tezĂ de doctorat epidemiologia moleculară și diversitatea ... · aspecte etio-epidemiologice la...

TEZĂ DE DOCTORAT

Epidemiologia moleculară și diversitatea genetică a sușelor de Toxoplasma gondii circulante în România (REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT) Doctorand Anamaria Balea Conducător de doctorat Prof. Dr. Vasile Cozma Membru titular al Academiei de Științe Agricole și Silvice București

Epidemiologia moleculară şi diversitatea genetică a suşelor de Toxoplasma gondii circulante în România

iii

Zoonozele reprezintă un grup de boli cu etiologie variată: bacteriană, virală, fungică sau parazitară, transmisibile de la animale la om (WEISS, 2008). Apariția și evoluția acestor boli este influențată de numeroși factori, cum sunt migrația populațiilor și suprapopularea, surse neadecvate de hrană și apă, intervenția faunei sălbatice și a animalelor de companie, sau chiar dezastrele naturale ori acțiunile militare (CHOMEL și colab., 2007; HOBERG și colab., 2008; WEISS, 2008; WOLFE și colab., 2005). Dintre agenții patogeni transmisibili de la animale la om, cei parazitari clasici, trematode, cestode, pentastomide sau protozoare sunt, majoritatea, zoonotici (KRAUSS și colab., 2003). O situație aparte o prezintă toxoplasmoza, produsă de Toxoplasma gondii, infecție zoonotică omniprezentă, transmisă de la pisica la om prin intermediul alimentelor sau apei contaminate cu oochisturi, sau prin intermediul produselor de origine animală, preponderent carne și lapte ce conțin elemente schizogonice. Parazitul, descoperit în 1908 (NICOLLE și MANCEAUX, 1908), are un ciclu dixen în care intervin felinele ca și gazde definitive și un număr mare de specii de mamifere și păsări ca gazde intermediare. În biologia parazitului pot interveni de asemenea diferite alte tipuri de gazde, cum sunt cele paratenice (râme, Lumbricus rubellus și Perionyn excavatus, BETTIOL și colab., 2000) sau de transport (gândacii de bucătarie, CHINCHILLA și colab., 1994). Deși infecția are distribuție mondială și, probabil, cea mai largă gamă de gazde intermediare, genul Toxoplasma conține o singură specie, Toxoplasma gondii (DUBEY, 2008). La nivel mondial este demonstrată intervenția unui număr mare de specii de animale ca gazde intermediare în ciclul biologic al T. gondii. Dintre acestea enumerăm mamiferele, ca rumegătoarele (ovine, taurine, caprine) (HARTLEY și MARSHALL, 1957; LIN și colab., 1990; JITTAPALAPONG și colab., 2005), porcul, iepurele (LIN și colab., 1990), mamiferele marine consumatoare de pește (vidra de mare, CONRAD și colab., 2005), carnivorele (vulpea, WOLFE și colab., 2001; ratonul, HANCOCK și colab., 2005; câinele, DUBEY și colab., 2008a; coiotul, MARCHIONDO și colab., 1976) sau rozătoarele (Mus musculus, Rattus norvegicus, Apodemus agrarius, A. flavicolis, Marmota monax, Tamiasciurus hudsonicus) (MACHAČOVÁ și colab., 2016; RUIZ și FRENKEL, 1980; BANGARI și colab., 2007). Dintre păsări, infecția este identificată la mai multe specii, ca pescărușul cu picioare galbene (Larus michahellis, CABEZÓN și colab., 2016), vrabia cu penaj arămiu (Zonotrichia capensis, RUIZ și FRENKEL, 1980) sau găina (RUIZ și FRENKEL, 1980). Dintre speciile aparținând familiei Corvidae, infecția este diagnosticată la cioara americană (Corvus brachyrhynchos), stăncuță (Corvus monedula) şi cioara de semănătură (Corvus frugilegus) în Cehia (LITERÁK și colab., 1992), corbul comun (Corvus corax) în Spania (MOLINA-LOPEZ și colab., 2012), cioara neagră de Hawaii (Corvus hawaiiensis) (WORK și colab., 2000) și la diferite specii de ciori (Corvus cornis, Corvus monedula, Corvus splendens) în Israel (SALANT și colab., 2013). La răpitoarele cu pene, T. gondii este raportată la diferite specii de răpitoare din America de Nord (Accipiter cooperii, Aquila chrysaetos, Coragyps atratus, Buteo lineatus, Buteo jamaicensis, Buteo platypterus, Accipiter cooperi, Bubo virginianus, Strix varia, Falco sparverius, Megascops asio) (LINDSAY și colab., 1993; LOVE și colab., 2016) și vulturul cu cap alb (Haliaeetus leucocephalus) (SZABO și colab., 2004). În Europa, infecția este depistată la uliul porumbar (Accipiter gentilis), șorecarul comun (Buteo buteo) și vânturelul roșu (Falco tinnunculus) în Cehia (LITERÁK și colab., 1992),

Anamaria Balea

iv

șorecar comun, huhurez mic (Strix aluco) și strigă (Tyto alba) în Franța (AUBERT și colab., 2008). Deși semnificația medicală a toxoplasmozei este universal recunoscută, există puține date referitoare la răspândirea infecției în țara noastră, preponderent la gazdele intermediare. Există studii care relevă valori diferite, cu caracter regional, a prevalenței la animale destinate consumului uman: 52.8% la capră (IOVU și colab., 2012), între 0.8-97.2% la porc și 16% mistreț (PAŞTIU și colab., 2013; HOTEA și colab., 2010; PETRICEANU și colab., 2007), 37.8-39% la cal (PAŞTIU și colab., 2015), respectiv între 6.5-68.8% la ovine (BONDOC și colab., 2007; HOTEA și colab., 2009, 2011a, 2011b). Carnivorele sălbatice sau ținute în captivitate sunt, de asemenea, purtătoare ale infecției toxoplasmice în țara noastră, aspect demonstrat la vulpe (ŞUTEU și colab., 2014), leu, pisica sălbatică (DĂRĂBUŞ și colab., 2014). Cu toate acestea, nu este cunoscut rolul păsărilor și este mai puțin studiată implicarea carnivorelor sălbatice în epidemiologia toxoplasmozei în România. Prezența infecției la speciile de consum este, de asemenea, un domeniu de interes permanent. În contextul enunțat, au fost abordate două obiective generale: relevarea prevalenței infecției la speciile destinate consumului uman, respectiv clarificarea unor aspecte etio-epidemiologice la specii din fauna silvatică a României. Obiectivele specifice ale tezei de doctorat au fost următoarele: evaluarea prevalenței infecției cu T. gondii la animale domestice (pisici, suine, iezi și bovine) și sălbatice (carnivore, corvide și păsări răpitoare); determinarea corelației între prezența anticorpilor și detectarea T. gondii prin metode directe; izolarea T. gondii; genotiparea izolatelor. Lucrarea cuprinde 147 de pagini şi este structurată pe două părţi: prima parte, stadiul actual al cunoaşterii, iar partea a doua, contribuţia personală. Prima parte a tezei este structurată pe 3 capitole. În capitolul I.1. sunt prezentate aspecte generale privind taxonomia, ciclul biologic şi morfologia T. gondii, precum şi aspecte genetice. În capitolul I.2. sunt prezentate aspecte epidemiologice referitoare la epidemiologia moleculară şi distribuţia genotipurilor de T. gondii la animale domestice şi sălbatice. În capitolul I.3. sunt prezentate metode de detectare indirecte şi directe a T. gondii. Partea a doua a tezei este structurată pe 7 capitole, incluzând ipoteza de lucru/obiective, urmată de cercetările proprii (capitolele II.1.-II.7.), de asemenea cuprinde concluziile generale, originalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei. Capitolul II.1. a avut ca obiectiv determinarea prevalenței infecţiei cu T. gondii, izolarea și caracterizarea din punct de vedere genetic a izolatelor de T. gondii de la pisici domestice din România. Studiul a fost realizat în perioada 2013-2015, pe un număr total de 31 pisici din 4 județe (Alba, Bistrița-Năsăud, Cluj, Argeș) din România.


v

În urma examenului coproparazitologic, au fost identificate oochisturi de T. gondii/H. hammondi la 5 pisici (16.1%; IC 95%: 5.5-33.7) dintre cele 31 examinate. Prin bioprobă şi PCR a fost confirmată prezenţa oochisturilor de T. gondii la 2 pisici dintre cele 5 pozitive la examenul coproparazitologic. Starea clinică generală a celor două pisici a fost modificată. Acestea au prezentat următoarele semne clinice: pisica 1 (3 luni, femelă) a prezentat conjunctivită bilaterală, tulburări respiratorii și diaree; pisica 2 (6 luni, femelă) a prezentat febră, conjunctivită și diaree. Prevalența totală a anticorpilor anti-T. gondii a fost de 60.7% (17/28; IC 95%: 40.6-78.5). În funcție de metoda utilizată, seroprevalența a fost de 57.1% (16/28; IC 95%: 37.2-75.5) prin MAT și 56% (14/25; IC 95%: 34.9-75.6) prin IMMUNOCOMB. Diluția maximă la care au fost detectați anticorpi anti-T. gondii la MAT a fost de 1:384. Comparând rezultatele obținute la MAT și IMMUNOCOMB, a rezultat concordanţă aproape perfectă între la cele 2 metode (k=0.81). Concordanța totală a fost de 93.3%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 85.7%. La ambele metode, 13 probe au fost pozitive și 11 negative. Rezultate discordante au fost obținute la o singură probă, care a fost negativă la MAT şi pozitivă la IMMUNOCOMB. Prin bioprobă au fost obţinute 6 izolate viabile de T. gondii: 2 izolate au provenit de la pisici coproelimiatoare de oochisturi, iar 4 izolate (14.8 %; IC 95%: 4.2-33.7) din cord de la pisici eutanasiate (n=27). În urma analizei PCR a digeratelor de cord, au mai fost identificate 3 probe pozitive, prevalenţa prin această metodă fiind de 25.9% (IC 95%: 11.1-46.3). Comparând rezultatele obţinute la bioprobă cord și PCR digerat cord, a rezultat o concordanță bună între la cele 2 metode (k=0.66). Concordanța totală a fost de 88.9%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 72.7%. La ambele metode, 4 probe au fost pozitive și 20 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 3 probe, care au fost negative la bioprobă și pozitive la PCR. Comparând rezultatele obţinute la serologie și PCR digerat cord, a rezultat o concordanţă redusă între cele 2 metode (k=0.39). Concordanța totală a fost de 66.7%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 60.9%. La ambele metode, 7 probe au fost pozitive și 11 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 9 probe, care au fost pozitive la serologie și negative la PCR. Au fost caracterizate din punct de vedere genetic prin metoda PCR-RFLP, 6 izolate viabile de T. gondii şi cele 3 probe pozitive la PCR. Izolatele viabile au fost denumite TgCatRo1-6. În urma analizei PCR-RFLP, în cazul izolatelor viabile de T. gondii, 5 au aparținut genotipului II și un izolat (TgCatRo5) a aparținut genotipului III. În cazul celor 3 izolate de ADN de T. gondii obținute din digeratele de cord, 2 izolate nu au putut fi genotipate datorită concentrației scăzute de ADN; izolatul genotipat a aparținut genotipului II.

Capitolul II.2. a avut ca obiectiv determinarea prevalenței infecției cu T. gondii, izolarea și caracterizarea din punct de vedere genetic a izolatelor de T. gondii obținute de la suine din România. Studiul a fost realizat în perioada 2011-2013, pe un număr total de 94 suine din sistemul extensiv de creștere din 11 județe (Alba, Brașov, Harghita, Mureș, Sibiu, Bihor, Bistrița-Năsăud, Cluj, Sălaj, Satu Mare, Arad) încadrate în 3 regiuni geografice (centru, nord-vest, vest) din România.

Anamaria Balea

vi

Prevalența anticorpilor anti-T. gondii a fost de 46.8% (44/94; IC 95%: 36.4-57.4). Seroprevalența a fost semnificativ (p=0.006) mai mare în județele Bihor (6/6) și Brașov (2/2), comparativ cu județele Sibiu (0/2) și Sălaj (0/4). În funcție de sex, seroprevalenţa a fost mai mare la masculi (53.3%; IC 95%: 37.9-68.3) decât la femele (40.8%; IC 95%: 27.0-55.8), dar această diferență nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic (p=0.22). Prevalența moleculară a infecției cu T. gondii în cord a fost de 26.6% (25/94; IC 95%: 18.0-36.7). ADN-ul de T. gondii nu a fost detectat la suinele din județele Brașov (0/2) și Mureș (0/2), deși la 3 din cele 4 animale au fost identificați anticorpi anti-T. gondii. Prevalența în funcție de sex a fost similară cu cea obținută la IFAT, mai mare la masculi (28.9%; IC 95%: 16.4-44.3) decât la femele (22.4%; IC 95%: 11.8-36.6), dar nesemnificativă din punct de vedere statistic (p=0.47). De asemenea, prevalența în funcție de categoria de vârstă a fost mai mare la adulte (27%; IC 95%: 13.8-44.1) decât la tineret (24.6%; IC 95%: 14.1-37.8), dar nesemnificativă din punct de vedere statistic (p=0.79). În urma analizei serologice, 44 probe de ser au fost pozitive (IFAT ≥1:32). Probele de cord de la aceste suine au fost analizate prin bioproba pe șoareci. La 4 săptamâni postinoculare, au fost identificate chisturi de T. gondii în creierul șoarecilor inoculați cu probe de la 3 (6.82%; IC 95%: 1.4-18.7) din cele 44 suine. Rezultatele obținute la bioprobă au fost confirmate prin PCR (Tabelul II.2.4.3). Izolatele de T. gondii au provenit de la suine din județele Alba (1/20) și Bihor (2/6), pozitive la IFAT și PCR. Izolatele de T. gondii au fost denumite TgRO-1PBH, TgRO-2PBH și TgRO-3PAB. În urma analizei MS, izolatele de T. gondii au aparținut genotipului II.

Capitolul II.3. a avut ca obiectiv determinarea prevalenței infecției cu T. gondii, izolarea și caracterizarea din punct de vedere genetic a izolatelor de T. gondii obținute de la iezi din România. Studiul a fost realizat în perioada aprilie - mai 2012, pe un număr total de 181 iezi, în vârstă de 3-4 luni, din 7 județe (Alba, Brașov, Mureș, Cluj, Satu Mare, Vâlcea, Hunedoara) încadrate în 4 regiuni geografice (centru, nord-vest, sud-vest, vest) din România. Prevalența anticorpilor anti-T. gondii a fost de 33.1% (60/181; IC 95%: 26.3-40.5). În funcție de județ și regiune, seroprevalența a fost semnificativ mai mare (p<0.0001) în județul Brașov (78.6%; IC 95%: 49.2–95.3) și în regiunea de vest (52.3%; IC 95%: 36.7–67.5). Toate probele provenite de la iezii din județul Vâlcea (n=19) au fost negative. În contrast cu județul Vâlcea, în restul județelor, cel puțin un animal din cele 12 turme a fost seropozitiv. Prevalența moleculară a infecției cu T. gondii în diafragm a fost de 6.1% (11/181; IC 95%: 3.1–10.6). În funcție de județ și regiune, prevalența a fost mai mare în județul Cluj (11.8%; IC 95%: 3.3–27.5) și în regiunile nord-vest (9.8%; IC 95%: 2.7–23.1) și vest (9.1%; IC 95%: 2.5–21.7). ADN-ul de T. gondii DNA a fost detectat la iezii din 6 turme. De asemenea, probele provenite de la iezii din județul Vâlcea (n=19) au fost negative. În urma analizei serologice, 32 probe de ser au fost intens pozitive (ELISA S/P ≥200%). Probele de diafragm provenite de la acești iezi au fost analizate prin bioproba pe șoareci. La 4 săptamâni postinoculare, au fost identificate chisturi de T. gondii în creierul șoarecilor inoculați cu probe de la 2 (6.7%; IC 95%: 0.8-22.1) din cei 32 iezi. Rezultatele obținute la bioprobă au fost confirmate prin PCR. Izolatele de T. gondii au


vii

provenit de la 2 iezi din aceeași turmă din județul Cluj (regiunea nord-vest), pozitivi la ELISA și PCR. Izolatele au fost denumite TgRO-1GK și TgRO-2GK. În urma analizei MS, izolatele de T. gondii au aparținut genotipului II. Comparând rezultatele obţinute la ELISA și PCR a rezultat o concordanţă slabă între cele 2 metode (k=0.11). Concordanța totală a fost de 68.5%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de doar 19.7%. La ambele metode, 7 probe au fost pozitive și 117 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 57 probe, din care 53 au fost pozitive la ELISA și negative la PCR, iar 4 au fost pozitive la PCR și negative la ELISA. Capitolul II.4. a avut ca obiectiv determinarea corelației între prezența anticorpilor specifici și detectarea T. gondii prin metode directe la bovine sacrificate din România. Studiul a fost realizat în perioada 2014-2015, pe un număr total de 100 bovine din sistemul extensiv de creștere din 10 județe (Alba, Harghita, Mureș, Suceava, Bihor, Bistrița-Năsăud, Cluj, Sălaj, Satu Mare, Hunedoara) încadrate în 4 regiuni geografice (centru, nord-est, nord-vest, vest) din România. Prevalența totală a anticorpilor anti-T. gondii a fost de 30% (30/100; IC 95%: 21.2-40.0). În funcție de metoda utilizată, seroprevalența a fost de 25% (25/100; IC 95%: 16.9-34.7) prin MAT și 12% (12/100; IC 95%: 6.4-20.0) prin ELISA. Seroprevalenţa în funcție de categoria de vârstă nu a fost diferită semnificativ din punct de vedere statistic (p=0.66). La majoritatea bovinelor au fost detectați anticorpi anti-T. gondii la MAT la diluția 1:6 și doar 2 bovine au fost pozitive la diluția maximă de 1:100. Comparând rezultatele obţinute la MAT și ELISA, a rezultat o concordanţă slabă între cele 2 metode (k=0.19). Concordanța totală a fost de 75.0%, iar procentul de concordanță pozitivă de 32.4%. La ambele metode, 6 probe au fost pozitive și 69 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 25 probe, din care 19 au fost pozitive la MAT și negative la ELISA, iar 6 au fost pozitive la ELISA și negative la MAT. În urma bioprobei, nu au fost observate semne clinice de toxoplasmoză la șoarecii inoculați. Șoarecii au fost analizați serologic prin MAT pentru detectarea seroconversiei (prezența/absența anticorpilor anti-T. gondii) și prin PCR (creier) pentru detectarea ADN-ului de T. gondii. În urma ambelor metode, șoarecii au fost negativi. De asemenea, la examenul microscopic nu au fost identificate chisturi de T.

gondii în creierul șoarecilor inoculați. Toate probele de digerat (ficat, cord și diafragm) au fost negative prin PCR convențional. În urma analizei MC-PCR, 7 bovine au fost pozitive (15.9%; IC 95%: 5.1-26.7). Acestea au fost negative prin bioprobă și PCR digerat, și doar 3 au fost serologic pozitive prin MAT. O bovină pozitivă la MAT (titru 1:6), nu a fost analizată prin MC-PCR fiind omisă din greșeală. Capitolul II.5. a avut ca obiectiv determinarea prevalenței infecției cu T. gondii, izolarea și caracterizarea din punct de vedere genetic a izolatelor de T. gondii obținute de la carnivore sălbatice din habitate naturale din România. Studiul a fost realizat în perioada 2010-2015, pe un număr de 15 specii din 4 familii (Felidae, Canidae, Mustelidae și Ursidae) de carnivore sălbatice din 28 județe din România.

Anamaria Balea

viii

Prevalența totală a infecției cu T. gondii a fost de 64.02% (274/428; IC 95%: 59.25-68.54) prin MAT și 10.96% (50/456; IC 95%: 8.32-14.29) prin PCR. Cea mai mare seroprevalență a fost obținută la familia Felidae (90.91%; IC 95%: 70.84-98.88), urmată de Mustelidae (76.19%; IC 95%: 60.55-87.95), Canidae (61.22%; IC 95%: 55.96-66.24) și Ursidae (33.33%, IC 95%: 0.84-90.57), diferențele dintre acestea fiind semificative statistic (p=0.007). Diluția maximă la care au fost detectați anticorpi anti-T. gondii a fost de 1:192 la Felidae și Mustelidae și 1:96 la Canidae, iar la Ursidae de 1:6 (Tabelul II.5.4.2). Cea mai mare prevalență moleculară a fost obținută la Mustelidae (19.15%; IC 95%: 9.15-33.26) și Felidae (16%; IC 95%: 4.54-36.08), urmate de Canidae (9.71%; IC 95%: 7.02-13.25), diferențele dintre acestea nefiind semnificative statistic (p=0.18). În urma bioprobei s-au obținut 3 izolate viabile de T. gondii de la Felidae (1 Lynx lynx și 2 Felis silvestris,) confirmate prin PCR (p=0.002). Izolatele au fost denumite TgLlRo1 (Lynx lynx) și TgFsRo1-2 (Felis silvestris). Izolatele au provenit de la animale serologic pozitive, excepție izolatul TgFsRo2, care nu a fost analizat prin MAT. Comparând rezultatele obţinute la MAT și PCR a rezultat o concordanţă slabă între la cele 2 metode (k=0.02). Concordanța totală a fost de 40%, iar procentul de concordanță pozitivă de 17.9%. La ambele metode, 28 probe au fost pozitive și 143 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 257 probe, din care 246 au fost pozitive la MAT și negative la PCR, iar 11 au fost pozitive la PCR și negative la MAT. Comparând rezultatele obţinute la MAT și bioprobă a rezultat o concordanţă slabă între cele 2 metode (k=0.06). Concordanța totală a fost de 31.8%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 21.1%. La ambele metode, 2 probe au fost pozitive și 5 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 15 probe, care au fost pozitive la MAT și negative la bioprobă. Comparând rezultatele obţinute la PCR și bioprobă a rezultat o concordanţă moderată între cele 2 metode (k=0.34). Concordanța totală a fost de 82.8%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 44.4%. La ambele metode, 2 probe au fost pozitive și 22 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 5 probe, din care 3 au fost pozitive la PCR și negative la bioprobă, iar 2 pozitive la bioprobă și negative la PCR. Izolatul TgLlRo1 nu a putut fi genotipat datorită cantității scăzute de ADN. Izolatul a fost inoculat pe culturi celulare pentru multiplicarea parazitului. De asemenea, 5 izolate de ADN au putut fi genotipate. În total, 7 probe (2 izolate viabile și 5 izolate de ADN) au fost genotipate. În urma analizei PCR-RFLP, izolatele de T. gondii au aparținut genotipului II.

Capitolul II.6. a avut ca obiectiv evaluarea prevalenței infecției cu T. gondii la păsări din familia Corvidae prin metode serologice și moleculare. Studiul a fost realizat în perioada 2013-2015, pe un număr de 5 specii din familia Corvidae din 8 județe (Alba, Brașov, Covasna, Bihor, Cluj, Ilfov, Buzău, Tulcea) din România. Prevalența totală a anticorpilor anti-T. gondii a fost de 70.87% (236/333; IC 95%: 65.62-75.63) prin MAT. În funcție de specie, prevalența a fost de 48.1% la C. monedula, 72.8% la C. frugilegus, 89.7% la C. cornix, 77.5% la P. pica și 42.9% la G. glandarius. Diluția maximă la care au fost detectați anticorpi anti-T. gondii a fost de 1:192 la C. frugilegus. Diferențele între prevalențe au fost semnificative statistic (p=0.0001).


ix

În urma analizei PCR, ADN-ul de T. gondii a fost detectat în 3 (1.23%; IC 95%: 0.25-3.55) din cele 244 probe de cord analizate. Probele pozitive au fost obținute de la cioara de semănătură (C. frugilegus) (1/106), cioara grivă (C. cornix) (1/39) și coțofană (P. pica) (1/40). Cele 3 corvide au fost pozitive atât la MAT, cât și la PCR. Probele au provenit din județele Brașov (C. frugilegus), Tulcea (C. cornix) și Alba (P. pica). Diferențele între prevalențe nu au fost semnificative statistic (p=0.75). În urma secvenţierii, cele 3 izolate de ADN de T. gondii au aparținut genotipului III. Izolatele au fost similare 100% cu genotipul III (sușa VEG, GenBank LN714498.1). Comparând rezultatele obţinute la MAT și PCR a rezultat o concordanţă slabă între la cele 2 metode (k=0.01). Concordanța totală a fost de 35.3%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 3.7%. La ambele metode, 3 probe au fost pozitive și 83 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 158 probe, care au fost pozitive la MAT și negative la PCR. Capitolul II.7. a avut ca obiectiv determinarea prevalenței infecției cu T. gondii la diferite specii de păsări răpitoare din România. Studiul a fost realizat în perioada 2010-2015, pe un număr total de 11 specii din 3 familii (Accipitridae, Falconidae și Strigidae) de păsări răpitoare din 13 județe (Alba, Brașov, Covasna, Mureș, Bihor, Cluj, Maramureș, Ilfov, Teleorman, Buzău, Constanța, Tulcea, Vrancea) din România. Prevalența anticorpilor anti-T. gondii a fost de 75.8% (95% IC: 57.74-88.91) prin MAT și 12.1% (95% IC: 3.40-28.20) prin IMMUNOBLOT. Diluția maximă la care au fost detectați anticorpi anti-T. gondii la MAT a fost de 1:48. În funcție de familie, prevalența a fost mai mare la Accipitridae (82.35%; IC 95%: 56.57-96.20) decât la Strigidae (73.33%; IC 95%: 44.90-92.12) prin MAT. Prevalențele au fost similare la Accipitridae (11.76%; IC 95%: 1.46-36.44) și Strigidae (13.33%; IC 95%: 1.66-40.46) prin IMMUNOBLOT. Prevalența moleculară a infecției cu T. gondii a fost de 18.5% (IC 95%: 9.25-31.43) prin PCR. În funcție de familie, prevalența a fost similară la Accipitridae (20.83%; IC 95%: 7.13-42.15) și Strigidae (17.86%; IC 95%: 6.06-36.89). În cazul familiei Falconidae, cele 2 păsări analizate (Falco tinnunculus și Falco

peregrinus) au fost negative la infecția cu T. gondii. Diferențele între prevalențe nu au fost semnificative statistic dependent de familie sau specie (p>0.05). Comparând rezultatele obţinute la MAT și IMMUNOBLOT a rezultat o concordanţă slabă între cele 2 metode (k=0.08). Concordanța totală a fost de 36.4%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 27.6%. La ambele metode, 4 probe au fost pozitive și 8 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 21 probe, care au fost pozitive la MAT și negative la IMMUNOBLOT. Comparând rezultatele obţinute la MAT și PCR a rezultat o concordanţă slabă între cele 2 metode (k=0.16). Concordanța totală a fost de 45.5%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 43.6%. La ambele metode, 7 probe au fost pozitive și 8 negative. Rezultate discordante au fost obținute la 18 probe, care au fost pozitive la MAT și negative la PCR. Comparând rezultatele obţinute la IMMUNOBLOT și PCR a rezultat o concordanţă slabă între cele 2 metode (k=0.03). Concordanța totală a fost de 72.7%, iar procentul de concordanță pozitivă între cele 2 metode a fost de 18.2%. La ambele metode, o probă a fost pozitivă și 23 negative. Rezultate discordante au fost obținute la

Anamaria Balea

x

9 probe, din care 3 au fost pozitive la IMMUNOBLOT și negative la PCR, iar 6 au fost pozitive la PCR și negative la IMMUNOBLOT. În urma bioprobei, s-a obținut 1 izolat de T. gondii (denumit TgSaRo1) de la specia Strix aluco. Prezența T. gondii a fost confirmată prin imunofluorescență utilizând anticorpi anti-TgSAG1. În urma analizei culturilor celulare, a fost evidențiată coinfecția cu Sarcocystis spp., confirmată și la examenul histopatologic (chisturi de Sarcocystis spp.). În urma analizei PCR-RFLP, izolatul TgSaRo1 a aparținut genotipului II. CONCLUZII GENERALE Studiile privind epidemiologia moleculară și diversitatea genetică a sușelor de

Toxoplasma gondii circulante în România, realizate în perioada 2010-2015, la USAMV CN - Disciplina de Parazitologie și Boli Parazitare, pe un număr total de 1249 animale, din care 406 domestice (4 specii) și 843 sălbatice (31 specii), au generat următoarele concluzii: Seroprevalența infecției cu T. gondii la animale domestice și sălbatice a fost de 30% la bovine, 33.1% la iezi, 46.8% la suine, 60.7% la pisici, 64.02% la carnivore sălbatice (Felidae, Canidae, Mustelidae, Ursidae), 70.87% la corvide (Corvus frugileus, Corvus monedula, Corvus cornix, Pica pica, Garrulus glandarius) și 75.8% la păsări răpitoare (Accipitridae, Falconidae, Strigidae). Prin PCR, ADN-ul de T. gondii a fost detectat în fecale la 6.5% dintre pisici, iar coproscopic prevalența infecțiilor cu T. gondii/H. hammondi a fost de 16.1%. Prevalența moleculară a infecției cu T. gondii prin PCR în țesuturi la animale domestice și sălbatice a fost de 0% la bovine, 1.2% la corvide (Corvus frugilegus,

Corvus cornix, Pica pica), 6.1% la iezi, 10.96% la carnivore sălbatice (Felidae, Canidae, Mustelidae), 18.5% la păsări răpitoare (Accipitridae, Strigidae), 25.9% la pisici și 26.6% la suine. Prin MC-PCR, prevalența ADN-ului de T. gondii în diafragm la bovine a fost de 15.9%. Prin bioproba pe șoareci, linia CD1, au fost obținute 15 izolate viabile de T.

gondii: 6 de la pisici domestice – TgCatRo1, TgCatRo2, TgCatRo3, TgCatRo4, TgCatRo5 TgCatRo6; 3 de la suine - TgRO-1PBH, TgRO-2PBH, TgRO-3PAB; 2 de la iezi - TgRO-1GK, TgRO-2GK; 3 de la carnivore sălbatice - Lynx lynx (TgLlRo1), Felis silvestris (TgFsRo1, TgFsRo2); 1 de la păsări răpitoare - Strix aluco (TgSaRo1).

Corelația între metodele de detectare directă și indirectă a fost variabilă, cu sau fără semnificație statistică, în funcție de specia analizată și metodele utilizate. Prin genotiparea izolatelor de T. gondii au fost evidențiate, prioritar în România, genotipurile II (la pisici, suine, iezi, carnivore sălbatice - Felis silvestris, Vulpes

vulpes, Mustela nivalis, și păsări răpitoare – Strix aluco) și III (la pisici și corvide - Corvus frugilegus, Corvus cornix, Pica pica).


xi

În ceea ce privește riscul contaminării umane prin consum de carne de la speciile de animale domestice analizate, rezultatele obținute au evidențiat un risc important al cărnii de porc și ied, dar nu au demonstrat cert riscul zoonotic al cărnii de bovine. Lucrarea se încheie cu lista bibliografică (267 de referințe bibliografice).

Anamaria Balea

xii

BIBLIOGRAFIA 1. AUBERT, D., TERRIER, M.E., DUMÈTRE, A., BARRAT, J., VILLENA, I., 2008, Prevalence of Toxoplasma gondii in raptors from France, J Wildl Dis, 44(1):172-3. 2. BANGARI, D.S., MOUSER, P., MILLER, M.A., STEVENSON, G.W., VEMULAPALLI, R., THACKER, H.L., 2007, Toxoplasmosis in a woodchuck (Marmota monax) and two American red squirrels (Tamiasciurus hudsonicus), J Vet Diagn Invest, 19(6):705-9. 3. BETTIOL, S.S., OBENDORF, D.L., NOWARKOWSKI, M., MILSTEIN, T., GOLDSMID, J.M., 2000, Earthworms as paratenic hosts of toxoplasmosis in eastern barred bandicoots in Tasmania, J Wildl Dis, 36(1):145-8. 4. BONDOC, I., ASIMINEI, S., ANTOCI, R. 2007, Immunoenzymatic study regarding the incidence of toxoplasmosis at some species of animals, Revista Română de Parazitologie, XVII(1):19-22. 5. CABEZÓN, O., CERDÀ-CUÉLLAR, M., MORERA, V., GARCÍA-BOCANEGRA, I., GONZÁLEZ-SOLÍS, J., NAPP, S., RIBAS, M.P., BLANCH-LÁZARO, B., FERNÁNDEZ-AGUILAR, X., ANTILLES, N., LÓPEZ-SORIA, S., LORCA-ORÓ, C., DUBEY, J.P., ALMERÍA, S., 2016, Toxoplasma gondii Infection in Seagull Chicks Is Related to the Consumption of Freshwater Food Resources, PLoS One, 11(3):e0150249. 6. CHINCHILLA, M., GUERRERO, O.M, CASTRO, A., SABAH, J., 1994, Cockroaches as transport hosts of the protozoan Toxoplasma gondii, Rev Biol Trop, 42(1-2):329-31. 7. CHOMEL, B.B., BELOTTO, A., MESLIN, F.X., 2007, Wildlife, Exotic Pets, and Emerging Zoonoses, Emerg Infect Dis, 13(1): 6–11. 8. CONRAD, P.A., MILLER, M.A., KREUDER, C., JAMES, E.R., MAZET, J., DABRITZ, H., JESSUP, D.A., GULLAND, F., GRIGG, M.E., 2005, Transmission of Toxoplasma: clues from the study of sea otters as sentinels of Toxoplasma gondii flow into the marine environment, Int J Parasitol, 35(11-12):1155-68. 9. DĂRĂBUŞ, G., AFRENIE, M., HOTEA, I., IMRE, M., MORARIU, S., 2014, Endoparasites in mammals from seven zoological gardens in Romania, J Zoo Wildl Med, 45(2):239-46. 10. DUBEY, J.P., 2008, The History of Toxoplasma gondii – The First 100 Years, J Eukaryot Microbiol, 55(6):467–75. 11. DUBEY, J.P., STONE, D., KWOK, O.C., SHARMA, R.N., 2008, Toxoplasma gondii and Neospora caninum antibodies in dogs from Grenada, West Indies, J Parasitol, 94(3):750-1. 12. HANCOCK, K., THIELE, L.A., ZAJAC, A.M., ELVINGERT, F., LINDSAY, D.S., 2005, Prevalence of antibodies to Toxoplasma gondii in raccoons (Procyon lotor) from an urban area of Northern Virginia, J Parasitol, 91(3):694-5. 13. HARTLEY, W.J., MARSHALL, S.C., 1957, Toxoplasmosis as a cause of ovine perinatal mortality, N Z Vet J, 5:119–124. 14. HOBERG, E.P., POLLEY, L., JENKINS, E.J., KUTZ, S.J., VEITCH, A.M., ELKIN, B.T., 2008, Integrated Approaches and Empirical Models for Investigation of Parasitic Diseases in Northern Wildlife, Emerg Infect Dis, 14(1):10–17. 15. HOTEA, I., DĂRĂBUŞ, GH., ILIE, M.., IMRE, K., OPRESCU, I., MORARIU, S. MEDERLE, N., 2009, The identification of Toxoplasma gondii infection in sheep by ELISA from Arad County, Lucrări Știinţifice Medicină Veterinară Timişoara, Vol. XLII (1):16–21. 16. HOTEA, I., DĂRĂBUŞ, GH., ILIE, M.S., IMRE, K., BALINT, A., INDRE, D., IMRE, M., SORESCU, D., CIOCAN, R., COSTINAR, L., PASCU, C., 2010, Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection in pigs reared in intensive system from Timis County, Lucrări Știinţifice Medicină Veterinară Timişoara, VOL. XLIII (1): 68–72.


xiii

17. HOTEA, I., ILIE, M., IMRE, M., SORESCU, D., DĂRĂBUŞ, GH., 2011a, Determining of toxoplasmosis seroprevalence, by ELISA, in lambs in Timis County, Lucrări Știinţifice Medicină Veterinară Iași, Vol. 54(1):161–164. 18. HOTEA, I., OPRESCU, I., ILIE, M., IMRE, K., DĂRĂBUŞ, GH., 2011b, Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection, by ELISA, in rams in Timis County, Lucrări Știinţifice Medicină Veterinară Iași, Vol. 54(3):325–328. 19. IOVU, A., GYÖRKE, A., MIRCEAN, V., GAVREA, R., COZMA, V., 2012, Seroprevalence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum in dairy goats from Romania, Vet Parasitol, 186(3-4):470-4. 20. JITTAPALAPONG, S., SANGVARANOND, A., PINYOPANUWAT, N., CHIMNOI, W., KHACHAERAM, W., KOIZUMI, S., MARUYAMA, S., 2005, Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection in domestic goats in Satun Province, Thailand, Vet Parasitol, 127(1):17-22. 21. KRAUSS, H., WEBER, A., APPEL, M., ISENBERG, H.D., SCHIEFER, H.G., SLENCZKA, W., VON GRAEVENITZ, A., ZAHNER, H., 2003, Zoonoses: Infectious Diseases Transmissible from Animals to Humans, 3rd Edition, ASM Press, Washington, DC, 456 pp. 22. LIN, S., LING, Z.C., ZENG, B.C., YANG, H.Y., 1990, Prevalence of Toxoplasma gondii infection in man and animals in Guangdong, Peoples Republic of China, Vet Parasitol, 34(4):357-60. 23. LINDSAY, D.S., SMITH, P.C., HOERR, F.J., BLAGBURN, B.L., 1993, Prevalence of encysted Toxoplasma gondii in raptors from Alabama, J Parasitol, 79(6):870-3. 24. LITERÁK, I., HEJLÍČEK, K., NEZVAL, J., FOLK, Č., 1992, Incidence of Toxoplasma gondii in populations of wild birds in the Czech Republic, Avian Pathol, 21(4):659-65. 25. LOVE, D., KWOK, O.C., VERMA, S.K., DUBEY, J.P., BELLAH, J., 2016, Antibody Prevalence and Isolation of Viable Toxoplasma gondii from Raptors in the Southeastern USA, J Wildl Dis, 52(3):653-6. 26. MACHAČOVÁ, T., AJZENBERG, D., ŽÁKOVSKÁ, A., SEDLÁK, K., BÁRTOVÁ, E., 2016, Toxoplasma gondii and Neospora caninum in wild small mammals: Seroprevalence, DNA detection and genotyping, Vet Parasitol, 223:88-90. 27. MARCHIONDO, A.A., DUSZYNSKI, D.W., MAUPIN, G.O., 1976, Prevalence of antibodies to Toxoplasma gondii in wild and domestic animals of New Mexico, Arizona and Colorado, J Wildl Dis, 12(2):226-32. 28. MOLINA-LÓPEZ, R., CABEZÓN, O., PABÓN, M., DARWICH, L., OBÓN, E., LOPEZ-GATIUS, F., DUBEY, J.P., ALMERÍA, S., 2012, High seroprevalence of Toxoplasma gondii and Neospora caninum in the Common raven (Corvus corax) in the Northeast of Spain, Res Vet Sci, 93(1):300-2. 29. NICOLLE, C., MANCEAUX, L., 1908, Sur une infection à corps de Leishman (ou organismes voisins) du gondi, C R Seances Acad Sci, 147:763–766. 30. PAŞTIU, A.I., GYÖRKE, A., BLAGA, R., MIRCEAN, V., ROSENTHAL, B.M., COZMA, V., 2013, In Romania, exposure to Toxoplasma gondii occurs twice as often in swine raised for familial consumption as in hunted wild boar, but occurs rarely, if ever, among fattening pigs raised in confinement, Parasitol Res, 112(6):2403-7. 31. PAŞTIU, A.I., GYÖRKE, A., KALMÁR, Z., BOLFĂ, P., ROSENTHAL, B.M., OLTEAN, M., VILLENA, I., SPÎNU, M., COZMA, V., 2015, Toxoplasma gondii in horse meat intended for human consumption in Romania, Vet Parasitol, 212(3-4):393-5. 32. PETRICEANU, G., GUŢU, E., RĂDULESCU, R.A., RAGALIE, A., TĂNĂSUICĂ, R., 2007, The prevalence of serological diagnosed toxoplasmosis cases in animals from Romania between 2006 and 2007 years, Institutul de Diagnostic si Sanatate Animala Bucuresti 1, 1–14. 33. RUIZ, A., FRENKEL, J.K., 1980, Intermediate and transport hosts of Toxoplasma gondii in Costa Rica, Am J Trop Med Hyg, 29(6):1161-6.

Anamaria Balea

xiv

34. SALANT, H., HAMBURGER, J., KING, R., BANETH, G., 2013, Toxoplasma gondii prevalence in Israeli crows and Griffon vultures, Vet Parasitol, 191(1-2):23-8. 35. ŞUTEU, O., MIHALCA, A.D., PAŞTIU, A.I., GYÖRKE, A., MATEI, I.A., IONICĂ, A., BALEA, A., OLTEAN, M., D'AMICO, G., SIKÓ, S.B., IONESCU, D., GHERMAN, C.M., COZMA, V., 2014, Red foxes (Vulpes vulpes) in Romania are carriers of Toxoplasma gondii but not Neospora caninum, J Wildl Dis, 50(3):713-6. 36. SZABO, K.A., MENSE, M.G., LIPSCOMB, T.P., FELIX, K.J., DUBEY, J.P., 2004, Fatal toxoplasmosis in a bald eagle (Haliaeetus leucocephalus), J Parasitol, 90(4):907-8. 37. WEISS, L.M., 2008, Zoonotic Parasitic Diseases: Emerging issues and Problems, Int J Parasitol, 38(11):1209–1210. 38. WOLFE, A., HOGAN, S., MAGUIRE, D., FITZPATRICK, C., VAUGHAN, L., WALL, D., HAYDEN, T.J., MULCAHY, G., 2001, Red foxes (Vulpes vulpes) in Ireland as hosts for parasites of potential zoonotic and veterinary significance, Vet Rec, 149(25):759-63. 39. WOLFE, N.D., DASZAK, P., KILPATRICK, A.M., BURKE, D.S., 2005, Bushmeat Hunting, Deforestation, and Prediction of Zoonotic Disease, Emerg Infect Dis, 11(12):1822–1827. 40. WORK, T.M,, MASSEY, J.G., RIDEOUT, B.A., GARDINER, C.H., LEDIG, D.B., KWOK, O.C., DUBEY, J.P., 2000, Fatal toxoplasmosis in free-ranging endangered 'Alala from Hawaii, J Wildl Dis, 36(2):205-12.

tezĂ de doctorat epidemiologia moleculară și diversitatea ... · aspecte etio-epidemiologice la...

Documents