RAPORT DE AUTOEVALUARE

Programul:

PCE – IDEI

Cod proiect: ID_566

Etape 2009 - 2011

Director Proiect Prof. Univ. Dr. Roşu Anca, UMF CRAIOVA

Titlul proiectului Contribuţii ale unor noi biomarkeri adipokinici şi citokinici în definirea pattern-ului activităţii artritei reumatoide precoce. Model matematic predictiv.

Prima etapa a cercetarii, derulata pe parcursul anului 2009 - a vizat initial aprofundarea studiului cunoasterii

mecanismelor moleculare implicate evenimentele inaugurale ale artritei reumatoide precum şi în secvenţele ulterioare care promovează şi întreţin destructurările complexe tisulare precum si a interventiilor unor biomarkeri de tip citokinic (IL-6, IL-18, IL-17) si adipokinic (leptin, visfatin) in definirea profilului activitatii si predictiei artritei reumatoide.

Un interes aparte a fost acordat studiului sinovialei reumatoide, facilitat de accesul cat mai puţin invaziv, ghidat către zonele-ţintă ale sinovialei – care a permis în ultimii ani descrierea unor pattern-uri şi chiar vârste ale sinovialei reumatoide ce urmează cronologia evenimentelor patogenice, cu identificarea a trei stadii histopatologice ale sinovialei reumatoide.

De asemenea, au fost inrolati pacienţii cu artrită reumatoidă precoce (aflaţi la mai puţin de 12 luni de la debut) care au verificat criteriile de includere (artrită reumatoidă < 12 luni de la debut, pacienţi naivi pentru medicaţie remisivă sau biologică) şi excludere (obezitate, diabet zaharat, sdr. metabolic, terapii cu glucocorticoizi, etc) dupa semnarea consimtamantului informat– în conformitate cu prevederile Declaratiei WMA de la Helsinki privind principiile eticii cercetarii medicale care implică subiecţi umani (WORLD MEDICAL ASSOCIATION DECLARATION OF HELSINKI – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subject).

Initial, 35 de pacienti au fost declarati eligbili, insa ulterior, insa doar de la 30 dintre acestia au fost obtinute toate probele biologice dovedite relevante dupa prelucrare si analizare. Toti pacientii inrolati au parcurs etapele stabilite in cadrul cercetarii:

- evaluarea clinică, si funcţională a cazurilor- a constat in evaluarea reumatologica ( durata redorii matinale, numărul articulaţii dureroase, numărul de articulaţii tumefiate, variabile integrate ulterior în DAS 28(4V) (disease activity score), evaluarea funcţionalităţii articulare (chestionare Health Assessment Questionnaire – HAQ).

- evaluarea biologică preliminară a presupus determinări ale VSH, proteinei C reactive, factorului reumatoid, a anticorpilor antiCCP IgG precum şi evaluarea standard (hemoleucograma, glicemie, creatinina, lipidograma, aminotransferaze, etc).

- prelevarea, stocarea adecvata de ser si fluid sinovial, cu determinari citokinice si adipokinice specifice: leptin si visfatin - DRG Leptin (Sandwich) ELISA EIA-2395 (DRG International Inc, USA) si DRG Visfatin (human) ELISA EIA-4633 (DRG International Inc, USA); IL-6 - DRG IL-6 ELISA EIA-4640; ulterior, in cursul derularii proiectului, specimenele au fost testate si pentru IL-17A (DRG Interleukin-17A (human) ELISA EIA-4840, IL-18 (DRG Interleukin-18 (human) ELISA EIA-4061) .

- prelevarea de tesut sinovial- prevalent de la nivelul articulatiei genunchiului, dar si al articulatiilor mici (MCFII, IFPII), precedata de evaluarea ultrasonografica Power Doppler, cu selectia ariilor-tinta cele mai elocvente pentru proliferarea sinoviala, de la nivelul carora s-au prelevat fragmente sinoviale prin biopsie minim-invaziva, cu ace Parker-Pearson – (Parker Pearson Synovial Biopsy Needle, Dixons Surgical Instruments Ltd, UK).

- evaluarea histopatologica – a analizat si cuantificat semicantitativ: intensitatea proliferării celulelor sinoviale: normal (0) sub 3 rânduri (1), 3-4 rânduri (2), 5-6 rânduri (3), peste 6 rânduri (4); intensitatea infiltratului cu celule limfoide şi plasmocite: lipsa infiltratului limfoid (0), agregate de celule limfoide (1), prezenţa de foliculi limfoizi (2), prezenţa foliculilor limfoizi cu centrii germinativi

1

(3); necroză fibrinoidă: prezentă (1), absentă (0). Fiecaruia dintre cazuri i s-a calculat un scor histopatologic compozit, suma a domeniilor analizate.

Aspecte particulare identificate: 1) sinoviocitele proliferate, prin reorientarea lor spaţială se dispun în straturi

paralele, care uneori realizează aspecte palisadice; 2) în cazul proliferărilor mai intense, peste 6 rânduri de sinoviocite, structurile proliferate au aspectul unor muguri, care nu conţin stromă sau vase de sânge, leziunile încadrându-se în gradul 4. ( Fig.4 prezenţa de muguri sinoviocitari, unii avasculari, col. HE, x 20)

Fig.1. proliferare sinoviocitara grad 2, col HE x20 Fig.2. proliferare sinoviocitara grad 3, infiltrat inflam. folicular grad 2, col. HE,x20

Fig. 3 proliferare sinoviocitara grad 4, col HE x20 Fig 4. prezenţa de muguri sinoviocitari, unii Avasculari, col. HE, x 40

- studiul infiltratul inflamator a relevat ca limfocitele constituie populaţia celulară dominantă a infiltratului

inflamator din AR, care se găsesc în apropierea suprafeţei sinovialei, dispuse difuz sau grupate în mici focare centrate sau nu de un vas de sânge, realizând nodulii Allison-Ghormley. Au mai fost observate infiltrate abundente limfocitare, grupate sub formă de noduli care în fazele avansate pot realiza aspectul clasic de foliculi limfoizi cu prezenţa de centrii germinativi.

Evaluarea imunohistochimică a celor 2 populaţii limfocitare (limfocit B- CD20+ şi limfocit T- CD45R0+) a

evidenţiat prevalenţa limfocitelor T în ţesutul sinovial al AR precoce, raportul numeric al celor 2 populaţii (B/T) fiind de 1/1,6 în agregările limfoide şi respectiv 1/2 în infiltratele difuze (Capitanescu et al., 2009)( figura 5 A si B).

2

A B

Figura 5: A- imunomarcaj CD20cy a limfocitelor perivasculare (grad 2), x400; B – imunomarcaj CD45R0

dispozitie conexă a vaselor sanguine (grad 3), x200 Limfocitele din alcătuirea foliculilor limfoizi sunt în special limfocite T helper sau inductoare CD 4+, în timp ce

limfocitele cu dispoziţie mai difuză şi cele perivasculare sunt limfocite T citotoxice CD 8+.

Figura 6: Imuno l citoplasmatic,

dispoziţie foliculară a limfocitelor,x. 40

re înfiltratele inflamatorii s-au dispus sub formă de foliculi limfoizi, pe alocuri chiar cu formare de centrii germinativi.

marcaj CD4 cu aspect membranar şi apica

Macrofagele au constituit în jur de 5-10 % din populaţia inflamatorie, fiind dispuse grupat în foliculii limfoizii

alături de limfocite. Rareori au putut fi observate şi macrofage multinucleate asemănătoare celulelor gigante de corp străin, dispuse dispersat. Pentru cazurile analizate, în funcţie de intensitatea infiltratului inflamator am stabilit ca şi pentru proliferarea sinoviocitară, mai multe grade de severitate: grad 1- absenta infiltratului/agregatelor inflamatorii; grad 2 – formarea de foliculi limfoizi, grad 3 – masiva infiltrare inflamatorie; grad 4 – prezenta celulelor gigante. Cele mai multe cazuri au prezentat infiltrate inflamatorii limfo-plasmocitare reduse, dispuse sub formă de agregate cu topografie perivasculară, pe locul secund situandu-se cazurile în ca

3

B A

Figura 7.A: moderat infiltrat inflamator de tip difuz dispus perivascular, col.H.E., x200; B: distributie limfocitara de tip

folicular in proximitatea vaselor sanguine, col.H.E., x200

A B

Figura 8. A -infiltrat inflamator grad 3 cu formare de folicul limfoid, col. HE, x 20; B - infiltrat inflamator grad 4 cu

prezenţa de celule gigante, col. HE, ob. 40

- necroza fibrinoidă a avut extindere şi profunzime diferită la nivelul sinoviocitelor de căptuşire. În funcţie de gravitatea leziunii am stabilit următoarele grade: grd 0- absenta; grd 1- focala; grd 2 – zonala; grd3 – difuza. Cele mai multe cazuri nu au aut necroză fibrinoidă. Totuşi în restul cazurilor am evidenţiat acest aspect morfologic plecând de la aspectul focal limitat, la un număr redus de sinoviocite, la o întindere zonală şi în două cazuri chiar difuză, cu aspect de necroză “în bandă”(fig. 9,10)

4

9 10

Figura 9: proliferare sinoviocitară grad 4, necroză fibrinoidă focală grad 1, col. HEx. 20; Figura 10: proliferare

sinoviocitară grad 2, necroză fibrinoidă zonală grad 2, col. HEx. 20

- proliferarea fibroblastică – a fost apreciata in 4 grade – de la 0 (absenta) pana la 3 (intensa). Cele mai multe cazuri au avut proliferare fibroblastică slabă sau medie. Aspectele cele mai relevante sunt redate in fig. 11,12.

Fig. 11: infiltrat inflamator grd 4, Fig. 12 : infiltrat inflamator grd 4, celule gigante, Prolif. fibroblastică grad 1, modificări vasculare grd 1, prolif. fibroblastica grd 2, Hex 20 col. HE, x20

- modificările vasculare - pentru cazurile analizate am cuantificat amploarea modificărilor vasculare în funcţie de prezenţa uneia sau mai multor modificări asociate, cum sunt: congestia, creşterea numărului de vase situate superficial sub stratul sinoviocitelor de căptuşire, extravazarea hematiilor, proliferarea endoteliului arteriolelor şi venulelor postcapilare (fig.13), stabilind 4 grade de severitate: gradul 1- vasodilataţie accentuată, în special la nivelul vaselor subsinoviocitare; gradul 2 – vasodilataţie, extravazare hematică sau creşterea numărului de vase subsinoviocitare; gradul 3 - vasodilataţie, extravazare hematică şi creşterea numărului de vase subsinoviocitare; gradul 4 - vasodilataţie, extravazare hematică, creşterea numărului de vase subsinoviocitare, proliferarea endoteliilor vasculare si microtromboze.

5

Figura 13: infiltrat inflamator grad 4, modificări vasculare cu vasodilataţie, creşterea numărului de vase şi

microtromboze, col. HE, x 20 La finele primului an de derulare a proiectului, rezultatele de etapa s-au concretizat in publicarea articolului cu titlul: CD20cy and CD45RO immunoexpressionin early rheumatoid arthritis synovium. Autori: Capitanescu B, Simionescu Cristiana, Stepan A, Margaritescu C, Georgescu CV, Anca Roşu; Romanian Journal of Morphology and Embryology 2010, 51(1):49–54. Pe parcursul celui de-al doilea an a fost continuata inrolarea cazurilor si prelucrarea serologica si din fluidul sinovial (pentru visfatin, visfatin, IL-18 - folosind trusele de diagnostic DRG Leptin (Sandwich) ELISA EIA-2395 (DRG International Inc, USA), DRG Visfatin (human) ELISA EIA-4633 (DRG International Inc, USA) si DRG IL18 (human) ELISA EIA-4061 (DRG International Inc, USA). Au fost continuate activitatile de studiu histopatologic, cu calcularea scorului histologic compozit (Hp), precum si studiul imunohistochimic vizand reactiitatea sinoviala a leptin si visfatin.

Datele au fost inregistrate in baza de date si ulterior au fost suspuse analizei statistice utilizand SPSS Statistics software. Mai intai, cu datele inregistrate in baza de date au fost calculati parametrii statistici descriptivi (mean, median, mode, range, standard deviation). Pentru fiecare variabila au fost utilizate histograme pentru evaluarea probabilitatii distributiilor. Ulterior, corelatiile intre diferitele variabile au fost calculate cu ajutorul coeficientului Pearson’s si a nivelului de semnificatie p (corelatie data de valori ale p <0.05). Coeficientul de corelatie defineste tendinta de dependenta intre variabile – pozitiva sau negativa, corelatia fiind mai puternica cand coeficientul este mai apropiat de 1 sau -1. Corelatia Sperman Rho s-a aplicat in situatii distincte. Rezultatele acestei etape s-au concretizat in elaborarea lucrararii cu titlul: Adipokinic profile of leptin and visfatin in synovium, serum and synovial fluid in early rheumatoid arthritis in care au fost evaluate corelatiile intre nivelurile serice, din fluidul sinovial si imunoreactivitatea sinoviala a leptin (LEP) si visfatin (VIS), pe de o parte, si parametrii deja validati care cuantifica activitatea bolii, precum si cu scorul histologic compozit al sinovialei, pe de altă parte.

Au fost evaluati cei 30 de pacienti cu artrita reumatoida precoce (carora le-au fost preleate probe de sange si au fost supusi biopsiei sinoviale minim-invazive, ecoghidate, cu ac Parker-Pearson, manevra ce a permis si prelevarea de fluid sinovial).

A fost constituit un lot de control pentru profilul serologic si din fluidul sinovial al LEP si VIS (27 pacienti cu osteoartrita (OA)) si un altul pentru specimentele de sinoviala (4 pacienti cu osteoartrita genunchiului; 4 cazuri operate pentru ruptura ligamentelor genunchiului).

Datele demografice si statistica descriptiva pentru lotul de AR precoce si, respectiv, pentru lotul de control sunt redate mai jos:

6

Lot AR precoce N Minimum Maximum Mean Standard Deviation

Varsta (ani) 30 28 58 42.77 7.39

Durata bolii (luni) 30 2.00 10.00 6.03 2.27

VSH (mm/h) 30 22.00 82.00 39.43 13.24

CRP (mg/dl) 30 0.60 4.40 1.65 0.98

FR (UI/ml) 30 5.00 180.00 41.90 46.99

Anti CCP (U/ml) 30 10.00 400.00 92.04 110.90

DAS28 score 30 3.93 7.79 5.79 0.94

LEPseric (ng/ml) 30 4.20 70.40 25.82 17.77

LEP fluid sinov. (ng/ml) 29 8.20 52.00 18.01 10.90

VISseric (ng/ml) 30 9.80 52.70 26.66 12.36

VIS-sf (ng/ml) 29 4.80 26.30 9.53 4.24

Scor Hp compozit 30 5.00 17.00 11.63 3.95

VIS – reactiv. sinov. 30 0.00 1.00 0.60 0.50

LEP reactiv. sinov. 30 0.00 1.00 0.40 0.50

Lot de control (OA) N Minimum Maximum Mean Stdandard Deviation

Varsta (ani) 27 29 58 44.48 8.14

VSH(mm/h) 27 4.00 15.00 8.96 3.24

CRP (mg/dl) 27 0.10 0.80 0.32 0.17

FR (UI/ml) 27 4.00 14.00 7.63 2.73

Anti CCP (U/ml) 27 1.00 10.00 4.70 2.57

LEPs (ng/ml) 27 1.60 15.20 5.33 3.53

LEPsf (ng/ml) 27 0.90 10.20 3.78 2.37

VISs (ng/ml) 27 3.80 21.30 9.96 4.07

VISsf (ng/ml) 27 0.50 7.20 2.78 1.80 Analiza statistica a obiectivat: - corelatiile semnificative (p<0.01) intre nivelurile serice de VIS si FR (r=0.605), CRP (r=0.584),

DAS 28 (r=0.487), scorurile Hp (r=0.468) and LEPseric (r=0.631), cu anti-CCP (r=0.353, p = 0.056); am consemnat absenta corelatiilor intre nielurile serice si din lichidul sinovial ale VIS (p = 0.281).

7

- corelatiile inalt semificative ale LEPseric cu FR (r=0.773), CRP (r=0.627), anti-CCP (r=0.737), VISs (r=0.631), Hp scor (r=0.653); corelatia cu DAS 28 (r=0.451, p = 0.012); am notat absenta corelatiilor intre nielurile serice si sinoviale ale LEP (p = 0.57).

Datele analizei histopatologice au relevat: - scorurile histopatologice compozite s-au corelat (p < 0.05) cu anti-CCP (r = 0.467), nivelurile

serice ale LEPs (r = 0.653, p<0.01) siVISs (r=0.468, p < 0.01)., precum si cu DAS 28 (r = 0.401, p = 0.028) si durata bolii (s = 0.484, p = 0.007).

In figura 14 sunt redate cateva dintre aspectele cele mai elocvente pentru pattern-urile histopatologice ale sinovialei pacientilor cu artrita reumatoida precoce:

A B

C D

Fig.14 AR precoce – tesut sinovial, col. HE, X 200: A) sinoviocite in palisada – mai mult de 6 straturi, neoangiogeneza si infiltrat inflamator perivascular; B) Proliferare sinoviocitara lining si sublining (3 - 4 randuri), necroza fibrinoida, fibroblasti sinoviali; C) infiltrat inflamator cu distributie foliculara in proximitatea unui vas sanguin; D) infiltrat inflamator cu distributie difuza intre fibroblastii sinoviali, cu predominanta plasmocitara.

Evaluarea expresiei imunohistochimice a LEP si LEPR la nivelul sinovialei la pacientii cu AR precoce a

evidentiat urmatoarele aspecte: - reactivitatea sinoviala pentru LEP si LEPR (leptin receptor) a fost obiectivata in 12 cazuri de AR,

prevalent la cele cu scoruri histopatologice > 15, cu activitate inalta a bolii (DAS28>6) si cu seropozitivitate intensa pentru anti-CCP.

8

- pattern-ul reactivitatii LEP a fost sinoviocitic (lining si sublining) (fig 15 A, B), prevalent citoplasmatic si nuclear, cu intensitate mai mare la nivelul populatiei macrofag-like (fig.15C); am consemnat si profilul granular citoplasmatic la nivelul fibroblastilor si macrofagelor sinoviale (fig.15E).

- pentru LEPR, reactivitatea a fost membranara si citoplasmatica (fig.15D), la nivelul populatiilor celulare cu

implicatii in imunopatogenie – limfocite, macrofage, fibroblasti sinoviali, celule adipocit-like (fig.15 F).

Fig.15 A-F: Artrita reumatoida precoce: A) reactie pozitiva pentru LEP in epiteliul sinovial, X 200; B) reactivitate a LEPR in epiteliul sinovial, X 200; C) reactivitate de tip citoplasmatic si nuclear a LEP – in toate straturile proliferarii sinoviocitare, X 600; D) imunoexprimare LEPR – pattern membranar si citoplasmatic, X 600; E) fibroblasti si macrofage sinoviale cu reactivitate LEP de tip granular citoplasmatic granular, X 600; F) reactie pozitiva pt. LEPR la nivelul cel adipocite-like, fbroblastilor si macrofagelor sinoviale, X 600.

9

- reactivitatea VIS s-a corelat cu scorurile histopatologice >10, cu seropozitivitatea intensa pentru anti-CCP si cu activitatea severa a bolii (DAS28>5.1);

- imunoreactivitatea VIS a fost heterogena, cu intensitati variabile in grosimea specimenelor analizate, mai intensa la nivel sinoviocitar (regiuni lining) si perivascular (fig 16 A-B).

- macrofagele, neutrofilele si adipocitele-like (fig. 16C), au exprimat VIS, tiparul fiind predominent citoplasmatic si doar sporadic nuclear.

- am remarcat imunoexpresia VIS in celulele endoteliale capilare (fig.16 A,C), in fibroblasti-like (fig.16D), in agregatele limfoide (fig.16 A,C)

A B

C D

Fig.16 A-D. Imunoreactivitatea VIS la nivelul tesutului sinovial – AR precoce: A) reactie sinoviocitara

heterogena, X 100; B) reactivitate VIS citoplasmatica in toate straturile proliferarii sinoviocitare, X 400; C) reactie positiva a neutrofilelor, macrofagelor si cel endoteliale capilara, X 600; D) reactivitate citoplasmatica a fibroblastilor, X 600.

Pentru cresterea relevantei rezultatelor studiului imunohistochimic, a fost analizata reactivitatea pentru LEP, LEPR si VIS a tesuturilor sinoviale a celor 8 cazuri de control. Rezultatele sunt redate in figura 17.

10

Fig. 17 Imunoreactivitatea pentru LEP, LEPR, VIS la nivelul tesutului sinovial de control: a) reactie

pozitiva pt LEP in condrocitele straturilor superficiale si medii ale cartilajului artrozic lezat, X 400; b) reactivitate LEP de tip citoplasmatic si nuclear in macrofagele tesutului sinovial, X 400; c) imunoreactivitatea LEP la nivelul sinoviocitelor lining si sublining intr-un fald vilos, X 200; d) imunoreactivitatea LEP la nivelul sinoviocitelor lining in sinoviala normala, X200; e) reactivitate LEPR in macrofagele tesutului sinovial in OA; f) reactie VIS pozitiva sinoviocitele lining din sinoviala normala; g) condrocite cu reactivitate VIS – cartilaj OA, X 400; h) imunoreactivitatea VIS a macrofagelor si celulele plasmatice – sinoviala OA, X 400.

11

La specimentele tisulare provenind de la pacientii cu osteoartrita genunchiului (OA) – reactivitatea pentru LEP a fost obiectivata la nivel condrocitar (fig. a), mai ales la nivelul straturilor superficiale si medii ale cartilajului cu destructurare severa dar si in citoplasma macrofagelor si celulelor plasmatice (fig b).

Nu a fost identificata imunoreactivitate pentru LEP la nivelul specimenelor sinoviale normale. In schimb, analiza specimenelor sinoviale provenind atat de la OA cat si normale a identificat imunoreactivitate

pentru LEPR la nivel sinoviocitar lining si sublining si in adipocite (fig. c,d). In plus, sinoviala OA exprima LEPR la nivelul macrofagelor. (fig. e)

In privinta imunoreactivitatii pentru VIS a tesuturilor de control, am observat: - reactie pozitiva predominent sinoviocitar – lining si sublining, la nivelul celulelor endoteliale si adipocitelor

(fig. f); - in specimenele sinoviale OA, VIS a fost exprimat si de condrocite, macrofage si celule plasmatice.

Cercetarea vizand definirea profilului LEP si VIS a fost motivata pe de o parte, de absenta altor studii care sa

obiectiveze comportamentul acestui tandem adipokinic in stadiile inaugurale ale AR la pacienti naivi pentru orice terapie modificatoare de boala. Studiul nu a evaluat comparativ AR precoce vs. constituita, data fiind existenta unor studii anterioare care vizeaza cazuri de boala cu istoric indelungat. In ciuda controverselor din literatura, (Tong et al, Anders et al), este deja cunoscut si acceptat ca profilul seric al LEP este mai inalt la pacientii cu AR decat la subiectii sanatosi (Otero et al), fiind util ca marker de progresie. Nivelurile scazute de LEP din fluidul sinovial semnifica un potential eroziv redus (Bokarewa et al), un alt studiu (Tagonska-Stepniak et al) asociind activitatea inalta a bolii cu concentrantiile crescute de LEP in FS la pacienti cu AR constituita. Aceste rezultate sugereaza ca leptin poate manifesta un rol protector fata de progresia eroziva, date contracarate in parte de studii pe modele animale LEP-deficiente care identifica efecte contradictorii – fie in ameliorare (Busso et al), fie in promovarea artritei (Bernotiene et al). S-a prezumat ca acest efect dual ar putea fi determinat de rezistenta la LEP, un rol putand avea nivelurile crescute ale CRP care interfera legarea de receptorii specifici (Chen et al). Aceste tipuri de “comportament” nu au fost complet elucidate inca (Seven, et al).

Desi au fost demonstrate interventiile proinflamatorii directe ale LEP in riposta imuna vizand macrofagele murine si umane (Zarkesh-Esfahani, et al, Raso et al ), neutrofilele umane (Montecucco et al, Caldefie-Chezet et al), celulelor NK (Tian et al), celulelor dendritice (Lam et al), celulelor T (Farooqi et al, Lord et al) si fibroblastilor sinoviali (Tong et al) – acesta este primul studiu care releva un comportament sinovial particular al LEP si LEPR in stadiile inaugurale ale artritei reumatoide, la pacienti naivi pentru DMADRs (disease modifying antirheumatic drugs), data fiind coexprimarea la nivelul celulelor imunocompetente, cu implicatii patogenetice certe. In plus, exprimarea tisulara a LEP este asociata cu un proces proliferativ exuberant (scoruri histopatologice compozite (Hp) ≥ 15), prevalent in cazurile cu activitate severa a bolii. Este posibil ca in evolutie, in AR constituita, interventia patogenica a LEP sa fie atenuata prin efectele altor adipokine (de tipul adiponectin) (Ouchi et al, Ehling et al)sau/si prin mecanisme citokinice, precum si ca efect al regimurilor remisive nonbiologice sau biologice.

Pornind de la premisa ca visfatin este un mediator independent asociat artritei reumatoide iar tintirea acestuia reprezinta o alternativa terapeutica, precum si de la numarul insuficient de studii relevante (Brentano et al) pe sinoviala reumatoida umana, in contrast cu datele provenind din studii pe modele animale (Luk et al, Busso et al) - cercetarea noastra a vizat definirea profilului participarii visfatin in artrita reumatoida precoce.

In privinta visfatin, rezultatele cercetarilor anterioare au demonstrat existenta unor concentratii serice si in fluidul sinovial crescute la pacientii cu AR (Nowell et al; Brentano et al), in corelatie cu nivelurile markerilor inflamatiei (Hee Rho et al). Mai intai, am identificat existenta unei corelatii inalt semnificative intre nivelurile serice de visfatin si parametrii specifici inflamatiei - CRP, FR, precum si cu scorul DAS28 si scorul histopatologic; am obiectivat existenta unei corelatii mai slabe cu nivelurile anti-CCP. De mentionat existenta aceleiasi semnificatii inalte intre nivelurile serice ale visfatin si cele de leptin. In schimb nu au existat corelatii intre nivelurile serice si cele din fluidul sinovial ale acestei adipokine.

Studiul nostru este cu atat mai relevant cu cat, de abia foarte recent, dupa momentul demararii actualului proiect, au fost publicate rezultatele unui studiu care identifica o asociere pozitiva intre nivelurile serice de visfatin (si adiponectin) si progresia radiologica pe parcursul a 4 ani la pacientii cu AR precoce, precum si cu nivelul anti-CCP.(Moschen et al, 2010)

Analizand profilul VIS in sinoviala pacientilor cu AR precoce – studiat pana acum mai ales la cazuri tratate deja cu remisive (Nowell et al), sau cu AR constituita (Brentano et al, Rho et al) , imunoexpresia VIS s-a dovedit a avea un profil distinct la pacientii cu activitate severa de boala si tablou histopatologic activ (scoruri Hp inalte), fiind identificata la cazurile cu niveluri inalte ale predictorilor standard (anti-CCP,FR, CRP, DAS28>5.1) si, surprinzator, la cei cu statut distinct - concentratii crescute ale VIS in ser coexistand cu niveluri scazute ale VIS in fluidul sinovial. Aceasta constatare argumenteaza ipoteza consumului sinovial al VIS in stadiile precoce,active, cu potential eroziv.

12

Cea de-a doua lucrare cu titlul IL-17 PATTERNS IN SYNOVIUM, SERUM AND SYNOVIAL FLUID FROM TREATMENT-NAÏVE, EARLY RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS a fructificat rezultatele unei alte coordonate a cercetarii, cea a studiului comportamentului IL-17A in stadiile precoce ale artritei reumatoide. Acelasi lot de 30 de pacienti cu artrita reumatoida precoce eligibili au fost evaluati sub aspect clinic reumatologic, al nivelurilor serice ale VSH, CRP, FR anti-CCP si IL-17A. Toate cazurile fost supuse biopsierii sinoviale minim-invazive, ecoghidate, cu ac Parker-Pearson, manevra ce a permis si prelevarea de fluid sinovial pentru cuantificarea IL-17A; a fost constituit un lot de control pentru profilul serologic si din fluidul sinovial al IL-17A (29 pacienti cu osteoartrita (OA)) si un altul pentru specimentele de sinoviala (4 pacienti cu osteoartrita genunchiului; 4 cazuri operate pentru ruptura ligamentelor genunchiului). Datele demografice si statistica descriptiva sunt pentru lotul de AR precoce sunt redate mai jos:

varsta (ani)

durata bolii (luni)

VSH (mm/h)

CRP (mg/dl)

FR (UI/ml)

Anti CCP (U/ml) DAS28 IL-17A seric (pg/ml)

IL-17ASF

(pg/ml)

Hpscor

valid 30 30 30 30 30 30 30 30 29 30N missing 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

Mean 42.77 6.03 39.43 1.65 41.90 92.04 5.79 11.80 18.77 11.63Std. Deviation 7.39 2.27 13.24 0.98 46.99 110.90 0.94 5.07237 12.188 3.95Minimum 28 2.00 22.00 0.60 5.00 10.00 3.93 5.00 4.40 5.00Maximum 58 10.00 82.00 4.40 180.00 400.00 7.79 22.50 44.10 17.00

Prelucrarea histopatologica si imunohistochimica a fragmentelor sinoviale a permis calculul scorului histologic

compozit si descrierea imunoexpresiei IL-17. Analiza statistica parametrilor a obiectivat identificarea corelatiilor intre profilul IL-17A si parametrii selectati.

Datele sunt redate mai jos:

IL-17Aseric

IL-17AFS

IL17 reactivit.

r 0.65 0.62 0.59VSH p <0.001 <0.001 0.001

r 0.56 0.59 0.44CRP p 0.001 0.001 0.016

r 0.506 0.573 0.371FR p 0.004 0.001 0.044

r 0.778 0.853 0.693anti -CCP p <0.001 <0.001 <0.001

r 0.397 0.411 0.546DAS 28 p 0.03 0.027 <0.001

r 0.624 0.669 0.763Hp scor p <0.001 <0.001 <0.001

Nivelurile serice si din fluidul sinovial (FS) ale IL-17A au fost mai inalte la pacientii cu AR precoce vs lotul de control (11.80 ±5.07 pg/ml vs 5.18±1.49 pg/ml), respectiv (18.77± 12.18 pg/ml vs 4.16±1.20 pg/ml).(fig.1A, 1B) In plus s-au constatat ca nivelurile serice le depasesc pe cele din fluidul sinovial, cele 2 variabile fiind inalt corelate (p<0.001, rs=0.730).( (Fig 2).

13

Profilul seric si FS al IL-17A s-a corelat cu markerii inflamatiei ( VSH- p< 0.001, rs=0.651; respectiv p< 0.001,

rs=0.616; CRP(p=0.001, rs=0.555, respectiv p= 0.001, rs=0.589) (Fig 3), cu imunomarkerii specifici – anti-CCP (p< 0.001, rs=0.778; p< 0.001, rs=0.853)(fig.4) si FR (p=0.004, rs=0.506, respectiv p=0.001, rs=0.573)(fig.5) precum si cu scorurile DAS28 (p=0.03, rs=0.397, respectiv p=0.027, rs=0.411)(fig.6).

Nu au fost depistate corelatii intre profilul seric si FS, pe de o parte, si durata bolii, pe de alta parte.

In figura 7 este redata corelatia celor 2 variabile cu scorul Hp (p<0.001, r=0.624, respectiv p<0.001, r=0.669).

14

Imunoexpresia sinoviala a IL-17 a fost identificata la 60% dintre cazurile de AR precoce, cu pattern dispersat la nivel sinoviocitar (fig.8A), atat citoplasmatic cat si nuclear, fiind constatata in toata grosimea proliferarii sinovicitara.(fig.18-A,B)

Am constatat imunoexprimare IL-17 mai intensa la nivelul limfocitelor, plasmocitelor si celulelor macrofag-like (fig. 18. C, D). O reactie de intensitate mai redusa a fost identificata la nivelul fibroblastilor si celulelor endoteliale(fig.18E,F).

15

Fig. 18 A-F – Aspecte ale imunoexpresiei IL-17 la nivelul sinovialei la cazurile cu AR precoce:

A-B. Imunoreactivitate citoplasmatica la nivel sinoviocitar. 400x, 600x.

C-D. Imunoexprimare in cel. inflamatorii si cel. macrofag-like: 400x, 600x.

E-F. Reactie pozitiva la nivel celular plasmocitar, endotelial, neutrofilic si fibroblastic: 600x.

16

In acest studiu am demonstrat ca expresia sinoviala IL-17 este marcat mai inalta la cazurile de artrita precoce comparativ cu cazurile de control (OA), constatare similara cu a altor studii anterioare (Chabaud et al, Moran et al) , dar in contradictie cu alt raport (Shahrara et al ) care demonstraza niveluri comparabile in omogenatele sinoviale, insa cazurile erau de AR constituita, cu istoric indelungat si fusesera tratate cu remisive. Un studiu recent (Kokkonen et al) a

levat m

Kirkham et al ca predictor independent al progresiei erozive. Un studiu publicat recent de Gullick et al, vizand i

ice (realizat

tand fi explicata prin diferente

etarea noastra a identific

re – mai ales ca alte studii (Patel et

. Originalitatea cercetarii noastre rezida in abordarea simultana, din trei perspect

studii anterioare (Tarner IH et al), (Baeten D et al),(Hum

eleate fiecarui caz – apreciem ca acest ultim tip de limitare a fost contrabalansat cu succes de maniera US Doppler-ghidata a biopsiei sinoviale minim-invazive care a permis selectia ariilor celor mai expresiv

AR precoce s-a dovedit astfel un instrument util pentru cercetare, destinat pentru completarea design-ului trialurilor clinice, fiind indispensabil intelegerii patogeniei, evaluarii dinamice a biomarkerilor,

Definire

rilor (aproximative) unei variabile aleatoare are. Variabilele aleatoare sunt concretizate prin eşantioanele de valori umeric bţinute în urma experimentelor.

redicţia- prin folosirea regresiei statitice

rea algoritmilor de data mining

atistica

Y = a+bX

re odificari dinamice ale IL-17 seric la subiectii cu AR inainte de debutul simptomelor si dupa debutul aparent – cu o descrestere la 7.7 luni de la debut, fara insa a corela profilul seric cu cel al FS si cu exprimarea sinoviala. Studiul nostru a obiectivat pattern-ul distinct al imunoexpresiei IL-17 – care este dispersata la intreaga regiune de proliferare sinoviala, spre deosebire de rezultatele comunicate de Moran et al, care identifica expresia IL-17 in ariile sublinig. De asemenea, cercetarea noastra a relevat corelatia cu scorul Hp, un predictor demonstrat de noi (Rosu et al, Vreju et al) al progresiei si activitatii bolii, rezultat cu atat mai relevant cu cat exprimarea sinoviala a IL-17mRNA este descrisa de

nsa AR constituita activa, raporteaza corelatia intre numarul sinovial crescut al celulelor IL-17+ T si activitatea de boala.

In cercetarea noastra, am identificat reactivitate sinoviala pentru IL-17 la 60% din cazurile de artrita precoce, rezultate concordante cu al altor studii (Kirkham et al) , (Yamada et al ). Noi am identificat exprimarea IL-17 doar partial in cadrul populatiei limfocitare, explicatiile posibile fiind absenta in cercetarea noastra a stimularii specif

a pe culturi celulare de Gullick et al), cu atat mai mult cu cat Hueber et al comunica recent ca mastocitele pot fi sursa alternativa a productiei sinoviale de IL-17, constatarea referindu-se insa la cazuri de AR cu istoric indelungat.

Variabilitatea marcata a pattern-urilor sinoviale ale IL-17 ramane inca neclara, pu demografice si de durata a afectiunii si, mai ales, prin existenta unor regimuri terapeutice diferite aplicate deja

pacientilor, care modifica profilul activitatii bolii si implicit, comportamentul citokinic sinovial. Constatarea nivelurilor serice crescute ale IL-17A confirma rezultatele unor studii anterioare (Raza et al,

Lubberts et al , Kokkonen et al), care obiectivau relatia acestora cu formele precoce de boala. Cercat niveluri mai crescute in fluidul sinovial vs cele serice, prezumand productia locala in sinoviala inflamata,

electiv la cazurile FR si anti-CCP intens seropozitive si cu actiitate severa a bolii (scoruri DAS28>5.1). Constatarea unei corelatii mai slabe intre IL-17A in FS si CRP a fost surprinzatoa al) se demonstra valoarea IL-17A ca inductor potent al CRP pe culturi celulare umane, identificand si corelatia

puternica a celor 2 parametri (Moran et al), insa doar in AR constituita, nu si in cea precoce. Rezultatele noastre sunt simultane cu demonstrarea intr-un studiu publicat in 2010 (Leipe et al) a corelatiei

puternice intre productia de IL-17 si magnitudinea activitatii si inflamatiei la pacienti netratati, atat cu artrita reumatoida precoce cat si cu artrita psoriazica precoce

ive – serologica, a fluidului sinovial si al sinovialei – a profilului IL-17 care a permis definirea de corelatii complexe, inclusiv cu scorul compozit Hp.

Rezultatele noastre argumenteaza ipoteza formulata deby F), potrivit careia pattern-urile sinovialei in stadiile precoce ale AR sunt inalt sugestive pentru un trend

agresiv al bolii si, in plus, pot exprima tinte terapeutice specifice. Desi pot fi aduse in discutie limitari de ordin statistic, dat fiind numarul relativ redus de cazuri, precum si de

numarul redus de fragmente sinoviale pr

e pentru proliferarea sinoviala. Studiul sinovialei in

atat pre cat si post-terapeutic. a modelului matematic de predictie a activitatii si selectarea metodelor de data minig Din punct de vedere matematic, prin predicţie se urmăreşte obţinerea a valo folosind valori cunoscute ale altor variabile aleato n e (sondaje sau şiruri de numere) oP este tratată aici in două moduri diferite: - prin folosi Regresia stPrin regresia liniară urmarim calculul unor formule de tipul:

17

regresia liniară simplă, prin care se urmăreşte predicţia lui Y in funcţie de X (o singură variabilă independentă) sau

Y = a +a X +a X +...+a X

că.

t pentru fiecare paramteru ai şi cel asociat cu testul ANOVA care ne face o verificare globală a estimaţiilor.

complicat, expresia căutată nu mai este o combina abile indep nte. Ca exemplu, ea poate sa fie:

Mai jos e câteva din presiile uzuale ale regresiei neliniară simplă:

aritmică: Sunt redate exemple figurative de neuron biologic, neuron artificial si respectiv, de retea neuronala artificiala:

ebb, pentru ca în 1962 Frank Rosenblatt să arate în ce fel se poate antrena

ui back-propagation care ajută la rezolvarea de probleme mai complexe, reţelele neuronale

hiper-planuri;

ă ce corespund ponderilor în cazul MLP) ce modelează un spaţiu de ieşire gaussian;

0 1 1 2 2 n nregresia liniară multiplă, unde Y este variabila dependentă – a cărei valoare se vrea aflată, a0, a1, a2,...an sunt

constante numerice care de asemenea trebuie aflate, iar X1, X2,...Xn sunt valorile variabilelor aleatoare independente - cunoscute.

Obţinerea de rezultate bune la regresie presupune minimizarea erorii de estimare (diferenţa între valoarea reală şi cea calculată de formulă). Pentru acest lucru se măsoară împrăştierea datelor prin dispersie sau se foloseşte abaterea medie pătrati

Faptul ca rezultatele ce se obţin nu sunt datorate hazardului se obţine prin analiza pragului de semnificaţie p asociat cu testul

Datorită complexităţii lor regresiile sunt de obicei calculate folosind un program informatic existent (de exemplu SPSS)

Referitor la regresia neliniară simplă, modelul dependeţei devine maiţie liniară de vari endeY = a+bX+cX2 numerăm ex

xaeby ⋅⋅= - exponenţială:

- putere: axby ⋅= bxay +⋅= ln - log

Reţelelor neuronale îşi au începuturile in 1943 când Warren S. McCulloch şi Walter Pitts demonstreză că se

poate construi o reţea neuronală folosind numai matematica şi algoritmii. Conceptul de antrenare a unei reţele neuronale a fost introdus la nivel conceptual in 1949 de către H

o reţea (prin modificarea ponderilor sinaptice în cazul în care reţeaua dădea un răspuns greşit). In 1974, odată cu introducerea algoritmuldevin de larg interes. Începând cu anii ’80 calculatoarele devin mai puternice se fac noi descoperiri în domeniu (reţele Hopfield) şi se gasesc noi domenii de aplicabilitate.

Mai jos prezentăm câteva dintre cele mai importante tipuri de reţele neuronale în funcţie de arhitectură şi de algoritmul de învăţare:

- multilayer perceptron (MLP): fiecare neuron însumează ponderat valorile de intrare şi produce ieşirea folosind funcţia de transfer şi nivelul de activare; topologia este de tip feed-forward;

- radial basis function network (RBF): spaţiul este partiţionat folosind hiper-sfere in loc dehiper-sferele fiind caracterizate de un centru şi de rază; o reţea RBF conţine un strat ascuns de unităţi radiale (fiecare având un centru şi o raz

18

- probabilistic neural nework (PNN): sunt folosite în special pentru a afla probabilitatea apartenenţei la o anumită clasă; algoritmul de învăţare încearcă să estimeze o funcţie de densitate de probabilitate (p.d.f.);

generalized regression neural network (GRNN): sunt similare cu PNN, dar se utilizează mai ales în problem

- Kohonen): folosite mai ales în învăţarea nesupervizată pentru re

t model, aceşti algoritmi il vor învăţa (intr-o anumită oporţie, rezultată după aplicarea algoritmului).

algoritmilor de data-mining am ales algoritmul de învăţare back-propagation aplicat u

i Bayes derivată din această f

l al altor tipuri de reţele neuronale.

i

măsurato lemă de clasificare a datelor în q categorii unde vom avea de luat decizia d(x)=Ωi , i∈1, 2,

rtenenţei la categoria Ωi şi parametrii de cost li a deciziilo incorec

σ (deviaţia

fericire, PNN nu sunt foarte sensibile la o mică modificare a factorului σ.

1. stratul pattern: vom avea câte un neuron pentru fiecare vector de intrare. Fiecare neuron va calcula un or are x (pentru clasificare) cu un vector de ponderi W , Z =x⋅ W , apoi va executa o operaţie

gm id algoritmul back-propagation), operaţia neliniară folosită este

- e de regresie; - linear network; - self organizing feature map network (SOFMcunoaşterea clusterelor de date, a legăturilor dintre ele sau a datelor din clustere noi. Algoritmii de data mining au un avantaj major asupra modelului statistic prin faptul că nu pun nici o condiţie

asupra datelor folosite: daca există o asociere, sau datele urmează un anumiprÎn ceea ce priveste selectareanei reţele neuronale de tip perceptron cu mai multe straturi (MLP) care poate rezolva problema de regresie. Pentru problemele de clasificare, o soluţie potrivită este aplicarea reţelelor neuronale probabiliste (PNN). Acest

tip de reţea pune totuţi condiţia de normalitate a variabilelor independente.

Reţele Neuronale Probabiliste (PNN) PNN au fost introduse de Specht (1988). Acest tip particular de reţea neuronală oferă o soluţie în cazul

problemelor de clasificare urmând abordarea probabilistică bazată pe formula Bayes. Teoria decizieormulă a fost introdusă în anii ’50 ţinând seama de asemănarea relativă a evenimentelor şi foloseşte informaţii

a priori pentru a îmbunătăţi predicţia. În arhitectura reţelei se folosesc estimatorii Parzen (1962) pentru a obţine funcţia de densitate de probabilitate (p.d.f.) a claselor.

PNN folosesc o mulţime de antrenament supervizată pentru a afla funcţiile de densitate de probabilitate dintr-un strat. Antrenamentul unei PNN este mult mai simplu decât ce

Marele avantaj este că trebuie să parcurgem o singură dată mulţimea de antrenament, în acest fel se garantează aproximarea tot mai bună a p.d.f pe măsură ce numărul de instanţe ale multimii de antrenament creşte. Un dezavantaj al PNN este că toate instanţele de antrenament trebuie stocate pentru folosirea ulterioară în clasificarea noilor date, acest lucru generând o creştere rapidă a utilizării memoriei, o creştere a timpului de antrenament atunci când cresc dimensiunile vectorilor de intrare şi a mulţimii de antrenament.

Problemele de clasificare la care se aplică cel mai mult PNN sunt de a determina apartenenţa unei date multivariate (de ex. un vector p-dimensional) x la unul din cele q posibile grupuri Ω , i=1,...,q, bazate pe o mulţime de

ri. Să considerăm o prob..., q, unde x reprezintă o dată de intrare (vector). Dacă ştim p.d.f. (multivariate) f1(x), f2(x),…, fq(x), asociate

categoriilor Ω1, Ω2,... Ωq, probabilităţile a priori hi=P(Ωi) a apar te, atunci, conform regulii Bayes, vom clasifica x ca aparţinând categoriei Ωi dacă următoarea

inegalitate este adevărată li hi fi(x) > lj hj fj(x), i≠j. Au fost dezvoltate tehnici nonparametrice petru estimarea funcţiilor de densitate de probabilitate din date de

intrare alese aleator cum ar fi aproximarea multivariată Gaussiană. Factorul cheie în antrenamentul PNN este modalitatea de determinare a parametrului

standard a p.d.f. Gaussiană) folosind antrenamentul. În mod obişnuit, σ se alege euristic. Dacă este ales prea mare sau prea mic, acest lucru va duce la creşterea ratei eroare în clasificare. Astfel o deviaţie prea mică va produce o aproximare prea „selectivă” în timp ce o deviaţie prea mare va face ca datele de intrare să pară ca aparţinând mai multor clase. Din

Arhitectura de bază a PNN constă în unităţi „noduri” aranjate în trei straturi după stratul de intrare:

produs al vect ului de intr i i ineliniară asupra lui Zi înainte de a trimite nivelul de activare către unitatea (neuronul) de sumare. Remarcăm că în locul

funcţiei de activare si o a (din 2( 1)iZ −

e σ . Acest lucru este

echivalent cu 22e σ−

. 2. stratul de sumare: fiecare unitate de sumare primeşte ca intrări ieşirile neuronilor stratului anterior asociate

cu o clasă dată. Se însumează ieşirile neuronilor din stratul pattern care corespund cu categoria din care a fost selectat

vectorul de intrare:

( i iW x x− ) ( )Wτ −

2( ) ( )

2i iW x W x

ie

τ

σ− −

−

∑ .

19

3. stratul de ieşire (decizie): neuronii din acest strat conţin două intrări. Aceste unităţi produc rezultate (ieşiri) binare în legătură cu cele două categorii Ωr şi Ωs , r ≠ s, r,s∈1,2,…,q utilizând următorul criteriu de clasificare

2 22jeσ σ> ∑ . Aceste unităţi au o singură p

( ) ( )( ) ( )2

j ji i W x W xW x W x

eττ − −− −

− −

∑ ondere C dată de parametrii cost, probai

bilităţile cunoscute a

priori şi ntrenament din fiecare categorie. Mai precis, numărul de date de a s s r

r r s

Ch l nh l n

= − ⋅

Aşa cum am arătat, s

.

ingurul factor care trebuie selectat pentru antrenament este deviaţia standard σ a funcţiilor Gaussiene. Reţeaua neuronală este antrenată iniţializând vectorul ponderilor Wi dintr-un neuron din primul strat ca fiind

are este estimată p.d.f. f (x) corespunzătoare, cu alte cuvinte, de acurateţea estimaţiei deviaţiei

Perceptrerbos în 1974, dar numai

din 1986 ald J. William a început să prezinte interes.

IniţializeaRepetă calculată(reţea, e) ; parcurgere înainte (feed-forward)

eltai pentru toţi neuronii dinspre stratul de ieşire către cel de intrare;

sunt clasificate corect sau criteriul de oprire este satisfăcut

ea algoritmilor de data mining

implementa

0 si 1).

(Multilay

datele existente) al reţelei pe

u avem o metodă de evaluare a corectitudinii deciziilor finale (valoarea rezultată a variabilei dependente). Din această cauză, în faza a doua, antrenam d a

t şi de test (2 si 3)

cele ce urmeză.

ie q clase de decizie Ω1 nament.

fiecare vector x din mulţimea de antrenament şi apoi conectând stratul patern cu stratul de sumare. Acurateţea deciziei dată de suprafeţele de decizie: l h f (x) > l h f (x) i i i j j jdepinde de acurateţea cu c i pentru fiecare fi(x). o ai multe straturi (MLP) n cu mMetoda de antrenament back-propagation a fost descrisă pentru prima dată de Paul W, prin munca lui David E. Rumelhart, Geoffrey E. Hinton şi RonPe scurt, algoritmul este:

ză toate ponderile din reţea (aleator, cu valori apropiate de zero)

Pentru fiecare exemplu e din mulţimea de antrenament O = ieşire_

T = ieşirea reală Calculeză eroarea T – O la ieşirea reţelei

Calculează dparcurgere înapoi

Calculează deltawi pentru toate ponderile dinspre stratul de intrare spre stratul de ieşire; parcurgere înainte

Modifică ponderile în toată reţeaua Până când toate exemplele

Aplicar Aplicarea algoritmilor de data mining presupune construirea unui program informatic ce va

algoritmul de antrenament (învăţare) şi decizie in cazul reţelei neuronale probabiliste (Probabilistic Neural Networks - PNN) folosite in cazul clasificării.

PNN au fostfolosite în cazul in care variabila dependentă este categorială (conţine de exemplu numai valori de

În cazul aplicării algoritmului de învăţare pentru reţeaua neuronală de tip perceptron cu mai multe straturi er Perceptron) au fost utilizate programe care deja au implementat acest algoritm (de ex: SPSS). În prima fază, s-au identificat variabilele independente si cea dependentă ţinând cont de corelaţiile deja

calculate şi s-au prelucrat valorile (se efectueaza eliminarea instanţelor ce conţin date lipsa sau date extreme, eventual se scalează).

Un al doilea pas a presupus aplicarea algoritmului de antrenament (învăţare din datele din baza de date.

A treia fază presupune testarea (aplicarea) algoritmului pe date noi. În acest caz n

entul se face numai pe un anumit procent (de exemplu 85%) din datele initiale, restul de date (15%) urmânfi folosite în faza trei (faza de test). Pentru o bună învăţare a modelului de date, fazele de antrenamense efectueaza de mai multe ori cu datele alese aleator din datele initiale (cross-validation). Algoritmul de antrenament (partea de bază) pentru PNN este prezentat în

Input. F , Ω2,... Ωq, fiecare coonţinând un număr mi de date (vectori) de antre1. Se calculează distanţele dintre fiecare vectori din mulţimea de antrenament din clasa i. Ω2. Se găseşte distanţa medie di din clasa i şi deviaţia standard sdi a distanţelor.

20

3. Considerăm un interval de încredere de 99.7% pentru distanţa medie dată de media di şi deviaţia standard sdi pentru a calcula domeniul IΩ=(di-3sdi, di+3sdi) de căutare pentru σi.

4. Pentru fiecare clasă de decizie considerăm Ωi, considerăm estimatorii Parzen-Cacoulos modificaţi, fi(x) daţi de form

2

221 / 2

ula 1(

1 1( ) , 1, 2,...,j

ii

x xm

2 )i p pji i

x e i qσ

−−

= ⋅ =∑ ca funcţii de densitate de probabilitate corespunzătoare.

mσ π−=

f

05. Din fiecare clasă de decizie Ωi alegem un vector ix şi calculăm fi( i0x ).

6. (decizia Bayes) Comparăm fi( i0x ) cu fj( i

0x ) pentru toţi i j după următorul algoritm: ≠

„IF li hi fi(0ix ) > lj hj fj(

0ix ) (pentru toţi j≠i) THE 0N ix ∈Ω IF l h fi i i i i ELSE ( 0x ) ≤ l h fj j j i( 0x ) (pentru anumiţi j≠i) THEN

0ix ∉Ωi”.

7. (acurateţea) Pentru o clasă de decizie (fixă) Ω considerăm 3 variabile logice: i

TRUE – dacă li hi fi > lj hj fj (pentru toţi j≠i), UNKNOWN – dacă li hi fi = lj hj fj (pentru câţiva j≠i) şi FALSE în restul cazurilor. Fiecare din cele trei variabile va avea valoarea iniţială zero. Când obţinem o valoare de adevăr a regulii de mai

sus, vom incrementa variabila corespunzătoare. 8. Funcţia cost este dată de numărul de vectori de intrare clasificaţi în mod corect. 9. Repetăm pasul 5 pentru o altă alegere a lui 0

ix Ωi până când acest lucru nu mai este posibil.

10. Repetăm pasul 5 pentru toţi vectorii 0jx din Ωj pentru toţi j≠i.

iIΩ11. (căutarea parametrului σ - căutare incrementală). Împărţim fiecare interval folosind N puncte, în

N+1 sec l 5 pentru utilizând σi=σi-kδi şi σi=σi+kδI, k=1,2,…,N. toare egale cu lungimea δi=6⋅sdi/N. Repetăm pasu

iIΩ12. Dacă valoarea curentă a lui σi dep oprim algoritmul. ăşeste

13. Găsim valoarea maximă a funcţiei cost. Output. σi , i=1,2,…q corespunzătoare funcţiilor de cost cu valori maxime, reprezentând valorile optimale ale

parametrilor σ pentru fiecare clasă de decizie Ωi, i=1,2,…q. Algoritmul back-propagation este următorul: Pas 1. Selecţia şi prelucrarea datelor Datele selectate (sondajul) trebuie să fie reprezentative pentru mulţimea totală. Dacă încercăm să efectuăm

o clasificare ulţimii de antrenament este foarte importan

plu, valori prea mari lgoritmului scalarea

ronale

vector de instrare X; inimiza eroare rezultatului obţinut

(propagarea înapoi a erorii) şi repetă pasul 2.1 până când nu putem obţine o eroare mai mică sau eroare scade sub un prag defi it.

a acest pas se calculează valorile δi pentru fiecare neuron în ordine inversă, începând cu neuronul de ieşire. Pentru ieşire vom calcula:

elta_output =desired_output (T) – network_output (O) Pentru un nod din stratul de ieşire (ca în exemplu) vom calcula

, atunci datele trebuie să aparţină tuturor claselor. Mărimea mtă: prea puţine sau prea multe date pot da rezultate greşite. De asemenea, valorile pot influenţa datele de ieşire şi viteza antrenamentului, de exem

pot încetini executţia algoritmului (la folosirea funcţiei sigmoid), deci, inainte de execuţîia adatelor poate fi foarte folositoare.

Rezultatul dorit poate influenţa de asemenea viteza şi convergenţa algoritmului: valoarea 1 este greu de obţinut pentru că neceistă valori mare pentru ponderi, dar o valoarea de 0.9 este mai uşor de atins.

Pas 2. Modificarea ponderilor asociate conexiunilor neuAceasta pare constă în: 1. Calculează rezultatul reţelei (de tip feed-forward) date de un2. Modifică ponderile tuturo conexiunulor din reţea pentru a m

nL

d

21

un neuron i având intrările (x1, x2 te (w1, w2, …, wn) în felul următor:

δi = Wk δk + … + Wj δj După ce au fost calculaţi toţi δi (în ordine inversă) putem modifca ponderile conexiunilor. Astfel, pentru

, …, xn) putem modifica ponderile coresponden

kikk dePentru neuronii din straturile ascun

i xedfww )(ηδ+=

se putem folosi aceeaşi formulă, dar în loc să folosim intrarea xk vom folosi ie ea y a conexiunii cu pondere wk.

plexitatea datelor, numărul de vectori de intrare, ş.a.m.d.) au eroarea de la ieşirea reţelei scade sun un anumit prag.

şir k Pas 3. Repetiţia Algoritmul se repetă de mai multe ori folosind date de intrarea aleatoare (din sondaj) până când numărul

maxim de repetări (epochs) este atins (depinzând de aplicaţie, coms

ite

Actualizarea web s Actualizarea paginii proiectului http://www.umfcv.ro/id-566 cu datele analizei statistice rezultate din etapele succesive ale cercetării – a fost realizată pe măsură ce au putut fi formulate concluzii cu impact asupra definirii valorii de biomarkeri pentru profilul de activitate si predictie pentru celor doua adipokine si cele 3 citokine cercetate la cazurile

e artrita reumatoida precoce.

rganizarea unei conferinţe în scopul diseminării rezultatelor finale

programul CONGRESULUI NAŢIONAL DE REUMA

aloroasă la aprofundarea mecanismelor complexe implicate in determinismul artritei precoce în stadiile precoce.

iului complex al sinovialei reumatoide prin acces biopsic sinovial minim-invaziv, cât mai precoce după debutul bolii.

entificarea modalitatilor de realizare a unui cadru pentru extindere a cercetarii

.1.Continuarea implementarii modelului matematic

e a parametrilor studiati – redati in tabelul de mai jos – au fost utilizate in implementarea odelului matematic.

d O

A fost organizată o conferinţă cu tema: “ O nouă perspectivă în predicţia poliartritei precoce: Leptin şi Visfatin”, conferinţă susţinută pe data de 24 noiembrie 2011 în

TOLOGIE, desfăşurat la Braşov în perioada 23-26.11.2011. Conferinţa s-a bucurat de participarea membrilor Societăţii Române de Reumatologie şi a participanţilor de

alte specialităţi (medicină fizică şi recuperare, medicină internă), suscitând un real interes şi fiind apreciată ca o contribuţie v

Conferinţa s-a axat pe definirea profilurilor particulare ale celor 2 adipokine în serul, în fluidul sinovial şi în sinoviala pacienţilor cu AR precoce, naivi pentru DMARDs (disease modifying antirheumatic drugs) sintetice şi/sau biologice. Datele analizei statistice vizând parametrii clinici, imun-inflamatori, histopatologici şi imunohistochimici – au validat pentru cele două adipokine valoarea de markeri ai activităţii şi ai predicţiei evoluţiei distructive, reprezentând şi argumente în favoarea stud

Id 3 Datele analizei statisticm

δj

Wi1

Wjn

δk

...

δi Wjj

22

N

V Mis

Mean Deviation Minimum Maximum alid sing

Std.

Varsta (ani) 30 0 4 28 2.77 7.39 58

Istoric boala (luni) 30 0 6.03 2.27 2 10

VSR (mm/h) 30 0 3 19.43 3.24 22 82

CRP (mg/dl) 0.6 30 0 1.65 0.98 4.4

FR (UI/ml) 30 0 41.9 46.99 5 180

Anti CCP (U/ml) 9 130 0 2.04 10.9 10 400

DAS28 30 0 5.79 0.94 3.93 7.79

LEPs (ng/ml) 30 0 25.82 1 77.77 4.2 0.4

LEPsf (ng/ml) 29 1 18.01 10.9 8.2 52

VISs (ng/ml) 30 0 2 16.66 2.36 9.8 52.7

VISsf (ng/ml) 4.8 229 1 9.53 4.24 6.3

Hp score 30 0 11.63 3.95 5 17

IL-6 (pg/ml) 30 0 29.73 17.93 9.5 70.4

IL-6 sf 29 1 631.95 409.57 80 1350

IL-18sf 29 1 20 51 43.19 132.16 40.5IL-17A s (pg/ml) 30 0 11.8 5.07237 5 22.5

IL-17A sf (pg/ml) 29 1 18.77 12.188 4.4 44.1

edere al regresiei liniare au fost testate toate nivelurile serice si sinoviale ca variabile dependente

în funcţigresie prin care puten sa prezicem valoarea unui nivel seric sau sinovial

bţinut. Au fost

ti CCP (p<0.001)

(p<0.001)

st scrise aici numai formulele e regresie pentru care fiecare parametru (constantă calculată) este semnificativ (p<0.05)

Utilizare

lgoritmului de antrenament şi testare “

ajul C++. Un alt avant

pt ce ne-a lasat libertatea de modificare rapidă a formatul

aceasta + ca variabile independ

variabilele care se coreleaza cu nivelul seric al Leptin. Au fost testate pe rând câte o variabilă, apoi cate doua, ş.a.m.d

Din punct de ve de celelalte. Criteriul a fost să găsim o formulă de re

în funcţie de alţi parametri mai uşor de oobţinute următoarele dependeţe: LEPs = 12.36 + 0.187 x RF + 0.06 x AnVISs = 19.912 + 0.158 x RF (p<0.001) IL17s = 8.057 + 0.036 x RF + 0.024 x Anti CCP (p<0.001) IL17sf = 9.323 + 0.099 x RF + 0.055 x Anti CCP IL18sf = 127.694 + 0.798 x Anti CCP (p<0.001) Pragul asociat fiecărei formule este comun pentru toate estimaţiile (global). Au fo

d

a perceptronului cu 2 straturi Faptul ca algoritmii deja implementaţi în alte limbaje de programare nu sunt suficient de configurabili, sau că

necesită prea multă interacţiune din partea utilizatorului a determinat implementarea aback-propagation” pentru o reţea de tipul perceptron cu mai multe straturi. Limbajul de programare ales pentru implementare a fost Java, care deşi este mai lent ca viteză de execuţie, este

mult mai uşor de utilizat şi pe mai puţine date are aproape acceaşi perfomaţă ca un program scris in limbaj al limbajului Java este ca are deja implement cod pentru accesarea datelor dintr-o bază de date. Datele au fost citite dintr-o bază de date MS Excel faui datelor, numelui coloanelor, etc. Pentru aproximarea valorilor serice şi sinoviale, am luat pe rând fiecare variabilă (nivel seric sau sinovial) ca

variabilă dependentă şi am testaat dacă se poate aproxima folosind variabilele corelate cu ente. Am testat pe rând cate o variabilă independentă, apoi câte două, apoi trei, ş.a.m.d. Am încercat să determinam nivelul seric al Leptin plecând de la parametrii CRP, RF, Anti CCP, DAS28 şi

scorul Hp – aceştia fiind

23

Antrenamentul reţelei a fost făcut (urmând algoritmul de cross-validation) pe 80% dintre valori, iar restul de 20% au fost folosite pentru testare. Au fost făcute cate 10 execuţii ale algoritmului pentru fiecare alegere a variabilelor şi a fost calculată eroarea medie obţinută în aceste cazuri.

Regula de oprire a algoritmului a fost ca eroarea obţinută la pasul curent să nu scadă timp de 20 de paşi ai algoritmului sau numarul de paşi să nu depăşească 10000. Erorile medii obtinute pentru predicţia nivelului seric al Leptin sunt prezentate in tabelul de mai jos:

Antrenament Validare (test) 0.259 0.227

Nu s-au obţinut rezultate notabile in ceea ce priveste estimarea nivelului seric al Visfatin. Reţeaua neuronală a dat cele mai bune rezultate în predicţia nivelului din fluidul sinovial al IL17A în funcţie de CRP, Anti CCP şi RF.

Antrenament Validare (test) 0.206 0.181

Restul de teste au afişat la antrenament sau validare (sau ambele) în medie erori mai mari ca 0.3 (acurateţe sub 70%). Utilizarea reţelelor neuronale probabiliste (PNN)

Algoritmul de antrenament şi testatea pentru PNN a fost implementat tot in limbajul Java. Baza de date a fost MS Excel.

Algoritmul a considerat ca si variabla ce determină clasa de apartenenţă + nivelul sinovial al LEPTIN, VISFATIN şi IL17A (separat).

Ca şi variabile independete am considerat mai întâi cele care se corelează cu nivelurile sinoviale, mai întâi cele care au coeficientul de corelaţie mai mare si apoi restul.

Deoarce în algoritm avem nevoie să gasim un parametru sigma (σ) într-un interval de căutare, am împărţit intervalul, pe rând, în 10, apoi 20, 30,..., 100, 200, 300, ..., 1000 diviziuni.

Au fost facute pentru fiecare din parametri şi diviziuni câte 10 repetări ale algoritmului, folosind acceaşi proporţie 80% - 20% pentru cross-validation.

Folosind algoritmul de decizie folosind PNN nu am obţinut rezultate notabile în clasificarea instanţelor bazei de date în funcţie de reactivitatea sinovială. Acest lucru se datorează în mare parte faptului ca variabilele nu sunt normal distribuite şi/sau numărului mic de date. Optimizarea dinamica a algoritmilor de data mining

Algoritmii implementaţi - în special algoritmul pentru antrenamentul reţelei neuronale probabiliste (PNN) – au

fost imbunătăţiţi din punct de vedere al vitezei de lucru. Astfel, execuţia unui singur test care dura in medie cinci minute a fost scăzută la mai puţin de 30 secunde.

O problemă aparută în timpul efectuării testelor a fost rezolvată: calculul valori funcţiei exponenţiale ex când x are valori mari. Acest lucru a fost rezolvat înlocuind expresia ex cu aproximarea ei dată de polinomul lui Taylor, pentru un ordin al polinomului ales euristic (n=8 ne oferă suficiente zecimale pentru un calcul corect).

Imbunătăţirea a avut în vedere faptul că baza de date nu se schimbă de la o execuţie la alta. Astfel, distanţele, mediile si deviaţiile standard ale grupurilor au fost calculate numai la prima rulare, următoarele folosind calculele deja

efectuate. O alta imbunătăţire semnificativă a fost micşorarea timpului de acces la baza de date (implementată ca un fisier

Excel) prin folosirea sistemului de gestiune a bazelor de date MySql care are o viteză de acces a datelor superioară. Identificarea aplicatiilor potentiale in alte afectiuni reumatologice

Aplicarea metodelor probabiliste in constructia modelului matematic poate fi extinsa si la alte afectiuni cum sunt de exemplu artritele nediferentiate, in cazul carora actualmente se constata un efort concertat al comunitatii academice in validarea unor seturi de recomandari pentru clasificare, definire predictiva si monitorizare.

Pornind de la rezultatele cercetarii, ne propunem, pe de o parte, cresterea relevantei prin includerea in studiu a unui numar mai mare de pacienti cu artrita reumatoida precoce, iar pe de alta parte, extinderea cercetarii prin studiul de noi variabile de tip adipokinic (resistin, apelin, vaspin) si citokinic Th17 (IL-23, IL-22, IL-27, IL-10) – vizând astfel largirea panelului de biomarkeri relevanti pentru activitatea si predictia artritei reumatoide.

24

Referinte bibliografice

1. TONG KM, SHIEH DC, CHEN CP et al.: Leptin induces IL-8 expression via leptin receptor, IRS-1, PI3K, Akt cascade and promotion of NF-kappaB/p300 binding in human synovial fibroblasts. Cell Signal. 2008; 20(8): 1478-88.

2. ANDERS HJ, RIHL M, HEUFELDER A, LOCH O, SCHATTENKIRCHNER M: Leptin serum levels are not correlated with disease activity in patients with rheumatoid arthritis. Metabolism. 1999; 48(6): 745-8.

3. OTERO M, LAGO R, GOMEZ R, et al.: Changes in plasma levels of fat-derived hormones adiponectin, leptin, resistin and visfatin in patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2006; 65(9): 1198-201.

4. BOKAREWA M, BOKAREW D, HULTGREN O, TARKOWSKI A: Leptin consumption in the inflamed joints of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2003; 62(10): 952-6.

5. TARGOŃSKA-STEPNIAK B, MAJDAN M, DRYGLEWSKA M: Leptin serum levels in rheumatoid arthritis patients: relation to disease duration and activity. Rheumatol Int. 2008; 28(6): 585-91.

6. BUSSO N, SO A, CHOBAZ-PÉCLAT V, et al.: Leptin signaling deficiency impairs humoral and cellular immune responses and attenuates experimental arthritis. J Immunol. 2002; 168(2): 875-82.

7. BERNOTIENE E, PALMER G, TALABOT-AYER D, SZALAY-QUINODOZ I, AUBERT ML, GABAY C: Delayed resolution of acute inflammation during zymosan-induced arthritis in leptin-deficient mice. Arthritis Res Ther. 2004; 6(3): R256-63.

8. CHEN K, LI F, LI J, et al.: Induction of leptin resistance through direct interaction of C-reactive protein with leptin. Nat Med. 2006; 12(4): 425-32.

9. SEVEN A, GUZEL S, ASLAN M, HAMURYUDAN V. Serum and synovial fluid leptin levels and markers of inflammation in rheumatoid arthritis. Rheumatol Int 2009;29:743–747.

10. ZARKESH-ESFAHANI H, POCKLEY G, METCALFE RA, et al.: High-dose leptin activates human leukocytes via receptor expression on monocytes. J Immunol. 2001; 167(8): 4593-9.

11. RASO GM, PACILIO M, ESPOSITO E, COPPOLA A, DI CARLO R, MELI R: Leptin potentiates IFN-gamma-induced expression of nitric oxide synthase and cyclo-oxygenase-2 in murine macrophage J774A.1. Br J Pharmacol. 2002; 137(6): 799-804.

12. MONTECUCCO F, BIANCHI G, GNERRE P, BERTOLOTTO M, DALLEGRI F, OTTONELLO L: Induction of neutrophil chemotaxis by leptin: crucial role for p38 and Src kinases. Ann N Y Acad Sci. 2006; 1069: 463-71.

13. CALDEFIE-CHEZET F, POULIN A, VASSON MP: Leptin regulates functional capacities of polymorphonuclear neutrophils. Free Radic Res. 2003; 37(8): 809-14.

14. TIAN Z, SUN R, WEI H, GAO B: Impaired natural killer (NK) cell activity in leptin receptor deficient mice: leptin as a critical regulator in NK cell development and activation. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 298(3): 297-302.

15. LAM QL, LIU S, CAO X, LU L: Involvement of leptin signaling in the survival and maturation of bone marrow-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 2006; 36(12): 3118-30.

16. FAROOQI IS, MATARESE G, LORD GM, et al.: Beneficial effects of leptin on obesity, T cell hyporesponsiveness, and neuroendocrine/metabolic dysfunction of human congenital leptin deficiency. J Clin Invest. 2002; 110(8): 1093-103.

17. LORD GM, MATARESE G, HOWARD JK, BAKER RJ, BLOOM SR, LECHLER RI: Leptin modulates the T-cell immune response and reverses starvation-induced immunosuppression. Nature. 1998; 394(6696): 897-901.

18. OUCHI N, WALSH K: Adiponectin as an anti-inflammatory factor. Clin Chim Acta. 2007; 380(1-2): 24-30. 19. EHLING A, SCHÄFFLER A, HERFARTH H, et al.: The potential of adiponectin in driving arthritis. J

Immunol. 2006; 176(7): 4468-78. 20. LUK T, MALAM Z, MARSHALL JC: Pre-B cell colony-enhancing factor (PBEF)/visfatin: a novel mediator

of innate immunity. J Leukoc Biol. 2008; 83(4): 804-16. 21. NOWELL MA, Richards PJ, Fielding CA, Ognjanovic S, Topley N, Williams AS, et al. Regulation of pre-B

cell colony-enhancing factor by STAT-3-dependent interleukin-6 trans-signaling: implications in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2006;54:2084–95.

22. BRENTANO F, Schorr O, Ospelt C, Stanczyk J, Gay RE, Gay S, et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/ visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrixdegrading activities. Arthritis Rheum 2007;56:2829–39. [PubMed: 17763446].

23. HEE RHO Y, Solus, J., Sokka T, et al. Adipocytokines are associated with radiographic joint damage in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2009 July ; 60(7): 1906–1914.

25

26

24. MOSCHEN AR, GERNER RR, TILG H. Pre-B cell colony enhancing factor/NAMPT/visfatin in inflammation and obesity-related disorders. Curr Pharm Des 2010; 16(17):1913-20.

25. RAZA K, Falciani F, Curnow SJ, Ross EJ, Lee CY, Akbar AN, et al. Early rheumatoid arthritis is characterized by a distinct and transient synovial fluid cytokine profile of T cell and stromal cell origin. Arthritis Res Ther 2005;7:R784–95.

26. Lubberts, E. Th17 cytokines and arthritis. Semin Immunopathol 2010; 32: 43-53. DOI 10.1007/s00281-009-0189-9.

27. Rosu A, Ciurea P, Simionescu C, Margaritescu C, Musetescu AE, Ciurea R, Vreju AF. The study of angiogenesis in early rheumatoid arthritis--clinical, immunohistochemical and immunological correlations. J Med Life. 2008;1(3):287-94.

28. Vreju F, Ciurea M, Roşu A, Muşetescu A, Grecu D, Ciurea P. Power Doppler sonography, a non-invasive method of assessment of the synovial inflammation in patients with early rheumatoid arthritis. Rom J Morphol Embryol. 2011;52(2):637-43.

29. Chabaud M, Durand JM, Buchs N, Fossiez F, Page G, Frappart L, Miossec P: Human interleukin-17: a T cell-derived proinflammatory cytokine produced by the rheumatoid synovium. Arthritis Rheum 1999, 42:963-970.

30. Moran Em, Mullan R, McCormick J, Connoly M, Sullivan O et al. Human rheumatoid arthritis tissue production of IL-17A drives matrix and cartilage degradation: synergy with tumour necrosis factor-α, Oncostatin M and response to biologic therapies. Arthritis Res & Ther 2009 11(4): R113 (doi:10.1186/ar2772).

31. Shahrara S, Huang Q, Mandelin AM, Pope RM. TH-17 cells in rheumatoid arthritis. Arthritis Res & Ther 2008; 10:R93 (doi:10.1186/ar2477).

32. Kokkonen H, Soderstrom I, Rocklov J et al: Up-regulation of cytokines and chemokines predates the onset of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2010; 62(2): 383-91. DOI 10.1002/art.27186.

33. Kirkham BW, Lassere MN, Edmonds JP, Juhasz KM, Bird PA, et al. Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis: a two-year prospective study (the DAMAGE study cohort). Arthritis Rheum 2006 54: 1122–1131.

34. Gullick NJ, Evans HG, Church LD, Jayaraj DM, Filer A, et al. Linking Power Doppler Ultrasound to the Presence of Th17 Cells in the Rheumatoid Arthritis Joint. PLoS ONE 2010; 5(9): e12516. doi:10.1371/journal.pone.0012516.

35. Yamada H, Nakashima Y, Okazaki K, Mawatari T, Fukushi JI, et al. Th1 but not Th17 cells predominate in the joints of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2008; 67: 1299–1304.

36. Hueber AJ, Asquith DL, Miller AM, Reilly J, Kerr S, et al.Cutting Edge: Mast Cells Express IL-17A in Rheumatoid Arthritis Synovium. J Immunol 2010;184: 336–340.

37. Patel DN, King CA, Bailey SR, Holt JH, Venkatachalam K, Agrawal A, Valente AJ, Chandrasekar B: Interleukin-17 stimulates Creactive protein expression in hepatocytes and smooth muscle cells via p38 MAPK and ERK1/2-dependent NF-kappa B and C/EBPbeta activation. J Biol Chem 2007;282:27229-27238.

38. Leipe J, Grunke M, Dechant C, Reindl C, Kerzendorf U, et al. Th17 cells in autoimmune arthritis. Arthritis Rheum 2010; 62(10): 2876–2885 DOI 10.1002/art.27622.

39. Tarner IH, Harle P, Muller-Ladner U, Gay RE, Gay S: The different stages of synovitis: acute vs chronic, early vs late and non-erosive vs erosive. Best Pract Res Clin Rheumatol 2005, 19:19-35.

40. Baeten D, Houbiers J, Kruithof E, Vandooren B, Van den Bosch F, Boots AM, Veys EM, Miltenburg AM, De Keyser F: Synovial inflammation does not change in the absence of effective treatment: implications for the use of synovial histopathology as biomarker in early phase clinical trials in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2006, 65:990-997.

41. Humby F, Manzo A, Kirkham B, Pitzalis C: The synovial membrane as a prognostic tool in rheumatoid arthritis. Autoimmun Rev 2007, 6:248-252.

42. Parzen E. On estimation of a probability density function and mode. Ann. Math. Stat.1962; 33, 1065-1076. 43. Specht D.F. (1988) Probabilistic neural networks for classification mapping or associative memory.

Proceedings IEEE International Conference on Neural Networks, 1988; 1: 525-532. 44. Specht D.F. (1990) Probabilistic Neural Networks. Neural Networks 1990; 3 (1): 109- 118.