rezumat romana dana suteu

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI CLUJ-NAPOCA Facultatea de Biologie i Geologie

Dana Cristina uteu

STUDII DE TAXONOMIE MOLECULAR LA UNELE SPECII DE PLANTE ENDEMICE SAU RARE DIN

ROMNIA

- Rezumatul tezei de doctorat -

Coordonator tiinific Prof. Dr. Octavian Popescu

Cluj-Napoca

2012

CUPRINS REZUMAT

OBIECTIVELE PREZENTULUI STUDIU Pag. 1

INTRODUCERE Pag. 2

CONSIDERAII TEORETICE Pag. 2

1. Filogenia i analizele filogenetice (selectiv) Pag. 2

2. Markeri moleculari utilizai n filogenia i taxonomia plantelor

(selectiv)

Pag. 3

3. Caracterizarea din punct de vedere taxonomic, morfologic, ecologic i

al variabilitii fenotipice a plantelor studiate (selectiv)

Pag. 3

CONTRIBUII PERSONALE Pag. 8

4. Materiale i metode (selectiv) Pag. 8

5. Rezultate i discuii (selectiv) Pag. 9

5.1. Rezultate la genul Pulmonaria Pag. 9

5.2. Discuii la genul Pulmonaria Pag. 10

5.3. Concluzii la genul Pulmonaria Pag. 11

5.4. Rezultate la genul Onosma Pag. 11

5.5. Discuii la genul Onosma Pag. 15

5.6. Concluzii la genul Onosma Pag. 17

5.7. Rezultate la genul Eritrichium Pag. 17

5.8. Discuii la genul Eritrichium Pag. 21

5.9. Concluzii la genul Eritrichium Pag. 22

5.10. Rezultate la specia Primula leucophylla Pag. 22

5.11. Discuii la specia Primula leucophylla Pag. 26

5.12. Concluzii la specia Primula leucophylla Pag. 27

5.13. Rezultate la specia Primula intricata Pag. 27

5.14. Discuii la specia Primula intricata Pag. 30

5.15. Concluzii la specia Primula intricata Pag. 32

Bibliografie selectiv Pag. 33

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT Pag. 35

CUVINTE CHEIE Pag. 36

Rezumatul tezei de doctorat

1

Obiectivele prezentului studiu

Obiectul studiului l reprezint speciile/subspeciile endemice pentru Romnia sau

endemitele daco-balcanice i unele specii rare. n cadrul fiecrei specii de plante au fost

stabilite unul sau mai multe obiective:

Pulmonaria filarszkyana

Obiectivul 1: Identificarea unor markeri moleculari barcode capabili s diferenieze speciile

Pulmonaria rubra i Pulmonaria filarszkyana;

Obiectivul 2: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Pulmonaria rubra i Pulmonaria

filarszkyana;

Onosma pseudoarenaria

Obiectivul 1: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Onosma arenaria i Onosma

pseudoarenaria;

Obiectivul 2: Estimarea diversitii genetice a populaiilor de Onosma arenaria i Onosma

pseudoarenaria din Romnia;

Eritrichium jankae

Obiectivul 1: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Eritrichium nanum i Eritrichium

jankae;

Primula leucophylla

Obiectivul 1: Identificarea unor markeri moleculari barcode capabili s diferenieze speciile

Primula elatior i Primula leucophylla;

Obiectivul 2: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula leucophylla;

Obiectivul 3: Redefinirea arealului speciei Primula leucophylla pe baza analizelor

moleculare;

Primula intricata

Obiectivul 1: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula intricata.


2

Introducere

Prezentul studiu se nscrie pe direcia de revizuire taxonomic prin metode moleculare

a unor specii de plante al cror statut taxonomic este discutabil. Speciile/subspeciile endemice

sau rare selectate pentru studiu sunt caracterizate de un statut taxonomic incert, ele fiind

considerate, doar pe baza caracterelor morfologice i n absena unor studii genetice, de ctre

diferii autori ca avnd un statut taxonomic fie de specie distinct, fie subspecie sau chiar

varietate a unei alte specii. ntruct diferenele dintre caracterele morfologice care fac

distincia dintre specii/subspecii sunt minore i pot fi urmarea unor polimorfisme individuale

determinate de factorii de mediu i nu a unor diferene interspecifice, s-a considerat oportun

realizarea unor studii de genetic molecular care s contribuie la elucidarea statutului lor

taxonomic. Taxonii problematici selectai pentru studiu sunt urmtorii: Pulmonaria

filarszkyana, Onosma pseudoarenaria, Eritrichium jankae (familia Boraginaceae), Primula

leucophylla i Primula intricata (familia Primulaceae), iar statutul lor taxonomic va fi discutat

prin prisma relaiei lor cu speciile ale cror subspecii sau varieti sunt considerai a fi:

Pulmonaria rubra, Onosma arenaria, Eritrichium nanum i Primula elatior.

Consideraii teoretice

1. Filogenia i analizele filogenetice (selectiv)

Principiul pe care se bazeaz filogenetica este acela c membrii unui grup sau clade

mprtesc o istorie evolutiv comun i sunt mai nrudii ntre ei dect cu membrii altui

grup. Filogenia molecular presupune utilizarea macromoleculelor biologice (proteine, acizi

nucleici) pentru a obine informaii asupra istoriei evolutive a taxonilor i asupra legturilor

lor de nrudire.

Metodele filogenetice de construire a arborilor implic parcurgerea mai multor etape,

ulterior obinerii setului de date: alinierea secvenelor, determinarea modelului de substituie,

construirea arborelui i evaluarea arborelui. Exist dou grupe majore de metode de construire

a arborilor filogenetici, i anume: metode bazate pe distan i metode bazate pe analiza de

caractere. Cele mai cunoscute metode fenetice sunt UPGMA (Unweighted Pair Group

Method with Arithmetic means), NJ (Neighbor Joining) i ME (Minimum Evolution), iar


3

cele mai cunoscute metode bazate pe analiza de caractere sunt: MP (Maximum Parsimony),

ML (Maximum Likelihood) i Bayesian inference.

2. Markeri moleculari utilizai n filogenia i taxonomia

plantelor (selectiv)

Tipurile variate de markeri moleculari difer n ceea ce privete principiul,

metodologia i aplicaiile, ceea ce creaz problema selectrii markerului cel mai potrivit

pentru rezolvarea temei de cercetare propuse. Dei n filogenetica plantelor, cel mai ridicat

grad de ncredere n arborii generai este dat de congruena dintre informaiile procurate de la

cele trei genomuri: plastidial, nuclear i mitocondrial (Savolainen i Chase, 2003), totui,

multe studii se bazeaz pe utilizarea informaiilor provenite de la un singur genom, o

explicaie posibil fiind lipsa unor markeri genetici potrivii. Deoarece filogeniile

intraspecifice clar rezolvate pe baza a mai multor sisteme de date independente sunt dificil de

obinut i costisitoare, se ajunge la utilizarea a ctorva sisteme de markeri mai mult sau mai

puin optime, aceasta reprezentnd un compromis ntre nivelul de variabilitate suficient de

ridicat al markerilor i utilitatea lor pentru a rezolva genealogii clare (Eidesen i colab., 2007).

Cei mai utilizai markeri moleculari n taxonomia i filogenia plantelor se clasific n

urmtoarele dou categorii: proteine i acizi nucleici. Din prima categorie fac parte

izoenzimele iar din cea de a doua fac parte microsateliii, SNP-urile, genele specifice,

regiunile necodificatoare i alte regiuni. Printre principalele metode de detecie a markerilor

moleculari ADN se numr secvenierea, genotiparea, tehnica RFLP, tehnica AFLP i tehnica

RAPD.

3. Caracterizarea din punct de vedere taxonomic, morfologic,

ecologic i al variabilitii fenotipice a plantelor studiate

(selectiv)

Pulmonaria rubra (denumire popular mierea ursului, plmnari) este un endemit

carpatico-balcanic caracteristic fgetelor montane din Carpai. Este o specie frecvent din

etajul montan mijlociu pn n cel subalpin, prin pduri i buruieniuri, n fgete, brdeto-


4

fgete i brdete. n etajul alpin inferior se gsete sporadic prin buruieniurile de sub

jnepeniuri i tufriuri de Alnus viridis, pn la circa 2000 m altitudine (Tuber, 1982).

n ceea ce privete variabilitatea speciei, cei mai muli autori consider c specia P.

rubra are dou subspecii: P. rubra subsp. eurubra (P. rubra subsp. rubra) (fig. 1) i P. rubra

subsp. filarszkyana (Srbu i colab., 2001; Guuleac, 1960; Beldie, 1979). Totui, Borza

consider P. filarszkyana ca fiind doar o varietate a Pulmonariei rubra (Borza, 1947), n timp

ce Ciocrlan (2000) consider specia P. filarszkyana ca fiind o specie distinct, fr legturi

taxonomice cu P. rubra.

Fig. 1. Pulmonaria rubra subsp. rubra (foto: Dana uteu).

P. filarszkyana (P. rubra subsp. filarszkyana) este o specie endemic, aparinnd

Carpailor de Est (Beldie, 1979) care se difereniaz de P. rubra prin indumentul mult mai

scurt (1 mm) i mai moale (Guuleac, 1960). n general se consider a fi rspndit n

pdurile ntunecoase de molid i ntre jnepeni, n munii Maramureului, Rodnei i

Suhardului.

Onosma arenaria (denumire popular otrel) este o plant robust, hispid, bogat

foliat, cu aspect verde cenuiu. n timp ce la nivel de continent este rspndit peste tot, cu

excepia regiunilor nordice, n Romnia are o distribuie controversat, unii autori considernd

c se ntlnete n locuri nisipoase, coline aride, stepe, dune fixate fie din regiunile Baia Mare,

Cluj, Hunedoara, Timioara, Bucureti, Constana, Iai (Grinescu i Nyrdy, 1960) fie doar

n Delta Dunrii (Teppner, 1996).

n ceea ce privete variabilitatea speciei, Ciocrlan (2000) consider c prezint dou

subspecii: O. arenaria subsp. arenaria i O. arenaria subsp. pseudoarenaria, cea din urm

considerat un endemit pentru Transilvania.


5

Onosma pseudoarenaria (O. arenaria subsp. pseudoarenaria) este o specie heliofil

care habiteaz n zona colinar (fig. 2), pe soluri uscate, nisipoase i se caracterizeaz prin

populaii compuse din indivizi puini, deoarece se nmuleste greu din cauza fructelor

sclerificate, ceea ce i confer statutul de specie vulnerabil (Dihoru i Negrean, 2009). Difer

de O. arenaria prin urmtoarele caracteristici: numrul de cromozomi (2n=26 i nu 2n=20 ca

i n cazul O. arenaria), setule de 4-5 ori (nu de 8-10 ca i n cazul O. arenaria) mai scurte

dect setele iar spaiul dintre pernie este glabru (nu acoperit de periori rari i scuri ca i la

O. arenaria).

Este rspndit n regiunile Cluj, Braov, Hunedoara (Grinescu i Nyrdy, 1960).

n timp ce unii autori (Ciocrlan, 2000, 2009) o consider specie subordonat speciei

O. arenaria, ali autori (Rauschert, 1976) i subordoneaz 8 subspecii din Europa Central i

din Peninsula Balcanic, printre care i Onosma pseudoarenaria subsp. pseudoarenaria

considerat un endemit transilvnean, iar Flora Europaea consider aceast specie ca

reprezentnd un endemit pentru Romnia i neavnd subspecii subordonate, subspeciile

alocate de Rauschert fiind considerate specii independente (Ball i Riedhl, 1972).

Fig. 2. Onosma pseudoarenaria n habitatul natural de la Suatu, jud. Cluj (foto: Liviu Filipa).

Eritrichium nanum (denumire popular ochiul arpelui) este o plant rar, cu populaii

srace, care se ntlnete pe stncriile i bolovniurile calcaroase expuse la soare din etajul

alpin i subalpin (fig. 3). Se ntlnete n Alpi Centrali i de Sud i n Carpaii de S-E (Chater,

1972).

Variabilitatea acestei specii este destul de discutat, unii autori considernd

subspeciile genului drept specii separate sau varieti. Flora Europaea (Chater, 1972) i


6

Ciocrlan (2009) iau n considerare doar dou subspecii: E. nanum subsp. nanum i E. nanum

subsp. jankae.

Fig. 3. Eritrichium nanum subsp. nanum n habitatul natural din Piatra Iorgovanului (stnga; foto: Dana uteu) i

n Munii Ciuca (dreapta; foto: Liviu Filipa).

Eritrichium jankae (Eritrichium nanum subsp. jankae) este considerat o specie

endemic pentru Romnia (Beldie, 1967; Grinescu, 1960; Borza, 1947; Ciocrlan, 2000;

Chater, 1972). Difer morfologic de E. nanum subsp. nanum prin inflorescena i frunzele

ndesuit alb argintiu lanate, prin tulpini de 5-7,5 cm (nu de 1-5 cm ca i la subsp. nanum), prin

frunzele late de 3-4,5 mm (nu de 1,5-3 mm ca i la subsp. nanum), precum i prin caliciul

puin mai lung, dar are acelai numr de cromozomi.

Se gsete n Munii Rodnei, Ciuca, Brsei, Bucegi, Iezer, Fgra, Cpnii i

Godeanu (Ciocrlan, 2009).

Primula elatior (denumire popular ciuboica cucului) este o specie ierbacee, peren,

diploid 2n=22 (Jacquemyn i colab., 2004). Se ntlnete n pduri mixte de foioase aflate n

zone temperate din Europa de Vest i Central, n nord gsindu-se pn n Danemarca i sudul

Suediei i n est pn n Asia Central (Woodell, 1969). n Romnia este o specie comun

(Nyrdy i Guuleac, 1960).

Variabilitatea Primulei elatior a fost subiectul unor lungi dezbateri n lumea tiinific

i nc nu s-a ajuns la un consens n ceea ce privete formele i varietile acestei specii. Cei

mai muli autori i atribuie acestei specii, printre multe forme, varieti i subspecii, i

subspeciile leucophylla i intricata (Ciocrlan, 2000; Valentine i Kress, 1972; Wright Smith

i Fletcher, 1947).

Primula leucophylla (Primula elatior subsp. leucophylla) prezint o morfologie (fig.

4) asemntoare cu P. elatior, de care se deosebete cu greu. Caracterele care o difereniaz


7

de aceasta sunt urmtoarele: frunze gri tomentoase pe dos i caliciul de 6-8 mm lungime

(Valentine i Kress, 1972; Ciocrlan, 2000).

Este considerat un endemit al Carpailor Orientali, fiind rspndit n Munii

Maramureului, Rodnei, Giurgeu, Suhard, Postvaru, Ceahlu, Raru, Obcinele Bucovinene

(Nyrdy i Guuleac, 1960), dup unii autori ntlnindu-se i n masivul Piatra Craiului,

Munii Climani, Ciuca, Nemira i Vrancei.

Fig. 4. Primula leucophylla n Munii Ceahlu (foto: Liviu Filipa).

Primula intricata (P. elatior subsp. intricata) se ntlnete n pajitile umede din

regiunea subalpin i alpin, n Munii Pirinei, Alpi i peninsula Balcanic (Nyrdy i

Guuleac, 1960). n Romnia, este o specie rar care habiteaz n Munii Bucegi i Munii

Brsei (Beldie, 1979; Nyrdy i Guuleac, 1960).

Difer de P. elatior prin bracteele mai lungi, lobii corolei mai profund emarginai iar

capsula este de lungimea caliciului (10-12 mm, spre deosebire de P. elatior unde capsula

ntrece cu mult caliciul) (Nyrdy i Guuleac, 1960).

Statutul ei taxonomic este nc dezbtut, unii autori o consider o specie distinct

(Grenier i Godron, 1853; Nyrdy i Guuleac, 1960; uteu i colab., 2011), alii o consider

o varietate a P. elatior (Pax i Knuth, 1889), iar alii o consider drept o subspecie a P. elatior

(Ldi, 1927; Ciocrlan, 2000; Valentine i Kress, 1972; Beldie, 1979; Wright Smith i

Fletcher, 1947).


8

Contribuii personale

4. Materiale i metode (selectiv)

Strategia de recoltare a materialului biologic

Materialul biologic folosit la analize a fost recoltat din mai pn n septembrie, ntre

anii 2006-2010 din mai multe locaii. S-a ncercat recoltarea unui numr de minim 5 indivizi

din fiecare populaie, care au fost introdui imediat n tuburi pline cu silicagel. n paralel, au

fost recoltate i vouchere care au fost folosite la determinarea fr dubii a speciei colectate.

Ulterior, aceste vouchere au fost puse la presat n ierbar. Adiional, n cadrul analizei speciilor

P. elatior - P. leucophylla - P. intricata s-a folosit i material de ierbar provenit din colecia

Herbarului Cluj-Napoca aflat n incinta Grdinii Botanice Alexandru Borza.

Extracia ADN-ului

S-a realizat prin mai multe metode, i anume: un protocol adaptat dup Doyle i Doyle

(1987, 1990), un protocol adaptat dup Mengoni (Mengoni i colab., 2000) i prin utilizarea

unui kit comercial: DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen).

Analiza microsateliilor cloroplastici

S-a bazat pe utilizarea a ase amorse dintre cele descrise de Weising i Gardner

(1999): ccmp 2, ccmp 3, ccmp 4, ccmp 6, ccmp 7 i ccmp 10. Aceast analiz a fost utilizat

doar pentru testarea polimorfismului n cazul unor populaii aparinnd genurilor Onosma i

Pulmonaria. Interpretarea rezultatelor s-a realizat prin analiza prezenei sau absenei benzilor

corespunztoare amplificrii cu fiecare amors n parte din gelul de poliacrilamid.

Analiza PCR-RFLP

Analiza PCR-RFLP s-a realizat pe trei regiuni din genomul cloroplastic: trnD-T, trnC-

D i psbA-trnS (dup Demesure i colab., 1995). Aceast analiz a fost utilizat doar pentru

testarea polimorfismului n cazul unor populaii aparinnd genurilor Onosma i Pulmonaria.

Interpretarea rezultatelor s-a realizat prin analiza prezenei sau absenei benzilor

corespunztoare amplificrii cu fiecare amors n parte din gelul de poliacrilamid.

Analiza AFLP

Analiza AFLP s-a realizat la toi indivizii din unele populaii din genurile Primula,

Eritrichium i Onosma. Pentru diferitele genuri de plante luate n lucru s-au folosit combinaii

diferite de amorse sugerate n literatura de specialitate. Scoringul fragmentelor a fost realizat

cu programul GeneMapper v.4.0 (Applied Biosystems) pentru a produce o matrice bazat pe

prezen/absen. Cu ajutorul scriptului n platforma R, AFLPdat, (Ehrich, 2006) s-au estimat


9

proporia locilor polimorfi, diversitatea genetic a lui Nei (Nei, 1987) i indexul de raritate. Pe

baza distanei Nei i Li (Nei i Li, 1979) a fost generat un arbore Neighbor Joining cu ajutorul

programului Splistree v. 4.10 (Huson i Bryant, 2006). Analiza varianei moleculare

(AMOVA) a fost obinut prin utilizarea programului ARLEQUIN v. 3.5 (Excoffier i

Lischer, 2010). Tot n cadrul programului Arlequin a fost calculat i FST (fixation index).

Analiza Principal Coordinate (PCO) s-a efectuat cu programul PAST (Hammer i colab.,

2001) utiliznd doi indici: indicele Simpson i indicele euclidean.

Secvenierea

S-a realizat secvenierea Sanger la toate cele patru genuri de plante n studiu:

Pulmonaria, Onosma, Eritrichium i Primula. S-a efectuat secvenierea att a regiunii ITS1

aparinnd genomului nuclear ct i a unor regiuni aparinnd genomului cloroplastic: intronii

trnL, trnG, rpl16, rps16, spacerii intergenici rpl32-ndhF, rps16-trnK, trnL-trnF, trnD-trnE,

trnS-trnfM, psbD-trnT, trnH-psbA, trnS-trnG, trnT-trnL. Secvenele obinute au fost

asamblate i editate manual utiliznd programul BioEdit v.7.0.9.0 (Hall, 1999). Ulterior,

analiza secvenelor a fost realizat cu programul Mega 4.1 (Tamura i colab., 2007).

Construcia arborilor s-a realizat prin metodele NJ, ML, ME, UPGMA folosind modelul

Kimura 2P (1980).

5. Rezultate i discuii (selectiv)

5.1. Rezultate la genul Pulmonaria

Analiza microsateliilor cloroplastici nu relev polimorfism ntre populaiile de Pulmonaria

rubra i Pulmonaria filarszkyana pentru niciuna dintre amorsele utilizate.

Analiza PCR-RFLP nu relev niciun polimorfism ntre populaiile de Pulmonaria rubra i

Pulmonaria filarszkyana pe baza amorsele DT i AS, dar evideniaz un polimorfism la

nivelul benzilor 2 i 5 datorat inseriei/deleiei unui fragment pentru amorsa CD.

Analiza secvenierii

Din cele 13 regiuni selectate s-a reuit amplificarea i secvenierea doar a 8 regiuni:

ITS1, rpL16, trnG, trnL, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E i trnH-psbA. Secvena concatenat

a acestor markeri, cu lungimea de aproximativ 5000 nucleotide a fost utilizat pentru

construcia de arbori prin metodele ME (fig. 5), ML, NJ, UPGMA.


10

Fig. 5. Dendrogram la genul Pulmonaria, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor ITS1, rpL16, trnG,

trnL, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E i trnH-psbA.

5.2. Discuii la genul Pulmonaria

Investigarea relaiilor filogenetice dintre Pulmonaria rubra i Pulmonaria filarszkyana

Arborii construii prin metodele ME (fig. 5), ML, NJ i UPGMA sunt congrueni i

prezint dou grupri: prima alctuit de populaiile de P. officinalis i cea de-a doua alctuit

din populaiile de P. rubra i P. filarszkyana. Grupul compus din populaiile de P. officinalis

se separ cu o valoare maxim de bootstrap, statutul taxonomic al acestei specii fiind clar

delimitat i prin caractere morfologice. n cadrul celui de al doilea grup, subgruparea alctuit

de P. filarszkyana este unitar, cele trei populaii avnd toate acelai haplotip indiferent de

markerii utilizai. Acest fapt este de neles dac se are n vedere proximitatea dintre punctele

de colectare, toate aparinnd judeului Maramure. Arealul acestui taxon fiind limitat la

cteva locaii din Carpaii de Est, permite existena unui flux genic nentrerupt ntre locaii.

Taxonul P. rubra se separ n dou subgrupri. Prima subgrupare (alctuit din populaiile din

Valea Cepelor, Arieeni i Valea Ierii) se datoreaz unei proximiti n poziia punctelor de

colectare, dar, n ciuda acestei proximiti, toate cele trei populaiile au haplotipuri uor

diferite. A doua subgrupare (alctuit din populaiile din Retezat, Giurgeu-Hma i Prul

Vii Seci) adun populaii din zone/judee ndeprtate ale rii, ceea ce poate fi explicat prin

faptul c traseul fluxului genic dintre populaiile de P. rubra se face de-a lungul arcului

carpatic. P. rubra este o specie marcant a asociaiei Fagetum dacicum, asociaie caracterizat

prin fgete pure sau aproape pure. La nivelul arcului carpatic aceast asociaie continu

aproape nentrerupt, ceea ce nlesnete fluxul genic. Pe de alt parte, populaiile din Carpaii


11

Occidentali sunt separate de cele din Carpaii Orientali i Meridionali prin vi precum valea

Mureului i valea Someului care pot reprezenta bariere geografice pentru fluxul genetic. n

plus, nici pdurile de fag nu continu nentrerupt ntre grupa Carpailor Occidentali i restul

grupelor carpatice.

Dei grupul compus din populaiile de P. filarszkyana este bine delimitat n cadrul

gruprii comune cu P. rubra, totui plasarea acestui taxon n aceast grupare susine mai mult

punctul de vedere conform cruia P. filarszkyana este o subspecie a Pulmonariei rubra i nu o

specie distinct cum este cazul speciei P. officinalis.

5.3. Concluzii la genul Pulmonaria

La genul Pulmonaria, utilizarea microsateliilor cloroplastici nu este suficient,

rezoluia lor nefiind suficient de fin.

Analiza markerilor PCR-RFLP a evideniat polimorfism ntre taxonii P. rubra i P.

filarszkyana atunci cnd se utilizeaz regiunea trnC-trnD.

Studiile bazate pe analiza secvenelor indic faptul c taxonului P. filarszkyana ar

trebui s-i revin statutul de subspecie a speciei Pulmonaria rubra.

5.4. Rezultate la genul Onosma

Analiza microsateliilor cloroplastici nu relev polimorfism ntre populaiile de Onosma sp.

studiate pentru niciuna dintre amorsele utilizate.

Analiza PCR-RFLP nu relev niciun polimorfism ntre populaiile de Onsosma sp. pe baza

amorsei DT, dar evideniaz un polimorfism pentru amorsele CD i AS. Polimorfismul

evideniat de amorsa CD este greu de decelat din cauza diferenelor mici dintre benzi, iar

stabilirea haplotipurilor se realizeaz pe baza amorsei AS. Polimorfismul generat de perechea

de amorse AS este vizibil la banda numrul 5 i reprezint inseria/deleia unui fragment de

nucleotide.

Analiza secvenierii

Pe baza secvenei ITS1 de aproximativ 350 pb au fost construii arbori prin metodele

ME (fig. 6), ML, NJ, UPGMA.

Din cele 13 regiuni selectate s-a reuit amplificarea i secvenierea doar a nou

regiuni: rpL16, trnG, trnL, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E, trnT-L, rps16-trnK i trnH-psbA,

cu lungimea concatenat de aproximativ 6000 nucleotide, care au fost utilizate pentru

construcia de arbori filogenetici. Arborii au fost construii prin metodele ME (fig. 7), ML,

NJ, UPGMA.


12

Fig. 6. Dendrogram la genul Onosma, construit prin metoda ME pe baza secvenei ITS1.

Fig. 7. Dendrogram la genul Onosma, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor rpL16, trnG, trnL, rpl32-

ndhF, psbD-trnT, trnD-E, trnT-L, rps16-trnK i trnH-psbA.


13

Analiza AFLP

Cu ajutorul scriptului n platforma R, AFLPdat, s-au determinat proporia locilor

polimorfi, diversitatea genetic a lui Nei i indicele de raritate (tabelul 1).

Tabelul 1. Proporia locilor polimorfi, diversitatea genetic i indicele de raritate pentru

populaiile genului Onosma.

Specia Cod

populaie Proporia

markerilor variabili

Diversitatea

genetic Indicele de

raritate (DW)

Onosma viridis Ors-OV 0,0660 0,0440 21,1819

Onosma visianii BC-OVs 0,1718 0,0845 192,8069

Onosma arenaria CD-OA 0,1762 0,0819 28,2933

LD-OA 0,0748 0,0352 59,9596

Onosma

pseudoarenaria

Cb-OP 0,2334 0,1002 17,7642

C-OP 0,2951 0,1353 29,4634

Del-OP 0,2070 0,0845 19,3396

GS-OP 0,2290 0,1027 30,9598

Go-OP 0,1277 0,0851 5,3400

IC-OP 0,1938 0,0886 31,9461

OM-OP 0,1806 0,0809 21,0883

PH-OP 0,1806 0,0771 44,7643

Sf-OP 0,2731 0,1490 12,1602

S-OP 0,1497 0,0722 16,4296

Pe baza matricei AFLP a fost generat un arbore Neighbor Joining (fig. 8).

Fig. 8. Dendrogram la genul Onosma, construit prin metoda NJ, pe baza matricei AFLP.


14

Rezultatele analizei Principal Coordinate (PCO) pe baza matricei AFLP folosind

indicele euclidean sunt prezentate n figura 9.

Fig. 9. Rezultate PCO utiliznd indicele euclidean la genul Onosma pe baza matricei AFLP (negru O.

pseudoarenaria, verde O. viridis, mov O. arenaria, albastru O. visianii).

Analizele varianei moleculare (AMOVA) s-au realizat cu partajarea varianei genetice

totale pe diferite nivele (n cadrul populaiilor, ntre populaii i ntre grupe de populaii).

Aadar, s-au realizat mai multe moduri de definire ale grupelor i pentru fiecare din acestea s-

a calculat variana molecular pe diferite nivele. Rezultatele obinute n cazul cnd nu se

definete niciun grup sunt trecute n tabelul 2.

Tabelul 2. Rezultatele AMOVA fr definirea grupurilor la genul Onosma.

Sursa variaiei Procentul de variaie FST

ntre populaii 63,68083 0,63681

n cadrul populaiilor 36,31917

n cazul n care s-au definit trei grupuri, primul corespunznd speciei O. visianii, al

doilea corespunznd speciei O. viridis (toate cele patru populaiile) i al treilea fiind un grup

comun O. arenaria i O. pseudoarenaria, s-au obinut rezultatele evideniate n tabelul 3.

Tabelul 3. Rezultatele AMOVA cu definirea a trei grupuri la genul Onosma.


ntre grupuri 51,95108 0,77651 ntre populaiile din cadrul

grupurilor

25,69971


-0.36 -0.3 -0.24 -0.18 -0.12 -0.06 0 0.06 0.12

Coordinate 1 36%

-0.2

-0.16

-0.12

-0.08

-0.04

0

0.04

0.08

0.12

0.16

Coord

inate

2 1

1%


15

n cazul n care s-au definit patru grupuri, primul corespunznd speciei O. visianii, al

doilea corespunznd speciei O. viridis (toate cele patru populaiile), al treilea corespunznd

speciei O. arenaria (cele dou populaii) i al patrulea corespunznd speciei O.

pseudoarenaria (toate cele 12 populaii) s-au obinut rezultatele evideniate n tabelul 4.

Tabelul 4. Rezultatele AMOVA cu definirea a patru grupuri la genul Onosma.



grupurilor

24,38


5.5. Discuii la genul Onosma

Investigarea relaiilor filogenetice dintre Onosma arenaria i Onosma pseudoarenaria

Arborii generai pe baza secvenei ITS1 construii prin metodele ME (fig. 6), ML, NJ

i UPGMA, prezint o structur identic indiferent de metoda utilizat. n cadrul sub-

subgrupului format din populaiile de O. arenaria i O. pseudoarenaria, se observ o separare

slab a celor doi taxoni, pe baza unei singure transversii. Dei secvenele ITS au rezolvat cu

succes probleme taxonomice intragenerice la genuri strns nrudite cu genul Onosma

(Weigend i colab., 2009; Cohen i Davis, 2009; Mansion i colab., 2009; Selvi i colab.,

2009), n acest caz rezoluia lor este foarte sczut, situaie semnalat i de Kolarik i colab.

(2010) care afirm c cei doi taxoni se grupeaz ntr-o singur clad cu rezoluie intern

sczut datorat unei lipse de variaie.

Arborii construii prin metodele ME (fig. 7), ML, NJ i UPGMA, pe baza secvenelor

concatenate a celor nou regiuni cloroplastice arat o situaie diferit fa de arborii generai

pe baza secvenei ITS1. Populaiile aparinnd taxonilor O. arenaria i O. pseudoarenaria nu

se mai separ cum a fost n cazul secvenei ITS1, singura populaie care se separ din acest

subgrup fiind populaia de O. pseudoarenaria subsp. tridentina colectat din Serbia. Aceast

diferen ntre rezoluia celor doi markeri poate fi explicat pe baza naturii lor. Se cunoate

faptul c ADN-ul cloroplastic din cauza naturii sale nerecombinante, a ratei de mutaie

sczute i a modului de transmitere maternal, pstreaz modelele genetice strvechi i

ilustreaz procese istorice precum izolarea refugial, divergena genetic, efectul fondatorului,

rutele de migrare pentru perioade mai mari de timp dect markerii nucleari motenii

biparental (Comes i Kadereit, 1998), pe cnd ADN-ul nuclear, datorit recombinrii i ratei

crescute de mutaie, ilustreaz procese genetice mult mai recente. Unii autori (Teppner, 1971)

afirm faptul c cele dou specii sunt relativ noi i s-au format prin hibridizare. Astfel, O.

pseudoarenaria probabil a provenit prin alotetraploidizarea unor taxon de tip Haplotricha cu


16

12 cromozomi (exp. O. echioides) cu un taxon de tip Asterotricha cu 14 cromozomi (exp. O.

fastigiata), iar O. arenaria a provenit probabil prin retroncruciarea O. pseudoarenaria cu

unii taxoni de tip Haplotricha cu 12 cromozomi. Dat fiind istoria strns legat a celor doi

taxoni, este explicabil aceast lips de variaie la nivel de ADN cloroplastic, n timp ce la

nivel de ADN nuclear cele dou specii se difereniaz mai rapid una de cealalt. Diferenierea

populaiei de O. pseudoarenaria subsp. tridentina din Serbia fa de celelalte populaii de O.

pseudoarenaria este explicabil att prin faptul c este o subspecie, unii autori chiar

considernd-o specie valid (Ball i Riedhl, 1972), ct i prin semnalul biogeografic datorat

distanei geografice dintre populaii.

n ceea ce privete estimarea parametrilor diversitate genetic, proporia markerilor

variabili i indicele de raritate bazai pe matricea AFLP (tabelul 1), nu se obin rezultate

concludente, valorile fiind relativ egale pentru toate populaiile de Onosma. Singura specie

care se difereniaz clar pe baza indicelui de raritate este specia O. visianii, difereniere care

se poate datora att semnalului taxonomic ct i semnalului biogeografic, populaia fiind

colectat din Croaia.

n ceea ce privete arborele NJ generat pe baza matricei AFLP (fig. 8) se observ

urmtoarea situaie: populaiile de O. viridis i O. visianii se separ de restul grupului, ulterior

separndu-se i una de cealalt. Lungimea ramurilor n cazul acestor dou specii arat i mai

net separarea lor fa de grupul O. arenaria O. pseudoarenaria. n cadrul acestui grup, cele

dou populaii de O. arenaria se grupeaz distinct fa de O. pseudoarenaria cu o valoare

maxim de bootstrap. Lungimea acestei ramuri sugereaz nc o dat faptul c desprinderea

celor dou specii este relativ recent, dar c la nivel de genom nuclear ele sunt clar

difereniate. n cadrul aceluiai grup se mai observ diferenierea a dou populaii: populaia

din Serbia care este evident izolat genetic fa de restul populaiilor de O. pseudoarenaria i

populaia din Govjdia (judeul Hunedoara) care este situat ntr-o zon mpdurit, la poalele

Carpailor de Sud, i este evident de asemenea izolat genetic. Restul populaiilor de O.

pseudoarenaria formeaz subgrupuri distincte. Totui, n cazul populaiilor din Puli (judeul

Hunedoara), Izvorul Criului (judeul Slaj) i Suatu (judeul Cluj), valorile de bootstrap sunt

mari i arat izolarea genetic recent a acestor populaii.

Analiza AMOVA pe baza matricei AFLP atunci cnd nu se definesc grupuri arat o

variaie interpopulaional de 63,68% (tabelul 2) ceea ce sugereaz existena unor populaii

relativ distincte genetic care se pot grupa pe criterii taxonomice i/sau biogeografice. Acelai

fapt este susinut i de valoarea ridicat a indicelui FST (0,63681). n cazul n care se definesc

trei grupuri (tabelul 3), unul compus din populaia de O. visianii, al doilea compus din


17

populaiile de O. viridis i al treilea compus din populaiile de O. arenaria i O.

pseudoarenaria se obine un procent de variaie ntre grupuri de 51,95% ceea ce arat o bun

separare i definire a grupurilor. i creterea valorii indicelui FST la 0,77651 sugereaz aceeai

difereniere clar a grupurilor. Atunci cnd se definesc patru grupuri (tabelul 4), unul compus

din populaia de O. visianii, al doilea compus din populaiile de O. viridis, al treilea compus

din populaiile de O. arenaria i al patrulea compus din populaiile de O. pseudoarenaria se

obine un procent de variaie ntre grupuri uor mai sczut dect n cazul precedent (48,31%)

ceea ce sugereaz c O. arenaria este delimitat de O. pseudoarenaria, dar aceast delimitare

este relativ recent comparativ cu delimitarea speciilor O. visianii i O. viridis fa de grupul

O. arenaria O. pseudoarenaria. Concomitent se observ i o scdere a indicelui FST

(0,72692), ceea ce arat aceeai delimitare mai puin evident a speciei O. pseudoarenaria

fa de O. arenaria, comparativ cu diferenierea clar fa de celelalte specii precum O.

visianii i O. viridis.

Analiza PCO pe baza matricei AFLP (fig. 9) arat o delimitare puternic a speciei O.

visianii fa de restul speciilor, o delimitare clar dar nu aa puternic a speciei O. arenaria, o

delimitare a speciei O. viridis n comun cu cele dou populaii de O. pseudoarenaria mai

divergente (cea din Serbia i cea din Govjdia) i o grupare comun a restului de populaii de

O. pseudoarenaria.

Aadar, majoritatea analizelor efectuate indic faptul c cele dou specii, Onosma

arenaria i Onosma pseudoarenaria, reprezint specii distincte dar relativ recent separate,

rezultat care confirm analizele palinologice i cariologice.

5.6. Concluzii la genul Onosma

Secvena ADNnr, ITS1, relev o uoar separare a taxonului O. arenaria de O.

pseudoarenaria pe baza unei singure modificri punctiforme.

Analiza secvenelor provenite de la nou regiuni aparinnd genomului cloroplastic nu

relev nicio separare a celor doi taxoni.

Rezultatele analizei AFLP separ clar cei doi taxoni.

Pe baza acestor rezultate, adugate la diferenierea cariologic i palinologic, reiese

c cei doi taxoni reprezint uniti distincte desprinse relativ recent una de cealalt.

5.7. Rezultate la genul Eritrichium

Analiza secvenierii

Pe baza secvenei ITS1 de aproximativ 350 pb au fost construii arbori prin metodele

ME (fig. 10), ML, NJ, UPGMA.


18

Fig. 10. Dendrogram la genul Eritrichium, construit prin metoda ME pe baza secvenei ITS1.

Din cele 13 regiuni cloroplastice selectate s-a reuit amplificarea i secvenierea doar a

nou regiuni: rpL16, trnG, trnL, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E, trnT-L, rps16 i trnH-psbA,

cu o lungime concatenat de aproximativ 5800 nucleotide, care au fost utilizate pentru

construcia de arbori filogenetici. Arborii au fost construii prin metodele ME (fig. 11), ML,

NJ, UPGMA.

Fig. 11. Arbore de consens 50% la genul Eritrichium, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor rpL16,

trnG, trnL, rps16, rpl32-ndhF, psbD-trnT, trnD-E, trnT-L i trnH-psbA.

Analiza AFLP

Parametrii determinai cu scriptul AFLPdat: locii polimorfi, diversitatea genetic a lui

Nei i indicele de raritate sunt prezentai n tabelul 5.


19


populaiile genului Eritrichium.

Specia Populaia Proporia markerilor variabili

Diversitatea

genetic Indicele de

raritate (DW)

Eritrichium

jankae

GH-EJ 0,3957 0,2228 25,7616

C-EJ 0,5294 0,2852 24,0836

Eritrichium

nanum

ALPI-EN 0,2459 0,1345 94,9871

PC-EN 0,3636 0,1903 42,2113

CZ-EN 0,4759 0,3172 18,4224

CG-EN 0,3957 0,1803 62,1173

BO-EN 0,3689 0,1786 39,5904

Rei-EN 0,2566 0,1381 24,4530


Fig. 12. Dendrogram la genul Eritrichium, construit prin metoda NJ, pe baza matricei AFLP.


20

Rezultatele AMOVA n cazul n care s-au definit dou grupuri, primul corespunznd

populaiilor de Eritrichium nanum din Alpi i al doilea corespunznd populaiilor din Carpai

de E. nanum i E. jankae, sunt evideniate n tabelul 6.

Tabelul 6. Rezultatele AMOVA cu definirea a dou grupuri la genul Eritrichium.



grupurilor

9,60


n cazul n care se definesc trei grupuri, att pe criterii taxonomice ct i

biogeografice, primul grup coninnd populaiile de E. nanum din Alpi, al doilea grup

coninnd populaiile de E. nanum din Carpai i al treilea grup coninnd populaiile de E.

jankae, se obin rezultatele prezentate n tabelul 7.

Tabelul 7. Rezultatele AMOVA cu definirea a trei grupuri la genul Eritrichium.



grupurilor

15,4


Rezultatele analizei Principal Coordinate (PCO) pe baza matricei AFLP sunt

prezentate n figura 13.

Fig. 13. Rezultate PCO la genul Eritrichium pe baza matricei AFLP (negru populaiile de E. nanum i E.

jankae din Carpai, ptrat albastru populaiile de E. nanum din Alpi).


21

5.8. Discuii la genul Eritrichium

Investigarea relaiilor filogenetice dintre Eritrichium nanum i Eritrichium jankae

Analiza secvenei nucleare ITS1 nu indic nicio separare ntre taxonii Eritrichium

nanum i Eritrichium jankae, toate populaiile aparinnd genului Eritrichium colectate din

Romnia prezentnd acelai ribotip. n schimb, la acest nivel se observ o separaie cert

biogeografic ntre populaiile colectate din Carpai i cele colectate din Alpii Elveieni. Toate

metodele de construire ale arborilor ME (fig. 10), NJ, ML, UPGMA genereaz acelai model

de separaie cu o valoare de bootstrap de 99 ntre populaiile aparinnd celor dou zone

geografice. Aceast separaie de criterii biogeografice este meninut i la nivel de markeri

AFLP. Arborele NJ generat pe baza matricei AFLP (fig. 12) nu indic nicio separare ntre

populaiile de Eritrichium din Romnia, dar le separ pe acestea de populaiile din Elveia cu

o valoare maxim de bootstrap.

Analiza secvenelor cloroplastice prezint o situaie oarecum diferit. n cadrul

arborilor generai pe baza acestor regiuni (fig. 11) se menine aceeai separaie observat la

nivelul secvenei nucleare ITS1 ntre populaiile de Eritrichium colectate din Carpai i cele

colectate din Alpii Elveieni, dar se mai observ o separaie ntre populaiile de Eritrichium

colectate din Romnia, populaia de Eritrichium colectat din Masivul Piatra Craiului

separndu-se de restul populaiilor din Romnia. Aceast populaie are un haplotip

intermediar ntre cel existent la populaiile din Alpi i cel existent la populaiile din Carpai.

n ceea ce privete proporia markerilor variabili i diversitatea genetic estimate pe

baza matricei AFLP (tabelul 5), ntre populaiile de Eritrichium nanum i E. jankae nu se

observ diferene marcante. n cazul indicelui de raritate se observ o valoare mare (94,98)

pentru populaiile din Alpi, ceea ce indic o divergen a acestora fa de populaiile din

Carpai, pe criterii biogeografice, dar nu se observ nicio separare a populaiilor de E. jankae

fa de cele de E. nanum.

n cadrul analizei AMOVA se observ o separaie clar ntre grupul format de

populaiile din Alpi i cel format din populaiile din Carpai, mai mult de jumtate din variaie

(53,48%) datorndu-se componentei intergrupuri (tabelul 6). Identic, creterea indicelui FST

de la 0,37392 atunci cnd nu se definesc grupuri la 0,63086 cnd sunt definite dou grupuri

(cel din Alpi i cel din Carpai), arat faptul c cele dou grupuri sunt bine delimitate. Atunci

cnd se realizeaz analiza AMOVA cu includerea unui grup format din cele dou populaii de

E. jankae (tabelul 7) se obine o valoare mult mai mic a varianei dintre grupuri (29,9%)

dect n cazul precedent, ceea ce indic faptul c grupurile nu sunt bine definite. Acelai lucru

este susinut i de scderea valorii FST de la 0,63086 la 0,42897.


22

Analiza PCO (fig. 13) realizat pe baza matricei AFLP indic aceeai separare ntre

populaiile de Eritrichium din Alpi i restul populaiilor de Eritrichium din Carpai, nici n

acest caz populaiile de E. jankae nu se separ de restul populaiilor din Romnia.

Toate analizele efectuate indic faptul c taxonul E. jankae nu merit rangul de specie

dar nu i merit nici rangul de subspecie, cei doi taxoni nedifereniindu-se la nivel genetic.

Deoarece diferenierea morfologic ntre cei doi taxoni exist, se impune posibilitatea

considerrii taxonului E. jankae drept un ecotip nedifereniat genetic al taxonului E. nanum.

Dezvoltarea indumentului alb argintiu lanat la nivelul inflorescenei i frunzelor, i care duce

la ncetinirea evaporrii apei, poate fi o modificare aprut ca rspuns la factorii de mediu, i

anume climatul secetos n care se gsete E. jankae. Aadar, taxonul E. jankae poate

reprezenta doar un ecotip difereniat morfologic dar nu i genetic al taxonului E. nanum.

5.9. Concluzii la genul Eritrichium

Rezultatele analizelor bazate pe ITS1, ADNcp i AFLP nu indic separarea taxonului

E. jankae de taxonul E. nanum, dar indic separarea biogeografic a populaiilor de E. nanum

din Alpi fa de populaiile de E. nanum din Carpai, cu o excepie reprezentat de populaia

de E. nanum din Munii Piatra Craiului, care pe baza ADNcp are un haplotip intermediar ntre

cele dou grupuri.

Niciuna dintre analizele efectuate nu indic separarea taxonului E. jankae de taxonul

E. nanum, ci relev faptul c cei doi taxoni sunt identici din punct de vedere genetic.

Pe baza rezultatelor obinute, E. jankae reprezint, cel mai probabil, un ecotip

nedifereniat genetic al taxonului E. nanum.

5.10. Rezultate la specia Primula leucophylla

Analiza secvenierii

Secvenele provenite de la trei markeri moleculari: rpL16, psbD-trnT i trnH-psbA, cu

lungimea concatenat de aproximativ 2700 nucleotide, au fost utilizate pentru construcia de

arbori prin metodele ME (fig. 14), ML, NJ, UPGMA.

Analiza AFLP

Parametrii determinai cu scriptul AFLPdat: locii polimorfi, diversitatea genetic a lui

Nei i indicele de raritate sunt prezentai n tabelul 8.


23

Fig. 14. Dendrogram la genul Primula, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor rpL16, psbD-trnT i

trnH-psbA.


populaiile genului Primula.

Specia Populaia Proporia markerilor

variabili

Diversitatea

genetic

Indicele de

raritate (DW)

Primula elatior

Ap-PE 0,1630 0,0781 18,4976

Fg-PE 0,1545 0,0746 25,3190

Pos-PE 0,2489 0,1270 58,5491

Pcra-PE 0,1888 0,0892 20,7056

Roc-PE 0,2060 0,0987 17,1952

Rot-PE 0,1673 0,0815 14,0721

Cear-PE 0,1931 0,0969 11,6968

Tatr-Kob-PE 0,2017 0,0978 21,5133

Tatr-Pol-PE 0,2060 0,0995 20,0620

Tatr-Lil-PE 0,2017 0,1101 21,0011

Alp-Pass-PE 0,1416 0,0695 19,3688

Jul-PE 0,0944 0,0429 17,8315

Alp-Alt-PE 0,1373 0,0660 16,3522

Alp-Gross-PE 0,2017 0,1021 17,0290

Primula

leucophylla

Ciuc-PL 0,1759 0,0866 21,8210

Gho-PL 0,1330 0,0652 14,7325

Clp-PL 0,0472 0,0472 3,7617

Clt-PL 0,1201 0,0575 15,6667


24


Fig. 15. Dendrogram la genul Primula, construit prin metoda NJ, pe baza matricei AFLP.

Rezultatele AMOVA obinute n cazul cnd nu se definete niciun grup sunt trecute n

tabelul 9.

Tabelul 9. Rezultatele AMOVA fr definirea grupurilor la genul Primula.




n cazul n care s-au definit dou grupuri pe criterii taxonomice, primul corespunznd

populaiilor de Primula elatior i al doilea corespunznd populaiilor de Primula leucophylla,

s-au obinut rezultatele evideniate n tabelul 10.

Tabelul 10. Rezultatele AMOVA cu definirea a dou grupuri pe criterii taxonomice la genul

Primula.


ntre grupuri 14,94951 0,50159 ntre populaiile din cadrul grupurilor 35,20986


n cazul n care s-au definit trei grupuri pe criterii biogeografice, primul corespunznd

populaiilor de Primula elatior din Alpi, al doilea corespunznd populaiilor de P. elatior din


25

Tatra i al treilea corespunznd restului de populaii de Primula din Carpaii de S-E, s-au

obinut rezultatele evideniate n tabelul 11.

Tabelul 11. Rezultatele AMOVA cu definirea a trei grupuri pe criterii biogeografice la genul

Primula.


ntre grupuri 18,73280 0,48949 ntre populaiile din cadrul grupurilor 30,21576


n cazul n care s-au definit patru grupuri att pe criterii taxonomice ct i pe criterii

biogeografice, primul corespunznd populaiilor de Primula elatior din Alpi, al doilea

corespunznd populaiilor de P. elatior din Tatra, al treilea corespunznd populaiilor de P.

elatior din Carpaii de S-E i al patrulea corespunznd populaiilor de Primula leucophylla, s-

au obinut rezultatele evideniate n tabelul 12.

Tabelul 12. Rezultatele AMOVA cu definirea a patru grupuri pe criterii biogeografice i

taxonomice la genul Primula.



grupurilor

25,79792


Analiza Principal Coordinate (PCO) s-a realizat pe baza matricei AFLP. Cnd se

utilizeaz indicele euclidean se obin rezultatele prezentate n figura 16 - stnga, iar cnd se

utilizeaz indicele Simpson se obin rezultatele prezentate n figura 16 - dreapta.

Fig. 16. Rezultate PCO pe baza indicelui euclidean (stnga) i pe baza indicelui Simpson (dreapta) la genul

Primula pe baza matricei AFLP (negru - populaiile de P. elatior din Carpaii de S-E, cruce albastr - populaiile

de P. elatior din Tatra, ptrat albastru - populaiile de P. leucophylla, romb verde - populaiile de P. elatior din

Alpi).


26

5.11. Discuii la specia Primula leucophylla

Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula leucophylla

n ceea ce privete proporia locilor polimorfi i diversitatea genetic (tabelul 8) nu se

observ nicio separare a P. leucophylla de P. elatior. Valorile obinute pentru P. leucophylla

sunt destul de sczute dar, totui, exist populaii de P. elatior precum cea din Alpi, Soca

Valley, care prezint valori i mai sczute. Indicele de raritate are valori medii, nu arat nicio

izolare pentru populaiile de P. leucophylla fa de cele aparinnd speciei P. elatior.

Analiza Neighbor-Joining (fig. 15) prezint o structurare a populaiilor de P.

leucophylla, dar aceast grupare nu este susinut prin valori de bootstrap menionabile.

Analiza PCO a matricei AFLP relev o grupare pe criterii biogeografice i nu pe

criterii taxonomice. Astfel, populaiile de P. elatior din Alpi se separ de restul populaiilor

din Carpai (fig. 16). Utiliznd indicele Simpson la analiza PCO (fig. 16 - dreapta) se observ

o uoar separare a taxonului P. leucophylla n cadrul grupului din Carpai.

Analizele AMOVA bazate pe matricea AFLP fr definirea vreunui grup (tabelul 9)

arat o variaie mare intrapopulaional (55,33%) i o variaie mic interpopulaional, ceea ce

indic faptul c majoritatea sau chiar toate populaiile utilizate n studiu sunt destul de slab

separate ntre ele i sunt uniforme din punct de vedere genetic. Separaia moderat a

populaiilor este susinut i de valoarea FST de 0,44669. Atunci cnd se face o asamblare pe

criterii taxonomice, P. elatior vs P. leucophylla (tabelul 10), se observ c variaia dintre cele

dou grupuri este sczut (14,94%), ceea ce indic c grupurile nu sunt bine conturate. Cel

mai mare procent de variaie (49,84%) se datoreaz tot componentei intrapopulaionale.

Atunci cnd se realizeaz o asamblare n grupuri pe baza unor criterii geografice (tabelul 11),

se observ c procentul de variaie dintre grupuri crete uor (18,73%) sugernd faptul c

grupurile sunt mai bine definite, dar procentul de variaie cel mai mare se datoreaz tot

componentei intrapopulaionale (51,05%). Cea mai bun conturare a grupurilor se obine

atunci cnd se realizeaz o asamblare att pe criterii geografice ct i taxonomice (tabelul 12).

n acest caz, creterea procentului de variaie dintre grupuri la valoarea de 21,79% indic

existena unei slabe separri a taxonului P. leucophylla de specia P. elatior.

Analiza de secvene cloroplastice prezint n cazul arborilor generai prin metodele

ME (fig. 14), ML, NJ i UPGMA aproximativ aceeai grupare. n cadrul grupului format din

populaiile de P. elatior i P. leucophylla se disting clar anumite populaii de P. elatior:

populaiile din Postvaru, din Fgra, din Cearcnu i din Piatra Craiului. n cadrul

subgrupului format din restul populaiilor, se distinge sub-subgrupul P. leucophylla care

cuprinde toate populaiile aparinnd acestui taxon, dar acest sub-subgrup este mai slab


27

separat de majoritatea populaiilor din grupul P. elatior dect unele populaii subalpine

calcifile de P. elatior din Carpaii de S-E.

Diferenierea genetic pe baza analizei AFLP i a datelor ADNcp ntre P. elatior i P.

leucophylla este slab. Delimitarea taxonului P. leucophylla drept o unitate taxonomic

distinct nu este susinut de rezultatul niciunei analize. Rezultatele studiului indic mai mult

posibilitatea ca P. leucophylla s fie un ecotip al P. elatior. Dezvoltarea indumentului care

ncetinete evaporarea apei din frunze poate fi o modificare aprut ca rspuns la factorii de

mediu, i anume climatul secetos n care se gsete P. leucophylla.

P. leucophylla, fiind ntlnit etajul montan superior-subalpin i n pajitile subalpine,

este separat ecologic la nivel altitudinal de P. elatior s. str. care are o distribuie larg n

cadrul Carpailor de S-E dar n etajul submontan-montan (Ciocrlan, 2009). Deoarece este un

taxon marginal ecologic, P. leucophylla este separat i din punct de vedere fenologic de P.

elatior s. str., acest separare fenologic putnd duce la o limitare a fluxului genetic dintre cei

doi taxoni ceea ce duce n timp la o difereniere n structura genetic.

5.12. Concluzii la specia Primula leucophylla

Nici analiza AFLP nici analiza ADNcp nu susin delimitarea taxonului P. leucophylla

ca o unitate taxonomic distinct de P. elatior.

Rezultatele studiului sugereaz c P. leucophylla ar reprezenta un ecotip adaptat la

condiiile de clim secetoas al speciei P. elatior.

Ecotipul P. leucophylla datorit izolrii ecologice i fenologice se afl n stadiul de

difereniere fa de specia P. elatior.

5.13. Rezultate la specia Primula intricata

Analiza secvenierii

Secvenele provenite de la trei markeri moleculari: ITS1, trnL i trnH-psbA, cu

lungimea concatenat de aproximativ 1200 nucleotide, au fost utilizate pentru construcia de

arbori prin metodele ME (fig. 17), ML, NJ, UPGMA.


28

Fig. 17. Dendrogram la Primula intricata, construit prin metoda ME, pe baza secvenelor ITS1, trnL i trnH-

psbA.

Analiza AFLP


Fig. 18. Dendrogram la Primula intricata, construit prin metoda NJ, pe baza matricei AFLP.


29

Cu ajutorul scriptului n platforma R, AFLPdat, s-au determinat proporia locilor

polimorfi, diversitatea genetic a lui Nei i indicele de raritate (tabelul 13).


populaiile genului Primula, utilizate n studiul speciei Primula intricata.

Specia Populaia Proporia markerilor

variabili

Diversitatea

genetic Indicele de

raritate

(DW)

Primula elatior

Ap-PE 0,2356 0,1133 32,6641

Fg-PE 0,2101 0,1031 54,4281

Tatr-Kob-PE 0,2675 0,1324 63,3665

Jul-PE 0,1337 0,0611 27,9473

Alp-Gross-PE 0,29298 0,1490 32,3495

Primula leucophylla Clt-PL 0,1401 0,0700 26,6714

Primula intricata Alp-Pass-PI 0,1337 0,0687 167,1520

Rezultatele AMOVA obinute n cazul cnd nu se definete niciun grup sunt

prezentate n tabelul 14.

Tabelul 14. Rezultatele AMOVA fr definirea grupurilor la populaiile genului Primula,

utilizate n studiul speciei Primula intricata.




n cazul n care s-au definit dou grupuri pe criterii taxonomice, primul corespunznd

populaiilor de Primula elatior i Primula leucophylla i al doilea corespunznd populaiei de

Primula intricata, s-au obinut rezultatele evideniate n tabelul 15.

Tabelul 15. Rezultatele AMOVA cu definirea a dou grupuri pe criterii taxonomice la




grupurilor

22,36


n cazul n care s-au definit trei grupuri pe criterii taxonomice, primul corespunznd

populaiilor de Primula elatior, al doilea corespunznd populaiei de Primula intricata i al

treilea corespunznd populaiei de Primula leucophylla s-au obinut rezultatele evideniate n

tabelul 16.


30

Tabelul 16. Rezultatele AMOVA cu definirea a trei grupuri pe criterii taxonomice la




grupurilor

30,53


Analiza Principal Coordinate (PCO) s-a realizat de asemenea pe baza matricei

AFLP utiliznd indicele Simpson (fig. 19).

Fig. 19. Rezultate PCO pe baza indicelui Simpson pentru populaiile genului Primula, utilizate n studiul speciei

Primula intricata pe baza matricei AFLP (negru - populaiile de P. elatior din Carpai, ptrat mov - populaiile

de P. elatior din Alpi, triunghi albastru - populaia de P. leucophylla, romb verde - populaia de P. intricata din

Alpi).

5.14. Discuii la specia Primula intricata

Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula intricata

Rezultatele analizei AMOVA cnd nu se definesc grupuri (tabelul 14) indic faptul c

cea mai mare variaie se ntlnete ntre populaii (67,7%). Acest fapt sugereaz existena unor

populaii diverse unele de celelalte care pot fi uor separate n grupuri. Valoarea mare a

indicelui FST (0,67701) confirm acelai fapt. Variaia intrapopulaional de 32,3% indic o

relativ uniformitate n cadrul populaiilor. n cazul n care se definesc trei grupuri: P. elatior,

P. leucophylla i P. intricata (tabelul 16), cea mai mare cantitate de variaie genetic se

datoreaz componentei intergrupuri (43,92%) ceea ce sugereaz c grupurile sunt bine

difereniate ntre ele, cu un flux genetic sczut ntre ele. Variaia dintre populaiile din cadrul

grupurilor este de asemenea crescut, indicnd acelai fapt. De asemenea, creterea valorii


31

indicelui FST la 0,81298 reconfirm acelai pattern. Rezultatul obinut poate fi datorat i

distanei mari dintre punctele de colectare ale populaiilor, aadar c pentru a avea certitudine

n ceea ce privete diferenierea grupurilor, s-a realizat nc o analiz AMOVA cu dou

grupuri: P. elatior mpreun cu P. leucophylla i separat P. intricata (tabelul 15). Rezultatul

arat clar faptul c mai mult de jumtate din variaia genetic (58,93%) este explicat prin

componenta variaiei dintre grupuri. Rezultatul susine clar separaia P. intricata fa de P.

elatior, mai mult dect este susinut separaia P. leucophylla fa de P. elatior, rezultatul

variaiei genetice dintre grupuri la definirea celor trei grupuri fiind mai mic dect n acest caz.

Concomitent, se nregistreaz i scderea valorii indicelui FST la 0,74457, ceea ce confirm

acelai fapt. Aadar grupul constituit din P. intricata este un grup compact, bine format,

sugernd existena unei specii distincte.

Analiza PCO (fig. 19) a matricei AFLP arat clar separarea P. intricata fa de grupul

constituit din P. elatior i P. leucophylla. Aceast separaie nu este o separaie pe criterii

geografice, populaiile de P. elatior din Alpi nu se grupeaz cu populaia de P. intricata din

Alpi, ci mai degrab se grupeaz cu P. leucophylla n cadrul unui grup P. elatior - P.

leucophylla.

Arborele generat prin metoda NJ (fig. 18) pe baza matricei AFLP arat o separaie

clar cu o valoare de bootstrap maxim a dou filogrupuri. Primul grup este constituit din

populaia de P. intricata din Alpi i al doilea este constituit din populaiile de P. elatior i P.

leucophylla. Populaia din Alpi de P. intricata este clar difereniat de restul populaiilor de

Primula att prin valoarea maxim de bootstrap dar mai ales prin lungimea ramurilor

arborelui NJ.

Rezultatele analizei diversitii genetice i a proporiei markerilor variabili (tabelul 13)

indic populaia de P. intricata ca fiind printre cele mai parcimonioase. n general,

diversitatea genetic este sczut n cadrul populaiilor mici i izolate ca o consecin a unor

procese precum driftul genetic, bootleneck-ul, consangvinizarea i efectul fondatorului

(Wright, 1931; Nei, 1975; Young i colab., 1996). Indicele de raritate (DW) este o msur a

divergenei i exprim numrul de markeri privai, iar n cazul speciei P. intricata aceast

valoare este maxim (167,1520), ceea ce o difereniaz nc o dat de grupul P. elatior.

Arborii generai prin analiza de secvene (fig. 17) indic faptul c cele dou populaii

de P. intricata nu fac parte din grupul P. elatior. n funcie de metoda utilizat, specia P.

intricata se grupeaz fie ntr-un grup comun cu specia P. acaulis, fie se grupeaz mai apropiat

de P. elatior dect de P. acaulis sau P. veris, dar totui, ea nu este inclus n grupul alctuit de

P. elatior i P. leucophylla. Secvenele aparinnd populaiilor de P. intricata sunt foarte


32

divergene fa de cele aparinnd grupului P. elatior, din lungimea concatenat de 1200 de

nucleotide a celor trei markeri, peste 200 de situri informative se gsesc ntre P. intricata i

grupul P. elatior. Cele dou populaii de P. intricata, cea din Alpi i cea din Carpai, difer

ntre ele prin nou modificri punctiforme, fapt explicabil prin distana geografic dintre

punctele de colectare a celor dou populaii, care n plus mai fac parte din dou lanuri

muntoase cu o structur geologic i cu o istorie glaciar diferite.

5.15. Concluzii la specia Primula intricata

Rezultatele tuturor metodelor abordate i analizelor efectuate sunt convergente i

susin separarea P. intricata de grupul P. elatior.

Pe baza rezultatelor, studiul prezent consider c este necesar acordarea statutului de

specie independent fr legturi de subordonare taxonomic fa de P. elatior, speciei P.

intricata.


33

Bibliografie selectiv

1. Ball, P. W., Riedhl, H., 1972. Onosma. In: Tutin, T. G., Heywood, V. H., Burges, N. A., Valentine, D. H., Walters, S. M., Webb, D. A., (edit.), Flora Europaea, III. University Press, Cambridge.

2. Beldie, A., 1967. Flora i vegetaia Munilor Bucegi. Ed. Academiei Republicii Socialiste Romnia, Bucureti.

3. Beldie, A., 1979. Flora Romniei. Determinator ilustrat al plantelor vasculare II. Ed. Academiei Republicii Socialiste Romnia, Bucureti.

4. Borza, A., 1947. Conspectus florae Romaniae. Regionumque affinum. Tipografia Cartea Romneasc, Cluj.

5. Chater, A. O., 1972. Eritrichium. In: Tutin, T. G., Heywood, V. H., Burges, N. A., Valentine, D. H., Walters, S. M., Webb, D. A., (edit.), Flora Europaea, III. University Press, Cambridge.

6. Ciocrlan, V., 2000. Flora ilustrat a Romniei. Pteridophyta et Spermatophyta. Ed. Ceres, Bucureti. 7. Ciocrlan, V., 2009. Flora ilustrat a Romniei. Pteridophyta et Spermatophyta. Ed. Ceres, Bucureti. 8. Cohen, J. I., Davis, J. I., 2009. Nomenclatural changes in Lithospermum (Boraginaceae) and related

taxa following a reassessment of phylogenetic relationships. Brittonia, 61:101-111.

9. Comes, H. P., Kadereit, J. W., 2003. Spatial and temporal patterns in the evolution of the flora of the European Alpine System. Taxon, 52:451-462.

10. Demesure, B., Sodzi, N., Petit, R. J., 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology, 4:129-131.

11. Dihoru, G., Negrean, G., 2009. Cartea roie a plantelor vasculare din Romnia. Ed. Academiei Romne, Bucureti.

12. Doyle, J. J., Doyle, J. L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, 19:11-15.

13. Doyle, J. J., Doyle, J. L., 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12:13-15. 14. Ehrich, D., 2006. AFLPdat: a collection of R functions for convenient handling of AFLP data.

Molecular Ecology Notes, 6:603-604.

15. Eidesen, P. B., Alsos, I. G., Popp, M., Stensrud, ., Suda, J., Brochmann C., 2007. Nuclear vs. plastid data: complex Pleistocene history of a circumpolar key species. Molecular Ecology, 16:3902-3925.

16. Excoffier, L., Lischer, H. E. L., 2010. Arlequin suite ver 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources, 10:564-567.

17. Freeland, J. R., 2005. Molecular Ecology. John Wiley & Sons, Chichester. 18. Grenier, J. C. M., Godron, D. A., 1853. Flore de France, ou Description des Plantes qui Croissent

Naturellement en France et en Corse, J.B. Baillire, Paris. 19. Grinescu, I., 1960. Eritrichium. In: Svulescu, T., (edit.), Flora Republicii Populare Romne, VII. Ed.

Academiei Republicii Populare Romne, Bucureti. 20. Grinescu, I., Nyrdy, E. I., 1960. Onosma. In: Svulescu, T., (edit.), Flora Republicii Populare

Romne, VII. Ed. Academiei Republicii Populare Romne, Bucureti. 21. Guuleac, M., 1960. Pulmonaria. In: Svulescu, T., (edit.), Flora Republicii Populare Romne, VII. Ed.

Academiei Republicii Populare Romne, Bucureti. 22. Hall, T. A., 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program

for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposia Series, 41:95-98.

23. Hammer, ., Harper, D. A. T., Ryan, P. D., 2001. PAST: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Palaeontologia Electronica, 4(1):9.

24. Huson, D. H., Bryant, D., 2006. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Molecular Biology and Evolution, 23(2):254-267.

25. Jacquemyn, H., Honnay, O., Galbusera, P., Roldn-Ruiz, I., 2004. Genetic structure of the forest herb Primula elatior in a changing landscape. Molecular Ecology, 13:211-219.

26. Kimura, M., 1980. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitution through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution, 16:111-120.

27. Kolarik, V., Zozomov-Lihov, J., Mrtonfi, P., 2010. Systematics and evolutionary history of the Asterotricha group of the genus Onosma (Boraginaceae) in central and southern Europe inferred from

AFLP and nrDNA ITS data. Plant Systematics and Evolution, 290:21-45.

28. Ldi, W., 1927. Fam. Primulaceae, In: Hegi, G., (edit.), The Illustrate flora of Central Europe (in German), 5(3). Carl Hanser, Mnchen.


34

29. Mansion, G., Selvi, F., Guggisberg, A., Conti, E., 2009. Origin of Mediterranean insular endemics in Boraginales: integrative evidence from molecular dating and ancestral area reconstruction. Journal of

Biogeography, 36:1282-1296.

30. Mengoni, A., Gonelli, C., Galardi, F., Gabbrielli, R., Bazzicalupo, M., 2000. Genetic diversity and heavy metal tolerance in populations of Silene paradoxa L. (Caryophyllaceae): a random amplified

polymorphic DNA analysis. Molecular Ecology, 9:1319-1324.

31. Nei, M., 1975. Molecular population genetics and evolution. North-Holland, Amsterdam. 32. Nei, M., 1987. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York. 33. Nei, M., Li, W. H., 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction

endonuclease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 76:5269-5273.

34. Nyrdy, E. I., Guuleac, M., 1960. Primula. In: Svulescu, T., (edit.), Flora Republicii Populare Romne, VII. Ed. Academiei Republicii Populare Romne, Bucureti.

35. Pax, F., Knuth, R., 1889. Primulaceae, In: Engler, A., (edit.), The Plant Kingdom (in German), Regni vegetabilis conspectus, 10. W. Engelmann, Leipzig.

36. Rauschert, S., 1976. Zur Nomenklatur und Chorologie des Formenkreises von Onosma pseudoarenarium Schur s. lat. Folia Geobotanica & Phytotaxonomica, 11:269-279.

37. Savolainen, V., Chase, M. W., 2003. A decade of progress in plant molecular phylogenetics. Trends in Genetics, 19(12):717-724.

38. Srbu, I., Ivnescu L., tefan N., Mnzu C., 2001. Flora ilustrat a plantelor vasculare din estul Romniei - determinator. Vol. II. Ed. Universitii Alexandru Ioan Cuza, Iai.

39. Selvi, F., Cecchi, L., Coppi, A., 2009. Phylogeny, karyotype evolution and taxonomy of Cerinthe L. (Boraginaceae). Taxon, 58:1307-1325.

40. uteu, D., Puca, M., Bcil, I., Coste, A., Filipa, L., Stoica, I. A., Hurdu, B. I., Ursu, T., Coldea, G., 2011. Does Primula intricata Gren. et Godr. Merit Species Rank? A Taxonomic Revision Based on

nrDNA, cpDNA and AFLP Data. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 39(1):24-29.

41. Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S., 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 24:1596-1599.

42. Tuber, F., 1982. Fgetele din Podiul Lipovei, n: Fgete carpatine. Semnificaia lor bioistoric i ecoprotectiv: Lucrrile simpozionului din 30-31 mai 1979. Ed. Academiei Republicii Socialiste Romnia, 198-205.

43. Teppner, H., 1971. Cytosystematik, bimodale Chromosomenstze und permanente Anorthoploidie bei Onosma (Boraginaceae). esterreichische Botanische Zeitschrift, 119:196-233.

44. Teppner, H., 1996. Die Onosma Arten (Boraginaceae Lithospermeae) Rumniens n Beitrge zur naturwissenschaftlichen Erforschung siebenbrgens VI.

45. Valentine, D. H., Kress, A., 1972. Primula L. In: Tutin, T. G., Heywood V. H., Burges, N. A., Moore, D. M., Valentine, D. H., Walters, S. M., Webb, D. A., (edit.), Flora Europaea, III. University Press,

Cambridge.

46. Weigend, M., Gottsschling, M., Selvi, F., Hilger, H. H., 2009. Marbleseeds are gromwellsSystematics and evolution of Lithospermum and allies (Boraginaceae tribe Lithospermeae) based on molecular and

morphological data. Molecular Phylogenetics and Evolution, 52:755-768.

47. Weising, K., Gardner, R. C., 1999. A set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in the chloroplast genomes of dicotyledonous plants. Genome, 42:9-19.

48. Woodell, S. R. J., 1969. Natural hybridization in Britain between Primula vulgaris Huds (the primrose) and P. elatior (L.) Hill (the oxlip). Watsonia, 7:115-127.

49. Wright, S., 1931. Evolution in Mendelian populations. Genetics, 16:97-126. 50. Wright Smith, W., Fletcher, H. R., 1946. The genus Primula: Section Vernales Pax. Transactions and

proceedings of the Botanical society of Edinburgh, 34:432-458.

51. Young, A., Boyle, T., Brown, T., 1996. The population genetic consequences of habitat fragmentation for plants. Trends in Ecology and Evolution, 11:413-418.


35

Cuprinsul tezei de doctorat

LIST DE ABREVIERI Pag. 1

INTRODUCERE Pag. 3

CONSIDERAII TEORETICE Pag. 5

Capitolul 1. Filogenia i analizele filogenetice Pag. 6

1.1. Consideraii generale asupra filogeniei Pag. 6

1.2. Etapele analizei datelor filogenetice Pag. 11

Capitolul 2. Markeri moleculari utilizai n filogenia i taxonomia plantelor

Pag. 17

2.1. Modul de motenire a genomului nuclear la plante Pag. 18

2.2. Organizarea i modul de motenire a genomului mitocondrial la plante

Pag. 19

2.3. Organizarea i modul de motenire a genomului plastidial la plante Pag. 19

2.4. Principalele categorii de markeri moleculari utilizate la plante Pag. 21

2.5. Metode de detecie a markerilor moleculari ADN Pag. 33

Capitolul 3. Caracterizarea din punct de vedere taxonomic, morfologic,

ecologic i al variabilitii fenotipice a plantelor studiate Pag. 39

3.1. Caracterizarea general a familiei Boraginaceae Pag. 39

3.1.1. Pulmonaria rubra vs. Pulmonaria filarszkyana Pag. 41

3.1.2. Onosma arenaria vs. Onosma pseudoarenaria Pag. 45

3.1.3. Eritrichium nanum vs. Eritrichium jankae Pag. 49

3.2. Caracterizarea general a familiei Primulaceae Pag. 52

3.2.1. Primula elatior vs. Primula leucophylla vs. Primula intricata Pag. 54

CONTRIBUII PERSONALE Pag. 61

OBIECTIVELE PREZENTULUI STUDIU Pag. 62

Capitolul 4. Materiale i metode Pag. 63

4.1. Strategia de recoltare a materialului biologic Pag. 63

4.2. Extracia ADN-ului Pag. 73

4.3. Verificarea i cuantificarea acizilor nucleici prin electroforez Pag. 78

4.3.1. Electroforeza n gel de agaroz Pag. 78

4.3.2. Electroforeza n gel de poliacrilamid Pag. 79

4.4. Analiza microsateliilor cloroplastici Pag. 82

4.5. Tehnica PCR-RFLP Pag. 84

4.6. Tehnica AFLP Pag. 85

4.7. Secvenierea Pag. 91

4.8. Analiza datelor Pag. 96

Capitolul 5. Rezultate i discuii Pag. 99

5.1. Rezultate i discuii la genul Pulmonaria Pag. 99

5.1.1. Rezultate referitoare la analiza microsateliilor cloroplastici Pag. 99

5.1.2. Rezultate referitoare la analiza PCR-RFLP Pag. 99

5.1.3. Rezultate referitoare la analiza secvenierii Pag. 99

5.1.4. Discuii: Identificarea unor markeri moleculari barcode capabili s diferenieze speciile Pulmonaria rubra i Pulmonaria filarszkyana

Pag. 108

5.1.5. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Pulmonaria rubra i Pulmonaria filarszkyana

Pag. 110


36

5.1.6. Concluzii pariale referitoare la genul Pulmonaria Pag. 111

5.2. Rezultate i discuii la genul Onosma Pag. 112

5.2.1. Rezultate referitoare la analiza microsateliilor cloroplastici Pag. 112

5.2.2. Rezultate referitoare la analiza PCR-RFLP Pag. 112


5.2.4. Rezultate referitoare la analiza AFLP Pag. 127

5.2.5. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Onosma arenaria i Onosma pseudoarenaria

Pag. 132

5.2.6. Discuii: Estimarea diversitii genetice a populaiilor de Onosma arenaria i Onosma pseudoarenaria din Romnia

Pag. 136

5.2.7. Concluzii pariale referitoare la genul Onosma Pag. 137

5.3. Rezultate i discuii referitoare la genul Eritrichium Pag. 138


5.3.2. Rezultate referitoare la analiza AFLP Pag. 151

5.3.3. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Eritrichium nanum i Eritrichium jankae

Pag. 155

5.3.4. Concluzii pariale referitoare la genul Eritrichium Pag. 160

5.4. Rezultate i discuii referitoare la genul Primula Pag. 161

5.4.1. Rezultate i discuii referitoare la specia Primula leucophylla Pag. 161

5.4.1.1. Rezultate referitoare la analiza secvenierii Pag. 161

5.4.1.2. Rezultate referitoare la analiza AFLP Pag. 169

5.4.1.3. Discuii: Identificarea unor markeri moleculari barcode capabili s diferenieze speciile Primula elatior i Primula leucophylla

Pag. 174

5.4.1.4. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula leucophylla

Pag. 176

5.4.1.5. Discuii: Redefinirea arealului speciei Primula leucophylla pe baza analizelor moleculare

Pag. 180

5.4.1.6. Concluzii pariale referitoare la specia Primula leucophylla Pag. 181

5.4.2. Rezultate i discuii referitoare la specia Primula intricata Pag. 181

5.4.2.1. Rezultate referitoare la analiza secvenierii Pag. 182

5.4.2.2. Rezultate referitoare la analiza AFLP Pag. 187

5.4.2.3. Discuii: Investigarea relaiilor filogenetice dintre Primula elatior i Primula intricata

Pag. 191

5.4.2.4. Concluzii pariale referitoare la specia Primula intricata Pag. 193

5.5. Concluzii finale Pag. 194

BIBLIOGRAFIE Pag. 196

ANEXE Pag. 226

Cuvinte cheie

Pulmonaria, Onosma, Eritrichium, Primula, plante endemice, plante rare, markeri moleculari,

taxonomie molecular, AFLP, ADNnr, ADNcp.

rezumat romana dana suteu

Documents