QuantiFERON -TB

Gold(Metoda n tub)Test IFN-gamma al sngelui total Msurarea rspunsurilor la antigenele peptidice ESAT-6, CFP-10 & TB7.7(p.4)

ProspectUtilizare pentru Diagnostic In Vitro

1

CUPRINS1. UTILIZARE INTENIONAT 2. REZUMATUL I EXPLICAIA TESTULUI Principiile dozrii Timpul necesar pentru efectuarea dozrii 3. REACTIVII I MODUL DE PSTRARE Materiale necesare (dar nu furnizate) Instruciuni de pstrare Tuburile de colectare a sngelui Reactivii Kit-ului Reactivii reconstituii i neutilizai 4. ATENIONRI I PRECAUII Atenionri Precauii 5. COLECTAREA I MANIPULAREA PROBEI 6. INSTRUCIUNI PENTRU UTILIZARE STADIUL NTI Incubarea sngelui i recoltarea plasmei STADIUL DOI IFN- Uman - ELISA 7. CALCULE I INTERPRETAREA TESTULUI Obinerea curbei standard Controlul calitii testului Interpretarea rezultatelor 8. LIMITRI 9. CARACTERISTICILE PERFORMANEI 10. INFORMAII TEHNICE Rezultate nedefinite Probele de plasm coagulat Probleme de trasare ELISA Dezvoltarea nespecific a coloraiei Citiri pentru standarde cu densitate optic mic Background ridicat Curba standard neliniar i variabilitatea duplicatului 11. BIBLIOGRAFIE 12. SERVICII TEHNICE 13. PROCEDURA DE TESTARE REZUMAT 3 3 5 5 6 6 7 7 7 7 8 8 9 10 11 11 12 16 16 17 18 22 22 25 25 25 26 26 26 27 27 28 30 31

2

1. UTILIZARE INTENIONATQuantiFERON-TB Gold In-Tube (IT) este un test pentru diagnostic in vitro, care utilizeaz un cocktail de peptide: ESAT-6, CFP-10 i TB7.7(p4) care stimuleaza celulele din sngele ntreg heparinizat. Detecia -interferonului (IFN-) prin Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) este utilizat pentru identificarea rspunsurilor in vitro la aceste antigene peptide care sunt asociate cu infecia cu Mycobacterium tuberculosis. QuantiFERON-TB Gold IT este un test indirect pentru infecia cu M. tuberculosis (inclusiv boala) i este destinat utilizrii n acociaie cu evaluarea riscului, radiografie i alte evaluri medicale i de diagnostic.

2. REZUMATUL I EXPLICAIA TESTULUITuberculoza este o boal transmisibil, cauzat de infecia cu organismele complexe M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum), care n mod normal se mprtie la noi gazde, prin picturi ce conin nuclei care se mprtie n aer de la pacienii cu tuberculoz. Un individ nou infectat poate deveni bolnav de tuberculoz n decurs de sptmni pna la luni, dar majoritatea indivizilor infectai rmn n stare de infectie latenta. Infecia latent de tuberculoz (ILTB), o stare asimptomatic netransmisibil, persist la unii indivizi, care pot dezvolta boala de tuberculoz mai trziu, dup luni sau ani. Scopul principal al diagnosticrii ILTB este s ia n consideraie tratamentul medical pentru prevenirea tuberculozei. Pn recent, testul dermatologic de tuberculin (TDT) a fost singura metod disponibil pentru diagnosticarea ILTB. Sensibilitatea cutanat la tuberculin apare de la 2 pn la 10 sptmni dup infectare. Oricum, unii indivizi infectai, incluznd pe aceia cu un interval larg de condiii ce mpiedic funciile imunitare dar, de asemenea, i ceilali fr aceste condiii, nu rspund la tuberculin. Dimpotriv, unii indivizi pentru care este puin probabil s aibe infecie cu M. tuberculosis manifest sensibilitate la tuberculin i au rezultate TDT pozitive dup vaccinarea cu bacil Calmette-Gurin (BCG), infecie cu mycobacteria, alta dect complexul M. tuberculosis, sau ali factori nedeterminai. ILTB trebuie deosebit de boal de tuberculoz, o stare raportabil care, de obicei, implic plmnii i tractul respirator inferior, dei i alte sisteme de organ pot fi, de asemenea, infectate. Boala de tuberculoz este diagnosticat de rezultate istorice, fizice, radiologice, histologice i micobacteriologice. Testul QuantiFERON-TB Gold IT este un test pentru rspunsurile celulare imun-mediate (CIM) la antigenele peptidice care stimuleaz proteinele micobacteriene. Aceste proteine, ESAT-6, CFP-10 i TB7.7(p4), sunt absente din toate suele BCG i din majoritatea micobacteriilor non-tuberculoz, cu excepia M. kansasii, M. szulgai i M. marinum.1 Indivizii infectai cu organismele complexului M. tuberculosis au de obicei limfocite n sngele lor, care le recunosc pe acestea i alte antigene micobacteriene. Acest proces de recunoatere implic generarea i secreia citokinei, IFN-. Detecia i cuantificarea ulterioar a IFN- st la baza acestui test.

3

Antigenele utilizate n QuantiFERON-TB Gold IT sunt un cocktail de peptide ce stimuleaz proteinele ESAT-6, CFP-10 i TB7.7 (p4). Numeroase studii au demonstrat c aceste antigene peptide stimuleaz rspunsurile IFN- n celulele T ale indivizilor infectai cu M. tuberculosis, dar n general nu la persoanele neinfectate sau la cele vaccinate cu BCG fr boal sau risc de ILTB.1-34 Oricum, tratamentele medicale sau condiiile care reduc funcionalitatea imunitar pot reduce potenial rspunsurile IFN-. Pacienii cu alte anumite infecii micobacteriene pot fi de asemenea sensibili la ESAT-6, CFP-10 i TB7.7 (p4), deoarece genele care codific aceste proteine sunt prezente n M. kansasii, M. 1,22 szulgai i M. marinum. Testul QuantiFERON -TB Gold IT este un test pentru ILTB ct i un ajutor preios pentru diagnosticarea infeciei complexe cu M. tuberculosis la pacienii bolnavi. Un rezultat pozitiv susine diagnosticul de boal de tuberculoz; oricum, infeciile cu alte micobacterii (de ex.., M. kansasii) pot de asemenea s determine rezultate pozitive. Alte evaluri medicale i de diagnosticare sunt necesare pentru confirmarea sau excluderea bolii de tuberculoz.

4

Principiile dozriiSistemul QuantiFERON-TB Gold IT utilizeaz tuburi de colectare a sngelui specializate, care sunt utilizate pentru colectarea sngelui integral. Incubarea sngelui are loc n tuburi, timp de 16 pn la 24 de ore, dup care plasma este recoltat i testat pentru prezena IFN-, produs ca rspuns la antigenele peptide. Testul QuantiFERON-TB Gold IT este efectuat n dou etape. nti, sngele ntreg este colectat n fiecare din tuburile QuantiFERON-TB Gold de colectare a sngelui, care includ un tub de control Nil, un tub Antigen TB i un tub Mitogen, opional. Tubul Mitogen poate fi utilizat cu testul QuantiFERON-TB Gold IT, ca un control pozitiv. Acesta poate fi n special util n cazul n care exist un dubiu referitor la starea imunitar a individului. Tubul Mitogen servete, de asemenea, ca un control pentru corecta manipulare i incubare a sngelui. Tuburile trebuie incubate la 37C ct mai repede posibil maxim la 16 ore de la colectare. Dup o perioad de incubare de 16 pn la 24 de ore, tuburile sunt centrifugate, plasma este ndeprtat, iar cantitatea de IFN- (UI/mL) msurat de testul ELISA. Un test este considerat pozitiv pentru rspunsul la tubul Antigen TB dac este semnificativ peste valoarea IFN- UI/mL din tubul Nil. Dac este utilizat, proba de plasm Mitogen-stimulat servete ca un control pozitiv de IFN- pentru fiecare prob testat. Un rspuns sczut la Mitogen ( 0,150, procedura de splare a plcii trebuie investigat.

17

Interpretarea RezultatelorRezultatele testului QuantiFERON-TB Gold IT sunt interpretate utiliznd urmtoarele criterii: NOT: Diagnosticarea sau or excluderea bolii tuberculoz i evaluarea probabilitii ILTB necesit o combinare a rezultatelor epidemiologice, istorice, medicale i de diagnostic care trebuie luate n consideraie cnd se interpreteaz rezultatele testului QuantiFERON-TB Gold IT.

DAC S-AU UTILIZAT DOAR TUBURILE NIL & ANTIGEN TB Nil [UI/mL] 8,0 Antigen TB minus Nil [UI/mL] < 0,35 0,35 i < 25% din valoarea Nil 0,35 i 25% din valoarea Nil > 8,02 Oricare QuantiFERON-TB [UI/mL] Raport/Interpretare

Negativ Pozitiv1 Nedeterminat3

Infecia cu M. tuberculosis NU este posibil

Infecia cu M. tuberculosis este posibil Rezultatele sunt nedeterminate pentru rspunsul la Antigen TB

Dac infecia cu M. tuberculosis nu este suspectat, rezultatele iniiale pozitive pot fi confirmate prin retestarea probelor originale de plasm n duplicate n ELISA QuantiFERON-TB Gold. Dac repetarea testrii unuia sau ambelor replicate este pozitiv, individul trebuie considerat c are testul pozitiv. 2 n studiile clinice, mai puin de 0,25% din subieci au avut concentraii de IFN- > 8,0 UI/mL pentru Control Nil. 3 Vezi seciunea Probleme de trasare pentru cauzele posibile.

1

Magnitudinea concentraiei msurate de IFN- nu poate fi corelat cu stadiul sau gradul infeciei, nivelul rspunsului imunitar sau probabilitatea progresiei ctre boala activ.

18

FIGURA 3. Interpretarea Diagramei de flux cnd sunt utilizate tuburile NIL & ANTIGEN TB

Antigen TB Nil 0,35 UI/mL

INTERPRETARENu Da

Antigen TB Nil 25% din valoarea Nil

Nu

Da

NuNEDETERMINAT

Nil 8,0 IU/mL

VALIDAREDa

NEGATIV

POZITIV

19

DAC S-AU UTILIZAT TUBURILE NIL, ANTIGEN TB I MITOGEN Nil [UI/ mL] 8,0 Antigen TB minus Nil [UI/mL] < 0,35 0,35 i < 25% din valoarea Nil Mitogen minus Nil [UI/mL]1 0,5 Negativ 0,5 Pozitiv2 Oricare QuantiFERON-TB [UI/mL] Raport/ Interpretare

Infecia cu M. tuberculosis NU este posibil Infecia cu M. tuberculosis este posibil Rezultatele sunt nedeterminate pentru rspunsul la Antigen TB

0,35 i 25% din valoarea Nil

< 0,35 0,35 i < 25% din valoarea Nil > 8,041

< 0,5 < 0,5 Nedeterminat3

Oricare

Oricare

Rspunsurile la controlul Mitogen pozitiv (i ocazional Antigen TB) pot fi adesea n afara domeniului cititorului microplac. Aceasta nu are impact asupra rezultatelor testului. 2 Dac infecia cu M. tuberculosis nu este suspectat, rezultatele iniiale pozitive pot fi confirmate prin retestarea probelor originale de plasm n duplicate n ELISA QuantiFERON-TB Gold. Dac repetarea testrii unuia sau ambelor replicate este pozitiv, individul trebuie considerat c are testul pozitiv. 3 Vezi seciunea Probleme de trasare pentru cauzele posibile. 4 n studiile clinice, mai puin de 0,25% din subieci au avut concentraii de IFN- > 8,0 UI/mL pentru Control Nil.

Magnitudinea concentraiei msurate de IFN- nu poate fi corelat cu stadiul sau gradul infeciei, nivelul rspunsului imunitar sau probabilitatea progresiei ctre boala activ.

20

FIGURA 4. Interpretarea Diagramei de flux cnd sunt utilizate tuburile NIL, ANTIGEN TB & MITOGEN

Antigen TB Nil 0,35 UI/mL

INTERPRETAREDa NuAntigen TB Nil 25% din valoarea Nil

Nu

Da

Mitogen Nil < 0,50 UI/mL

DaNEDETERMINAT

NuNil 8,0 UI/mL

i/sauNil > 8,0 UI/mL

VALIDARE

NuNEGATIV

DaPOZITIV

21

8. LIMITRIRezultatele testului QuantiFERON-TB Gold IT trebuie utilizate n conjuncie cu istoricul epidemiologic al fiecrui individ, starea medical curent i alte evaluri diagnostice. Indivizii cu valori Nil mai mari de 8 UI/mL sunt clasificai ca nedeterminat, deoarece un rspuns mai mare cu 25% la Antigenele TB poate fi n afara domeniului de msurare a dozrii. Rezultatele pe care nu te poi baza sau rezultatele nedeterminate pot apare datorit: Deviaiile din procedura descris n Prospect, Nivelele excesive de IFN- circulant sau prezena anticorpilor heterofili, Mai mult de 16 ore de la scoaterea probelor de snge de la incubarea la 37C.

9. CARACTERISTICILE PERFORMANEI Studii cliniceDeoarece nu exist un standard definitiv pentru infecia latent de tuberculoz (ILTB), sensibilitatea i specificitatea estimat pentru testul QuantiFERON-TB Gold IT nu poate fi practic evaluat. Specificitatea testului QuantiFERON-TB Gold IT a fost aproximat prin evaluarea evaluarea ratelor fals pozitive la persoanele cu risc sczut (fr factori de risc cunoscui) pentru infecia de tuberculoz. Sensibilitatea a fost aproximat prin evaluarea grupurilor de pacieni cu cultur confirmat de boal TB activ. Specificitate ntr-un studiu efectuat n SUA care a nrolat 866 voluntari, sngele pentru testul QuantiFERON-TB Gold IT a fost recoltat cnd a fost plasat TST. Informaiile demografice i factorii de risc pentru TB au fost determinai utiliznd un studiu standard la timpul de testare. Din 432 voluntari fr factori de risc cunoscui pentru infecia cu M. tuberculosis, rezultatele testului QuantiFERON-TB Gold IT i TST au fost disponibile pentru 391. Nici unul nu a fost vaccinat BCG. Un al doilea studiu de specificitate a fost efectuat cu QuantiFERON-TB Gold IT la indivizi cu risc sczut din Japonia, din care aproximativ 90% au fost vaccinai BCG. Rezultatele din ambele studii de specificitate sunt prezentate n Tabelul 2.

22

TABEL 2. Specificitatea QuantiFERON-TB Gold IT: Rezultatele pentru persoanele fr risc raportat infecia cu M. tuberculosis. STUDIUL Vaccinar e BCG % Total Nr. testai QFT-G Nedeterminat Nr. QFT-G Pozitiv / Nr. Testelor Valide Specificitatea QFT-G (95% IC) Nr. TST Pozitiv / Nr. Testai 6 / 391 Specificitatea TST* (95% IC)

SUA (nepublicat) Japonia (nepublicat) TOTAL

0% ~ 90%

391 190 581

1 4 5 / 584 (0,9%)

3 / 390 3 / 186 6 / 576

99,2% (97,6-99,8) 98,4% (95-99,6) 99,0%

98,5% (96,5-99,4) -

*Utiliznd o limit a 10mm TST. Specificitatea TST estimat este 99,1%, dac se utilizeaz o limit de 15mm. Sensibilitatea pentru TB activ Suspecii TB din Australia i Japonia care au fost ulterior confirmai cu infecie de M. tuberculosis prin cultur, au fost testai pentru evaluarea sensibilitii la QuantiFERON-TB Gold IT. Deoarece nu exist un test standard definitiv pentru infecia latent de tuberculoz (ILTB), un surogat adecvat este cultura microbiologic a M. tuberculosis, deoarece pacienii cu boal sunt prin definiie infectai. Pacienii au primit tratament mai puin de 8 zile naite de colectarea sngelui pentru testul QuantiFERONTB Gold IT. Tabelul 3 rezum rezultatele de la cele dou grupuri de pacieni cu cultur pozitiv de M. tuberculosis. Sensibilitatea global a QuantiFERON-TB Gold IT pentru boala activ TB a fost 89% (48/54). TABEL 3. QuantiFERON-TB Gold IT: Subiecii cu cultur confirmat de infecie cu M. tuberculosis. STUDIU Boal Nr. QFT-Gold Sensibilitatea confirmat Pozitiv / Nr. QFT-Gold de Testelor Valide (95% IC) Pacieni TB Japonezi Studiu de validare Pacieni TB Pulmonar Australieni Studiu de Extrapulmonar validare TOTAL Cultur 24 / 27 7 / 10 Cultur 17 / 17 48 / 54 89% (72-96%) 70% (40-89%) 100% (82-100%) 89% (78-95%)

23

Diagnosticul de ILTB Un numr de studii care au fost publicate demonstreaz performana QuantiFERON-TB Gold IT la populaii variate cu risc de ILTB. n principiu, rezultatele ctorva studii selectate sunt prezentate n Tabelul 4. TABEL 4. Studii publicate selectate privind QuantiFERON-TB Gold IT la populaii cu risc de ILTB.STUDIUL Indieni HCW (Pai et al 2005)26 Total testai 726 Rezultate Aflare la rate TB foarte mari. 40% QFT-Gold IT pozitivi cf 41% TST pozitivi la 10mm. Mare concordan cu TST, nici un efect al BCG pe nici un test. Ambele teste legate de factorii de risc de vrst i perioada de lucru n domeniul profesionitilor din sntate. Prevalena global a ILTB cu QFT-Gold IT a fost 4,6% (27/590) la HIV+ persoane. Rezultatele pozitive au fost asociate cu riscurile TB. Doi subieci pozitivi la QFT-Gold IT au progresat la TB activ n decurs de un an. Rspunsurile nedeterminate (n=20, 3,4%) au fost semnificativ asociate cu un numr CD4