principii de diagnostic microb.etape de lucru)@

8/17/2019 Principii de Diagnostic Microb.Etape de Lucru)@

1/18

PRINCIPII DE DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIC- consideraţii generale

O preocupare importantă a microbiologilor este stabilirea unui diagnostic microbiologic

corect, imaginarea unor teste de laborator necesare acestuia, ca şi studiilor de epidemiologie (care

se ocupă cu monitorizarea incidenţei bolilor infecţioase, a transmiterii acestora în colectivităţi şi cuelaborarea măsurilor necesare profilaxiei acestor boli). Pe de altă parte, clinicienii aşteaptă de la

microbiologi identificarea agenţilor patogeni, testarea sensibilităţii tulpinilor microbiene la

antibiotice şi o raportare rapidă a rezultatelor care să furnizeze informaţii relevante necesare

deciziilor medicale.

n general, este importantă semnalarea prezenţei unei infecţii, determinarea naturii sale

specifice şi furnizarea de date care să permită instituirea unui tratament timpuriu. Pentru stabilirea

tratamentului, diagnosticul microbiologic timpuriu este mai urgent în bolile infecţioase, dec!t în

orice alt tip de proces patologic. "n multe infecţii, morbiditatea şi mortalitatea pot fi reduse

semnificativ dacă se instituie în timpul cel mai scurt un tratament corect# în alte infecţii,

spitalizarea poate fi evitată sau scurtată şi intervenţiile c$irurgicale specifice pot fi evitate, dacă un

tratament antimicrobian este administrat rapid.

Cuantiicarea re!ultatelor. %cest concept nu a fost cu adevarat evaluat în microbiologie,

dec!t în cazul uroculturilor, deşi poate fi folosit şi în alte situaţii. &e exemplu, poate a'uta la )

diferenţierea unui microorganism prezent ca un *contaminant+, de unul implicat activ în infecţie#

) determinarea importanţei relative a diferitelor microorganisme în infecţiile mixte. n mod

obişnuit, cuantificarea uzuală prin metoda diluţiilor sau prin metoda ansei calibrate nu este

necesară. -umărul microorganismelor prezente poate fi apreciat cu *creştere abundentă+, *creştere

moderată+ sau *creştere săracă+, pe baza coloraţiei ram şi a creşterii constatate pe o placă cu

mediu de izolare (de ex., colonii extinse pe grupul de striuri, pe grupul / etc.). 0oloraţia ram

este importantă datorită diferenţelor în biologia, sensibilitatea faţă de agenţi antimicrobieni, rata de

creştere a bacteriilor ram pozitive şi ram negative, care pot fi corelate cu exigenţele lor

nutritive sporite (în cazul germenilor pretenţioşi).&iferitele metode de diagnostic (clasice şi moderne), de detectare şi ulterior de identificare

a agenţilor infecţioşi, au grade de sensibilitate diferite, cu praguri diferite în ceea ce priveşte

densitatea numerică iniţială a bacteriilor în proba patologică (tabelul nr. ). Printre disciplinele

biologice care au realizat în ultimii ani progrese considerabile în materie de automatizare,

bacteriologia medicală se număra printre cele care au aşteptat cel mai mult progresul te$nic.

/1


2/18

2abel nr. . Principalele tipuri de metode de detectare a bacteriilor in probele patologice, in functie de densitatea

numerica a bacteriilor, care ilustreaza si gradul de sensibilitate a metodelor.

333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333 Bacterii - Densitate nu"erica# greutate Metoda Pragul de detectare

$%& - $ ng

$%' - %($ ng Microsco)ie * $%' + $%& ,acteriiSerologie *$%' ,acterii + %($ng

$% + %(%$ ng

$%. + $)g Sonde * $%. +$%'

$%/ + %($ )g

$% - %( %$ )g Sonde ra"iicate * $%$ + $%.

$ - $ g PCR # Cultura * $- $%/ ,acterii 333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333

Pri"a eta)a in evolutia te$nologica a bacteriologiei medicale a constat in disponibilitatea

galeriilor miniaturizate, gata de a fi utilizate, cu caractere de identificare bine ordonate si usor de

folosit, care au permis caracterizarea genurilor si speciilor si identificarea precisa si rapida a

acestora. &esi metodele clasice ram!n utile intr4un numar mare de cazuri, pentru bacteriile greu

cultivabile, metodele moleculare cum ar fi amplificarea genica in vitro (prin te$nica PCR) si

secventierea moleculelor de %5- 6 7, au permis progrese spectaculoase at!t in cercetare, c!t si in

diagnosticul bacteriologic. &e exemplu, in ultimul deceniu, prin astfel de metode au fost detectate

si identificate bacterii patogene, anterior necunoscute Bartonella henselae, Tropheryma

whippelii. %utomatizarea mai accentuata a te$nicilor moleculare este o necesitate care ar face

aceasta te$nologie accesibila unui numar mai mare de laboratoare.

A doua eta)a in evolutia te$nologica a constat in automatizarea te$nicilor de studiu a

sensibilitatii la agenti antimicrobieni prin microdilutie in mediu lic$id, ceea ce a permis sa se

acceada la o simplificare metodologica si o exprimare parametrica a rezultatelor. 0uplarea

te$nicilor de identificare, cu aceste sisteme de citire interpretativa a antibiogramelor usureaza

munca si interpretarea rezultatelor de catre microbiologi. 2otusi antibiograma realizata prin metoda

difuzimetrica ram!ne foarte utila pentru anumite genuri si specii bacteriene.

A treia eta)a in evolutia te$nologica a constat in automatizarea unui examen, considerat pe

drept cuvant, ca cel mai important in domeniul bacteriologiei clinice, respectiv hemocultura, un

/6


3/18

examen fundamental pentru diagnosticul bacteriemiei si septicemiei. nfectiile grave, generalizate

necesita un diagnostic rapid, pentru a institui rapid antibioterapia tintita si eficienta.

Metode de diagnostic 0

I1 Diagnosticul "icro,iologic 2direct3

II1 Diagnostic i"unologic 2indirect3

. Diagnosticul inectiilor si identiicarea agentilor )atogeni cu a4utorul te5nicilor

"oleculare.

I1 Diagnosticul "icro,iologic 2direct3 necesita parcurgerea urmatoarelor etape(v. %nexa )

$1 Prele6area si trans)ortul )roduselor )atologice7

. E8a"enul direct al )roduselor macroscopic si microscopic (preparat 89l)#

/. I!olarea in cultura )ura a agentului patogen incriminat in etiologia unei infectii

(prin insam!ntare pe un mediu de cultura adecvat 4 medii de cultura uzuale,

selective sau de imbogatire)#

:. Identiicarea agentului )atogen se face in mai multe etape (vezi %nexa ), dupa

insam!ntarea pe medii de cultura speciale si examinarea urmatoarelor proprietati

4 Caractere de cultura si de colonie (dupa insam!ntarea pe diferite mediilic$ide si solide)#

4 ;xamenul microscopic permite determinarea ti)ului "orologic (fig. 1/)

si a ainitatilor tinctoriale (dupa efectuarea de frotiuri colorate prinmetoda ram (fig. 1:) si prin metode selective (pentru evidentiereasporilor, capsulei, incluziilor)#

4 Caractere ,ioc5i"ice 2"eta,olice)# studiul acestor caractere permitedeterminarea biotipului si o identificare destul de precisa#- ,ioti)i!area este accesibila ma'oritatii laboratoarelor si in acelasi timpmult utilizata deoarece proprietatile bioc$imice ale bacteriilor suntdeterminate de determinanti genetici cromozomali, astfel ca sunt maistabile dec!t alte caractere determinate de determinanti genetici plasmidiali# biotipizarea poate fi realizata cu a'utorul testelor bioc$imicecare au inregistrat o evolutie in timp, de la imaginarea lor si p!na in

prezento Teste indi6iduale, numite azi conventionale sau de referinta# se efectueaza

individual (un test < un tub 9 o placa) si in macrovolume (fig. 16 %, =, &)#o Siste"e de identiicare ,ioc5i"ica "ultitest, care utilizeaza medii speciale in

volume mici (tuburi de $emoliza) si care permit efectuarea si interpretarea maimultor teste bioc$imice in acelasi tub. >edii multitest mult utilizate in clinica, pentru identificarea enterobacteriilor, sunt 27, >8? si >@.

/A


4/18

oSiste"e "icrotest care se efectueaza in microvolume si care asociaza un numar marede teste in aceeasi placa9tub si care sunt de regula suficiente pentru a realiza oidentifcare precisa. >ulte dintre sistemele microtest au fost imaginate initial pentruidentificarea membrilor familiei Enterobacteriaceae# unele dintre speciile situlpinile de enterobacterii determina imbolnaviri grave, al caror diagnostic se

impune sa se faca cu rapiditate si precizie. ;xemple de sisteme microtest pentruidentificarea enterobacteriilor API 20E, Enterotube II, icro!I", icro#can.Sistemul API reprezinta un sistem de identifcare produs de

frma BioMérieux -Lyon, Franta, in numeroase variante pentrudierite grupe de microorganisme: API 20E (pentru enteroacterii sialti acili !ram negativi", API 20 NE (pentru acili !ram negativinon-enterici", API Staph, API Strep, API Candida etc# Acest sistempermite identifcarea unui numar mare de specii acteriene in $% -&' ore in general (varianta api) &*+ permite identifcarea in ' ore"ara a necesita determinarea unor caracteristici fziologicesuplimentare# Sistemul API 20E este considerat unul dintre cele mai

perormante sisteme de identifcare a enteroacteriilor find oversiune miniaturizata a procedurilor conventionale pentruidenticarea enteroacteriilor si a altor acterii !ram negative#+tapele de lucru cu acest sistem sunt ilustrate in fg. ()# Sistemuleste insotit de un catalog de identifcare eista in prezent si unprogram computerizat ( API Lab Plus"# Studiile realizate pe tulpiniizolate din mediul spitalicesc au aratat ca API &*+ este unul dintrecele mai complete sisteme comerciale de identifcare aenteroacteriilor find usor de citit si interpretat, permit.ndcomparatia valida a rezultatelor din dierite laoratoare ale lumii#

4 Caractere de )atogenitate si 6irulenta9 factorii de virulenta nu sunt studiati in clinica in general, ci in cercetare,totusi anumiti factori sunt foarte utili identificarii unui agent patogen, cum

ar fi: proprietatile hemolitice si tipul de hemoliza in cazul streptococilor,

coagulaza in cazul stafilococilor;

4 evidentierea proprietatilor $emolitice, citolitice, a proprietatilor deaderenta si invazie a unui substrat celular sensibil (culturi in vitro de celulenormale diploide sau linii celulare stabilizate), a capacitatii de a sintetizaenzime (agresine) si toxine (v. fig. / 4 //)# pentru confirmarea testelor invitro este necesar apoi studiul in vivo al proprietatilor de patogenitate sivirulenta (capacitatea de a initia o infectie la animale sensibile delaborator, agresivitatea si toxigeneza), ca si al imunogenitatii agentilor patogeni si raspunsului imun al gazdei#

4 Sensi,ilitatea#re!istenta la anumite substante antibiotice si

c$emoterapeutice (proprietati determinate de determinanti genetici

cromozomali stabili, utile identificarii anumitor specii 4 de ex., testul

sensibilitatii la optoc$in util in identificarea #tr. pneumoniae, sensibilitatea la

/B


5/18

bacitracina si rezistenta la 7C2 a streptococilor D4$emolitici, serogrupul %, pe

c!nd cei serogrupurile 0,?, sunt rezistenti la bacitracina si sensibili la 72C).

4 Inter)retarea re!ultatelor si identiicarea agentului inectios1

9 Siste"e de identiicare a "icroorganis"elor - dentificarea tulpinilor

bacteriene se poate face cu a'utorul unor sisteme de identificare de tipul A1 C5ei dic5oto"iceB1 Ta,ele de identiicare 2siste"e )olitetice3C1 Progra"e de identiicare asistata de calculator

A. C5eile dic5oto"ice pentru identificarea prezumtiva a microorganismelor sunt de acelasitip cu cele utilizate pentru identificarea macroorganismelor, reprezent!nd sistemesecventiale in cadrul carora identificarea se face pas cu pas, inaint!nd progresiv de4a lungula mai multor cai ramificate. %legerea unei cai sau a alteia depinde de caracterelemacroscopice sau microscopice observate sau rezultatele pozitive sau negative ale testelor bioc$imice efectuate. Prezinta dezavanta'ul ca, in cazul aprecierii incorecte a unui caracter,

se porneste pe o cale gresita a c$eii de identificare, care conduce la un diagnostic fals. B. Ta,elele sau sc5e"ele de identiicare )olitetice listeaza caractere importante pentruidentificarea unui grup de bacterii si caracterele specifice speciilor de bacterii din grupulrespectiv, frecvent izolate in clinica, de ex. stafilococi, enterobacterii. Prezinta avanta'ul cafiecararui caracter i se acorda o valoare egala pentru identificare si, in acelasi timp, pentrufiecare specie este prezentat si procentul de tulpini pozitive pentru fiecare caracter semnificativ.

C. Progra"ele de identiicare asistata de calculator au o baza de date mare, care permiteidentificarea corecta si calcularea gradului de asemanare a tulpinii de identificat cu tulpinide referinta ale aceleiasi specii bacteriene, semnal!nd si caracterele atipice ale tulpinii deidentificat# calculeaza scorul de identificare si in cazul c!nd acesta nu este maxim (EE,EF),

sugereaza teste suplimentare care ar putea imbunatati scorul si ar creste sansele deidentificare finala# sugereaza si alti taxoni posibili. ;xemple de programe de identificare P.I.B. $Probabilistic I%enti&ication o& Bacteria', BACT.I". $Bacterial i%enti&ication', API

Lab Plus $Bio(rieu)'.

'1 Deter"inarea s)ectrului de sensi,ilitate la anti,iotice 2a anti,ioti)ului3tulpinii bacteriene izolate, prin metoda antibiogramei < necesara in cazul unor genuri si specii supuse fenomenului de dob!ndire a rezistentei (stafilococi,enterococi, #tr. pneumoniae, enterobacterii, Pseu%omonas aeru*inosa, +aemophilus sp., eisseria *onorrhoeae s.a.).

&1 Seroti)i!area agentului )atogen )rin reactii serologice( permite caracterizareadin punct de vedere antigenic a tulpinii bacteriene izolate etapa necesara in cazulunor specii supuse fenomenului de variatie antigenica ;. coli, 7almonella sp.#serotipizarea poate fi utila studiilor epidemiologice.

:1 Ti)i!area cu a4utorul agilor 2li!oti)ie3( metoda aplicata mai ales in studiileepidemiologice. 5eprezintă determinarea spectrului de sensibilitate al unor tulpini bacteriene (#. typhimurium, #. aureus, E. coli, -. cholerae, C. %iphteriae etc.) faţă

/E


6/18

de un set de preparate fagice şi se bazează pe faptul ca celulele bacterieneaparţin!nd aceleiaşi tulpini sunt sensibile la aceleaşi preparate fagice.

n continuare, sunt prezentate anumite detalii metodologice referitoare la etapele identificarii. I1 Diagnosticul "icro,iologic 2direct3 4

$1Prele6area si trans)ortul )roduselor )atologice - Reco"andari generale

• 5ecoltarea de probe corespunzatoare (de ex. s!nge si lic$id cefalora$idian in cazul unei

suspiciuni de meningita)#

• 5ecoltarea probei trebuie sa se faca la momentul potrivit, in timpul fazei acute a bolii#

• &aca este posibil, proba trebuie recoltata inainte de inceperea tratamentului cu substante

antimicrobiene#

• 0olectarea unei cantitati suficiente de produs biologic si un numar adecvat de probe (de ex. o

cantitate suficienta de s!nge9ser pentru mai mult de un set de determinari)#• ;vitarea contaminarii produsului prin

• microbiota normala (de ex. urina se recolteaza din 'etul mi'lociu)#• ec$ipament nesteril#

• @tilizarea unor containere potrivite si medii de transport corespunzatoare#

• ;tic$etarea corecta a probelor#

• 0ompletarea formularului de anc$eta cu informatii clinice si o posibila etiologie#

•

7tabilirea legaturii cu laboratorul si informarea acestuia de eventuale teste necesare#• 2ransportul probelor biologice la laborator in timpul cel mai scurt, perioada in care trebuie

mentinute conditiile necesare mentinerii viabilitatii agentilor patogeni eventual prezenti in

probe# aceste conditii se refera la

2emperatura < care trebuie sa fie optima pentru supravietuirea tipului de germeni banuiti# de

ex. speciile de eisseria sunt sensibile la temperaturi scazute, temperatura optima de transport

a probelor suspecte fiind de /AG0, in timp ce pentru produsele polimicrobiene, temperatura

optima de transport este de :G0, evit!ndu4se multiplicarea germenilor asociati, prezenti in mod

normal in produsul biologic respectiv#

2impul de supravietuire al agentilor patogeni in probe, p!na la prelucrarea acestora in

laborator# timpul maxim este in medie de 6 ore, dar poate fi prelungit prin utilizarea mediilor

de transport sau de conservare, care contin in acelasi timp si factori in$ibitori ai multiplicarii

microorganismelor asociate (ex. mediu 7tuart)#

:H


7/18

Potentialul redox al mediului si conditia de anaerobioza, necesara transportului bacteriilor

anaerobe, asigurata in recipiente cu azot sau dioxid de carbon sau cu un agent reducator#

seringa de recoltare a probelor (s!nge sau lic$id de inflamatie a tesuturilor afectate) nu trebuie

sa contina aer, iar acul trebuie sa fie infipt intr4un dop de cauciuc inainte de recoltare.

Conditii )articulare de recoltare si trans)ort ale )rinci)alelor)roduse ,iologice recoltate in ca!ul ,olilor inectioase

4 E8udatul nasoaringian < se recolteaza in infectii ale cailor respiratorii# recoltarea se facecu tampon de vata steril, dimineata, pe nem!ncate, inainte de peria'ul dintilor# recoltarea seface prin miscari circulare pe suprafata amigdalelor si a peretelui posterior al faringelui. 7eevita atingerea limbii. Perioada p!na la prelucrarea in laborator a probelor nu trebuie sadepaseasca $, c!nd acestea sunt pastrate la temperatura camerei sau maximum : $ la :G0.

4 S)uta < se recolteaza in infectii bron$o4pulmonare# recoltarea se face in placi Petri saurecipiente cu g!t larg sterile, din expectoratia consecutiva unui acces de tuse# se analizeaza

portiunile mucoide, eventual sanguinolente.4 Puroiul, materialul v!scos care contine leucocite intregi sau degradate, celule ale tesutuluiafectat, fibrile de fibrina si corpi microbieni, se recolteaza cu a'utorul seringii din cavitatiinc$ise si cu ansa, tampon sau pipete Pasteur din leziuni desc$ise. Perioada de transport a probelor nu trebuie sa depaseasca $ la la temperatura camerei sau : $ la :G0.

4 Secretiile "uco)urulente de pe mucoase si tegumente se recolteaza cu tampoane, ace sau pipeta Pasteur sterile si se transporta rapid la laborator #

4 S;ngele se recolteaza pentru examenul numit hemocultura, considerat cel mai importantexamen din bacteriologia clinica, deoarece este fundamental pentru stabilireadiagnosticului de bacteriemie si septicemie, forme grave ale bolilor infectioase carenecesita un diagnostic rapid si instituirea tratamentului #

4 recoltarea se face, dupa aplicarea locala a unui antiseptic (tinctura de iod), din vena bra$iala la adult si din vena 'ugulara la copil, direct in flacoanele cu mediu decultura (unul pentru germeni aerobi si unul pentru anaerobi)# se recomandarespectarea proportiei s!nge 9mediu de cultura ( volum s!nge9 H volume mediu).

4 ac0onIeJ sau %%=2) sau cu a'utorul unor teste rapide de tipul K &ip 7treaI L).

- Secretia uretrala se recolteaza cu a'utorul ansei sau cu tamponul steril si se transportarapid la laborator gonococul ( eisseria *onorrhoeae) fiind sensibil sub /AG0.

-Materiile ecale eliminate spontan (in infectii digestive acute) sau dupa purgative saline, serecolteaza in coprorecoltoare cu mediu de transport si conservare a viabilitatii germenilor(7tuart sau 0arJ4=lair)# se selecteaza pentru analiza bacteriologica a acestui produs numitacoprocultura, portiunile care prezinta mucozitati, puroi, striuri sanguinolente si din maimulte zone.

- Lic5idul cealora5idian( lic5idul )leural se recolteaza in meningite, afectiuni pleuro4 pulmonare, prin punctie realizata de catre medicul specialist#

:


8/18

4 insam!ntarea se face la patul bolnavului sau produsele se transporta rapid la laborator( eisseria menin*iti%is M meningococul nu supravietuieste sub /AG0 mai mult de /HN)#

- Ali"entele se analizeaza in cazul unei suspiciuni de toxiinfectie alimentara# inainte deinsam!ntare, alimentele lic$ide se omogenizeaza, iar cele solide se maruntesc si semo'areaza in apa fiziologica sterila.

4 =o"is"entele se analizeaza in cazul unei suspiciuni de toxiinfectie alimentara. 5esturile alimentare lic$ide se omogenizeaza, iar cele solide se maruntesc si se mo'areazain mod steril in apa fiziologica sterila# insam!ntarea se face la patul bolnavului sau produsul se transporta la laborator in maximum. 6 ore, la :G0.

- Produsele recoltate la necro)sie < se recomanda recoltarea lor in timpul cel mai scurtdupa deces si desc$iderea doar in final a cavitatii abdominale, cu scopul evitariicontaminarii altor probe cu bacterii din microbiota intestinala# transportul se face la :G0.

/1 E8a"enul direct al )roduselor macroscopic si microscopic (preparate 89l pt. evidentierea

prezentei, ca si a mobilitatii microorganismelor din proba analizata)#

.1 I!olarea in cultura )ura a agentului patogen incriminat in etiologia unei infectii (prin

insam!ntare pe un mediu de cultura adecvat 4 medii de cultura uzuale, selective sau de imbogatire)#

1 Identiicarea agentului )atogen

- se examineaza caracterele de cultura si de colonie (dupa insam!ntarea pe diferite medii de

cultura, lic$ide si solide)# se examineaza microscopic proprietatile morfologice ale germenilor

dezvoltati pe mediu lic$id pe preparate proaspete 89l (pentru evidentierea mobilitatii, caracter

util identificarii)#

- din culturile dezvoltate pe mediu lic$id9solid se fac preparate fixe < frotiuri, care se

examineaza la microscopul optic cu obiectivul de imersie si se determina ti)ul "orologic

(fig. 1/) si ainitatile tinctoriale7 frotiurile se coloreaza prin metoda ram, cu mare valoare

pentru diagnosticul prezumtiv (fig. 1:), ca si prin metode selective, daca este cazul (pentru

evidentierea sporilor, capsulei, incluziilor 4 prezenta diferitelor structuri intra 4 si extraparietale

fiind utile identificarii#

- studiul proprietatilor bioc$imice ale microorganismelor M ,ioti)i!are (exemple sunt prezentate

in fig. 11, 16)# toate caracterele observate se noteaza si apoi se utilizeaza pentru identificarea

taxonomica# dintre toate posibilitatile de tipizare si identificare taxonomica, biotipizarea esteaccesibila ma'oritatii laboratoarelor si in acelasi timp mult utilizata deoarece proprietatile

bioc$imice ale bacteriilor sunt determinate de determinanti genetici cromozomali, astfel ca

sunt mai stabile dec!t alte caractere determinate de determinanti genetici plasmidiali.

- =iotipizarea poate fi realizata cu a'utorul testelor bioc$imice (fig. 11, 16, 1A)

- Teste indi6iduale 2conventionale sau de referinta)# exemple fig. 16 %, =,

:


9/18

- Siste"e de identiicare ,ioc5i"ica "ultitest# ex.edii multitest mult utilizate in clinica, pentruidentificarea enterobacteriilor, sunt 27 (fig. 16 0), >@ si >8?.

- Siste"e "icrotest care se efectueaza in microvolume si care asociaza un numar mare de testein aceeasi placa9tub si care sunt de regula suficiente pentru a realiza o identifcare precisa (fig.1A < galerie %P).

?ig. 1/. 2ipuri morfologicede baza la bacterii.

?ig. 1:.>etoda coloratiei diferentiale ram# reactivi si timpi de lucru. 8a microscop, bacteriile ram

pozitive apar colorate in violet,iar cele ram negative


10/18

?ig. 11. ;tapele de lucru in izolarea si identificarea prezumtiva a stafilococilor.

::


11/18

%. =.

0. &.

a) b) c) d) e) a) b) c)

?ig. 16. dentificarea prezumtiva a ;nterobacteriilor pe baza caracterelor bioc$imice.

% < >etoda cromogena (test individual) pentru testul oxidazei (reactie pozitiva ⇒ st!nga)#= 4 2est (indiv.) pentru evidentierea reducerii nitratilor la nitriti si - (reactie pozitiva ⇒ tubul din st!nga)#0 4 &iferite reactii bioc$imice pe mediul multitest 27 a) fermetarea glucozei gaz# b) fermentarea

glucozei (fara gaz), za$arozei si lactozei# c) fermentarea glucozei (fara gaz), fara fermentareaza$arozei si lactozei# d) producere de 7# e) bacil ram (4) nefermentativ (nu apartineenterobacteriilor)#& 4 2este individuale de fermentatie tuburi &ur$am (pentru colectarea gazului rezultat # a) test pozitiv

pentru fermentarea glucidului fara producere de gaz# b) test negativ# c) test pozitiv pentru fermentareaglucidului producere de gaz.

?ig. 1A. ;tapele de lucru ale identificarii bioc$imice a bacteriilor cu a'utorulgaleriilor miniaturizate tip API $Bio(rieu)'.

:1


12/18

%t!t sistemele multitest, c!t si cele microtest, prezinta multiple avanta'e permit o identificare rapida comparativ cu testele conventionale#

:6


13/18

permit o identificare mai precisa si standardizarea metodei# permit economie de timp, materiale, personal.

-Inter)retarea re!ultatelor si identiicarea agentului inectios -Identifcarea tulpinilor microiene se poate ace cu a/utorul unor sisteme de

identifcare de tipul :

A1 C5ei dic5oto"iceB1 Ta,ele de identiicare 2siste"e )olitetice3C1 Progra"e de identiicare asistata de calculator

Principiile pe care se bazeaza aceste sisteme de identificare au fost prezentate succint la pag. /E.

Metode ra)ide de identiicare#detectare a ,acteriilor

7pre deosebire de toate aceste metode de testare a proprietatilor bioc$imice care suntdependente de cresterea bacteriilor, utilizarea unor teste cu substraturi enzimatice cromogene si procedeele cromatografice, permit laboratoarelor sa identifice precis si rapid numeroase specii de

microorganisme. 7ubstraturile cromogene detecteaza enzime preformate in bacterii si permitidentificarea unor microorganisme specifice direct in produsele patologige, metoda nefiinddependenta de cresterea bacteriana. 5ezultatele acestor teste rapide sunt luate in considerare, in paralel cu cele traditionale, bazate pe cresterea pe medii selective, pe examinarea caracterelor decolonie si a celor morfologice observate pe frotiuri colorate ram. 2estele bazate pe utilizarea desubstraturi cromogene, se utilizeaza in paralel si cu testele de tipul *spoturilor+, cum ar fi testulcatalazei si al oxidazei (fig. 16 %), pentru o identificarea prezumtiva corecta a microorganismelor semnificative din punct de vedere clinic. &iferite variante ale acestor te$nici, ca si metoda gaz4cromatografiei pot fi folosite pentru detectarea produsilor bacterieni direct in probele clinice sau pentru a furniza informatii a'utatoare identificarii bacteriilor la nivel de gen si specie.

1. Deter"inarea s)ectrului de sensi,ilitate 2anti,ioti)ului3 tul)inii ,acteriene

i!olate( )rin "etoda anti,iogra"ei in varianta difuzimetrica (>ir,? - Bauer)# se

determina spectrul de sensibilitate la un set de antibiotice, cunoscute ca fiind active

pentru grupul de bacterii caruia îi apartine tulpina identificata, dar care sunt supuse

fenomenului de dob!ndire a rezistentei, cu scopul alegerii celui mai potrivit pentru

antibioterapie (fig. 1E)# determinarea concentratiei minime in$ibitorii (0.>..) si

minime bactericide (0.>.=.), utile determinarii proprietatilor farmacologice ale

antibioticelor, ca si calcularii dozelor terapeutice sunt sc$ematizate in fig. 1B#

>ai nou, este utilizata si metoda E-test (spectru de sensibilitate 0.>..) (v. fig. :6).

6. Seroti)i!area permite caracterizarea din punct de vedere antigenic a tulpinii bacteriene izolate, prin evidentierea antigenelor bacteriene, cu seruri imune poli4 simonospecifice, metoda aplicata mai ales in studiile epidemiologice# de ex. prinreactii de aglutinare bacteriana (directa) pe lama (fig. 6H) si in tub# reactii de latex4aglutinare (aglutinare pasiva).

:A


14/18

?ig..1B. &eterminarea concentratiei minime in$ibitorii (0.>..) si a concentratiei minime bactericide

(0.>.=.). 7etul de tuburi care contin cantitati descrescatoare (dilutii binare) de substante antibiotice inmediu de cultura, se inoculeaza cu tulpina bacteriana de testat. &upa incubare (la /AG0, B $), tuburile seexamineaza macroscopic si se determina 0.>.., care este indicata de cea mai mica concentratie deantibiotic care in$iba cresterea bacteriana (in acest exemplu B Qg9ml). Pentru a evidentia si efectul bactericid0.>.=. (nu doar cel bacteriostatic, in$ibitor al cresterii), se insam!nteaza in placi cu mediu solid faraantibiotice, c!te H, ml din tuburile cu concentratii de antibiotic superioare 0.>.. 0oncentratia de antibiotic

care in$iba aparitia de colonii in proportie de cel putin EE,E F (in acest exemplu 6 Qg9ml) indica 0.>.=.

?ig. 1E. 2estarea sensibilitatii la antibiotice (antibiograma) prin metoda difuzimetrica RirbJ4 =auer.2ulpina bacteriana testata (insam!ntata *in p!nza+ pe mediul solid >ueller4inton din placa, pe suprafatacaruia s4au plasat discuri de antibiotice, dupa care placa se incubeaza la /AG0, B $) este sensibila la anumite

antibiotice si rezistenta la altele. Pentru ca tulpinile sa fie considerate sensibile, diametrele zonelor de in$ibitiea cresterii din 'urul discurilor de antibiotice trebuie sa depaseasca anumite valoari4prag, valori care se gasesc in tabelespeciale. SSSS.6e!i ca)itolul reeritor la T51 Anti,iogra"ei1

:B


15/18

picatura suspensie picatura suspensie bacteriana bacteriana

picatura picatura apaser imun fiziologica sterila

P M

?ig. 6H. 7c$ema testului de aglutinare pe lama, realizat prin punerea in contact a uneisuspensii bacteriene, realizata prin omogenizarea in apa fiziologica sterila a unei colonii bacterienedintr4o cultura a tulpinii de serotipizat, cu seruri imune polispecifice si monospecifice, diluatecorespunzator titrului reactiei pe lama, indicat de producator (P M proba, > M martor).

A. Ti)i!area cu a4utorul agilor 2li!oti)ie31 >etoda se bazeaza pe spectrul de gazdalimitat al multor bacteriofagi, astfel ca unele linii fagice stabilesc relatii si un ciclulitic doar cu o anumita tulpina a unei specii bacteriene. 7e utilizeaza seturi diferitede preparate fagice standardizate, destinate tipa'ului fagic al unor specii bacteriene,ale caror tulpini nu pot fi diferentiate prin metode bioc$imice sau serologice (de ex. pentru tipizarea unor specii ale genurilor #taphylococcus, Corynebacterium,#almonella). >etoda este utila mai ales epidemiologiei, care studiaza distributia sicirculatia tulpinilor bacteriene in populatie si se practica in 0entrele -ationale de5eferinta pentru bacteriile patogene respective ale nst. 0antacuzino (etapele delucru ale lizotipiei sunt sc$ematizate in fig. 6).

II1 Diagnostic i"unologic 2indirect34 studiul raspunsului imun al organismului gazda, fata de agentul infectios nu este obligatoriu, pentru caraspunsul imun fata de unii agenti infectiosi este tardiv, slab sau absent (de exemplu, in infectiilelocale)# se investig$eaza

4 Raspunsul imun me%iat umoral < metode de studiuo in vitro < reactii serologice %g4%c, efectuate cu ser de pacient si antigene de

diagnostic, efectuate cu scopul decelarii si titrarii anticorpilor specificiantigenelor utilizate#

:E


16/18

o in vivo < intradermoreactii (.&.5.) < cu antigene purificate, in'ectate intradermic, care permit demonstrarea faptului ca organismul respectiv estesensibilizat, are anticorpi fata de agentul patogen din care s4a extras antigenulinoculat.

4 Raspunsul imun me%iat celular < metode de studiuo in vitro < testarea functiei leucocitelor P>--, a macrofagelor (teste de migrare, de

fagocitoza, $istoc$imice), a limfocitelor 2 si = (testul transformarii limfoblastice)#o in vivo < r.eactii de $ipersensensibilitate int!rziata mediata celular (:B ore).

?ig. 6. lustrarea metodei lizotipiei (tipizarea tulpinilor bacteriene cu a'utorulfagilor litici), pe etape de lucru.

I=1 Diagnosticul inectiilor si identiicarea agentilor )atogeni cu a4utorul te5nicilor

"oleculare.

1H


17/18

&esi metodele clasice ram!n utile intr4un numar mare de cazuri, pentru bacteriile greu

cultivabile, metodele moleculare au permis progrese spectaculoase at!t in cercetare, c!t si in

diagnosticul bacteriologic. &iagnosticul microbiologic bazat pe analize genetice prezinta

numeroase avanta'e. ;ste foarte indicat in cazul microorganismelor cu crestere lenta sau care cresc slab sau nu

cresc deloc pe medii de laborator, evit!nd incubarile prelungite si rezultatele fals negative.

2. &eoarece nu este necesara insam!ntarea probelor si cultivarea agentilor patogeni, probele

patologice pot fi recoltate si pastrate prin ing$etare perioade lungi de timp. %ceste probe

sunt utile si pentru verificarea eficacitatii vaccinurilor.

/. Permit identificarea de noi specii prin compararea datelor obtinute prin metode moleculare,

cu cele existente in bazele de date. &e exemplu, in ultimul deceniu, prin astfel de metodeau fost detectate si identificate bacterii patogene, anterior necunoscute Bartonella

henselae, Tropheryma whippelii.

. >etodele moleculare pot fi utilizate in diagnosticul infectiilor cu bacterii parazite obligat

intracelular (ex. Ric1ettsia sp., Bartonella sp., Chlamy%ia sp.) si virusuri care necesita

pentru cultivare substraturi vii sau pentru care nu exista p!na in prezent metode de cultivare

in conditii de laborator. %cesti agenti infectiosi pot fi identificati cu a'utorul unor 1it 4uri de

diagnostic molecular, standardizate si comercializate. @n exemplu in acest sens este

bacteria C. trachomatis care poate fi evidentiata direct in probele patologice (secretie

vaginala sau uretrala, urina) cu a'utorul unei variante a te$nicii P05 numita 805 ( i*ase

Chain Reaction) (vezi 0ap. =acterii parazite obligat intracelular 4 Chlamy%ia sp.'

Studiul "ar@erilor geno"ici se realizeaza prin amplificarea unui fragment de %&- specific

pentru o anumita unitate taxonomica microbiana (te$nica PCR), restrictie enzimatica pe genomul

total sau pe un anumit fragment amplificat in prealabil, $ibridizare cu sonde marcate.

Pro,e de aci!i nucleici

5eprezinta o secventa de %&- care $ibridizeaza specific cu o catena complementara. O proba poate fi construita pentru a detecta fie %&-, fie %5-. Probele pot fi mici (in lungime de

aprox. H nucleotide) sau mari (c!teva mii de nucleotide). Principiul de baza al te$nologiei

probelor de %&- este $ibridizarea, care implica denaturarea moleculelor de %&- dublu catenare,

1


18/18

in molecule monocatenare si detectarea acestora cu probe de %&- monocatenar marcate. 2estul

$ibridizarii poate fi folosit pentru

$3 a de"onstra inrudirea genetica (secvente omologe ale succesiunii de baze in %&-4ul

diferitelor organisme, astfel ca au fost utilizate extensiv in construirea unor sc$eme taxonomice

filogenetice, de obicei prin analiza secventelor de %5-r 6 7 inalt conservate)# de ex., pentru

stabilirea taxonomiei bacteriilor apartin!nd genurilor Campylobacter si +elicobacter , s4au folosit

te$nici moleculare $ibridizarea %&-

principii de diagnostic microb.etape de lucru)@

Documents