I embrioni, - trebuie s3 fie imperecheate cu cei rnai buni rnasculi. Se

intensificg prin transferul de embrioni ~i ritmul ameliorgrii efectivelor.

lm~ortanta economicZi a transferului de embrioni rezida in faptul ca

r e obfin rnai multi descendenti valoro.$ rezultati din cupluri cu insugiri

superioare, iar reproducgtorii cei mai buni (masculi gi fernele) sunt folositi I intens la reproductie.

I Transferul de ernbrioni are gi irnportante imwlicatii sanitar-

veterinare ~i genetice. lnteresul genetic se explica prin posibilitatea de a

schimba, far3 risc, genele dorite, regrupate individual, independent de

mediul matern. Tn anumite conditii de rnanipulare, transferul de embrioni

constituie rnijlocul cel mai sigur pe plan sanitar-veterinar de rnutatie a

genelor.

De o mare actualitate, cu implicatii sanitar-veterinare, dar gi

economice, este problerna ernbrionilor purtstori de boli. in cadrul

opera,iunilor de asanare, m i de anirnale contaminate sunt eliminate dln

efectiv prin sucrificare, rezultand astfel pierderi economice imense. 1 Unele cercetari intreprinse de Singh Elizabeth $i col. i n 1982. au

I demonstrat c i ernbrionii recoltati de la animale serologic pozitive gi

transferati la receptoare negative, nu au transmis infectia la produgri

rezultati.

( Din punct de vedere ~tiintific, transferul de embrioni permite

studierea proceselor intime ale reproducerii animalelor, ca gi utilizarea

I unor metode biotehnologice conexe, cum ar fi: micrornanipularea $i

microchirurgia ovulelor $i embrionilor, fertilizarea "in vitro", conservarea

embrionilor pe lunga durata, obtinerea de hirnere, etc. 1 Ca un corolar al activitaei pe plan mondial i n domeniul transferului

de embrioni, stau miirturie importantele consfituiri $i simpozioane

gtiintifice organizate in diferite tari, care au subliniat importanta acestei

biotehnologii. Astfel, i n 1974, in SUA s-a infiintat "International Embryo-

( Transfer Society", care cuprinde speciali~ti din dorrieniu~ transferului de

mblioni la specia umanil pi la animale. In Europa, la paris, in ,982 s-a

ituit "L' Association Europene de Transplantation Embrionairen.

In tara noastra s-au facut lucrgri de transfer de embrioni la taurine

(ICPCB Balotegti. SEZ Tg. Mureg, Facultatea de zootehnie gi ::

Biotehnologii Timigoara), la ovine (SCPCOC Palas, USAM" Cluj-Napoca

$1 Timigoara), la suine (Romsuintest Perig) $1 acestea

i

14.5.2. Napele transferului de embrionj

Transferul de embrioni cuprinde rnai multe &ape.

- alegerea donatoarelor gi receptoarelor,

- preggtirea fernelelor donatoare gi receptoare;

- sincronizarea estrului la femelele donatoare gi femelele

receptoare;

- provocarea poliovulatiei la fernelele donatoare-

- recoltarea embrionilor gi controlul Calitatil lor;

- conservarea embrionilor;

- transferul propriu-zis al embrionilor la fernelele receptoare;

- ingrijirile donatoarei gi receptoarelor dups transfer,

14.5.2.1 .Aleaerea donatoarelor

Alegerea donatoarelor este 0 etapa deoseb~t de importants pentru

reugita transferului de embrioni. in aceasta acthitate se !in, seama de

starea de reproductie a efectivulul d ~ n care provln donatoarele

Princ~palele criterii de selecfie a donatoarelor sunt, rasa, vgrsta

valoarea zootehnica, dezvoltarea corporala armonioasi, starea de

sanatate perfect&. modul de comportare la reproductie, rnodul cum au 1

decurs fgtarile anterioare, rezistenta la boli. etc. Foane importants este

valoarea progesteronemiei, stabilitg in perioada ciclului de control,

inaintea inducerii s~per~vulatiei. De mare actualitate este problems

utilizsrii gi reutilizgrii donatoarelor pe parcursul unuia sau mai mu{tor

consecutivi. Pentru aceasta sunt cercetate posibilitatile de evitare a

imbolnavirilor donatoarelor i n timpul sincronizsrii estrulu~, a provocarii

poliovulatiei, recoltarii embrionilor gi altor operatiuni legate de transferul

de embrioni.

14.5.2.2. Aleaerea receptoarelor.

Cu toate ca, aparent, receptoarele sunt mai ugor de selec!ionat

decat donatoarele, alegerea lor este o problema complexii. Se au in

vedere rnai multe criterii: ,

- este de preferat ca transferul de embrioni sa se fac3 la tineret

femel gi primipare, deoarece la aceste categorii de femele

frecventa infectiilor genitale este rnai redusa, traumatismele

postpartum sunt rnai rare, iar raspunsul la sincronizare este mai

bun;

- starea de sangtate perfects, pentru aceasta fiind obligatoriu

examenul ginecologic;

- starea de intretinere bung pentru a face fat3 solicit3rilor din

timpul gestatiei;

- situatia epizootologic2 a efectivului - bung.

Receptoarele pot avea cslduri naturale sau. induse hormonal. Tn

efectivele mici se recomanda sincronizarea provocat8, iar din efectivele

mari se pot folosi femele cu calduri spontane, urmarite pe parcursul mai

multor cicluri.

Foarte importante sunt: depistarea caldurilor i stabilirea

momentului optim pentru insamintarea donatoarei $i respectiv transferul

propriu-zis la receptoare; este necesars eliminarea receptoarelor care nu

sunt bine sincronizate cu donatoarele.

lnainte de efectuarea transferului gi dups acesta trebuie sa se evite

stresul provocat de schimbarea brusca a regimului de furajare,

,.

rarea animalelor, variaqile - dimatice, actiuni sanitar-veteij~larip,

' .&urata §i intensitatea zilei luminil (ovine).

Scopul acestor m8suri preventive este realizarea unui echilibru

f [

hormonal, metabolic, de histocompatibilitate pentru a pastra calitatea

mediului uterin ce conditioneazg implantarea gi nidatia embrionului.

14.5.2.3, lnducerea poliovulatiei la donatoare.

< B

Principalul factor lirnitativ i n eficacitatea transferului de embrioni

este productia de embrioni. Actualmente se apreciaza c3 30% din i 1 d

donatoare nu produc niciun embrion utilizabil, iar 45% produc in medie 4 1 i embrioni. Aceasta diferentg de rispuns se datoreaza, pe de-o parte,

variabilitstii produselor hormonale utilizate, iar pe de altg parte

! receptivitgtii individuale (Saumande, J. 1980, Buggin, M. 1990). i % Pentru provocarea poliovulatiei la donatoare se pot folosi diferite b 9 scheme de tratament: i - administrarea de PMSG in doz3 unicg sau in doze r.?petate, la t $ diferite intervale de timp, asoc~at cu anticorpi anti-PMSG gi cu ? progesteron; i 3 - folosirea FSH, obtinut din extracte hipofizare de porc;

- utilizarea uor produse comerciale, pure, de FSH $i LH;

- adm~n~strarea de gonadotrop~na corionic3 (HCG), urmats de

PGF2, la 48 ore dupe stimularea hormonala cu HCG.

lndiferent de substantele stimulente utilrzate, eficac~tatea lor

depinde de reactiv~tatea ovarelor donatoarei, de echilibrul neuro-

hormonal $i metabolic al acesteia.

$ :. 14.5.2.4. Sincronizarea estrulur recei~toarelor cu a1 donatoarelor.

i n vederea asigurarii conditiilor optime pentru n ~ d a t ~ e $i dezvoltarea

produsului de conceptie transferat i n organele genitale ale "mamei

adoptive" (femela receptoare) este necesars sincronizarea estrului

acesteia cu al urnarnei naturalen (fernela donatoare). Aceart8 necesitate

decurge din faptul c3 nurnai astfel modificerile aparatului genital al

receptoarei sunt identice cu cele de la niveiul aparatului genital a1

donatoarei.

Exista doue posibilititi de sincronizare a estrului donatoarei cu

receptoarele: naturala gi horrnonala.

Sincronizarea pe cale naturalg este rnai greu de realizat, deoarece

necesita existents unui nurnar mare de femele din care sa fie alese

1(1 receptoarele gi o perioada rnai indelungata de tirnp, in care fernela

donatoare $i viitoarele receptoare sZi fie urrnirite riguros pe parcursul

3 rnai multor cicluri succesive de cilduri.

La ovine, aceasti sincronizare consti in aplicarea "flushing-ului" gi

10 introducerea berbecilor in turma de oi. Flushingtul asigura o rnai buna

rnetabolizare a proteinelor din hrana $i ca urrnare cregte greutatea

hipofizei, care este urmata de intensificarea capacitatii acesteia de a fl sintetiza horrnoni gonadotropi: FSH $i LH. Prezenta berbecilor i n turrna,

prin ferornonii elaborati, stirnuleaza functia de reproductie a oilor

(Signoret, J.P. 1991). DacP, ins& berbecii sunt introdugi prea devrerne in

turrni, inainte ca oile s i fie receptive, atunci prezenta berbecilor poate

avea efecte stimulative doar pentru o parte din oi. in tirnp ce altele i ~ i I

' prelungesc anestrul.

S~ncronizarea caldurilor poate fi obtinuta $i prin utilizarea unor a produse hormonale ca:

- cloprostenol, care este un analog al prostaglandinei PGF2,; a - PGF2, - in doza de 100-1 50pg. de 2 orihi, la intervale de 13-1 5

zile;

- progesteron - administrat intramuscular sau sub forrna de

pesarii (bureti vaginali) rnentinute 1 1-1 2 zile, urrnat de

inocularea a 400-750 U.I. de PMSG.

1 Metoda hormonala de sincronizare a estrului la cele doua categbrii '1

1 fernele, degi este rnai costisitoare, este mai raspindita in practici pi

rezultatele obtinute sunt rnai sigure, rnai bune.

14.5.2.5. Recoltarea embrionilor.

Tehnica pi mornentul recoltarii ernbrionilor variaza in functie de

specie, cunoscindu-se metode nechirurgicale $i rnetode chirurgicale.

Metoda nechirurgicali de recoltare a embrionilor se aplice la

taurine gi ovine gi necesita un instrurnentar adecvat cu ajutorul ciruia se

realizeaz3 spalarea oviductelor $i a coarnelor uterine. Acest procedeu

de recuperare a ernbrionilor din aparatul genital a1 femelei donatoare se i aplica la citeva zile dupa rnornentul fecundatiei, cand embrionii se

gisesc la nivelul segrnentelor respective.

La vaca, aceasts metods se asearnana cu insamantarea spermei

1 prin rnetoda bimanuali, i n timp ce la oaie este necesara endoscopia

precedata de anestezie $ i laparascopie; aceasta metode de recoltare a

i ernbrionilor nu se aplica la scroafa d&torita lungirnii mari a coarnelor

uterine.

Recoltarea ernbrionilor prin rnetode chirurgicale se poate face de la

animale sacrificate sau de la animale vii. Astfel, i n cazul sacrificarii

animalelor, se pot recolta at%t ovule pentru fecundare "in vitro", cat $i

ernbrioni din oviducte sau din coarnele uterine. Aceasti rnetoda nu este

raspandita datorita lmposibilitgtii reutilizgrii donatoarelor.

Recoltarea de la animate vii elirnina acest neajuns, creind

posibilitatea reutilizarii donatoarelor de rnai multe ori. Se face la 4-5 zile

de la fecundare $ i cuprinde urrnatoarele rnomente operatorii: contentia

fernelei i n decubit lateral sau dorsal (in functie de specie); laparatomia

pe linia alb5, aproape de sirnfiza ischic-pubiena; exteriorizarea aparatului

genital; realizarea punctiei cornului uterin cu un ac bont, care face parte

dintr-un crrcuit: oviduct-corn uter~n-canula-cateter-placa de recoltare- 1

pghar colector cu peretii dubli; spillarea cornului uterin; examinarea

embrionilor cu stereolupa; cultivarea sau transferul imediat al

embrionilor; aplicarea unor tratamente postoperatorii pentru prevenirea

infectiilor gi aderenfelor.

14.5.2.6. Examinarea embrionilor.

Dupa recoltare pi p5ni c%nd ace~tia sunt transferati la receptoare

sau conservati, embrionii sunt examina\i pentru a se aprecia viabil~tatea

lor in momentul recoltarii gi gansele ulterioare de a fi transferati.

Examenul embrionilbr & realizeazi i n dou3 etape:

- identificarea gi clasificarea embrionilor;

- aprecierea viabilitgtii embrionilor:

Prima etapa const3 in identificarea gi recuperarea embrionilor din

lichidul de spalare, unul cate unul, cu ajutorul unei lupe binoculare qi a

unei micropipete gi introducerea lor intr-o placa cu mediul de cultura; cel

ma; des utilizat mediu de cultura este PBS (Phosphate Buffered Saline).

Urmeaza clasificarea lor astfel:

- ovocite nefecundate - au membrana pelucida neregulata,

lipsegte conturul celular, apar vacuole gi dispersia rnaterialului

celular;

- embrioni degenerati - caracterizati prin degenerescenla

blastomerelor, aparitia in interiorul membranei pelucide a unei

mase netransparente, nestructurate;

- embrioni normali dezvolta!~ - au blastomerele integre 51 in

numar variabil, in funcfie de momentul recoltarii;

- embrioni retardati - au blastomerele integre, dar ca dezvoltare

nu corespund momentului recoltirii.

Cea de-a doua etap5 gi anume aprecierea viabilitajii embrion~lor

are o mare important3 pentru evitarea factorilor de risc in aparitia gi

. & . ,

nsferuldi, nidatiei $i gestatiei. ,:

Metode utilizate pentru aprecierea viabilitgtii embrionilor sunt: { - aprecierea morfologic~; i 1 - metode biochimice; 5 : - metode histologice;

i - cultura "in vitro".

t in aprecierea morfologica a embrionilor se are in vedere o serie de i

; criterii, cum ar fi: sfericitatea embrionilor, forma gi regularitatea

i embrionului, grosimea, fisurile membranei pelucide, transparenta I ernbrionului, structura lui, conturul celular, variabilitatea taliei celuielor,

/ integritatea celulelor. Pe baza acestor criterii se stabilegte calitatea I

1 embrionilor: excelenti, bung, mijlocie, slaba.

1 Dintre metodele biochimice utilizate amintim: folosirea diacetatului I i i

de fluoroscein5 (devin fluorescente numai celulele vii), determinarea

consumului de glucozA, determinarea lactatdehidrogenazei, care este i I invers propoqional5 cu calitatea embrionilor.

Prin metode histologice se apreciazs ca fiind nesatisfiicatori

embrionii care au celule cu nucleu picnotic.

Pentru cultura "in vitro" a embrionilor, se folose9te mediul PBS, cu

adaos de ser de capri (25%) sau de ser fetal (20%) sau de ser de bou

(20°/0) sau de ser urnan inactivat (20%); acest mediu complex se aduce

la temperatura de 37 OC gi trebuie s i contin3 5% oxigen, 5% dioxid de

carbon, 90*/0 azot.

14.5.2.7. Conserwarea embrionilor

Pentru mentinerea qi prelungirea vrabilititii embrionilor pan8 in

rnomentul transferulu~, se folosesc diferite metode de conservare de

scurti durata gi respectiv de lung4 durats.

Consewarea de hcurta durat. arigurd mentinerea embr~onilor i n

vitro", o perioada variabilG de timp: 9-48 ore, in cazul conservar~i la

temperatura camerei; c ind temperatura este de 37 OC embrion~i i g ~

continua dezvoltarea putind ajunge pan8 in stad~ul de blastoc~st; la

( temperatura de 0-10 OC dezvoltarea embr~on~lor este oprita gi se rela la

37 OC. se folosesc diferite medii de culturfi, dar rata gestatiilor este mai 1 mica decat Tn cazul in care embrionii ar fi transferati imediat dupe

recoltare.

Conservarea de lunaii durata presupune congelarea embrionilor.

Embrionul, spre deosebire de spermatozoid este un ansamblu de celule

bogate in apa gi evolueaza in timp. De aceea, congelarea embrionilor a este un proces mai complex, care impune mdsuri severe pentru evitarea I mortalitatilor.

Tn procesul de crioconservare sunt implicati doi factori:

- evitarea formarii ghetii intracelulare, care prin forrnarea de

cristale mari poate sfi duce la distrugerea membranei

citoplasmatice;

I - evitatarea deshidratarii brutale.

r Pentru evitarea acestor factori daunatori se iau urmatoarele

I masuri:

- asigurarea unei viteze optime de racire. Pentru aceasta,

I embrionul aspirat intr-o paieta de plastic se introduce intr-un

congelator prograrnabil, echilibrat la -7 OC. Apoi temperatura

I scade progresiv cu 0,3 "C, p2na ajunge la -30 OC, dupa care

I paieta cu embrion se introduce in azot lichid la -196 OC.

- utilizarea crioprotectorilor pentru reducerea 9ocurilor osmotice: I

I dimetil sulfoxid (DMSO), glicerol 10% sau propandiol.

Eficienta congelgrii i n paiete se apreciaze prin compararea ratei de

I uupravietuire obtinuta dupa stocare cu cea a ratei utilizsrii embrionilor

I necongelati.

incepdnd cu lucr~rile lui Foley 9i col. (1984), vitrificareq suscits un

I mare interes Tn criobiologie, constituind o nouA cale de crioconservare a

embrionilor, prin care este depA9it obstacolul de formare a cristalelor

mari de gheata, intracelular.

Cu ajutorul vitrificarii, trecerea de la stadiul lichid la cel solid se

realizeaza progresiv, astfel incat, la o temperatura suficient de joasa,

lichidul devine at i t de vascos incit are rigiditatea unui solid.

in cazul metodelor clasice de congelare, concentratiile de

crioprotector sunt prea mici pentru a obtine un stadiu viscos gi la

exteriorul celulelor embrionare. De aici, necesitatea cregterii acestor

concentratii, indiferent de viteza de congelare.

lnconvenientul major al concentratiilor mari de crioprotectori este

toxicitatea acestora pentru embrioni. De aceea, s-a incercat reducerea

acestui efect toxic prin scaderea temperaturii gi a duratei de expunere a

celulelor inainte de congelare gi utilizarea unor amestecuri de

crioprotectori (glicerol+propandiol).

Embrionii aflati in diferite stadii de dezvoltare (morule compacta,

blastocist tsnar, blastocist) sunt aspira!i intr-o paietfi cu mediu de

vitrificare gi depugi intr-o picatura din ace1 rnediu, situat la mijlocul 4 paietei. Picatura cu embrion este separata prin doua bule de aer de o

solutie de sucroza. Paieta se inchide apoi la cele doua capete $1 este

plonjatg progresiv in azot lichid, incep2rrd cu extremitatea dinspre capul

uzinal.

Dupa o duratfi variab~lti de stocaj, paietele sunt scoase d ~ n azotul

lichid pi imersate intr-o baie de ap5 la temperatura de 20 O C , pin8

i d~spare gheata din solutia de sucroza Continutul f~ecerei paiete ~ t e I trecut apoi fntr-o place gi Issat la temperatura camerei tirnp de 5-10 i minute; apoi embrioni~ sunt trecuti de 1-3 ori prin solutie de PBS, inainte

I e a fi pugi in culture sau transferati la receptoare.

i f Y

11'1

74.5.2.8. ~~~~l D ~ ~ ~ ~ ~ - Z I S . I I / efbbn'nndl~r . . la rece~toare,

lntroducerea embrionilor proaspat recoltati sau a celor congelati in

aparatul genital al receptoarelor se poate realiza prin metode

nechirurglcale sau chirurgicale.

Metodele nechirurgicale se aplica la vaca, dupa aceiagi tehnica de

~noculare a spermei, prin metoda recto-vag~nalg.

Metodele chlrurg~cale se aplicg la oaie 81 scroafa $1 constau in

efectuarea laparatomiei pe linia alba, ev~dentierea cornului uterln in care

se va introduce embrionul cu ajutorul unui p~pete de plastic sau a unel

ser~ngi speciale. Locul de depunere a embrionului trebuie s i corespunds

cu dezvoltarea lui gi poate fi treimea posterioara a oviductului sau viirful

cornului uterin

La oale, transferul embr~onilor se face gi prln metoda endoscoplca,

procedindu-se astfel: receptoarea se contenfioneazii i n decub~t dorsal, I

se face toaleta mecanici local3 ~i anestezia localti. Apoi se

punctioneaza abdomenul gi se insufla aer in cavitatea abdorninala. Se

v1zualizeaz3 cornul uter~n corespondent ovarulur cu corp galben $1 se

fixeazii cu o pensi. Se punctioneaza cornul uter~n gi se depune

embrionul la locul corespunzator virstei lur.

14.5.3. Pers~ectivele transferului de embrioni.

Transferul de embrioni va capata o extindere mai mare, deoarece

cu ajutorul lui pot fi studiate procese biologice, cum ar fi: limitele de

hranire ~i adgpostire a produgifor de conceptie in uter, relatiile dintre

embrion-uter-ovar, influenla unor factori genetici gi nutritionali asupra

produsului de conceptie, crearea de linii consangvine, de rase noi.

Biotehnologiile finalizate prin transfer de embrioni cuprind

totalitatea metodelor qi tehnicilor rezultate din integrarea 9tiintelor

biologice, biochimiei, biofizicii, informaticii, in scopul manipularii genetice

a unui embrion, celule embrionare, nucleu, gene, etc. in cadrul acestora

disting o serie de tehnici ca: fecundatia 'in vitro", diagnosticul timpuriu

sexului, rnanipularee &$tic&.

Fecundatia "in vitro" cuprinde o serie de etape: obtinerea i .

ovocitelor, maturarea ovocitelor "in vitro", capacitarea spermatozoizilor,

fecundarea, cultura embrionilor "in vitro", transferul embrionilor.

Sexarea ernbrionilor se poate realiza prin. i 1 - procedeul citogenetic - presupune analiza cariotipului celulelor

trofoblastice, in metafaza, recoltate prin microchirurgie; este 1

traumatizant pentru embrion; ?

j - procedeul imunolog~c - se bazeaza pe prezenta la suprafata b

'i

celulelor mascule a unui antigen de histocompatibilitate, numit

AgH-Y; acesta poate fi evidentiat prin imunofluorescent~ sau cu 1

ajutorul anticorpilor monoclonali anti H-Y; E - procedeul enzimologic - care se bazeaza pe faptul c i unele

enzime celulare sunt codificate de cgtre gene din cromozomul

X; cantitatea acestor enzime este de 2 ori mai mare la celulele b r femele decst la cele mascule, 1

! - determinarea unei secvente de AND speclfics cromozomului Y

ajuta la identificarea embrionilor masculi, cu o precizie de 95%

Biotehnica transferului de embrioni a creat posibilitatea obtinerii

ovulelor gi a embrionilor in stadiile de dezvoltare dorite, pe care apoi se

pot efectua diferite manipulari genetice. Cu ajutorul unui microscop

micromanipulator gi a unor microinstrumente specifice se pot efectua

diferite manopere microchirurgicale, cum ar fi:

d - extractiile de celule embrionare, pronuclei. fragmente de nuclei;

- sectionarea embrionului gi repunerea jumZitelllor rezultate in alte

membrane pelucide; obtinerea de himere, de clone; a - transferul de gene, grupuri de gene, nuclei d~ploizi.