Definitie Secvenializarea ADN-ului - procesul de identificare a ordinii precise a nucleotidelor (ATCG) ntr-o molecul de ADN. Secventializarea AND reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunii nucleotidelor dintr-un fragment ADN de analizat

n prezent exist numeroase metode de secveializare a ADN-ului clasificate n: - metode derivate de la metoda chimic a lui Maxam i Gilbert - metode derivate de la metoda enzimatic a lui Sanger - metode de ''nou generaie'' pirosecveniere, ion-torrent, etc

Secventierea chimica (Maxam Gilbert) Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea lantului la nivelul acestor modificari Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor ADNproteine etc)fiind o metod complicat i laborioas, n ultimii ani nu se mai utilizeaz;

Fig. 12.1. Secvenierea ADN prin clivarea chimic (Maxam-Gilbert)

Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger) - una din primele metode de secvenializare a fost descris n 1977 de Frederick Sanger care a primit cel de-al doilea premiu Nobel pentru descoperirea sa - se bazez tot pe reacia de replicare a ADN-ului catalizat de o polimeraz ADN-dependent

Elementele eseniale realizrii unei reacii de secveniere prin metoda Sanger a) fragment ADN de secveniat o molecul de ADN monocatenar b) polimeraza ADN c) cele 4 deoxinucleotide obinuite (dNTP: A, T, C, G) c) o oligonucleotide amors (primer) complementare cu molecula de secveniat marcat radioactiv i care ofer un capt 3' liber d) 4 di-deoxinucleotide (ddNTPs: ddA, ddC, ddG, ddT) nucleotide ce nu au gruparea fosfat n poziiile 2' (deoxi) i 3' (di).[endnoteRef:2] [2: https://mail.uaic.ro/~marius.mihasan/teaching/pdfs/general_biology_courses/curs_12_PCR.pdf ]

2) calea enzimatic (Sanger) n care ADN-ul este sintetizat in vitro pe baza matriei ADN studiat, n aa fel nct reacia se termin specific n poziia care corespunde unei baze anumite. Pentru a determina o secven de nucleotide pe una din cile menionate, ADN-ul este supus seriei de patru reacii separate, fiecare reacie fiind specific pentru una din baze. Prin electroforez produii de reacie vor migra n patru curse paralele, pe acelai gel. Urmrind band cu band, poate fi identificat ordinea nucleotidelor n ADN (fig. 12.2).

Fig. 12.2. Secvenierea ADN prin metoda dideoxi (Singer)

Aplicatii: n scopuri de diagnostic al purttorilor de gene normale sau mutante se compar rezultatele secvenierii cu datele structurii primare normale a genei din bibliotecile de ADN. Spre regret, nu se cunoate nc secvena tuturor genelor umane, de aceea n diagnostic se utilizeaz metode indirecte: nlnuirea cu markeri genetici apropiai (repetiii hipervariabile de ADN mini- i microsatelitic), determinarea situsurilor de restricie caracteristice genei date, hibridarea cu sonde specifice etc.