TEMA 23: PRINCIPIILE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR AL INFECIILOR DE ETIOLOGIE VIRAL

1. Virusurile. Natura. Particularitile biologice. Taxonomia i clasificarea.

Reprezint structuri acelulare cu potenial infeciosDimensiuni de rangul nm (20-400 nm)Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN)Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazii obligai intracelulariNu cresc i nu se divid, se reproduc n celule vii Nu cultiv pe medii artificiale, numai pe celule viiRezisten natural la antibiotice

CLASIFICAREA VIRUSURILORDup tipul AN (cu genom ARN/ADN)Dup dimensiuni (mici 20-50 nm, medii 50-150 nm, mari peste 150 nm)Dup tipul de simetrie a capsidei (helicoidal, cubic, mixt)Dup compozitia chimic (simple, complexe) Dup gazd (om, animal, insect, bacterie)Dup sensibilitatea n mediul extern, substane chimice, etc

Order (-virales) Family (-viridae) Subfamily (-virinae) Genus (-virus) Species (-virus)

Virusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, PoxviridaeVirusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, RetroviridaeVirusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, FiloviridaeVirusuri ARNd.c. : ReoviridaeVirion unitate structural infecioas a virusului Viroid ARNm.c., circular, asociat cu boli la plantePrion protein termostabil infecioas, cauzeaz la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi

2. Forma, compoziia chimic i structura virionului. Noiuni generale de viroizi i prioni.

COMPOZIIA CHIMIC I STRUCTURA VIRIONULUIVirusurile simple acid nucleic (AN) i nveli proteic capsida (ansamblu numit nucleocapsid)Virusurile complexe nucleocapsid i un nveli extern, lipoglicoproteic (supercapsid, peplos)Acidul Nucleic ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, liniar, circular sau fragmentat.ARN monocatenar : ARN+ (caten cu sens, funcie de ARNm) sau ARN- (caten fr sens, este necesar prezena enzimei polimeraza)Funcia AN asigurarea replicrii i expresia genomului pentru sinteza proteinelor virale

I: Double-stranded DNA (e.g. Adenoviruses, Herpesviruses, Poxviruses) II: Single-stranded (+) sense DNA (e.g. Parvoviruses) III: Double-stranded RNA (e.g. Reoviruses) IV: Single-stranded (+) sense RNA (e.g. Picornaviruses, Togaviruses) V: Single-stranded (-) sense RNA (e.g. Orthomyxoviruses, Rhabdoviruses) VI: Single-stranded (+) sense RNA with DNA intermediate in life-cycle (e.g. Retroviruses) VII: Double-stranded DNA with RNA intermediate (e.g. Hepadnaviruses)

Capsida format din uniti proteice, capsomere, aranjate simetric.Simetrie helicoidal capsomerele se fixeaz pe catena de AN, form de bastonaSimetrie cubic (icosaedric) capsomerele se aranjeaz n jurul AN, formnd un icosaedru (poliedru regulat cu 20 fee triunghiulare i 12 vrfuri), eikos=20Simetrie mixt (bacteriofagii, poxvirusurile)Funcia capsidei protecia AN, rol antigenic, adeziune

Supercapsida structur glucido-lipido-proteic, derivat din membrana celulei gazd. Lipidele provin din membrana celular, iar glicoproteinele sunt de origine viral (ex.: hemaglutinina, neuraminidaza)Funcie protecie, antigene de suprafa, adeziuneUnele virusuri conin enzime polimeraze, transcriptaze, etc.

Aciunea factorilor fizici, chimiciVirusurile sunt foarte sensibile la cldur, desicare, raze UV. Detergenii i solvenii inactiveaz virusurile cu supercapsid. Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80C

3. Multiplicarea (replicarea virusurilor). Fazele i etapele ciclului replicativ viral.

REPRODUCEREA VIRUSURILORI ADSORBIA virusului la celula-gazd prin intermediul receptorilor specifici (tropism)II PENETRAREA virusului n celulPinocitoz (viropexis) Fuziunea membranelorTranslocareInjectarea AN n citoplasm (bacteriofagii)III DECAPSIDAREA ( cu enzime celulare). Din acest moment urmeaz faza de eclips.IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor i replicarea AN)Are loc n citoplasm (virusuri cu ARN) sau n nucleul celulei (virusuri cu ADN)Biosinteza virusurilor ADNADNdc -> transcrierea ARNm -> replicarea, translaia (precoce, tardiv) -> sinteza proteicBiosinteza virusurilor ARN ARN+ -> replicare, translaie -> sinteza proteicARN- -> transcriere ARNm -> replicare, translaie -> sinteza proteic Retrovirusuri (ARN+) -> transcriere -> ADN- -> ADNdc -> transcriere -> ARNm -> replicare, translaie, sinteza pr. (sau integrare n cromosom)

V. MORFOGENEZA (asamblarea) i maturizarea virionilorProteinele capsidale particip la formarea nucleocapsidei (n nucleu sau citoplasm) iar glicoproteinele sunt inserate n MCP, substituind proteinele celulare. n aceast faz apar incluziunile virale sau corpusculii elementari.VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, nmugurire, exocitoz). Nr lor poate atinge 100.000 per/celulCiclul reproductiv viral are durata variabil de la cteva ore pn la cteva zile (ex.: 8h poliovirus, 72h citomegalovirus).Interferena viral fenomen n care, consecutiv infeciei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibat (virus interferat / virus interferent)

RELAII VIRUS-CELULA GAZDInfecie viral productiv, citocidVirusul este infecios iar celula permisiv (receptiv). La nivelul ma/o corespunde infeciilor acute, aparente sau inaparente (grip, rujeol ...)Infecii virale persistente Celulele infectate supravieuiesc, cu producerea permanent sau intermitent a virusului.1. Infecii abortive (cu virioni defectivi) infecia nu se exprim, are loc transformarea celulelor prin proteine virale. Ele devin int pentru efectorii imunitii (macrofage, T-limfocite) n cursul unor infecii cronice (PESS post-rujeolic)

2. Infecii integrate (virusuri ADN sau copii de ADN ale Retrovirusurilor). Consecine:Transformarea malign a celulei gazd Infecii lente - manifestarea infeciei dup o perioad de incubaie ndelungat cu expresia integral a genomului viral (ex.: HIV-SIDA) Infecii latente - reactivri ocazionale, repetate ale infeciei cu exprimarea integral a informaiei genetice virale (ex.: infecia herpetic) Infecii cronice perioade de remisie i acutizare, virusul este prezent permanent, chiar n absena simptomelor (ex.: hepatita viral B)

4. Metodele de cultivare a virusurilor: pe animale de laborator. Selectarea animalelor, cile de infectare. Avantajele i dezavantajele metodei; n ou embrionate de gin. Structura oului embrionat de gain. Metodele de inoculare (nchis i deschis). Avantajele i dezavantajele metodei; n culturi celulare. Tipurile de culturi de celule. Infectarea culturilor de celule.

CULTIVAREA VIRUSURILORVirusurile sunt cultivate pentru:Stabilirea diagnosticului etiologicTestarea infeciozitii virusurilorTestarea preparatelor antiviraleProducerea vaccinurilorSISTEME DE CULTIVARECulturi de celuleOu embrionat de ginAnimale de laborator

Animalele de laborator se utilizeaz limitat (receptivitate selectiv, preexistena infeciilor, cost avansat). Se recurge numai cnd nu exist alte posibiliti (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent oriceii albi nou-nscui, dar pot fi utilizai obolani, cobai, maimue, etc. Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infeciile bacteriene.

Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nedifereniate, cu multiplicare activ, steril i lipsit de mijloace de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)- Iniial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop n camera obscur. Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe membrana chorioalantoidean (utiliznd metoda deschis sau nchis). Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 35-37C timp de 48-72 ore

Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins). Celule provenite din esuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale. Plasate ntr-un mediu adecvat (nutrieni, pH, t) rmn viabile i se multiplic. Pentru cultivarea virusurilor se utilizeaz culturile n monostrat celular.Tipurile de culturi de celule (CC):Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obinute din esuturi adulte sau embrionare de origine animal sau uman. Suport 4-6 pasaje (subcultivri)Culturi diploide. Obinute din esut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaii Linii continui de celule. Obinute din esut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.HeLa carcinom de col uterinKB tumoare a rinofaringeluiHep-2 tumoare canceroas a laringelui

Obinera culturilor de celule primar tripsinizate:Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu)Fragmentarea i splarea cu sol. fiziologicDezagregarea tisular cu enzime proteolitice (tripsina)Separarea celulelor prin centrifugareDozarea suspensiei - 105 106 celule/ml ntroducerea celulelor n mediu nutritiv i repartizarea n recipiente sterileIncubarea pn la formarea monostratului celular (inhibiie de contact)Monostratul poate fi infectat cu virus sau servete drept surs de celule pentru o nou cultivare (pasaj)Mediile de cultur pentru culturi de celule (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumin, etc), conin AA, Vit, factori de cretere, sruri minerale, rou fenol pentru monitorizarea pH (vireaz n galben n mediu acid)Mediile de cretere (pentru cultivarea CC) sunt mbogite cu ser sangvin (uman, animal) Mediile de ntreinere se utilizeaz pentru meninerea monostratului n procesul reproducerii virale. Nu conin ser. CC reprezint sistemul virus-gazd predilect n virologia clinic i cercetare.

Inocularea CC Se aleg tuburi cu monostrat bine formatSe nltur mediul de cretere, se spal cu sol. Hanks Se inoculeaz 0,1 0,2 ml de prelevatPeste 30-60 min n tuburi se toarn cte 1 ml mediu de ntreinereSe ntroduc n termostat la temperatura adecvat 3 - 4 zile 5. Metodele de diagnostic ale infeciilor cauzate de virusuri (viroze)

METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELORMETODE DIRECTEExamenul virusoscopic (evidenierea direct a virionului sau a componentelor lui n prelevate)Examenul virusologic (izolarea i identificarea virusului)Detectarea Ag virale n prelevatIdentificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificarea genic PCR)METODE INDIRECTE- Serodiagnosticul (creterea de cel puin 4 ori a titrului Ac n dinamic)EXAMENUL VIRUSOSCOPICMicroscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri n variol, Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom Microscopia electronicImunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele imune virus AcImunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor

6. Materialele de examinare (prelevate) de la pacieni. Regulile de recoltare i ambalare, condiiile de transportare n laborator.

7. Metoda virusoscopic de examinare a prelevatelor n viroze.

EXAMENUL VIRUSOSCOPICMicroscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri n variol, Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom Microscopia electronicImunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele imune virus AcImunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor

8. Metoda virusologic n diagnosticul virozelor. Pregtirea probelor pentru examinarea n metoda virusologic.

EXAMENUL VIRUSOLOGICPrelucrarea prealabil a prelevatelor:Omogenizarea (dup necesitate) nlturarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea creterii bacteriilor i fungilor contaminani (penicilin - 500 UA/ml, streptomicin 500 UA/ml, nistatin - 20 UA/ml)

9. Izolarea virusului de culturi de celule, ou embrionate de gin, animale de laborator; indicarea virusului de culturi de celule (incluzii, ECP, proba de culoare, RHA, RHAds, proba plajelor), n oul embrionat (RHA, decesul embrionului, modificri pe MCA), pe animalele de laborator (simptome clinice, deces, RHA, modificri histopatologice); identificarea virusului (definirea genului, speciei).

ETAPELE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGICIzolarea virusuluiEvidenierea (indicarea) reproducerii viraleIdentificarea virusuluiIzolarea virusului se realizeaz prin inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator, embrionilor de gin sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectueaz n funcie de particularitile biologice ale agentului etiologic probabil i posibilitile laboratorului.Indicarea virusuluin culturi de celuleECP modificri degenerative i distrugere celular, rezultat al multiplicrii virale (rotunjire sau retracie celular, citoliz, apariia vacuolelor sau granulelor n citoplasm, picnoza nucleului, fuziunea membranelor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozin, Giemsa, fluorocrom.

3. Incluziuni viraleReprezint acumulri paracristaline de virioni sau de componente virale n aria de replicare i asamblare a virusurilor (citoplasm, nucleu). Coloraia Giemsa, hem-eozin, fluorocrom. Localizarea, forma i afinitatea tinctorial (bazofile, acidofile) sunt particulariti diagnostice pentru unele viroze.

4. Hemaglutinarea (Reacia de HA)Unele virusuri posed n componena capsidei, n special a supercapsidei, glicoproteine care pot adera la suprafaa hematiilor hemaglutinine (HA).RHA este caracteristic pentru virusurile cu HA acumulate n mediul de ntreinere. n acest caz mediul de ntreinere aglutineaz eritrocitele unor specii de mamifere sau psri.5. Hemadsorbia (Reacia de HAd) RHAd este caracteristic virusurilor cu HA n poziie intracelular. n procesul asamblrii acestor virusuri, HA lor se afl deja nserate n MCP la nivelul viitorului mugure. Dac la aceast etap n recipientul cu monostrat celular se adaug suspensie de hematii i se menine 15-20 min la t caracteristic fiecrui virus, la microscop pot fi urmrite hematiile fixate la suprafaa celulelor infectate (RHAd).6. Proba culorii- Metabolismul celular neafectat virajul culorii mediului din rou n galben (pH acid)Metabolismul celular inhibat culoarea mediului nu se modific7. Interferena Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determin fenomenul de interferen. Pentru detectarea V.rubeolei se infecteaz CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicrii acestui virus confirm prezena V.rubeolic Indicarea virusului n oul embrionat de ginOule se rcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricie maxim, apoi aseptic se taie coaja, se recolteaz lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA i embrionul se ntroduc n cutii Petri sterile. Se observ:Moartea embrionuluiApariia modificrilor (hemoragii, pustule) pe MCAAcumularea de HA n lichide

Indicarea virusului pe animale de laboratorBoala manifest a animalului, decesUrmrirea virusului n organele-int:HemaglutinareInfeciozitatea omogenatelorExamene histopatologice (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babe-Negri n neuronii infectai cu V.rabic, etc)Identificarea virusurilorDeterminarea genului, speciei i serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice. Se efectueaz cu ajutorul serurilor imune specifice antivirale n diferite reacii serologice:RNRIHA/RIHAdRFCRIFRIE (ELISA) ARI, etc

10. Metoda serologic - recoltarea, pstrarea, examinarea serurilor perechi n RIHA, RIHAds, RPG, RIF, RFC, RN, AIE. Citirea i interpretarea rezultatelor.

DETECTAREA AG VIRALE N PRELEVATEAvantaje: simplitatea i rapiditatea examenului, nu necesit meninerea infeciozitii virusuluiDezavantaje: sensibilitate direct proporional cu cantitatea virusului din prelevatSe utilizeaz Ac policlonali de origine uman (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origine murin)Reacii: RHAI, RLA, RIF, RIE (ELISA), Western-blot, ARI, etc.

11. Identificarea genomului viral prin tehnici de biologie molecular.

IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL (punerea n eviden a AN virali din prelevate n cursul infeciilor virale acute sau cronice i monitorizarea tratamentului).Pot fi examinate toate esuturile i lichidele biologice.Hibridizarea acizilor nucleici fr amplificareHibridizarea dup amplificare (PCR i variantele ei)DIAGNOSTICUL SEROLOGICEsena: depistarea Ac sintetizai de gazd n rspuns la o infecie viral.Dup o primo-infecie are loc inducerea formrii Ac, iar dup o reinfecie sau reactivare titrul Ac crete n dinamic. n serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la bolnav (seruri-perechi): prima prelevat la debutul bolii, a doua prelevat peste 15 zile.

Ac sunt depistai n ser, uneori n LCR, exsudate, lichid articular, etc. Pentru depistarea Ac se utilizeaz Ag virale de referin (suspensie viral inactivat, proteine virale native sau recombinante, oligopeptide sintetice).Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA), etc. Semnificaie diagnostic prezint trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie, primo-infecie) sau creterea titrului Ac de cel puin 4 ori n cursul infeciei. Ambele seruri vor fi testate n aceeai zi, prin tehnici identice i n acelai laborator.

TERAPIA ANTIVIRALDificulti:Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fr afectarea celulei!)Apariia mutantelor rezistenteActivitate asupra virusului n faz de multiplicare Costul avansat al tratamentuluiPrimele preparate antivirale anticanceroase.Preparatele antivirale contemporane:- Nu manifest activitate virucid, doar inhib reproducerea viralSunt dirijate contra etapelor reproducerii virale

Adeziunea virusului la celulMecanismul blocarea receptorilor celulari (HIV-oligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4 solubili)Dificulti: afinitate redus, degradare rapidFuziunea, penetrareaReprezint peptide sintetice (pentafuzida-T20, T1249) blocheaz fuziunea virusului HIV cu membrana celular (dificultate injecii s/c zilnice)DecapsidareaAmantadina, rimantadina inhib decapsidarea virusului gripal AUtilizare limitat dezvoltarea rezistenei

ReplicareaMecanismul blocheaz activitatea enzimelor virale de reproducere (transcriptaze, polimeraze, replicaze)Avantaj nu influeneaz componentele celulei-gazdAnalogi nucleozidiciSe disting de nucleozidele naturale prin modificarea componentului glucidic sau a bazei purinice sau pirimidinice. Blocheaz elongarea catenei de ADN n curs de formare. Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridin)Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudin, etc)Anti-HBV (entecavir, LdT, LdC faz de cercetare)

2. Analogi nucleotidici Cidofovir - CMV, HSV Adefovir - HIV, HBV, HSV, CMV Tenofovir HIV, HBV3. Analog al pirofosfatului Foscarnet HSV, CMV (HIV, HBV -?)4. Inhibitori nenucleozidici ai RT HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz)

Blocarea activitii polimerazelor virale se realizeaz prin:Competiie cu substratul natural al enzimeingrmdirea steric a centrului activ al enzimei Incorporarea n catena de ADN n curs de sintezBlocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe analogul su artificial

Asamblarea, eliberareaInhibitori ai proteazei HIV (sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, nelfinavir, etc) toxicitate, rezistenInhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (zanamivir, oseltamivir). Activ contra gripei A i B (efect preventiv, curativ, rezisten rar)

INTERFERONII (IFN)IFN ansamblu de proteine capabile s confere celulelor o stare de rezisten la o infecie viral.IFN tip 1 (clasic, antiviral):IFN-alfa (leucocitar)IFN-beta (fibroblastic) Inductori ai IFN 1: virusuri, LPS, ARN bicatenarIFN-gamma, tip 2, imun, produs de LT activate, NK. Manifest activitate imunomodulatoare

IFN acioneaz asupra ciclului de replicare viral prin intermediul celulei: interaciunea IFN-alfa cu receptorul su induce sau stimuleaz expresia unor gene celulare, rezultnd o activitate antiviral (blocarea translaiei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este posibil i blocarea asamblrii i nmuguririi virusului (HIV)IFN mresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gamma i a celor de clasa II IFN mresc activitatea macrofagelor i manifest activitate antiproliferativIFN-gamma activeaz celulele NK

Utilizarea terapeutic a IFN hepatite B i C cronice, infecii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemiiAlte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro.

TERAPIA CELULAR (CMV, EBV)Fondat pe administrarea CTL (limfocite Tc) autologe.Prelevarea sngelui de la bolnavIzolarea CTL specificeClonarea i proliferarea CTL in vitroReinjectarea la pacient VIITOR: fototerapia, imunizarea intracelular (introducerea unei gene ce codific un anticorp antiviral)