  directing  cholesterol 

towards bile acid synthesis and reduces  its  level  in serum (White et al., 1994). Kaviarasan et al. (2005) reported that  level of  total cholesterol, triglyceride,  lipid peroxidation and glucose 

increased  in  hyperlipidemic  patients  with  DM  whereas  there  was  decreased  plasma 

concentration  of   vitamin  C,  E  and  other  antioxidants.  Taking  the  above  evidence  together 

suggest that vitamin C and E supplementation improves the lipid profile of  diabetic bitches by 

acting  through  cholesterol  7α‐hydroxylase  to  direct  cholesterol  into  bile  synthesis. 

Furthermore,  by  scavenging  free  radicals  it  decreases  oxidative  damage  to  oxidized  LDL‐

cholesterol. 

The significant (p < 0.01 %) decrease in the activity of  antioxidant enzymes, SOD, CAT 

and Gpx  in diabetic bitches (Table 2) are agree with the previous results in rats (Kedziora, et 

al., 2000; Vessby, et al., 2002).  The authors reported that, antioxidant capacity in plasma of  

type  –1  diabetic  rats  was  shown  to  be  lower  than  that  of   the  normal  animals,  and  they 

returned this reduction to decreased activity of  antioxidant enzymes. 

163

Page 166: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 166/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

The  present  work  demonstrated  a  potential  and  beneficial  effect  of   combined 

administration  of   insulin  either  with  vitamin  C  or  E  in  attenuating  oxidative  stress  and 

enhancing the body’s own antioxidant defenses in diabetic bitches with established oxidative 

stress.  As  tabulated  in  the  result  section,  most  of   the  evaluated  parameters  exhibited  a 

significant restoration which was comparable to that of  normal control.  In the contrary, the 

enzymatic  antioxidants  and  cell  damages  as  reflected  on  MDA  value  in  erythrocyte 

hemolysate remained significantly altered in the diabetic control bitches. 

The  antioxidant  enzymes  Gpx,  CAT  and  SOD  are  known  to  be  inhibited  in  diabetes 

mellitus  as  a  result  of   non‐enzymatic  glycosylation  and  oxidation.  The  positive  impact  of  

treatment of  DM using vitamins  (C and E) on  these enzymes observed  in  the present study 

could be explained by two possible mechanisms. First, the antioxidative effect of   vitamins C 

or E perhaps prevent  further glycosylation and peroxidation of  proteins by  interacting with 

free radicals minimizing their serious effects. Second, vitamin C or E may  induce the protein 

synthesis of   these enzymes, which explains  the observed elevated activity after  treatment. 

The  present  results  come  in  accordance  with  the  previous  researches  (Vina  et  al.,  2006; 

Borras et al., 2005; Pawlowska‐Goral et al., 2002; Vimal and Devaki 2004). The authors found that  polyphenolic  substances  such  as  estrogens,  flavonoids  and  vitamins  increased  the 

expression of  SOD and GPX enzymes at the transcriptional level. In conclusion of  this section, 

treatment of  diabetic bitches  in this study with vitamins C or E with  the main drug  (insulin) 

showed a significant restoration in the levels of  SOD, CAT, and GPX activity. 

Although  several  criteria  are  without  doubt  required  to  adequately  describe  a 

biomarker, the entire basis of  the biomarker  is the measurement of  compound that directly 

reflects  certain  biological  events  related  to  pathogenesis  of   a  disease  or  condition 

(Lykkesfeldt, 2007). Thus the rational of  MDA as a biomarker relies both that it is derived from 

lipid  peroxide,  that  changes  in  lipid  oxidation  levels  reflects  the  changes  in  MDA 

concentration. The significant (p < 0.01 %) increased level of  MDA in diabetic bitches (Table 2) in this 

study reflected the increased lipid peroxidation due to diabetes. This principle was previously 

observed  by  Rahimi  et  al.  (2005)  who  approved  the  increases  in  lipid  peroxidation  were 

usually accompanied diabetic patient. Numerous studies have demonstrated that antioxidant 

vitamins and supplements can help  in  lowering the markers  indicative of  oxidant stress and 

lipid peroxidation in diabetic subjects and animals (Naziroglu et al., 2005 and Penckofer, et al., 

2002). 

In  the  present  study,  we  observed  that  vitamin  C  or  vitamin  E  supplementation  to 

diabetic bitches improved the lipid peroxidation process as compared with diabetic condition 

as appeared in the significant (p < 0.01 %)  reduction in the levels of  MDA as oxidative damage biomarker  (Table 2). Also we observed the more obvious reduction of  MDA  levels  in  insulin 

vitamins treated group than  insulin group. These results could be explained by the previous 

observation of  Naziroglu et al., (2005) who found that, vitamin C is shown to be an important 

antioxidant,  to  regenerate  vitamin  E  through  redox  cycling,  and  to  raise  intracellular 

glutathione  levels. Thus vitamin C plays an  important  role  in protein  thiol group protection 

against oxidation. It has been proposed that, Vitamin C recycles Vitamin E by a non‐enzymatic 

reaction. Additional  interactions have been also reported between vitamin C and vitamin E. 

Vitamin C is associated with the recycling of  an important cellular antioxidant, the glutathione 

and functions with  it as a redox couple (Winkler et al., 1994). Glutathione  is also  involved  in 

the recycling of  Vitamin E by an enzymatic mechanism  (McCay, 1985; Chan, 1993). Another 

possibility is that, supplementation of  vitamin (C and E) inactivates the circulating free radicals 

164

Page 167: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 167/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

that quench NO before  it reaches pancreatic beta cells, where  induced their damage and/or 

death (Vina et al., 2006). 

The  current  study  indicated  that,  administration  of   the  examined  dose  of   either 

vitamin  C  or  vitamin  E  with  insulin  were  effective  in  inhibiting  hyperglycaemia, 

hypercholesterolemia, oxidative stress and lipid peroxidation than insulin alone. These effects 

were almost the same whatever the vitamin used. 

5. REFERENCES 

5. Adams, B., Chan, A., Callahan, H., Siwak, C., Tapp, D., Ikeda‐Douglas, C., Atkinson, P., Head, E., 

Cotman,  C.W.,  Milgram,  N.W.,  2000.  Use  of   a  delayed  non‐matching  to  position  task  to 

model age‐dependent cognitive decline in the dog. Behav. Brain.  Res. 108, 47– 56. 

6. Aebi, H., 1984. Methods Enzymol 105, 121‐126. 

7. Anderson  J W, Gowri M S and Turner  J. 1999. Antioxidant  supplementation effects on  low‐

density lipoprotein oxidation for individuals with type 2 diabetes mellitus;  J.  Am. Coll. Nutr. 

18, 451–461 

8. 

Annunziata  L, Domenico F, Pietro T. 2005. Glyco‐oxidation  in diabetes and  related diseases. 

Clin Chim Acta; 2:236–50. 

9. Bauer,  J.D.,  1982,  Clinical  laboratory  methods  9th  ed,  The  C.V.  Company  II  1830,  Westline 

industrial, Missouri, Chap. 33. 

10. 

Betteridge D. J. 1994. Diabetic dyslipidemia;  Am.  J. Med. (Suppl. 6A) 96, 255–315. 

11.  Borras C., Gambini J., Gomez‐Cabrera M. C., Sastre J., Pallardo F. V., Mann G. E., et al. 2005. 

17ßoestradiol up‐regulates  longevity‐related, antioxidant enzyme expression via  the ERK1 

and ERK2 [MAPK]/NFkB cascade. Aging Cell; 4:113‐8. 

12. 

Chan A. C. 1993. Partners  in defense, vitmian E and vitamin C. Can.  J. Physiol. Pharmacol. 

71:725‐731 

13.  Chaudhry  J,  Ghosh  NN,  Roy  K,  Chandra  R.  2007.  Antihyperglycemic  effect  of   a 

thiazolidinedione analogue and  its  role  in ameliorating oxidative stress  in alloxan‐induced diabetic rats. Life Sci.; 80:1135‐42. 

14.  Comazzi,  S.,  Paltrinieri,  S.,  Spagnolo,  V.,  Sartorelli,  P.  2002.  Some  aspect  of   erythrocyte 

metabolism in insulin‐ treated diabetic dogs. Research in veterinary Science, 72. 23‐27 

15.  Davison, L. J., Herrtage, M. E., Steiner, J. M., Williams, D. A. & Catchpole, B.,  2003. Evidence 

of  anti‐insulin autoreactivity and pancreatic inflammation in newly diagnosed diabetic dogs. 

J. Vet. Intern. Med. 17: 395 (abs.). 

16.  Expert Committee on the Diagnosis and Classification of  Diabetes Mellitus. 1997. Report of  

the Expert  Committee  on  the Diagnosis  and  Classification of   Diabetes  Mellitus.  Diabetes 

Care 20: 1183–1197. 

17.  Felmeden  D  C,  Spencer  C  G,  Blann  A  D,  Beevers  D  G  and  Lip  G  Y  2003  Low‐density 

lipoprotein subfraction and cardiovascular risk in hypertension: Relationship to endothelial dysfunction and effects of  treatment; Hypertension 41, 528–533. 

18.  Felsburg, P., 2002. Overview of  immune system development in the dog: comparison with 

humans. Human Exp. Toxicol. 21, 487–492. 

19.  Gumieniczek  A.  2005.  Effects  of   pioglitazone  on  hyperglycemia‐induced  alterations  in 

antioxidative  system  in  tissues  of   alloxan‐treated  diabetic  animals.  Exp  Toxicol  Pathol; 

56:321‐6. 

20.  Hoenig,  M.  &  Dawe,  D.,  1992.  A  qualitative  assay  for  beta  cell  antibodies.  Preliminary 

results in dogs with diabetes mellitus. Vet. Immunol. Immunopathol. 32: 195–203. 

21.  Kamata K. and Yamashita K. 1999. Insulin resistance and impaired endotheliium‐dependent 

renal vasodilation in fructose‐fed hypertensive rats; Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 

103,195–200 

165

Page 168: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 168/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

22.  Kamata  K.,  Kanie  N,  and  Inose  A.  2001.  Mechanisms  underlying  attenuated  conntractile 

respoonse  of   aortic  rings  to  noradrenaline  in  fructose‐fed  mice;  Eur.  J.  Pharmacol.  428, 

241–249 

23.  Karaoz E, Gultekin F, Akdogan M, Oncu M, Gokcimen A. 2002. Protective role of  melatonin 

and a combination of  vitamin C and vitamin E on lung toxicity induced by chlorpyrifos‐ethyl 

in rats. Exp Toxicol Pathol.; 54:97‐108. 24.

 

Kararli, T., 1995. Comparison of  the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry 

of  humans and commonly used laboratory animals. Biopharm. Drug Dispos. 16, 351–380. 

25.  Kaviarasan K., Arjunan M. M., and Pugalendi K. V. 2005. Lipid profile, oxidant‐antioxidant 

status and glycoprotein components in hyperlipidemic patients with/without diabetes; Clin. 

Chim.  Acta 362, 49–56. 

26.  Kearns, R., Hayek, M., Turek, J., Meydani, M., Burr, J., Greene, R., Marshall, C., Adams, S., 

Borgert, R., Reinhart, G., 1999. Effect of  age, breed and dietary omega‐6 (n‐6) :omega‐3 (n‐

3)  fatty  acid  ratio  on  immune  function,  eicosanoid  production,  and  lipid  peroxidation  in 

young and aged dogs. Vet. Immunol. Immunopathol. 69, 165–183. 

27.  Kedziora‐Kornatowska  KZ,  Luciak  M,  Paszkowski  J.  Lipid  peroxidation  and  activities  of  

antioxidant enzymes in the diabetic kidney: Effect of  treatment with angiotensin convertase 

inhibitors. IUBMB Life 2000;49:303–30. 

28.  Kowluru  Renu  A,  Kowluru  Vibhuti,  Xiong  Ye,  Ho  Ye‐Shih.  2006.  Overexpression  of  

mitochondrial  superoxide  dismutase  in  mice  protects  the  retina  from  diabetes‐induced 

oxidative stress. Free Radic Biol Med.; 41:1191‐6. 

29. 

Kurowska E. M., Spence J. D., Jordan J., Wetmore S., Freeman D. J, Piche L A and Serratore 

P.  2000.  HDL‐cholesterol‐raising  effect  of   orange   juice  in  subjects  with 

hypercholesterolemia;  Am.  J. Clin. Nutr . 72, 1095–1100 

30.  Lopes‐Virella, M.F., Stone, P., Ellis, S., and Colwell, J.A., 1977. "Cholesterol determination in 

high density lipoproteins separated by the three different methods, " Clin. Chem., 23(5), pp. 

882‐884. 

31.  Lykkesfeldt,  J., 2007. Malondialdehyde as biomarker of  oxidative damage to  lipids caused 

by smoking. Clinica Chimica Acta 380, 50–58. 32.  McCay P. B. 1985. Vitamin E: interactions with free radicals and ascorbate. Annu. Rev. Nutr. 

5:323‐340, 27. 

33.  Morgan V. 2008. Handbook of  Small Animal Practice. The 5th edition. SAUNDERS, Printed in 

the United States of  America. 

34.  Naziroglu M,  Sqimsek M. 2004. Effects of  hormone replacement therapy with oral vitamin 

C and E on plasma thyroid hormone levels in postmenopausal women with type 2 diabetes. 

Biomed Pharmacother. 

35.  Naziroglu  M,  Butterworth  P.,  2005.  Protective  effects  of   moderate  exercise  with  dietary 

vitamin  C  and  E  on  blood  antioxidative  defense  mechanism  in  rats  with  streptozotocin‐

induced diabetes. Can J Appl Physiol.30 (2):172–85. 

36. 

Nishikimi,  M.,  Appaji  N.,  and  Yogi.  K.  1972.  The  occurrence  of   superoxide  anion  in  the reaction of   reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochem. Bioph. Res. 

Commn. 46(2), 849‐854 . 

37.  Nobuyo, M.,  Frei Balz, Heinecke  Jay W. Vitamin C  fails  to protect amino acids and  lipids 

from oxidation during acute inflammation. Free Radic Biol Med 2006;40:1494‐501. 

38.  Ohkawa,H. ;Ohishi,w. and Yagik, 1979.  Annal;.Biochem. ;95,351 

39.  Pawlowska‐Goral K., Kusz E., Wardas M., Damek E. and Wardas P. 2002. The results of  the 

interference of  nitrates and vitamin E  in  the metabolism  in  the connective  tissue of   rat’s 

liver. Exp Toxicol Pathol.; 54:147‐50. 

40.  Penckofer, S., Schwertz, D., Florczak, K., 2002. Oxidative stress and cardiovascular disease in 

type 2 diabetes: the role of  antioxidants and prooxidants. J Cardiovasc Nurs .16(2):68–85. 

41.  Rahimi  R.,  Nikfar  S.,  Larijani  B.  and  Abdollahi  M.  2005.  Dossier:  Antioxidants  in  the 

prevention of  human diseases. A review on the role of  antioxidants in the management of  

diabetes and its complications. Biomedicine & Pharmacotherapy, 59, 365–373. 

166

Page 169: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 169/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

42.  Rotruck J. T., Pope A. L. and Ganther H. E. 1973. Selenium: Biochemical role as a component 

of  glutathione peroxidase. Science 179: 588‐590. 

43. 

SAS,  1987.  Statistical  Analysis  System,  Users  Guide:  Statistics,  SAS  Institute  Cary  ,  North 

Carolina. 

44.  Sasaki  T, 

Matsy S, Sonae A (1972) Effect of  acetic acid concentration on the colour reaction in the o‐toluidine boric acid method for blood glucose estimation. Rinshokagaku 1: 346‐353.

 

45.  Schwedhelm  E.,  Maas  R.,  Troost  R.  and  Boger  R.  H.  2003.  Clinical  pharmacokinetics  of  

antioxidants and their impact on systemic oxidative stress. Clin Pharmacokinet; 42:437–59. 

46.  Shahar E, Chambless L. E, Rosamond W. D., Boland L. L., Ballantyne C. M., McGovern P. G. 

and Sharnett A. R. 2003. Atherosclerosis risk in community study, plasma  lipid profi  le and 

incident  ischaemic stroke: the atherosclerosis risk  in communities  (ARIC) study; Stroke 34, 

623–631 

47.  So¨zmen EY, So¨zmen B, Delen Y. and Onat T. 2001. Catalase/superoxide dismutase (SOD) 

and  catalase/paraoxonase  (PON)  ratios  may  implicate  poor  glycemic  control.  Arch  Med 

Res;4:283–7. 

48.  Tavridou  A,  Unwin  NC,  Laker  MF,  White  M,  Alberti  GK.  1997.  Serum  concentrations  of  

vitamin A and E in impaired glucose tolerance. Clin Chim Acta; 266:129–40. 

49.  Tucker J. M and Townsen D.M. 2005. Alpha‐tocopherol: roles in prevention and therapy of  

human disease. Biomed Pharmacother; 59:380‐7. 

50.  Vessby,  J.,  Basu,  S.,  Mohsen,  R.,  Berne,  C.  and  Vessby  B.  (2002).  Oxidative  stress  and 

antioxidant status in type 1 diabetes mellitus. J. Internal Med. 251:69‐76. 

51.  Vimal  V  and  Devaki  T.  2004.  Linear  furanocoumarin  protects  rat  myocardium  against 

lipidperoxidation and  membrane damage during  experimental myocardial  injury. Biomed 

Pharmacother; 58:393‐400. 

52.  Vina  J, Borras C., Gomez‐Cabrera M. C. and Orr W. C. 2006. Role of  reactive oxygenspecies 

and  (phyto)oestrogens  in  the modulation of  adaptive  response  to  stress. Free Radic Res; 

40:111‐9. 

53. 

Wagner James G, Jiang Qing, Harkema Jack R, Illek Beate, Patel Dhavalkumar D, Ames Bruce N, et al. 2007. Ozone enhancement of  lower airway allergic inflammation is prevented by g‐

tocopherol. Free Radic Biol Med.; 43:1176‐88. 

54.  Winkler,  B.  Stephen  M.,  and  Tonia  S.  1994.  The  redox  couple  between  glutathione  and 

ascorbic acid: A chemical and physiological perspective. Free Radical Biology and Medicine, 

17, 333‐349. 

55.  White, A., Handler P., Smith E. L., Hill R L and Lehman I.  R.  1994.  Principles of  biochemistry  

7th edition (Tokyo: McGrawHill Kogakusha Ltd) pp 619–630 

56.  Young, I.S. and Woodside J.V. 2001. Antioxidants  in health and disease;  J. Clin. Pathol . 54, 

176–186 

57.  Zak, B., Dickenman, R., Whitsee, E., Burnett, H., and Cherney, P., 1954. "Rapid estimation of  

free and total cholesterol, " Am. J. Clin. Path., 24(1), pp. 1307‐1315. 

167

Page 170: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 170/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

Figure 

1: 

Diagrammatic 

representation 

of  

experimental 

protocol 

A total of  40 bitches were used in the 

experiment 

Group 1 contained 10 non 

diabetic bitches served as non 

diabetic control

Group 2 contained 30 diabetic 

bitches 

Samples of  10 of  each served as 

diabetic control before treated with 

Group 3 (10 animal) 

Treated 

with 

insulin 

Group 4(10 animal) 

Treated 

with 

insulin 

and 

ascorbic 

acid 

Group 5 

(10 

animal)

Treated 

with 

168

Page 171: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 171/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

Table 1: lipid profile and blood glucose level in control, diabetic, diabetic treated  bitches 

Significant Difference at P<0.01 

Means within the same column with different letters are significantly differed. 

Note: a, is the highest value, decreased via b, c, d to e. 

Group 1: Control non diabetic bitches 

Group 2: Diabetic untreated bitches Group 3: Insulin treated bitches 

Group 4: Insulin‐vitamin C treated bitches 

Group 5: Insulin‐vitamin E treated bitches 

Table  2:  Levels  of   SOD,  CAT, GPx  and MDA  in  erythrocyte  hemolyste  of   control, 

diabetic, diabetic‐ treated bitches 

MDA

(µmol/l)

GPx

 (mg/dl)

CAT

(units/mg Hb)

SOD

(units/mg Hb)

Parameters 

16.9 ± 0.3

22.0 ± 0.5

0.08 ± 0.002

0.07 ± 0.005

Group 1 28.4 ± 0.5

a 14.0 ± 0.5

d 0.05 ± 0.002

d 0.02 ± 0.002

d Group 2 

24.5 ± 0.5a 16.2 ± 0.4

c 0.06 ± 0.003

c 0.03 ± 0.002

c Group 3 

17.3 ± 0.3b 

19.2 ± 0.3b 

0.07 ± 0.003b 

0.05 ± 0.002b 

Group 4 

18.4 ± 0.4b 19.6 ± 0.4

b 0.07 ± 0.002

b 0.05 ± 0.002

b Group 5 

Significant Difference at P<0.01 

Means within the same column with different letters are significantly differed. 

Note: a, is the highest value, decreased via b, c, d to e. 

Group 1: Control non diabetic bitches 

Group 2: Diabetic untreated bitches Group 3: Insulin treated bitches 

Group 4: Insulin‐vitamin C treated bitches 

Group 5: Insulin‐vitamin E treated bitches 

Parameters  Glucose 

(mg/dl ) 

Cholesterol 

(mg/dl) 

LDL 

(µmol/dl) 

HDL (µmol/dl)

Group 1  86.6 ± 2.63c  126.3 ± 8.9

e25.3 ± 0.59

c  264.7 ± 1.8

a

Group 2  286.9 ± 5.20a  277.3 ± 2.9

a35.0 ± 0.47

a  222.9 ± 7.3

c

Group 3  99.8 ± 2.35b  192.0 ± 2.3

b32.2 ± 0.33

b  240.0 ± 4.4

b

Group 4  88.8 ± 2.33c  170.0 ± 2.5

d26.6 ± 0.37

c  263.8 ± 2.3

a

Group 5  87.5 ± 2.21c  184.0 ± 4.0

c27.6 ± 0.37

c  262.4 ± 4.4

a

169

Page 172: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 172/206

 

INVESTIGATION OF SELECTED BIOCHEMICAL INDICATORS OF 

EXERTIONAL RHABDOMYOLYSIS

 IN

 ARABIAN

 HORSES:

 PRO

INFLAMMATORY CYTOKINES AND OXIDATIVE STRESS MARKERS 

Wael M. EL‐Deeba,  Abd EL‐Aziz Almujalli

b , S. M. El‐Bahr

a  (Corresponding author) 

Department of  clinical studies, College of  Veterinary Medicine and animal Resources, King 

Faisal University. 

Saudi Arabia, AL‐Ahsa, 31982. 

e‐mail: [email protected] 

b Department of  clinical studies, College  of  Veterinary Medicine and animal Resources, King 

Faisal University. 

Saudi Arabia,  AL‐Ahsa, 31982. c 

Department of  Physiology, Biochemistry and Pharmacology, College  of  Veterinary Medicine 

and animal Resources, King Faisal University, Saudi Arabia,  AL‐Ahsa, 31982. 

Abstract 

A total of  30 horses were divided into two groups, one served as a control whereas other was 

exertional rhabdomyolysis (ER)‐diseased horses. After blood collection, the resulted sera were 

used  for  estimation  of   the  activities  of   creatin  kinase  (CK),  aspartate  transaminase  (AST), lactate  dehydrogenase  (LDH),  lactic  acid,  total  triacylglycerol,  glucose,  total  protein,  albumin, 

globulin,  urea,  creatinine,  Triiodothyronine  (T3),  calcium,  sodium,  potassium,  phosphorus, 

chloride, vitamin E, interleukin‐6 (IL‐6) and tumor necrosis‐α (TNF‐α). In addition, whole blood 

was  used  for  determination  of   selenium,  reduced  glutathione  (G‐SH)  and  prostaglandin  F2‐α

(PGF2α).  The  erythrocyte  hemolysates  were  used  for  the  determination  of   the  activities  of  

super oxide dismutase (SOD), catalase (CAT), total antioxidant capacity (TAC), nitric oxide (NO) 

and  malondialdehyde (MDA). The present findings  revealed a  significant (p≤ 0.05)  increase  in 

the values of  CK, AST, LDH, glucose,  lactate, TAG, urea, creatinine, phosphorus, MDA, TNF‐ α, 

IL6 and PGF2‐ α in diseased horses when compared with the control. In addition, the values of  

calcium, SOD, CAT, TAC, NO and GSH in diseased horses were significantly (p≤ 0.05) lower than 

the control. The other examined parameters remained unchanged. In conclusion, the examined 

pro‐inflammatory  cytokines  could  be  added  to  old  biomarkers  for  the  diagnosis  of   ER  in 

Arabian  horses.  In  the  future,  efforts  should  be  made  to  confirm  this  in  other  breed.  If   this 

could  be  achieved,  it  would  open  up  new  perspectives  in  research  fields  dealing  with  ER  not 

only in animals, but also in humans. 

Key words: Rhabdomylosis, horse, IL6, oxidative stress, TNF‐α, PGF2‐ α. 

1. INTRODUCTION 

Muscle disorders are a common cause of  suboptimal performance or even disability 

to  perform.  In  comparison  to  human  medicine,  the  etiology  of   muscle  disorders  in  equine 

medicine  is  less  explored.  Tying‐up  or  ER  was  previously  known  as  Monday‐morning  disease 

(Zentek,  1991).  Monday  morning  disease  was  associated  with  work  horses  that  was  given  a 

170

Page 173: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 173/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

day of  rest after a week of  hard work. When the horses were supposed to return to work on 

the following Monday, they developed stiffness and pain in the hindquarter musculature, and 

reluctance to move (Jones, 2003). Arabians horses are one of  the affected breed (Valentine et 

al., 2000; McKenzie et al., 2003). 

The  underlying  cause  of   this  metabolic  disorder  is  not  yet  known  but  is  thought  to 

involve carbohydrate metabolism (Valberg et  al., 1997).  Clinical signs of  ER,  including muscle 

pain,  cramping,  stiffness,  sweating,  exercise  intolerance,  weakness,  and  reluctance  to  move 

may  be  observed,  with  the  hindquarters  most  frequently  affected (Firshman  et  al., 2003).  In 

order to confirm a diagnosis of  ER blood samples should be obtained to determine serum CK 

and AST. Their elevation  indicates muscle damage and confirms the diagnosis of  the disease. 

In addition, AST activity may be heightened in asymptomatic horses with chronic ER. 

Exercise  has  been  shown  to  induce  tissue  damage  by  oxidation  of   cellular 

components,  such  as  membrane  lipids,  proteins,  carbohydrates  and  DNA  (Clarkson  and 

Thompson,  2000).  The  main  sources  of   reactive  oxygen  species  (ROS)  that  are  generated 

during  exercise  are  the  mitochondria  (respiratory  chain),  although  activated  phagocytes 

(respiratory burst) and several enzymes such as oxidases  perhaps contribute to an  increased ROS  release  (Leeuwenburgh  and  Heinecke,  2001).  Living  organisms  possess  antioxidant 

defense systems against ROS. These defense systems include endogen antioxidants, which can 

be classified as non enzymatic (vitamin E, vitamin C, uric acid) and enzymatic defense system. 

The most important antioxidant enzymes are SOD and CAT (Fridovich, 1995). If  the pro‐oxidant 

burden  overwhelms  the  endogenous  antioxidant  defenses  of   the  organism,  the  arising 

imbalance  between  pro‐ and  antioxidants  is  resulted  which  defined  as  oxidative  stress  (Sies, 

1991). Exercise‐induced oxidative stress is believed to contribute to accelerated muscle fatigue 

and  muscle  fiber  damage,  leading  to  exercise  intolerance  and  poor  performance  in  different 

animal  species  (Sen  and  Packer,  2000),  as  well  as  to  a  decreased  immune  defense  of   the 

organism  (Nieman,  1997).  If   the  importance  of   antioxidant  deficiencies  for  exercise‐induced oxidative  stress  and  exercise  intolerance  has  been  clearly  established,  thereby  that 

supplementation of  antioxidants might improve performance, remains to be proven (Clarkson 

and Thompson, 2000; Jenkins, 2000). 

Electrolyte imbalances were believed to have an important role in causing ER in some 

pleasure  and  racehorses.  Studies  by  Harris  and  Snow  (1991)  in  the  United  Kingdom  have 

focused  on  determining  electrolyte  balance  in  horses  with  tying‐up.  Commercial  diets  were 

found to be too low in salt (sodium chloride) and most horses needed an additional 1‐2 ounces 

of   salt  to  maintain  proper  balance.  While  some  horses  improved  dramatically  by  adding 

electrolytes in the form of  table salt (sodium chloride), lite salt (potassium chloride), or Epsom 

salt  (magnesium  chloride),  other  horses  showed  no  improvement.  Trace‐elements,  such  as selenium (Se), zinc (Zn), copper (Cu) and manganese (Mn) play an important catalytic role for 

the enzymatic activity of  SOD (Maughan, 1999; Mates, 2000). 

Strenuous  exercise  induced  a  transient  endotoxemia  and  a  pro‐inflammatory 

condition in the horse that persists for approximately 2 h after exercise (Douglas et al., 2007). 

IL‐6  is  an  important  mediator  of   inflammation.  The  pleiotrophic  cytokine  IL‐6  is  involved  in 

directing  the  innate  immune  response  to  acquired  immunity  (reviewed  by  Jones  (2005),  and 

has  been  described  as  a  regulatory  cytokine  in  osteoarthritis  (Goldring,  2000).  It  stimulates 

production of  metalloproteinase inhibitors (Shingu et al., 1993, 1995), but also potentiates the 

catabolic effects of  IL‐1 and TNF‐α on proteoglycan metabolism (Jikko et al., 1998; Flannery et 

al.,  2000).  According  to  authors  knowledge  there  is  no  data  concerning  the  oxidant‐

antioxidant balance or pro‐inflammatory response in cases of  ER in Arabian horses. Therefore, 

171

Page 174: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 174/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

the  present  study  aimed  to  investigate  new  biomarkers,  oxidative  stress  markers  and  pro‐

inflammatory cytokines for diagnosis of  ER in Arabian horses. 

2. MATERIAL AND METHODS 

2.1.  Animals

 

A total of  30 horses (4‐6 years old) were used in the present study. They were divided 

into two groups. Horses of  the first group (10 horses) were clinically healthy and served as a 

control  group.  Horses  of   the  second  group  (20  horses)  were  ER‐ diseased  horses.  They  were 

selected on the basis of  clinical examination and laboratory findings and they had a history of  

over exercise after a period of  rest and overfeeding of  non‐structural carbohydrates (grains). 

2.2. Sampling  protocol  

Blood samples were collected from the ear vein from all groups in fresh plain vial for 

serum  collection  and  heparinized  vials  for  whole  blood,  serum  and  erythrocyte  hemolysate 

preparations.  Sera were  used  for  estimation of   the activities CK, AST,  LDH.  In addition,  lactic 

acid, total triglycerides, glucose, total protein, albumin, globulin, urea and creatinine were also determined.  Sera  samples  were  also  used  for  the  determination  of   T3,  calcium,  sodium, 

potassium, phosphorus, chloride, vitamin E, IL‐6 and TNF‐α. However, whole blood was used 

for the determination of  selenium, G‐SH and PGF2‐α. The erythrocyte hemolysates were used 

for the determination of  the activities of  SOD, CAT, TAC, NO and MDA. 

2.3. Preparation of  hemolysate 

After collecting blood samples in heparinized tubes, centrifugation was performed at 

1000g  for  15  min  to  remove  the  buffy  coat.  The  packed  cells  obtained  at  the  bottom  were 

washed  thrice with phosphate buffer  saline (0.9% NaCl  in  0.01 M phosphate buffer,  pH  7.4). 

Erythrocytes were lysed with hypotonic phosphate buffer. The hemolysate was obtained after removing the cell debris by centrifugation at 3000g for 15 min. 

2.4. Determination of  selected  biochemical   parameters 

Enzymatic methods of  Bio‐diagnostic kits were used for colorimetric determination of  

serum  glucose  concentration  (Trinder,  1969),  TAG  (Young  et  al.,  1972),  total  protein  (Henry, 

1984),  albumin  (Doumas  et  al.,  1981),  globulin  (Coles,  1974),  AST  (EC  2.6.1.1;  Reitman  and 

Frankel,  1957),  urea  (Tabacco  et  al.,  1979)  and  creatinine  (Henry,  1984)  according  to 

manufacturing instructions. In addition, the activities of  CK (Faulker and Meites 1982), LDH (EC 

1.1.1.27; Wroblewski and Duean 1955), and value of  Lactate (Donawick et al., 1975) were also 

determined in the serum by using commercial available kits (Bio‐diagnostic kits). Serum concentration of  T3 hormone was determined using a solid phase competitive 

chemiluminescence  immuno‐assay  system  (Elecsys  2010,  Roche,  Diagnostic,  Mannheim). 

Concentrations  were  determined  using  kits,  controls,  mono‐clonal  mouse  antibodies  and 

reagent  supplied  by  Roche,  Diagnostic,  2005  .The  intra   –  and  inter  assay  coefficients  of  

variation  (C.V.  %)  were  3.6  and  5.4%.`The  minimum  detectable  levels  of   the  assay  were 

0.195ng /ml. 

2.5. Determination of  electrolytes and  vitamin E  

Serum calcium was determined colorimetrically by using commercial the kit of  Invitro 

Scientific according to the method described by Moorehead and Briggs, (1974). Calcium reacts 

with  cresolphthalein  complexone  to  form  purple  color  complex  in  alkaline  medium.  The 

intensity of  the color measured photometrically between wavelength 540 and 600nm with the 

maximum  absorbance  at  575  nm  is  directly  proportional  to  calcium  concentration  in  the 

172

Page 175: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 175/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

specimen. The serum  inorganic phosphate was determined according to the method cited  in 

Wootton, (1982). The substituted phenol was used as a reducing agent and pH was adjusted 

by  an  acetate  buffer.  The  color  development  was  hastened  by  copper present  in  the  buffer. 

The  blue  color  was  stable  at  least  for  30  minutes.  Sodium,  potassium,  and  chloride  were 

analyzed using the same commercial available test kits according to the methods described by 

Friedman and Young (1997) and Tietz, (1995). 

However,  whole  blood  selenium  was  measured  using  the  Unicam  939  AA 

spectrometer  and  AAS  hydride  technique.  Serum  vitamin  E  was  measured  by  HPLC  (Kontron 

Instruments,  Rotkreuz,  Switzerland)  using  acetate  of   alpha  tocopherol  as  internal  standard 

(Paolisso  et  al.,  1993).  Chromatographic  separation  was  performed  using  a  reversed  phase 

silica  gel  column  (Alltech,  Templeuvre,  France)  and  an  isocratic  elution  with  acetonitrile. 

Detection was performed photometrically at 292nm. 

2.6. Determination of  oxidative stress markers and   pro‐inflammatory  mediators 

Activity  of   SOD  (inhibition  rate  percent)  was  assayed  in  erythrocyte  hemolysate  as 

described by Nishikimi et al. (1972) using commercial available kits (Bio‐diagnostic, Kit number SD2520).  The  activity  of   CAT  was  assayed  in  the  erythrocyte  by  the  method  of   Aebi,  (1984) 

using  commercial  available  kits  (Bio‐diagnostic,  Kit  number  CA2516).  The  activity  of   the 

enzyme  was  expressed  as  units/mg  of   hemoglobin.  Whole  blood  GSH  was  determined 

spectrophotometrically  using  the  Bio‐diagnostic  kit  (GR2510).  Intra‐ and  inter‐assay  CV  were 

1%  and  3%,  respectively.  TAC  was  assayed  in  erythrocyte  hemolysate  as  described  by 

koracevic et al. (2001) using commercial available kits (Bio‐diagnostic, Kit number TA2512). NO 

was assayed in hemolysate as described by Montgomery and Dymock (1961) using commercial 

available  kits  (Bio‐diagnostic,  Kit  number  NO2532).  Lipid  peroxidation  was  assayed  by  the 

measurement of  MDA levels on the base of  MDA reacted with thiobarbituric acid at 532 nm, 

according to Ohkawa et al. (1979) using commercially supplied kits (Bio‐diagnostic, Kit number MD2529). 

Serum  concentrations  of   TNF‐α were  determined  using  an  ELISA  assay  developed 

with  commercially  available  reagents,  and  an  equine  recombinant  TNF‐α standard.  Standard 

ELISA plates (96 well, flat bottoms, Immulon 4HBX, Milford, MA) were coated with polyclonal 

antibody  recognizing  equine  TNF‐α (PETFNAI,  Endogen,  Thermo‐Fisher  Scientific,  Pittsburg, 

PA). The antibody was diluted 1:333 in carbonate buffer at pH 9.6 and 100 μl of  antibody was 

added  to  each  well.  The  microtiter  plates  were  incubated  overnight  at  4ºC,  after  which  the 

antibody was removed and the wells were filled with 100  μl of  blocking buffer (1% BSA in 1X 

PBS).  The  plates  were  incubated  for  1h  at  room  temperature.  Then  the  plates  were  washed 

three times with PBS containing 0.05% Tween 20 (PBST). Afterwards, 100 μl of  each sample or standard  was  added  to  triplicate  wells,  and  the  plates  were  incubated  at  37  ºC  for  2h.  The 

plates  were  washed  three  times  with  PBST.  Biotin  labeled  polyclonal  antibody  against  TNF‐a 

(PETNFABI, Endogen) was diluted 1:277 in PBST, and 100 μl was added to each well. The plates 

were  incubated  at  37  ºC  for  90  min,  after  which  they  were  washed  three  times  with  PBST. 

Next, 100  μl of   avidin‐horseradish peroxidase conjugate, (Pharmingen,  BD, Franklin Lake, NJ) 

diluted  1:5000  in  PBST  containing  0.5%  bovine  serum  albumin,  (Sigma,  St.  Louis,  MO)  was 

added to each well and incubated for 1h at room temperature. The plates were then washed 

five times with PBST. Finally, 100  μl of  substrate (2,20‐azino‐di‐(3‐ethylbenzthiazoline sulfonic 

acid),  Sigma  A1888,  ABTS) was  added  to  each  well.  The  plates  were  incubated  for  30  min  at 

room temperature in the dark, and then read at 405 nm on an automated microplate reader 

(Dynex MRX II, Dynex Technology, Inc., Chantilly, VA). 

173

Page 176: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 176/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

Serum IL‐6 values were determined by using ELISA kits supplied by Abazyme, LLC, USA 

(Catalog  Number  EL10023).  This  IL‐6  enzyme  linked  immunosorbent  assay  (ELISA)  applies  a 

technique called  a quantitative sandwich  immunoassay. The  microtiter plate provided  in this 

kit has been pre‐coated with a monoclonal antibody specific to IL‐6. Standards or samples are 

then  added  to  the  appropriate  microtiter  plate  wells  with  a  biotin‐conjugated  polyclonal 

antibody  preparation  specific  for  IL‐6  and  incubated.  IL‐6  if   present,  will  bind  and  become 

immobilized  by  the  antibody  pre‐coated  on  the  wells  and  then  be  “sandwiched”  by  biotin 

conjugate.  The  microtiter  plate  wells  are  thoroughly  washed  to  remove  unbound  IL‐6  and 

other  components  of   the  sample.  In  order  to  quantitatively  determine  the  amount  of   IL‐6 

present  in  the  sample,  Avidin  conjugated  to  Horseradish  Peroxidase  (HRP)  is  added  to  each 

microplate  well  and  incubated.  Avidin  is  a  tetramer  containing  four  identical  subunits  that 

each has a high affinity‐binding site for biotin. The wells are thoroughly washed to remove all 

unbound  HRP‐conjugated  Avidin  and  a  TMB  (3,3',5,  5'  tetramethyl‐benzidine)  substrate 

solution  is  added  to  each  well.  The  enzyme  (HRP)  and  substrate  are  allowed  to  react  over  a 

short  incubation  period.  Only  those  wells  that  contain  IL‐6,  biotin‐conjugated  antibody  and 

enzyme‐conjugated  Avidin  will  exhibit  a  change  in  colour.  The  enzyme‐substrate  reaction  is terminated  by  the  addition  of   a  sulphuric  acid  solution  and  the  colour  change  is  measured 

spectrophotometrically  at  a  wavelength  of   450nm  ±  2  nm.  The  concentration  of   IL‐6  in  the 

samples  (pg/mL)  is  then  determined  by  comparing  the  O.D.  of   the  samples  to  the  standard 

curve. The minimum detectable  level was 2pg/ml. Inter and  intra assay coefficients were 5.8 

and 6%, respectively and the recovery was 95%. 

Blood  was  collected  into  sterile  microcentrifuge  tubes  containing  a  solution  of   EDTA 

and  sodium  meclofenamate  (final  concentration:  10  mM,  Sigma,  St.  Louis,  MO)  for  the 

determination  of   prostaglandin  concentrations.  The  samples  were  placed  on  ice  for  10  min, 

after which they were centrifuged at 1000g for 20 min at 4ºC. The plasma was then harvested 

and  stored  frozen  at  –80  ºC  until  analysis.  On  the  day,  the  assay  was  performed,  100  μl  of  plasma  was  added  to  900μl  of   methanol,  vortexed  for  30  seconds  and  then  dried  down  by 

evaporation.  Concentrations  of   prostaglandins  (13,  14‐dihydro‐15‐keto  prostaglandin  F2α) 

were  evaluated  using the ACETM  competitive  enzyme  immunoassay  (Cayman  Chemical,  Ann 

Arbor, MI). 

2.8. Statistical  analysis 

The  obtained  data  of   the  examined  acute  phase  proteins  were  compared  between 

groups  within  different  concentrations  by  using  computer  package  of   the  statistical  analysis 

system (SAS, 1997). All data are presented as means ± standard error (S.E.) of  the means. 

3. RESULTS 

3.1. Clinical  signs 

The  observed  clinical  signs  were  in  the  form  of   pronounced  sudden  muscular 

weakness  and  stiffness,  depression,  reluctant  or  unable  to  move,  colic,  anorexia,  muscle 

tremors and myoglobinuria. All clinical signs were recorded shortly after exercise. In addition, 

rectal palpation of  the diseased group revealed highly distended bladder in 14 horses. 

3.2. Selected  biochemical  indicators in control  and  diseased  horses 

The  data  summarized  in  Table  1  included  the  activities  of   CK,  AST  and  LDH.  In 

addition  the  table  also  contains  the  values  of   glucose,  lactate,  TAG,  urea  and  creatinine  in 

control  and  diseased  horses.  The  present  findings  (Table  1)  revealed  a  significant  (p≤ 0.05) 

174

Page 177: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 177/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

decrease in the activities of  CK, AST and LDH whereas the values of  glucose, lactate, TAG, urea 

and  creatinine  were  significantly  (p≤ 0.05)  increase  when  compared  with  the  control  group. 

Values of  the other examined parameters (Table 1) remained unchanged significantly (p≤ 0.05) 

in disease horses when compared with control group. 

3.3. Electrolytes and 

 vitamin

 E  levels

 in

 control 

 and 

 diseased 

 horses 

The data of  Table 3 included the values of  calcium, sodium, potassium, phosphorus, 

chloride,  vitamin  E  and  selenium  in  control  and  diseased  horses.  The  value  of   calcium  in 

diseased  horses  (Groups  2) were  significantly (p≤ 0.05)  lower  than  the control horses.  In the 

contrary,  the  value  of   phosphorus  in  diseased  horses  (Groups  2)  were  significantly  (p≤ 0.05) 

higher than the control horses. Values of  the other examined parameters (Table 3) remained 

unchanged significantly (p≤ 0.05) in disease horses when compared with control group. 

3.4. Oxidative stress markers and   pro‐inflammatory  mediators 

The data of  Table 2 included the activities of  SOD and CAT in addition the table also 

contains the values of  GSH, TAC, NO, TNF‐ α, IL6 and PGF2‐ α and MDA in control and diseased horses. The activities of  SOD, CAT and TAC in diseased horses (Groups 2) were significantly (p≤

0.05)  lower than the control horses. The values of  MDA, TNF‐ α, IL6 and PGF2‐ α in diseased 

horse were significantly (p≤ 0.05) higher than the control horses whereas the values of  NO and 

GSH  were  significantly  (p≤ 0.05)  lower  in  diseased  horses  when  compared  with  the  control 

group. 

Table 1: Selected biochemical indicators in control and diseased horses 

Parameters  Control Diseased 

CK (IU L

 _1 

)  202.6 ± 9.9 25.450 ± 86.76 

AST (IU L _1

)  275.34 ± 6.6  30.990.0 ± 69.6 

LDH (IU L _1

)  501.45 ±  8.9 24.540.0 ±  58.6 

Glucose (mmol L _1

)  5.6 ± 1.2  9.5 ± 1.4 

T3 (ng/dl)  0.26 ± 0.02 0.25 ± 0.03 

Lactate (mmol L _1

)  1.0 ± 0.12  8.8 ± 1.01 

Total Protein (g/L)  66.8 ± 1.45 65.9 ± 1.66 

Albumin (g/L)  28.88 ± 1.21 29.78 ± 0.56 

Globulin (g/L)  34.45 ± 1.87  35.32 ± 1.98 

TAG (mmol L _1

)  1.0 ± 0.04  15.2  ± 0.56 

Urea (mmol/l)  7.32 ± 0.52 11.54 ± 1.22 

Creatinine  (µmol/l)  118.43 ± 2.67 203.34 ± 6.45 

*Means are significantly different at the level (p≤ 0.05). 

175

Page 178: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 178/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

Table  2:  Oxidative  stress  markers  and  pro‐inflammatory  mediators  in  control  and  diseased 

horses 

Parameters  Control Diseased 

MDA (μmol/L)  1.0 ± 0.12 8.2 ± 0.12 

CAT (U/mL)  1480.66 ± 543 612.32 ± 348.76 

GSH (mg/dL)  2.8 ± 1.94 1.56 ± 0.22 

TAC  (mmol/l)  0.53 ± 0.39 0.23 ± 0.12 

SOD (U/ml)  110 ± 6.26 66.23 ±  3.56 

NO (µmol/L1)  4.11 ± 0.66 3.12 ± 0.12 

TNF‐α (pg/ml _1

)  95.4 ± 15.22 310.6 ± 32.43 

PGF2‐α (pg/ml _1

)  22.54 ± 2.13 357.63 ± 9.59 

IL6 (pg/ml _1

)  1.4 ± 0.65  5.62 ± 2.32 

*Means are significantly different at the level (p≤ 0.05). 

Table 3: Electrolytes and vitamin E levels in control and diseased horses 

Parameters  Control 

(n=10) 

diseased 

(n=20) 

Calcium (mmol/L)  3.12 ± 0.23 2.13 ± 0.21 

Sodium (mmol/L)  144.8 ± 7.23 143.8 ± 6.45 

Phosphorus (mmol/L)  1.3 ± 0.11 1.9 ± 0.12 

Potassium(mmol/l)  4.16 ± 0.12 4.2 ± 0.13 

Chloride (mmol/L)  107.5 ± 8.21 106.68 ± 6.66

Selenium (μg/l)  109.6 ± 5.42 107.87 ± 7.91

Vitamin E (μmol/l)  6.77 ±1.32 6.67 ±1.52 

*Means are significantly different at the level (p≤ 0.05). 

4. DISCUSSION

 

In  the  current  study,  ER  represented  as  when  a  conditioned  horse  is  not  worked  and 

kept  on  full  feed  high  insoluble  carbohydrates  (such  as  grain),  the  horse  will  accumulate 

carbohydrates  in  the  muscles.  If   there  is  a  sudden  demand  for  work,  the  body  cannot 

adequately  remove  the  rapidly  accumulating  lactic  acid  in  the  muscles.  This  in  turn  causes 

vasospasms and ischemia which means essentially that the surrounding blood vessels "clamp 

down" so that  the  lactic acid  waste product cannot be removed. As a result,  intracellular pH 

drops; the disrupted, hard and crampy muscle was observed when a horse ties up. In addition, 

ER  is  often  seen  following  strenuous  muscular  exercise  and  is  a  response  to  intensive  and 

severe exercise.  It  is associated with damage to the muscle group predominantly  involved  in the  activity.  The  clinical  signs  observed  in  the  present  study  are  agree  with  previous 

researches  (Clarkson,  2002;  Hamer,  1997;  Knochel,  1990;  1993;  Line  and  Rust,  1995; 

Walsworth and Kessler, 2001) 

The significant increase in serum CK, AST and LDH values suspected ER with respective 

muscle  damage  (Valentine  et  al.,  2001;  Sjaastad  et  al.,  2004).  The  present  results  come  in 

accordance with previous studies (Hosie et al., 1986; Whitwell et al., 1988; Brandt et al., 1997; 

Palencia and Rivero, 2007; Votion et al., 2007). Phosphocreatine is relatively short‐lived power 

source that is effective at generating ATP rapidly. It has a high‐energy phosphate group that is 

donated to ADP to produce ATP.  It  is used at the beginning of  exercise to maintain high ATP 

levels during muscle contraction. Creatine kinase is the enzyme that catalyzes the conversion of  phosphocreatine and ADP to creatine and ATP. Phosphocreatine stores are depleted more 

quickly  in fast twitch muscle fibers since they have a higher rate of  ATP utilization (Ivy et al., 

176

Page 179: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 179/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

1981).  In  the  horse  Phosphocreatine  levels  are  decreased  about  50  to  70%  during  high 

intensity exercise (Valberg and Essen‐Gustavson, 1987). 

Elevated  AST  levels  are  also  an  indicator  of   muscle  damage  associated  with 

recumbence  (Skenderi  et  al.,  2006;  Valentine  &  Löhr,  2007).  Elevated  levels  of   AST  are  also 

thought  to  be  indicative  of   liver  damage (Nyblom  et al., 2004).  In the cell,  AST  is  involved  in 

formation  of   adenosine  triphosphate  (ATP;  Pesch  et  al.,  2006).  The  reported  significant 

increase in glucose, lactate and triglycerides levels in diseased horses than that of  the control 

perhaps  attributed  to  increase  the  rate  of   glycogenolysis,  glycolysis  and  lipogenesis, 

respectively. Feeding high insoluble carbohydrates to horses during rest increased the rate of  

glycogen storage. After rest period and when the animal exercised the animal get the energy 

through  mobilization  of   glucose  from  glycogen  storage  site  (glycogenolysis)  followed  by 

oxidation of  the obtained glucose (glycolysis). In addition, gluconeogenesis may be activated. 

These mechanisms were enough to supply energy. Moreover, the excess glucose perhaps was 

used  in  synthesis  of   triacylglycerol  (lipogenesis).  This  interpretation  underlined  by  the 

reported  significant  increase  in  triacylglycerol  of   diseased  horse  in  the  present  study.  The 

reported  increase  in  glucose,  lactate  and  triacylglycerol  was  reported  previously  in  horse (Westermann  et  al.,  2007).  The  significant  increase  in  urea  and  creatinine  level  in  diseased 

horses  (Table‐1)  indicated  renal  damage.  These  findings  disagree  with  those  obtained  by 

Clarkson (2006) who reported that, the renal system may not be affected in diseased horse. 

Electrolytes  are  body  salts  that  maintain  an  electrical  gradient  across  muscle  cell 

membranes.  During  exercise,  muscles  contract  when  nerves  stimulate  a  change  in  the 

electrical gradient and electrolytes move across the cell membrane. Muscle cells contain high 

concentrations  of   the  electrolytes  potassium  and  phosphate  and  low  concentrations  of  

sodium,  chloride,  and  calcium  (Radostits,  et  al.,  2007).  If   the  ion  pumps  (sodium/potassium, 

calcium/magnesium and calcium/ATPase) in the membrane surrounding the muscle cell which 

move substrates  in and out of  the cell are disrupted, the  interior environment of  the muscle cells  either  cannot  get  rid  of   waste  products  of   metabolism  or  has  too  much  of   a  metabolic 

substrate  to  be  able  to  function  or  can't  get  enough  of   a  metabolic  substrate  to  be  able  to 

function.  Therefore,  the  muscle  cell  simply  shuts  down.  When  muscle  cells  shut  down,  they 

don't do so in the relaxed position, they freeze up in the contracted position, which resulted in 

rock‐hard muscles. Biochemically, it's not all that different from rigor mortis. 

The reported hypocalcemia  in the present study perhaps shared  in generation of  ER. 

The hypocalcemia as a suggesting cause of  ER was reported before (Assmann et al., 1933 and 

Jacobson et al., 1991). 

It  was  suggested  that,  similar  to  other  species,  a  dietary  vitamin  E  and  selenium 

deficiency  might  cause  muscle  damage  in  ER  horses.  Vitamin  E  and  selenium  act  to  protect muscles from oxygen free radicals that can be generated with exercise. However, the present 

study did not reported changes in vitamin E and selenium level between diseased and healthy 

control horses. Therefore, either vitamin E or selenium deficiencies were avoided as a cause of  

ER  in  the  present  work.  Documented  cases  of   a  selenium‐responsive  muscle  disease  were 

reported  in  foals  from  several  countries  with  low  selenium  soil  content  in  the  1970s.  The 

association  with  muscle  disease  led  to  the  recommendation  that  horses  with  ER  should  be 

given  a  selenium  and  vitamin  E  supplement.  Although  selenium  deficiency  may  not  be  the 

primary  cause  for  ER,  many  practitioners  report  a  decrease  in  the  severity  of   tying‐up  when 

horses  receive  vitamin  E  and  selenium  supplementation.  This  may  be  due  to  the  fact  that 

horses generate more toxic free radicals with the ER syndrome and therefore have a greater 

need  for  supplementation.  Another  possibility  is  enzymatic  antioxidant  activity  might  be 

177

Page 180: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 180/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

higher in horses and protect the non enzymatic system from depletion. This underlined by the 

reported decrease in SOD and CAT of  diseased horses (Nathalie et al., 2008). 

The significant decrease of  SOD, CAT, TAC, GSH and NO in diseased horse attributed 

to the depletion of  antioxidant system to counteract the oxidative stress and reactive oxygen 

species.  In  the  equine  species,  an  exercise‐induced  imbalance  in  favor  of   oxidants  has  been 

described  in  several  experimental  studies  (Mills  et  al.,  1997;  Art  et  al.,  1999;  Deaton  et  al., 

2002; Kirschvink et al., 2002) as well as in field investigations (Balogh et al., 2001; White et al., 

2001; Hargreaves et al., 2002; Marlin et al., 2002). The production of  NO plays a vital role  in 

the  regulation  of   physiologic  processes,  and  both  proinflammatory  and  anti‐inflammatory 

effects  have  been  described  for  this  molecule.  NO  is  a  biologic  gas  produced  by  almost  all 

tissues. Recently it has been demonstrated that NO has an important role in muscle physiology 

(Balon  et  al.,  1994)  and  may  influence  both  contractile  function  and  muscle  metabolism.  A 

physiologic role as a vasodilatory regulator in skeletal muscle has been established for NO, and 

in that way it increases O2 and nutrient supply to the muscle. 

The  significant  decrease  in  the  above  discussed  antioxidant  system  was  underlined 

by  the  significant  increase  of   MDA,  TNF‐ α,  IL6  and  PGF2‐α in  diseased  horse  indicated  lipid peroxidation resulted from ER. Pro‐inflammatory molecules (TNF‐ α, IL6) have been reported 

to increase with strenuous exercise (Lee and Clarkson 2003). Furthermore, tissue damage and 

repair processes may involve the expression of  inflammatory cytokines (TNF‐ α, IL6). Cytokines 

can act directly on target cells or they may stimulate the creation of  secondary mediators such 

as other cytokines, PGF2‐α or free oxygen radicals. 

Since  some  exercise‐related  pathologic  conditions  are  considered  inflammatory 

processes  (Lee  and  Clarkson,  2003),  the  present  work  designed  to  examine  some  pro‐

inflamatory cytokines and prostaglandin in ER cases. To the authors knowledge this is the first 

study  to  demonstrate  the  use  of   pro‐inflammatory  cytokines  (IL‐6  and  TNF‐ α)  and  PGF2‐α

concentrations as biomarkers of  ER. Similar significant  increases  in TNF‐ α, IL6 and PGF2‐α in horse of  ER were reported  in case of  equine osteoarthritis (Ley et al., 2009), equine  laminitis 

(Stewart, 2009), strenuous exercise in equine (Donovan et al., 2007) and others (for details see 

Art and Lekeux, 2005). 

5. CONCLUSION 

Interestingly,  the  examined  pro‐inflammatory  cytokines  (TNF‐ α,  IL6)  and  PGF2‐α

concentrations could be added to other traditional biomarkers (CK, AST and LDH) used for the 

diagnosis of  ER in Arabian horses. In the future, efforts should be made to confirm this in other 

breed. If  this could be achieved, it would yield a valuable tool to diagnose ER and would open 

up new perspectives in research fields dealing with ER not only in animals, but also in humans. 

6. Bibliography 

1.  Aebi, H. 1984. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105, 121‐126. 

2.  Art, T., Kirschvink, N., Smith, N., Lekeux, P., 1999. Indices of  oxidative stress in blood and 

pulmonary  epithelium  lining  fluid  in  horses  suffering  from  recurrent  airway  obstruction. 

Equine Veterinary Journal 31, 397–401. 

3.  Assmann  H,  Bielenstein  H,  Hobs  H.  1933.  Beobachtungen  und  untersuchungen  bei  der 

haffkrankheit. Dtsch Med Wochenschr 59, 122–6. 

4. 

Balogh, N., Gaal, T., Ribiczeyne, S., Petri, A., 2001. Biochemical and antioxidant changes in 

plasma  and  erythrocytes  of   pentathlon  horses  before  and  after  exercise.  Veterinary Clinical Pathology 30, 214–218. 

178

Page 181: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 181/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

5. 

Balon, T., Nadler, L., 1994. Nitric oxide release  is present from  incubated skeletal muscle 

preparations. Journal Applied Physiology 77, 2519–2521. 

6. 

Brandt,  K.,  Hinrichs,  U.,  Glitz,  F.,  Landes,  E.,  Schulze,  C.,  Deegen,  E.,  Pohlenz,  J.,  Coenen, 

M., 1997. Atypische myoglobinurie der weidepferde. Pferdeheilkunde 13, 27–34. 

7.  Clarkson, M., 2002. Exertional rhabdomyolysis: myths and madness. The American Journal 

of  Sports Medicine 4,

 155‐156. 

8.  Clarkson, M., Thompson, S., 2000. Antioxidants: what role do they play in physical activity 

and health? American Journal of  Clinical Nutrition 72, 637S–646. 

9. 

Clarkson, P., 2006. Case report of  exertional rhabdomyolysis in a 12 year old boy. 

Medicine and Science in Sports Exercise 38, 197–200. 

10. 

Coles,  H.,  1974.  Veterinary  Clinical  Pathology.  W.B.  Saunders  Co.,  Philadelphia,  London, 

Toronto. 

11. 

Deaton,  M.,  Marlin,  J.,  Roberts,  A.,  Smith,  N.,  Harris,  A.,  Kelly,  J.,  Schroter,  C.,  2002. 

Antioxidant  supplementation  and  pulmonary  function  at  rest  and  exercise.  Equine 

Veterinary Journal 34, 58–65. 

12. 

Donawick, J., Ramberg,  F., Paul,  R.  Hiza, A., 1975. The diagnostic and prognostic value of  lactate determinations in horses with acute abdominal crisis. Journal of  the South African 

Veterinary Association 466, 127. 

13.  Donovan, D., Jackson, C., Colahan, P., Norton, N.,  and Hurley, D., 2007. Exercise‐induced 

alterations in pro‐inflammatory cytokines and prostaglandin F2α in horses. Veterinary 

Immunology and Immunopathology 118, 263‐269. 

14. 

Douglas C. Christie A., Patrick T., Natalie N., and David J., 2007. Exercise‐induced 

alterations in pro‐inflammatory cytokines and prostaglandin F2a in horses. Veterinary 

Immunology and Immunopathology 118, 263–269. 

15. 

Doumas, T., Bayson, D., Carter, J., Peters, T.,  Schaffer, R., 1981. Estimation of  total serum 

protein. Clinical Chemistry, 27, 1642‐1643. 

16.  Faulker,  R. and Meites, S., 1982. Selected Method of  clinical chemistry 9, 185. 

17. 

Firshman,  M.,  Valberg,  S.,  Bender,  J.,  Finno,  C.,  2003.  Epidemiologic  characteristics  and 

management  of   polysaccharide  myopathy  in  Quarter  Horses.  American  Journal  of  

Veterinary Research 64, 1319–1327. 

18.  Flannery,  R.,  Little,  C.,  Hughes,  C.,  Curtis,  C.,  Caterson,  B.,  Jones,  S.,  2000.  IL‐6  and  its 

soluble  receptor  augment  aggrecanase‐mediated  proteoglycan  catabolism  in  articular 

cartilage. Journal of  Biology 19, 549‐553. 

19. 

Fridovich,  I.,  1995.  Superoxide  radical  and  superoxide  dismutase.  Annual  Review  of  

Biochemistry 64, 97–112. 

20. 

Friedman,  B. et al., 1980. Clinical chemistry, 26:1D. 

21. 

Friedman, B.,  Young, D., 1997. Effects of  Disease on Clinical Laboratory Tests, 3rd Edition, 

AACC Press, Washington, D.C. 

22. 

Goldring,  B.,  2000.  Osteoarthritis  and  cartilage:  the  role  of   cytokines.  Current 

Rheumatology Reports 2, 459‐465. 

23.  Hamer, R., 1997. When exercise goes awry: exertional rhabdomyolysis. Southern Medical 

Journal 90, 548‐551. 

24.  Hargreaves, J., Kronfeld, S., Waldron, N., Lopes, A., Gay, S., Saker, E., Cooper, L., Sklan, J., 

Harris,  A.,  2002.  Antioxidant  status  and  muscle  cell  leakage  during  endurance  exercise. Equine Veterinary Journal 34, 116–121. 

179

Page 182: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 182/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

25. 

Harris,  A.,  and  Snow,  H.,  1991.  Role  of   electrolyte  imbalances  in  the  pathophysiology  of  

the equine rhabdomyolysis syndrome. In: Equine Exercise Physiology 3 ed. SGB Persson, A 

Lindholm and LB Jeffcott. ICEEP Publications, Davis CA, pp 435‐442. 

26. 

Henry,  B.,  1984.  Clinical  Diagnosis  and  management,  17th

  edition,  Saunder  Publisher. 

Elecsys  triiodothyronine  (11731360122)  and  thyroxine  (12017709122),  Cobas,  2005, 

Roche, Diagnostics, GmbH, D, 68298, Mannheim. 

27.  Hosie, D., Gould, W., Hunter, R., Low, C., Munro, R., Wilson, C., 1986. Acute myopathy in 

horses at grass in east and south east Scotland. Veterinary Record 119, 444–449. 

28. 

Ivy  J.L.,  D.L.  Costill,  P.J.  Van  Handel,  D.A.  Essig,  and  R.W.  Lower.  1981.  Alteration  in  the 

lactate threshold with changes in substrate availability. Int. J. Sports Med. 2, 139. 

29. 

Jacobson H, Striker G, Klahr S., 1991. Biochemical alterations  in advanced uremic failure. 

In:  Jacobson  H,  Striker  G,  Klahr  S,  editors.  The  principles  and  practice  of   nephrology. 

Philadelphia (BC): Decker; p. 682–689. 

30.  Jenkins, R., 2000. Exercise and oxidative stress methodology: a critique. American Journal 

of  Clinical Nutrition 72, 670S–674. 

31. 

Jikko, A., Wakisaka, T.,  Iwamoto, M. et  al., 1998. Effects of   interleukin‐6 on proliferation and proteoglycan metabolism in articular chondrocyte cultures. Cell Biology International 

22, 615–621. 

32.  Jones, S., 2005.  Directing transition from innate to acquired immunity: defining a role for 

IL‐6. Journal of  immunology 175, 3463–3468 

33.  Jones,  W.,  2003.  Nutritional  Support  for  Rhabdomyolysis.  Journal  of   Equine  Veterinary 

Science, 23, 325‐326. 

34.  Kirschvink, N., Art, T., de Moffarts, B., Smith, N., Marlin, D., Roberts, C., Lekeux, P., 2002. 

Relationship  between  markers  of   blood  oxidant  status  and  physiological  variables  in 

trained and heaves‐affected horses after exercise. Equine Veterinary Journal 34, 159–164. 

35. 

Knochel,  P.,  1990.  Catastrophic  medical  event  with  exhaustive  exercise:  white  collar rhabdomyolysis. Kidney International 38, 709‐719. 

36.  Lee, J., Clarkson, M., 2003.  Plasma creatine kinase activity and glutathione after eccentric 

exercise. Medicine & Science in Sports & Exercise 35, 930–936. 

37. 

Leeuwenburgh,  C.,  Heinecke,  J.W.,  2001.  Oxidative  stress  and  antioxidants  in  exercise. 

Current Medicinal Chemistry 8, 829–838. 

38.  Ley, C., Ekman, S., Ronéus, B., Eloranta L.,  2009. Interleukin‐6 and high mobility group box 

protein‐1  in  synovial  membranes  and  osteochondral  fragments  in  equine  osteoarthritis 

Research in Veterinary Science 86 , 490–497 

39. 

Line,  L.  and  Rust,  S.,  1995.  Acute  exertional  rhabdomyolysis.  American  Family  Physician 

52, 

502‐506. 40.  Marlin,  J.,  Fenn,  K.,  Smith,  N.,  Deaton,  D.,  Roberts,  A.,  Harris,  A.,  Dunster,  C.,  Kelly,  J., 

2002.  Changes  in  circulatory  antioxidant  status  in  horses  during  prolonged  exercise. 

Journal of  Nutrition 132, 1622S–1627S.  

41. 

Mates,  M.,  2000.  Effects  of   antioxidant  enzymes  in  the  molecular  control  of   reactive 

oxygen species toxicology. Toxicology 153, 83–104. 

42. 

Maughan,  J.,  1999.  Role  of   micronutrients  in  sport  and  physical  activity.  British  Medical 

Bulletin 55, 683–690. 

43.  McKenzie, C., Valberg,  J. Godden, S., Pagan,  D., MacLeay,  M., Geor,  J.,  Carlson, P., 2003. 

Effect  of   dietary  starch,  fat  and  bicarbonate  content  on  exercise  responses  and  serum 

creatine  kinase  activity  in  equine  recurrent  exertional  rhabdomyolysis.  Journal  of  

Veterinary Internal Medicine 17, 693–701. 

180

Page 183: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 183/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

 

44. 

Mills,  C.,  Smith,  C.,  Harris,  C.,  Harris,  P.,  1997.  Effect  of   allopurinol  on  the  formation  of  

reactive  oxygen  species  during  intense  exercise  in  the  horse.  Research  in  Veterinary 

Science 62, 11–16. 

45. 

Montgomery, C., and Dymock, J., 1961. The determination of  nitrite in water. Analyst 86, 

414–416. 

46. 

Nathalie,  K.,  Brieuc,  M.,  Pierre,  L.,  2008.  The  oxidant/antioxidant  equilibrium  in  horses. 

The Veterinary Journal, 177, 178–191. 

47.  Nieman, C., 1997. Immune response to heavy exertion. Journal of  Applied Physiology 82, 

1385–1394. 

48. 

Nishikimi,  M.,  Appaji  N.,  and  Yogi.  K.,  1972.  The  occurrence  of   superoxide  anion  in  the 

reaction  of   reduced  phenazine  methosulfate  and  molecular  oxygen.  Biochemistry  and 

Biophysics Research Commnication 46, 849‐854 

49. 

Nyblom  H.,  Bergren,  U.,  Balldin,  J.,  Olsson,  R.,  2004  High  AST/ALT  ratio  may  indicate 

advanced  alcoholic  liver  disease  rather  than  heavy  drinking.  Alcohol  &  Alcoholism  39, 

336–339. 

50. 

Ohkawa,  H.,  Ohishi,  W.  and  Yagi,  k.,  1979.  Assay  for  lipid  peroxides  in  animal  tissues  by thiobarbituric acid reaction. Analytical Biochemistry. 95,351‐358. 

51.  Palencia, P., Rivero, L., 2007. Atypical myopathy  in two grazing horses  in northern Spain. 

Veterinary Record 161, 346–348. 

52.  Paolisso  G,  D’Amore  A,  Giugliano  D,  Ceriello  A,  Varrichio  M,  Dı´Onofrio  F.  1993. 

Pharmacologic  doses  of   vitamin  E  improve  insulin  action  in  healthy  subjects  and  non‐

insulin‐dependent diabetic patients. American Journal of  Clinical Nutrition 57, 650–6. 

53. 

Pesch, S., Bermann, M. & Bostedt, H. 2006. Determination of  some enzymes and macro‐

and  microelements  in  stallion  seminal  plasma  and  their  correlations  to  semen  quality. 

Theriogenology 66, 307‐313. 

54. 

Radostits,  M.,  Blood,  C.,  Gay,  C.,  2007.  Veterinary  Medicine,  A  Textbook  of   disease  of  cattle,  sheep,  pigs,  goat  and  horses.  10th  Ed.,  SAUNDERS,  ELSEVIER,  Edinburgh,  London, 

New York, Oxford, Philadelphia, St Louis, Sydney, Toronto. 

55. 

Reitman,  M.,  and  Frankel,  S.,  1957.  A  colorimetric  method  for  determination  of   serum 

glutamic  oxaloacetic  and  glutamic  pyruvic  transaminase.  American  Journal  of   Clinical 

Pathology 28, 56. 

56.  SAS, 2001. Statistical analysis system. In: Users Guide: Statistics. SAS Institute. 

57. 

Shingu,  M.,  Nagai,  Y.,  Isayama,  T.,  Naono,  T.,  Nobunaga,  M.,  and  Nagai  Y.,  1993.  The 

effects of  cytokines on metalloproteinase inhibitors (TIMP) and collagenase production by 

human chondrocytes and TIMP production by synovial cells and endothelial cells. Journal 

of  Clinical Experimental Immunology 94, 145–149. 58.  Shingu, M., Miyauchi, S., Nagai, Y. et al., 1995. The role of  IL‐4 and IL‐6 in IL‐1‐dependent 

cartilage matrix degradation. British Journal of  Rheumatology 34, 101–106. 

59.  Sies, H., 1991. Oxidative stress:  introduction.  In: Sies, H. (Ed.), Oxidative Stress: Oxidants 

and Antioxidants. Academic Press, London, pp. XV–XXII. 

60.  Sjaastad, V., Hove, K., Sand, O., 2004. Physiology of  Domestic Animals. Oslo, Scandinavian 

Veterinary Press. 266‐267. 

61. 

Skenderi, K., Kavouras, S., Anastasiou, C., Yiannakouris, N. & Matalas L., 2006. Exertional 

Rhabdomyolysis during a 246‐km continuous running race.  Medicine & Science  in sports 

and exercise 38, 1054‐1057. 

62. 

Stewart J., Pettigrew A , Cochran A., and Belknap J., 2009. Indices of  inflammation  in the 

lung  and  liver  in  the  early  stages  of   the  black  walnut  extract  model  of   equine  laminitis. 

Veterinary immunology and immunopathology 129,  254‐260. 

181

Page 184: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 184/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași

 

63. 

Tabacco,  A.,  Meiathini,  F.,  Moda,  E.,  Tarli,  P.,  1979.  Simplified  enzymic  /  colorimetric 

serum urea nitrogen determination.  Clinical Chemistry 25, 336‐337. 

64. 

Tietz, N., 1995. Clinical Guide to Laboratory Tests, 3rd

 Edition, W.B. Saunders, Philadelphia, 

PA). 

65.  Trinder, P., 1969. Determination of  glucose in blood using glucose oxidase with alternative 

oxygen acceptor. Analytical Clinical. Biochemistry 6, 24. 

66.  Valberg,  S.,  and  B.  Essen‐Gustavsson.  1987.  Metabolic  response  to  racing  determined  in 

pools  of   type  I,  IIA,  and  IIB  fibers.  In:  Gillespie  JR,  Robinson,  NE,  eds.  Equine  Exercise 

Physiology 2. p. 290. Davis, CA. ICEEP publications. 

67. 

Valberg,  J.,  MacLeay,  M.,  Mickelsen,  R.,  1997.  Exertional  rhabdomyolysis  and 

polysaccharide  storage  myopathy  in  horses.  Compendium  on  Continuous  Education  for 

the Practical Veterinarian 19, 1077–1085. 

68. 

Valentine,  A.,  and  Löhr,  V.,  2007.  Myonecrosis  in  three  horses  with  colic:  evidence  for 

endotoxic injury. The veterinary Record 161, 786‐789. 

69.  Valentine,  A.,  McDonough,  P.,  Chang,  F.,  Vonderchek,  A.,  2000.  Polysaccharide  storage 

myopathy in Morgan, Arabian, and Standardbred related horses and Welsh‐cross ponies. Veterinary Pathology 37, 193–196. 

70.  Valentine, A., Van Saun, J., Thompson,  N., Hintz,  F., 2001. Role of  dietary carbohydrate 

and  fat  in  horses  with  equine  polysaccharide  storage  myopathy.  American  Veterinary 

Medical Association 219, 1537‐1544. 

71.  Votion,  M.,  Linden,  A.,  Saegerman,  C.,  Engels,  P.,  Erpicum,  M.,  Thiry,  E.,  Delguste,  C., 

Rouxhet, S., Demoulin, V., Navet, R., Sluse, F., Serteyn, D., Van Galen, G., Amory, H., 2007. 

History  and  clinical  features  of   atypical  myopathy  in  horses  in  Belgium  (2000–2005). 

Journal of  Veterinary Internal Medicine 21, 1380–1391. 

72.  Walsworth,  M.,  and  Kessler,  T.,  2001.  Diagnosing  exertional  rhabdomyolysis:  a  brief  

review and report of  two cases. Military Medicine 166, 275‐277. 

73.  Westermann,  M.,  De  Sain‐van  der  Velden,  M.,  Van  der  Kolk,  H.,  Berger,  R.  Wijnberg,  D., 

Koeman,  P.,  Wanders,  A.,  Lenstra,  A.,  Testerink,  N.  Vaandrager,  B.,  Vianey‐Saban,  C., 

Acquaviva‐Bourdain,  C.,  Dorland  L.,  2007.  Equine  biochemical  multiple  acyl  CoA 

dehydrogenase deficiency (MADD) as a cause of  rhabdomyolysis. Molecular Genetics and 

Metabolism 91, 362–369. 

74.  White, A., Estrada, M., Walker, K., Wisnia, P., Filgueira, G., Valdes, F., Araneda, O., Behn, 

C.,  Martinez,  R.,  2001.  Role  of   exercise  and  ascorbate  on  plasma  antioxidant  capacity  in 

thoroughbred  race  horses.  Comparative  Biochemistry  and  Physiology.  Part  A:  Molecular 

and Integrative Physiology 128, 99–104. 

75. 

Whitwell, E., Harris, P., Farrington, G., 1988. Atypical myoglobinuria: an acute myopathy in grazing horses. Equine Veterinary Journal, 20, 357–363. 

76.  Wootton, P., 1982.  Microanalysis  in Medical Biochemistry 6 th

 Ed. Churchill, LTD. London 

pp. 107. 

77.  Wroblewski, F., and Duean, S., 1955. Bestimmung der Aktivital der lactate dehydrogenase. 

Proceedings of  Society of  Experimental Biology, 90, 210‐214. 

78. 

Young,  S.,  Thomas,  W.,  Friedman,  B.,  Pestaner,  C.,  1972.  Effects  of   drugs  on  clinical 

laboratory tests. Clinical Chemistry 18, 1041–1303. 

79.  Zentek, J., 1991. Myopathies in a riding horse stable. Tierarztl Prax.19, 167‐9. 

182

Page 185: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 185/206

 

THE PARS DISTALIS (ANTERIOR PITUITARY) IN ONE‐HUMPED 

CAMEL (CAMELUS DROMEDARIUS   )  : A MORPHOLOGICAL STUDY 

IHAB EL_ZOGHBY1*

 , AHME D KASSAB2 

1Department of  Histology and Cytology,

 2Department of  Anatomy and 

Embryology and, Faculty of  Veterinary Medicine (Moshtohor), Benha University, Egypt; 

*Corresponding author: 1

E‐mail: [email protected] 

Abstract : Fourteen pars distalis of  one‐humped camels  (Camelus

 

dromedarius) were studied using  light, scanning and transmission electron microscopes. Camels  (9 males and 5  females) 

ranged from three to five years of  age were used in this study. The pars distalis were principally 

composed of  clusters of  tightly‐packed cells  in the form of  anastmosing cords. The cells were 

separated from each other by collagen fibers and sinusoids of  various sizes. The pars distalis of  

camels  included  the  following  cells:  mammotrophs,  somatotrophs,  gonadotrophs, 

corticotrophs, thyrotrophs and  folliculo‐stellate cells. Somatotrophs were  the most abundant 

secretory  cells  and  were  readily  identifiable  by  their  large  homogeneously  dense  secretory 

granules. The gonadotrophs  contain  small  secretory  granules. Corticotrophs were angular  in 

outline  and  occasionally  possessed  finger‐like  projections.  Thyrotrophs  were  few  in  number 

and  contain  small  scattered  secretory  granules.  The  folliculo‐stellate  cells  were  small  and 

contained no secretory granules. The present study showed that the camel pars distalis has five secretory and one non‐secretory 

cell types, which could be easily differentiated from each other by the number and size of  their 

secretory granules. 

Key words: Pars distalis; Camel; Scanning; Transmission Electron Microscope. 

INTRODUCTION 

It is well known that the mammalian pituitary gland consists of  two structurally distinct 

lobes,  the adenohypophysis and  the neurohypophysis. The adenohypophysis consists of   the 

pars distalis, pars intermedia and pars tuberalis (Hanstrom, 1966;

 Daniel

 and

 Prichard,

 1975).

 

The pars distalis forms the main body of  the pituitary gland and consists of  several types 

of   endocrine  cells  that  secrete  at  least  six  trophic  hormones  (Webb,  1982).  The 

histomorphology of  the pars distalis has been studied  in various domestic species (Delmann, 

1971);  in  horse  (Harrison  and  Sharyock,  1940;  Webb,  1982);  in  bovine  (Dawson,  1948; 

Bassett,  1951;  Cupps  et  al.,  1954;  Jubb  and  McEntee,  1955);  in buffaloes  (Roy,  1970;  Das, 

1979);  in small  ruminants  (Trautmann  and Fiebiger,  1957; Webb, 1981);  in  the goat  (Singh, 

1971; Khatra and Nanda, 1981; Gomez et al., 1989) and in the dog and cat (Das, 1971; Girod 

and Lheritier, 1986). However, there are no available reports that describe the pars distalis in 

the camel. 

The secretory cells of  pars distalis secret at  least six hormones: growth hormone  (GH), prolactin,  adrenocorticotrphic  hormone  (ACTH),  thyroid‐stimulating  hormone  (TSH), 

183

Page 186: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 186/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

luteinizing  hormone  (LH)  and  follicle‐stimulating  hormone  (FSH).  Each  hormone,  with  the 

exception of  LH and FSH,  is produced by separate cell type (Moriarity, 1973; Nakane, 1975). 

Each  cell  type  appears  to  be  similar  in  many  mammalian  species  (Foster,  1971;  Farquhar, 

Skutelsky  and  Hopkins,  1975).  Many  of   the  different  cell  types  can  be  identified  by  their 

ultrastructural morphology; particularly by the size of  their secretory granules (Webb, 1981). 

But there are no studies that dealt with the  identification of  cell types  in the pars distalis of  

the dromedary camel (Camelus dromedarius) 

The two objectives of  this study were: firstly, to elucidate a detailed description of  the 

pars  distalis  in  the  hypophysis  of   dromedary  camel  (Camelus  dromedarius)  by  Scanning 

electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Secondly, to compare 

the camel’s pars distalis cell types  with pars distalis cells in other domestic animals. 

MATERIALS AND METHODS 

Nine adult male and five female camels (Camelus dromedarius) ranged from three to 

five  years  of   age  were  used  in  this  study.  Samples  were  obtained  from  Benha  and  Toukh slaughterhouses  in Egypt. Each pituitary gland was quickly  removed  from  its  fossa. The pars 

distalis were isolated from each pituitary gland and was cut into 1 mm blocks. 

For light microscopy, the tissues were fixed in 10% neutral buffered formalin solution 

then dehydrated, cleared, embedded and cut at 4‐5 microns. The tissues stained with H&E and 

Crossmon’s  trichrome  stain  according  to  the  methods  described  by  Crossman  (1937)  and 

Bancroft, Cook, Stirling, and Turner (1994). 

The  scanning  electron  microscopy  study  was  made  in  Faculty  of   Agriculture,  Alazhar 

University, Egypt. The specimens were dehydrated  in ascending grades of  alcohols,  isopentyl 

acetate  for 2‐3 days, critical point dried with carbon dioxide, mounted on aluminum holders 

and  coated with  gold  in  a  sputtering device.  Finally,  the  structures were  examined using  a JEOL JSM 5500 LV SEM. 

The transmission electron microscopy was made in Almasa Military Veterinary Hospital 

in Egypt. Small pieces of  camel pars distalis were  fixed  in 2.5% gluteraldehyde solution with 

0.1 M phosphate buffer  (pH 7.4)  for 24‐48 hours, post  fixed  in 2% osmic  acid  for 2 hours, 

dehydrated  in  ascending  grades of   alcohols and  immersed  in propylene oxide.  Finally,  they 

were  embedded  in  Epoxy  resin.  The block was polymerized  for 24 hours  at 70○C.  semithin 

sections  (0.4 µm) were  cut with  glass  knives on  an ultramicrotome and  stained with 0.3 % 

toludine blue for light microscopy to determine the orientation of  the specimen. The ultrathin 

sections  (70  nm)  were  cut,  mounted  on  copper  mesh  grids  (No.  200)  and  stained  with 

saturated  solution of  uranyl acetate dihydrate. Then,  the  sections were examined with SEO 

Electron Microscope. The sizes of  granules were determined using the SemAfore software. 

RESULTS 

The parenchymal cells of  the pars distalis were appeared in clusters of  tightly‐packed 

cells.  The  cells  were  arranged  in  anastmosing  cell  cords  of   (Fig.  1)  with  variable  thickness. 

These cells were covered externally by connective tissue capsule (Fig. 2) and were separated 

from  each  other  by  collagen  fibers  and  sinusoids  of   various  sizes  which  were  lined  with 

endothelium (Fig. 3). 

184

Page 187: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 187/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 1. Photomicrograph of  camel pars distalis illustrating cord like arrangement of  cells (C) and 

in between sinusoidal vessels (S). The acidophil (A) can be distinguished easily from basophil 

(B). The pars distalis faces cavum hypophysis (H). H&E. X 200. 

Fig. 2. Scanning electron micrograph of  camel pars distalis showing connective tissue capsule 

(arrows) that surrounding the parenchymal cells (C) and sinusoids (S). 

Fig. 3. Photomicrograph of  camel pars distalis  stain with Crossman’s  trichrome  showing  the 

distribution of  the collagen fiber (arrows) among the cell clusters (C) and blood sinusoids (S). 

X400. 

185

Page 188: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 188/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

There were blood vessels (Fig. 4) between the secretory cells of  pars distalis. The wall 

of  the blood vessels was reinforced with a tough collagen fiber and fine scattered fibrils were 

also observed  (Fig. 5).  The  cells were a mixture of   secretory with  typical details of  protein 

secreting  cells  and non‐secretory  cell  types. The  clusters were  surrounded by  a network of  

capillaries.  The  pars  distalis  of   camels  included  the  following  cells:  mammotrophs, 

somatotrophs, gonadotrophs, corticotrophs, thyrotrophs and folliculo‐stellate cells. 

Fig. 4.  Scanning electron micrograph  showing  a blood  vessel  (BV)  in  the  camel pars distalis 

containing blood cells (b) which adjacent to secretory cells (C). 

Fig. 5. High magnification Scanning electron micrograph of  large blood vessels. Collagen fibrils 

(c)  are  randomly  distributed  along  its  longitudinal  axis.  Secretory  granules  (G)  were  seen 

adjacent to the blood vessel and blood cells (b). 

Mammotrophs and somatotrophs 

The mammotrophs and  somatotrophs were difficult  to distinguish  from each other 

because of  their similarity. Somatotrophs were the most abundant secretory cells and tended 

to be found in groups within a cluster. They were readily identifiable because they contained 

large homogeneously dense secretory granules. The granules were generally  round to ovoid 

and were  scattered either  throughout  the  cytoplasm or  concentrated near  that part of   the 

186

Page 189: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 189/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

peripheral cell membrane (Fig. 6 & 7). They were distributed throughout the gland, but with a 

relatively higher concentration  in the antero‐ventral area. Lower concentration of  these cells 

was founded in the dorso‐posterior area. The diameter of  the cells varied and the sizes of  the 

secretory granules ranged from 400‐ 1100 nm (Fig. 8). 

Fig. 6. Transmission  electron micrograph of  mammotrophs or somatotrophs from camel pars 

distalis. Note the nucleus (N) and the dense secretory granules (G) are concentrated near the 

peripheral cell membrane. A blood vessel (BV) was seen with blood cells (b). Scale bar: 5 µm. 

Fig. 7. Scanning electron micrograph from camel pars distalis showing various shape and size 

of  secretory granules. 

187

Page 190: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 190/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 8. Transmission  electron micrograph of  secretory granules in somatotrophs of  camels pars distalis. Note the granules 

are of  high number, large size and density packed. Scale bar: 2 µm 

Gonadotrophs 

The  shape  of   gonadotrophs  varied  from  angular  to  ovoid  and  may  be  irregular  in 

shape  (Fig. 9). Their size and secretory granule number were varied according  their activity. 

The  secretory  granules  were  smaller,  rounder  and  their  diameters  were  ranged  between 

about 250  to 850 nm  in diameter. These cells were often  larger  than  the somatotrophs and 

mammotrophs. The cells had a variable number of  mitochondria and attached with neighbor 

cells by  junctional complex. The number of  secretory granules was quite variable between one 

cell and another. 

The  secretory  granules  in  gonadotrophs  of   camel's  pars  distalis  were  darker  and 

denser than those of  the somatotrophs and mammotrophs (Fig. 10). The rough endoplasmic 

reticulum was sparsely distributed. The cytoplasm contained many free ribosomes. 

Fig. 9. Transmission electron micrograph of  gonadotrophs from camel pars distalis containing 

small scattered secretory granules (G). Junctional complexes (arrows) were seen between 

cells. The nucleus (N) and mitochondria (M) are seen. Scale bar: 5 µm. 

188

Page 191: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 191/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 10. Transmission  electron micrograph of  secretory granules  in gonadotrophs of  camels 

pars distalis. Note the granules are of  few in number and small in size. Scale bar: 2 µm 

Corticotrophs 

Corticotrophs were few in number and variable in size. They were usually angular  in 

outline  and  occasionally  possessed  finger‐like  projections  (Fig.  11).  The  projections,  which 

extended between adjacent cells, contained few organelles other than secretory granules. The corticotrophs  contained  variable  numbers  of   secretory  granules  scattered  throughout  the 

cytoplasm. The granules were usually round, with diameters ranging between 150 to 300 nm. 

Fig. 11. Transmission electron micrograph of  camel pars distalis containing corticotrophs (Co) surrounded  by  somatotrophs  (So)  and  gonadotrophs  (Go).  The  corticotrophs  has  angular 

189

Page 192: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 192/206

Page 193: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 193/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig. 13. Transmission  electron micrograph of  folliculo‐stellate cells (F) in the camel pars 

distalis. The nucleus (N) is elongated. Corticotrophs (Co), gonadotrophs (Go) and Junctional 

complexes (arrows) are seen.  Scale bar: 5 µm 

DISCUSSION 

The pars distalis of   the  camel was  composed of   glandular  cells  enclosed by  connective 

tissue and surrounded by a capillary network,  like other mammals as  in  cattle  (Gasse  et  al. 

1986;  Fumagalli  and  Zanini,  1985);  in  goat  (Khatra,et  al.,  1981)  and  in  small  ruminants 

(Trautmann and Fiebiger, 1957 and Dellmann, 1971). These observations also support similar 

findings in dog and pig ( Das, 1971).

 

The result of  the present study showed that the density of  solitary fibrils surrounding the 

inner surface of  vessels seemed to change according to the size. They are denser in the large 

vessel and are  sparser  in  the  small vessels or  sinusoids.  It may be  related  to  the  structural 

strength of  vessels. These finding is agreement with Nishimura et al 2004 in the goat. Also the 

sinusoids are generally distributed between the cluster according to the endocrine function of  

the gland which also with agreement with Murray et al. (1997) in human and Townsend et al. 

(2004) in equine. 

Mammotrophs  and  somatotrophs  were  the  easiest  secretory  cells  to  identify.  Their 

secretory granules were lagre and secttered over their cytoplasm, similar to that described by 

Parry, McMillen,

 Robinson

 &

 Thorburn

 (1979)

 in sheep.

 

Our  result  revealed  that  the  mammotrophs  and  somatotrophs  are  the most  abundant 

secertory cells in the camels pars distalis. While Farquhar 

et al. (1975) in rat and Foster (1971) 

in rabbits observed that mammotrophs only were the most abundant secretory cell type. Such 

cells were  readily  identifiable due  to  they were  the  largest of  any pars distalis cell  type and 

their secretory granules are very  large. 

The gonadotrophs varied from angular to ovoid and may be  irregular  in shape, similar to 

that  mentioned  by  Nakane  (1975).The  aforementioned  author  observed  that  the  shape  of  

gonadotrophs  were  large  round  or  angular.  Moriarty  (1976)  found  that  there  were  three 

distinct cell types which contained LH and/or FSH and that their shapes varied from angular or 

stellate  to  large and ovoid. Moreover, as  secretory activity was  increased and a  cell  lost  its population of  granules, it became more angular or satellite. 

191

Page 194: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 194/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

The present study showed that somatotrophs and gonadotrophs are completely different 

by their size and secertory granules. On the other hand,  Farquhar et al. (1975) recorded that 

somatotrophs  and  gonadotrophs  could  not  be  differentiated  and  proved  indistinguishable 

from each other using morphological criterion of  granule size. 

Corticotrophs were also  identified  in  this study. The cells exhibited all the characteristics 

described  by  many  authors  following  morphological  and  immunocytochemical  studies  in 

several  species  (Siperstein  &  Allison,  1965;  Foster,  1971;  Moriarty,  1973;  Farquhar 

et  

al., 

1975).  The  corticotrophs  were  not  numerous,  which  is  in  agreement  with  the  results  of  

Nakane,  Setalo  &  Mazurkiewicz  (1977), who  found  that  the number of  corticotrophs  in  rat 

pituitary sections represented approximately 15% of  the total secretory cell population. 

The  secretory  granules  of   the  thyrotrophs  of   the  camel  pars  distalis  are  spherical, 

numerous and distributed throughout the cytoplasm, in the way described by Shirasawa et al. 

(1985) in the goat. The secretory granules show their characteristically small size, giving values 

similar to those found by Shirasawa et al. (1985) especially  in the female goat. These results 

suggest that the size of   the secretory granules  in the camels tend to be  larger than  in other 

species of   mammals. The granule content  is of  a very variable density, which coincides to a certain  extent with  the diversity which appears  in other  species. However  Shirasawa  et  al. 

(1985) observed them as being electrodense in the goat. 

The  folliculo‐stellate  cells  of   the  camel  pars  distalis  that  were  described  in  this  study 

characterized by their shape, a granularity, relatively few mitochondria and poor development 

of   RER.  On  the  other  hand,  Smith  (1963)  was  the  first  to  describe  large  stellate  cells  with 

prominent  cytoplasmic  fibrillae  in  the  guinea‐pig  pituitary.  Cells  with  similar  ultrastructural 

features  have been described  in  the  rabbit  (Young, 

et  al.,  1965;  Foster,  1971),  in  the  rat 

(Farquhar,  1971;  Vila‐Porcile,  1972;  Farquhar,  Skutelsky  &  Hopkins,  1975) and  in  the deer 

(Young & Chaplin, 1975). 

Foster 

(1971)  found  the  cells  in  the  rabbit  pituitary  with  numerous  microfilaments  and microtubules.  He  speculated  that  the  cells  might  be  capable  of   movement  and  might  be 

concerned  in  the  circulation  of   intracellular  fluid.  A  phagocytic  role  has  been  disscused  by 

Young 

et  

al  (1965) and Farquhar (1971). 

The results for camel pars distalis demonstrate that specific identification techniques (e.g. 

immunocytochemistry) are  required  to help  identify or verify certain of   the pars distalis cell 

types. 

REFERENCES 

1.  Bancroft,  J.  D.;  Cook,  H.  C.;  Stirling,  R.  W.  and  Turner,  D.  R.  (1994):  Manual  of  

histological  techniques  and  their  diagnostic  application.  2nd.  Churchill  Livingston, 

Edinburgh, London, Madrid, Melbourne, New York, and Tokyo. 

2.  Bassett,  E.  G.  (1951):  The  anterior  lobe of   cattle pituitary.  I. Quantitative  cell  type 

variation in various normal and abnormal sexual conditions. J. Endocr. 7: 203‐214. 

3.  Crossman,  G.  (1937):  A  modification  of   Mallory  connective  tissue  stain  with  a 

discussion of  the principals involved. Anat. Rec. 69: 33‐83. 

4. 

Cupps, P. T.; Laben, R. C. and Mead, S. W.  (1954): Histology of  the pituitary,  testis 

and adrenal in relation to reproduction in the bull. Dairy Sci. 37: 1074‐1087. 

5. 

Daniel,  P.M.  and  Prichard,  M.M.L.  (1975)  Studies  of   the  hypothalamus  and  the 

pituitary  gland  with  special  reference  to  the  effects  of   transaction  of   the  pituitary 

stalk. Acta Endocrinologica, Suppl. 201. 

6. 

Das, L.

 N.

 (1971):

 Quantitative and histochemical studies on age correlated changes 

in canine and porcine hypophysis. Ph. D. Dissertation. Iowa University Library Ames. 

192

Page 195: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 195/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

7.  Das,  L.  N.  (1979):  Observation  on  subgross  morphology  of   the  hypophysis  and 

histomorphology of   the neurohypophysis of   Indian buffalo.  Indian  J. Anim.  Sci. 49: 

531‐ 542. 

8.  Dawson, A. B. (1948): The relationship of  the pars tuberalis to the pars distalis in the 

hypophysis of  the rhesus monkey. Anat. Rec. 102: 103‐ 122. 

9. 

Dellmann, H.

 D.,

 (1971):

 Veterinary histology. Lea and Febiger, Philadlphia.

 

10. 

Dellmann H.D. and J. Eurell (1998) Textbook of  Veterinary Histology 5th Edition, pp 

289‐291, Lippincott Williams and Wilkins,  Philadelphia. 

11. 

Farquhar, M. G. (1971): Processing of  secretory products by cells of  anterior pituitary 

gland. Memoirs of  the society for endocrinology. 19, 79‐122. 

12. 

Farquhar, M. G.; Skutelsky, E. H.; and Hopkins, C. R. (1975): Structure and function of  

the  anterior  pituitary  and  dispersed  cells.  In  vitro  studies.  In  ultrastucture  in 

bioological systems. Vol. 7 the anterior pituitary, pp83‐135. Eds A. Tixier‐ Vidal& M.G. 

Farquhar. Academic Press, New York. 

13. 

Foster, 

C. 

L. 

(1971): 

Relationship  between  ultrastructure  and  function  in  the adenohypophysis of  the rabbit. Mem. Soc. Endocr. 19, 125‐146. 

14.  Fumagalli, G. and Zanini, A.  (1985):  In cow anterior pituitary, growth hormone and 

prolactin can be packed  in separate granules of  the same cell. J. cell Bio. 100: 2019‐

2024. 

15. 

Gasse  H.  and  Schwarz  R.(1986):  Chromophobe  cells  and  their  significance  as 

folliculostellate  cells  in  the  pars  distalis  adenohypophysis  in  cattle.  Dtsch  Tierarztl 

Wochenschr.  7;93(5):224‐8. 

16.  Girod, C.; and Lheritier, M.; Trouillas, S.and Dubois, M. P.  (1986): Cell types of  the 

pars distalis of  the hedgehog (Erinaceus europaeus L.) adenohypophysis: cytological, 

immunocytochemical and ultrastructural studies. 4 thyrotropic cells. Acta Anat. 127, 48‐52. 

17. 

Gomez, M.A.; Navarro,  J. A.; Gomez, S.; Camara,  P.;  Gomez,  J. C. and Bernabe,  A. 

(1989):  Cytological,  immunocytochemical  and  ultrastructural  study  of   the 

adenohypophyseal pars distalis of   the kid  (Capra hircus): The TSH cell. Anat. Histol. 

Embryol. 18: 305‐315. 

18. 

Hanstrom, B. (1966): Gross anatomy of  the hypophysis in mammals> in the pituitary 

gland, Vol. 1 pp. 1‐57. Eds G. W. Harris & B.T. Donovan. Butterworth, London. 

19. 

Harrison,  B.  and  Sharyock,  H.  (1940): Cytogenesis  in  the pars distalis of   the horse. 

Anat. Rec. 78: 449‐471. 

20. 

Jubb, K. V., and McEntee, K.  (1955): Observations on  the bovine pituitary gland.  II. 

Architecture and cytology with special reference to basophil cell function. Cornell Vet. 

45: 593‐641. 

21. 

Khatra, G.S. and Nanda, B. S. (1981): Age related changes in the histomorphology of  

the adenohypophysis of  the goat. Anat. Histol. Embryol. 10: 238‐245. 

22. 

Moriarity, G. C.  (1973): Adenohypophysis: utltrastructural cytochemistry (a review). 

J. Histochem. Cytochem. 21:855‐894. 

23.  Moriarty, G. C. (1976): Immunocytochemistry of  the pituitary glycoprotein hormones. 

Journal of  Histochemistry and Cytochemistry, 24, 846—863. 

24. 

Murray, K.; De Lera, J. M.; Astudillo, A. and McNicol, A. M. (1997): Organization of  

basement membrane components in the human adult and fetal pituitary gland and in 

pituitary adenomas. Virchows Arch 431:329‐335. 

193

Page 196: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 196/206

Page 197: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 197/206

LIGHT AND ELECTRON MICROSCOPE STUDIES OF THE ADRENAL 

GLANDS OF THE EGYPTIAN GEESE 

( ALOPOCHEN   AEGYPTIACUS) 

Ihab M. EL‐Zoghby 

Department of  Histology and Cytology, 

Faculty of  Veterinary medicine (Moshtohor), Benha University, Egypt. 

E‐mail: [email protected] 

ABSTRACT: Twenty mature and immature male and female Egyptian geese, ranged in age from 

three to eighteen months, were used  in this study. The adrenal glands of  the Egyptian geese 

were paired organs weighing approximately 200‐250 mg (7.5 mg/100 g body weight) and were 

situated anterior to the kidneys on each side of  the dorsal aorta and  inferior vena cava.  Each 

adrenal  gland was  surrounded  from  outside  by  a  connective  tissue  capsule.  The  interstitial 

tissue was  rich  in  blood  vessels,  collagen,  and  reticular  fibers.  The  parenchyma  cells  of   the 

adrenal  gland  were  arranged  in  cords  especially  at  sub‐capsular  zone  (SCZ).  Thin  layers  of  

connective  tissue  separated  these  cords  and  there were  two  types  of   cells:  acidophilic  and 

basophilic  cells,  which  intermingle  with  each  other  and  are  separated  by  sinusoids.  The 

acidophilic  cells were  large,  polyhedral  to  columnar  in  shape, with  a  highly  vacuolated  and 

lightly stained acidophilic cytoplasm; while the cells of  inner cords were large columnar and are 

less vacuolated. Ultrastructurally,  these  cells  could be  classified  into  two  types, according  to 

the amount of   lipid droplets and mitochondria: cells  that contained numerous  lipid droplets 

with few somewhat large globular mitochondria, and the other type were cells containing few 

lipid  droplets.  Basophilic  cells were  bluish  islets  or  scattered  groups  found  in‐between  the acidophilic  cells.  According  to  the  shape  of   the  secretory  granules,  these  cells  could  be 

classified  into  two  types:  cells  that  contained  homogenous,  polymorphic  electron  dense 

secretory  granules,  and  cells  that  contained  secretory  granules  of   electron  dense  core 

surrounded  by  hallow  electron  lucent  coat.  With  the  increasing  the  age  of   the  geese,  the 

connective  tissue  capsule  became  thick  and  the  interstitial  tissue  was  increased.  The 

acidophilic  cells  of   the  inner  zone  were  more  vacuolated  and  less  acidophilic  and  slightly 

numerous  in the peripheral, acidophilic cells than  in those of  the  inner zones. The basophilic 

cells appeared less vacuolated and were smaller. 

Key words: Egyptian Geese, Adrenal gland, Light and Transmission Electron Microscope. 

INTRODUCTION 

The  role  of   the  adrenal  gland  is  more  difficult  to  be  evaluated  in  geese  than  in 

mammals. The difficulties are partly related to the intermingling of  the cortical and medullary 

tissues. It  is generally accepted that the cortex of  the geese adrenal gland cannot be divided 

into the three distinct zones (zona glomerulosa, zona fasciculata, and zona reticularis) as in its 

mammalian counterparts  (Gulmez, Kocamis, Liman and Kukner, 2004). The adrenal gland  is 

an  indispensable  endocrine organ;  it  is  a  complex  organ  concerned with  the production of  

multiple hormones and performs many kinds of  physiological functions. The adrenal gland  is 

as  important  in  birds  as  it  is  in mammals;  and  the  removal  of   the  adrenal  gland  in  birds 

eventually leads to death (Peng, 

Chen 

and 

Liang, 

2005). Morphological studies of  the adrenal gland have been reported in pigeon 

(  Bhattacharyya,  1975),  Canadian  goose  (Gulmez  et  al.,  2004),  and  in  Wanxi  white  geese 

195

Page 198: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 198/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

(Wang,  Zhu  and  Jin,  1999),  in  fowl  (Siller,  Teague  and Mackenzie,  1975),  in  quail  (Basha, 

Vijayaragavan  and  Ramesh,  2004),  in  duck  (Pearce,  Cronshaw  and  Holmes,  1978)  and  in 

African ostrich  chicks  (Li Tang, Peng, Wang,  Luo, Cheng, Zhang, Sun,  Liu, and Song, 2009). 

However,  little  attention was  paid  especially  to  the morphology  of   the  adrenal  glands  in 

Egyptian geese, and the glands ultrastructure remains obscure. 

The purpose of  this study was to provide a concise account of  general morphology, 

the  cellular  and  sub  cellular  structures  of   the  adrenal  glands  in  Egyptian  geese,  and  to 

compare them with those observations in other birds. This would hopefully contribute to the 

understanding of  the features of  the adrenal gland in birds in general, and of  adrenal glands of  

Egyptian geese morphology, in particular. 

MATERIALS AND METHODS 

Twenty mature and  immature male and female Egyptian geese were collected from 

EL‐Qaliubiya Province in Egypt. Each sex was represented by ten birds that ranged in age from 

three to eighteen months.  The birds were anaesthetized using 10% urethane, (1 g/kg  body weight), and were sacrificed. The paired adrenal glands were carefull dissected and removed 

from each sample and then cut  into 1 mm blocks. Tissues  for  light microscopy were fixed  in 

10%  neutral  buffered  formalin  solution  and  Bouin’s  solution  for  72  h,  then  dehydrated, 

cleared,  and  embedded  in  paraffin.  Sections  (5  ‐ 6  microns)  were  cut  and  stained  with 

haematoxylin and eosin and Crossman’s  trichrome stain and Gomeri’s  reticulin and Periodic 

acid Schiff  according to the methods given by (Crossman, 1937; Bancroft, Cook, Stirling, and 

Turner 1994). 

The  transmission electron microscopy evaluation was conducted at Science collage of  

Ain Shams University in Egypt. Small pieces of  adrenal gland were fixed in 2.5% gluteraldehyde 

solution with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) for 24‐48 hours, post fixed in 2% osmic acid for 2 hours, dehydrated in ascending grades of  alcohols and immersed in propylene oxide. Finally, 

they were  embedded  in Epoxy  resin. The block was polymerized  for 24 hours  at 70○C.  The 

ultrathin sections (70 nm) were cut, mounted on copper mesh grids (No. 200) and stained with 

saturated solution of  uranyl acetate dihydrate and lead citrate as described by Chiu, Schmidt 

and  Prasad  (1993).  Then,  the  sections  were  examined  with  Jeol  JEM  100S  Transmission 

electron microscope (70KV). 

RESULTS 

The adrenal glands of  the adult Egyptian geese were paired organs weighing approxi‐

mately 200‐250 mg (7.5 mg/100 g body weight) and were situated anterior to the kidneys on 

each side of  the dorsal aorta and  inferior vena cava. The glands measured approximately 7.5 

mm  in  length and 5mm  in width,  and  in transverse section,  it appeared either triangular or 

oval with a thickness ranging from 3.5 to 4.5 mm. 

The adrenal gland was surrounded from outside by connective tissue capsule 

(Fig.  1)  that  contained mainly  collagen  fibers  (Fig.  2),  reticular  fibers, with  very  few  elastic 

elements, blood vessels and fibroblasts. Delicate septa were arising from the capsule and were 

ramifying between parenchyma tissues  form the  interstitial tissue. The  interstitial tissue was 

rich  in  blood  vessels,  reticular  fibers  (Fig.  3)  which  surrounded  both  types  of   cells  and 

sinusoids. Groups  of   ganglionic  cells  are  found  both  outside  (Fig.  4)  and  inside  the  gland’s 

parenchyma. 

196

Page 199: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 199/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

subcapsular  zone,  two  cells  wide  (Fig.  5),  and  the  cells  were  orientated  so  that  their 

longitudinal axes were transverse to the cord and the nucleus in each cell was situated toward 

the outer margin. Thin layers of  connective tissue separated these cords and there were two 

types of  cells (Fig. 5): acidophilic and basophilic cells. These cells intermingled with each other 

and were separated by sinusoids (Fig. 6). The first type of  cells, the acidophilic cells, was arranged in two‐ cells wide cords that 

rested on PAS positive membrane  (Fig. 7&7a). At peripheral  (subcapsular)  zone,  these  cells 

were  arranged  in  clumps  forming  loops  directed  opposite  to  the  capsule.  These  cells were 

large, polyhedral to columnar with highly vacuolated and lightly stained acidophilic cytoplasm. 

The  cells  of   inner  cords  were  large  columnar  cells  and  are  less  vacuolated.  The  nuclei  of  

acidophilic cells were rounded, apically located and contained one or two prominent nucleoli. 

Ultrastructurally, the acidophilic cells appeared columnar in shape, their cytoplasm contained 

numerous globular mitochondria, and many ribosomes, lipid droplets (Fig. 8), and smooth and 

rough  endoplasmic  reticulum  and  their  nuclei  were  spherical,  large  contained  prominent 

nucleoli and coarse chromatin. These cells could be classified into two types, according to the amount of   lipid droplets and mitochondria,  cells  contained numerous  lipid droplets  (Fig. 8) 

with few somewhat large globular mitochondria and the other type were cells containing few 

lipid droplets (Fig. 9). 

The second  type of  cells,  the basophilic cells, were  found  in  the  form of   islets  that 

appeared, with general stain, as bluish  islets or scattered groups  in between  the acidophilic 

cells (Fig. 10). They were polygonal or rounded  in shape with basophilic cytoplasm and  large 

spherical centrally located nuclei that contained two or even three nucleoli. According to the 

affinity  of   the  cytoplasm  to  the  stain,  the  basophilic  cells  could  be  differentiated  into  two 

types: cells with deeply  stained  basophilic cytoplasmic granules, and cells with  lightly  stained  

basophilic cytoplasmic granules  (Fig. 10a). The blood sinusoids were  found between  the cell 

cords  and  islets,  and  were  numerous  and  wider  in  the  center  of   the  gland  than  in  the 

peripheral zone of  the gland. The peripheral zone were formed mainly from the first type of  

cells where, the inner zones formed of  large amount of  second type of  cells and a few of  first 

type of  cells. 

TEM  revealed  that  the  cytoplasm  of   the  basophilic  cells  contained  rod  shaped 

mitochondria  with  tubular  cristea,  ribosomes,  a  few  rough  endoplasmic  reticulum,  lipid 

droplets and secretory granules. According to the shape of  the secretory granules, these cells 

could  be  further  classified  into  two  types:  cells  that  contained  homogenous,  polymorphic 

electron  dense  secretory  granules  (Fig.  11),  and  cells  that  contained  secretory  granules  of  

electron dense core surrounded by hallow electron lucent coat (Figs. 12 &13). 

With  the  increasing  the  age  of   the  gees,  the  connective  tissue  capsule  became thicker, and  the amount of  the  interstitial tissues  increased  (Fig. 14). The acidophilic cells of  

the  inner  zone were more  vacuolated  and  less  acidophilic,  and  the  vacuoles were  slightly 

numerous  in  the  peripheral  acidophilic  cells  than  in  those  cells  of   the  inner  zones.  The 

basophilic cells appeared less vacuolated and smaller. 

FIGURE LEGENDS 

Fig.  1.  Photomicrograph  in  geese  adrenal  gland  of   three  months  old  female  showing  the 

capsule(c), blood vessel (bv), parenchyma of  the gland (p), acidophilic cells (a) and basophilic 

cells (b) H&E. X 100. 

Fig.  2.  Photomicrograph  in  geese  adrenal  gland  of   seven  months  old  female  showing  the 

collagen fibers (cf), blood sinusoids (bs) and blood vessels (bv). Crossman’s trichrome stain. X 

100. 

The  parenchyma  cells  of   adrenal  gland  were  arranged  in  cords  especially  at 

197

Page 200: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 200/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

Fig. 3. Photomicrograph  in geese adrenal glands of  seven months old  female with Gomori’s 

reticulin methods showing  the distribution of   the  reticular  fiber  (rt) among  the of   the gland 

parenchyma X400. 

Fig. 4. Photomicrograph in geese adrenal glands of  ten months old female showing the capsule 

(c), parenchyma (p) and ganglionic cells (arrows). H&E. X 200. 

Fig. 5. Photomicrograph  in geese adrenal glands of   ten months old  female showing  the  two 

cells width forming the cords also, blood sinusoid (bs), acidophilic cells (a) and basophilic cells 

(b).  H&E. X 600 

Fig. 6.  Transmission  electron micrograph  from  eleven months male  of   geese  adrenal  gland 

showing  blood  sinusoid  (bs)  and  thin  layer  of   connective  tissue  between  the  cells  of   the 

glands. X2000. 

Fig. 7. Photomicrograph in geese adrenal glands of  seven months old male showing the septa 

between the cell  (s) and & Fig. 7a.showing the positive membrane (arrows) of  the same age 

and sex. PAS technique X 100 and 1000 respectively. 

Fig. 8.  Transmission  electron micrograph  from  eleven months male of   geese  adrenal  gland 

showing  the  subcapsular  columnar  cells  with  the  nucleus  (s),  cell  membrane  (cm), mitochondria (m) and large number of  fat droplet (f) in their cytoplasm. X4000. 

Fig.  9.  Transmission  electron micrograph  from  eleven months male of   geese  adrenal  gland 

showing  the other subcapsular columnar cells with  low fat droplet (f) in their cytoplasm and 

mitochondria (m). X3000. 

Fig.  10.  Photomicrograph  in  geese  adrenal  glands  of   twelve months  old male  showing  the 

distribution of  basophilic cells (b)  in  inner zone of  the gland between the acidophilic cells (a) 

also blood sinusoids (bs). Fig. 10a. Showing the two types of  basophilic, one deeply stain (d) 

and other lightly stains (l) of  the same age and sex.  H&E. X100 and 600 respectively. 

Fig. 11. Transmission  electron micrograph in geese adrenal glands of  twelve months old male 

showing  the  basophilic  cells  containing  nucleus  (n),  cell  membrane  (cm),  mitochondria (arrows) and secretory granules (sg). X1000. 

Fig. 12. Transmission  electron micrograph in geese adrenal glands of  twelve months old male 

showing  the  distribution  of   the  two  types  cells  of   basophilic  cells.  Cells  contained 

homogenous, polymorphic electron dense secretory granules (1) and cells contained secretory 

granules of  electron dense core surrounded by hallow electron lucent coat (2). X3000. 

198

Page 201: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 201/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

199

Page 202: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 202/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

200

Page 203: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 203/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

Fig.  13.  High magnification  transmission  electron micrograph  in  geese  adrenal  glands  of  

twelve months old male showing the difference of  the secretory granules of  basophilic cells, 

homogenous,  polymorphic  electron  dense  secretory  granules  (1)  and  secretory  granules  of  

electron dense core surrounded by hallow electron lucent coat (2) 

Fig. 14. . Photomicrograph in geese adrenal of  eighteen months old female showing the thick 

capsule(c), blood vessel (bv), subcapsular zone (scz) containing acidophilic cells. H&E. X 1000. 

DISCUSSION 

The birds are quite different from the mammals in that their adrenal glands are distinctly 

divided into  an outer cortex, and a  medulla that lies in the center of  the gland, because of  the 

scattered chromaf fin tissue pervaded with islands between the cortical cells (Luo, 1983;

 and

 

Li, Luan, Yue and Zh, 2003). For geese in this study, the parenchyma tissue was intermingled 

with each other, which generally agrees with the description of  avian adrenal gland  provided 

by Unsicker (1973), Aire, (1981) and Cronshaw, Holmes, Ely, and Redondo (1989) for mallard 

duck. 

The present  study also  revealed  that  the parenchyma of  adrenal gland of  Egyptian geese 

consisted of   two types of  cells  intermingled with each other. These cells are acidophilic and 

basophilic  cells.  The  former  cells  is  largely  found  in  the outer  zone of   the  gland, while  the 

latter  type  is  concentrated  in  the  center of   the gland. These  results are  in  agreement with 

Sinha and Ghosh (1961) in pigeon, Ghosh (1962) in avian,  and  with Vyas and Jacob (1976) in 

Indian avian species. In  ostrich  chicks,  the  interrenal  tissues  and  the   t issue   of   the   medulla 

intermingle  with  each other, which generally agrees with  the  description of   other 

avian  species. Beesides, the  adrenal glands of   ostrich chicks appeared to  show 

larger amount  of   interrenal tissue (Li et al., 2009) than other avian species. 

The peripheral zone of  the adrenal gland  is arranged  in clumps  forming  loops  reverse to 

the  capsule, which  is  lined by  columnar  cells which are highly vacuolated  lightly acidophilic 

while  those  of   the  inner  cords  were  large  and  less  vacuolated  but  more  acidophilic.  As 

observed  by T.E.M, there are two types of  cells according to the amount of  lipid droplets and 

mitochondria,  these  finding are  similar  to  those described by Gulmez, Kocamis, Liman and 

Kukner (2004) in goose (Anser Anser); while  in

 parakeet, quail, and myna adrenal it was that 

the  subcapsular  zone  cells  in quail  continued  inside  the  gland  as  a  double‐ layered  central 

201

Page 204: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 204/206

Lucrări Științifice  – vol 53 seria Medicină Veterinară

cords (Bhattcharyya and Ghosh, 1972). The central cords consisted of  high columnar cells with 

nuclei that were localized in adjacent layer of  cells. In parakeets,  they found that subcapsular 

zone  cells  were  vacuolated  and  their  nuclei  were  localized  adjacent  to  the  basement 

membrane. Also,  the cytoplasm of   internal zone cells consisted of  columnar epithelium that 

was dense and basophilic.  In Wanxi white geese, the cell cords  in SCZ were arranged tightly, 

parallel  to  each  other,  and  were  perpendicular  to  the  capsule,  which  consisted  of   high 

columnar cells with a lightly stained cytoplasm and a central nucleus (Wang et al., 1999). The 

arrangement of  these cell cords is similar to those of  the fascicular zone in mammalian adrenal 

gland.The  two  types  of   cells,  found  in  the  center  of   the  gland,  could  be  differentiated 

according  to  the affinity of   their cytoplasm  to  the stain: cells with deeply  

stained  basophilic 

cytoplasmic  granules,  and  cells with  lightly   stained   basophilic  granules. Hodges  (1974)  has 

related  the variation of   the basophilia of  medullary  cells  to  the physiological activity of   the 

cells. In this respect, Telford and Bridgman (1990) showed that there are two cell populations 

in  the  medulla  of   adrenal  gland  of   mammals,  about  80%  of   theswe  cells  synthesize 

epinephrine and the remainder of  the cells produce norepinephrine. In birds, the interrenal or 

cortical  tissue  is of  mesodermal origin and  secretes  the  corticosteroid hormones, while  the chromaf fin  or  medullary  tissue  is  of   ectodermal  origin  and  secretes  adrenaline  and 

noradrenaline (Assenmacher, 1972; and Mori and George,1978). Medullary cells  in duck are 

characterized by a  large population of  electron opaque neurosecretory granules. These cells 

contain  fewer mitochondria  and  cisternae  of   endoplasmic  reticulum  than  the  cortical  cells 

Cronshaw, Holmes and Loeb (1974). In Japanese quails, medullary cells have polyhedral shape 

and centrally  located nucleus. Close to  the centrally  located nucleus, a moderate number of  

mitochondria,  endoplasmic  reticulum  and  well  developed  Golgi  complex  can  be  found. 

Catecholamine‐containing  secretory  granules  in  both  Epinephrine  and Norepinephrine  cells 

are enveloped by a continuous membrane and granules of  Epinephrine are much smaller  in 

size  and more  in  number than that  in  Norepinephrine,  in duck (Klingbeil, Holmes,

 Pearce,

 and  Cronshaw,  1979),  in  avian  (Manna  and Ghosh,  1979)  and  in  quail  Cigankova,  Zibrin, 

Boda, and Holovska, 2005). 

The results of  the present study for Adrenal glands of  Egyptian geese demonstrated that 

the uses of  specific identification techniques (e.g. immunocytochemistry) are required to help 

identify or verify certain of  cell types. 

REFERENCES 

1. 

Aire, T. A.  (1981): Morphometric study of  the avian adrenal gland. J. Anat. 131, 19‐23 

2. 

Assenmacher,  I.  (1972):  The  peripheral  endocrine  glands;  in  I  Farner  and  King,  Avian 

biology, vol.3, pp. 184‐J 287 ,Academic Press, New York. 

3.  Bancroft, J. D.; Cook, H. C.; Stirling, R. W. and Turner, D. R. (1994): Manual of  histological 

techniques and their diagnostic application. 2nd. Churchill Livingston, Edinburgh, London, 

Madrid, Melbourne, New York, and Tokyo. 

4. 

Basha, S.H., Vijayaragavan, C., Ramesh, G., (2004): Light and electron microscopic studies 

on  the  interrenal  tissue  of   the  adrenal  gland  in  Japanese  quail  (Coturnix  coturnix 

 japonica). Indian J. Anim. Sci. 74, 1021–1023. 

5. 

Bhattacharyya, T.K., (1975): Fine structure of  the interrenal cell in the quail and the 

pigeon. Anat. Embryol. (Berl.) 146, 301–310. 

6.  Bhattacharyya, T.K., & Ghosh, A. (1972): Cellular modification of  interrenal tissue induced 

by corticoid therapy and stress in three avian species. Am. J. Anat, 133, 483‐494. 

202

Page 205: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 205/206

Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară Iași 

7.  Chiu, W.; Schmidt, M. F., and Prasad, B. V. V.  (1993): Teaching electron diffraction and 

imaging of  macromolecules. Biophys. J., 64:1610‐1625. 

8. 

Cigankova,  V.,  Zibrin,  M.,  Boda,  K.,  Holovska,  K.,  (2005):  Effect  of   long‐term 

experimental  hypodynamy  on  the  adrenal  glands  of   Japanese  quails:  an  ultrastructural 

study. B. Vet. I. Pulawy 49, 449–453. 

9. 

Cronshaw J,

 Holmes,

 W.

 N.,

 Ely,

 J.

 A.

 and

 Redondo,

 J.

 L.

 (1989):Pre‐natal development of  

the adrenal gland  in  the mallard duck  (Anas platyrhynchos). Cell Tissue Res. 258(3):593‐

601. 

10. Cronshaw, J., Holmes, W. N., Loeb, S. L., (1974): Fine structure of  the adrenal gland in the 

duck (Anas platyrhynchos). Anat. Rec.  180, 385–405. 

11. 

Crossman, G.  (1937): A modification of  mallory connective tissue stain with discussion of  

the principle involved. Anat. Rec. 69, 33‐38. 

12. 

Ghosh, A.  (1962):  A  comparative  study  of   the  histochemistry  of   the  avian  adrenals.  In 

Progress in comparative endocrinology. Gen. Comp. Endocrinol. Suppl. 1:75‐80. 

13. 

Gulmez, N.,  Kocamis,  H.,  Liman, N.,  Kukner,  A.,  (2004):  Interrenal  cell  zonation  in  the 

adrenal gland of  the goose (Anser anser). Growth Dev. Aging 68, 11–18. 14. Hodges, R. D. (1974): The histology of  the fowl. (Endocrine chapter, pp 464:474). Academic 

Press. London, New York, San Francisco. 

15. Klingbeil,  C.K.,  Holmes,  W.  N.,  Pearce,  R.  B.,  and  Cronshaw,  J.  (1979):  Functional 

significance  of   interrenal  cell  zonation  in  the  adrenal  gland  of   the  duck  (Anas 

platyrhynchos). Cell Tissue Res. 2; 201 (1):23‐36. 

16. 

Li, D. X., Luan, W. M., Yue, Zh. P., (2003): Animal Histology and Embryology. Jilin Peo‐ ple’s 

Press, Changchun, pp. 230–231 (in Chinese). 

17.  Li Tang, Peng,k., Wang, J. Luo, H., Cheng, J., Zhang, G., Sun, Y., Liu, H.and Song, H. 

(2009): The morphological study on  the adrenal gland of  African ostrich chicks. 

Tiss. 

And 

cell 

41:231‐

238. 18.  Luo,  K.,  (1983):  Anatomy  and  Histology  of   Domestic  Fowls.  Fukien 

Science Publishers Press, Foochow, pp. 187–189. 

19. Manna,  C.  K,  and  Ghosh,  A.  (1979):  Comparative  cytomorphology  of   the  avian 

adrenocortical tissue. Z Mikrosk Anat Forsch. 93(1):104‐12. 

20. Mori, J. G. and George, J. C.  (1978): Seasonal histological changes  in the gonads, thyroid 

and adrenal of  the Canada goose (Branta canadensis interior). Acta anat. 101: 304‐324. 

21. Pearce, R. B., Cronshaw, J., Holmes, W. N., (1978): Evidence for the zonation of  interrenal 

tissue in the adrenal gland of  the duck (Anas platyrhynchos). Cell Tissue Res.  192, 363–379. 

22. 

Peng, K.M., Chen, Y.X.,  Liang,  Z.S.  (2005) Anatomy of   the Domestic Animals and  Fowls. 

Higher Education Press, Beijing, pp. 286. 

23. 

Siller, W. G., Teague, P. W. and Mackenzie, G. M.  (1975): The adrenal cortico‐medullary 

ratio in the fowl. Br Poult Sci. 16(4):335‐42. 

24. 

Sinha,  D.  and  Ghosh,  A.  (1961):  Some  aspects  of   adrenocortical  cytochemistry  in  the 

domestic pigeon. Endkrinologie 40: 270‐280. 

25. Telford, R. I. and Bridgman, F. C. (1990): Introduction to functional histology. 1st Ed. Harper 

and Eow, Publishers, New York. 

26. 

Unsicker,  K.  (1973):  Fine  structure  and  innervation  of   the  avian  adrenal  gland.  Non‐

cholinergic nerve fibers.  Z. Zellforsch. 145, 557—575 

27. 

Vyas, D. K.,  Jacob, D.  (1976):  Seasonal  study of   the  adrenal gland of   some  Indian  avian 

species. Acta Anat (Basel). 95(4):518‐28. 

28. 

Wang, J.,

 Zhu,

 L.L.,

 Jin,

 G.M.,

 (1999):  Study  on  adrenal  glands  of   Wanxi  white  geese. 

J.Anhui Agric. Techn. Teach. Coll.  13, 1–4. 

203

Page 206: vol_53_2010-1.pdf

7/26/2019 vol_53_2010-1.pdf

http://slidepdf.com/reader/full/vol532010-1pdf 206/206