microscopie

Microscopie optica.Microscopie optica.Masuratori cu microscopul opticMasuratori cu microscopul optic

Microscopie opticaUMF Carol Davila – Catedra de Biofizica

Tehnici de microscopieTehnici de microscopie

Microscopie Microscopie opticaoptica• Microscopie optica de transmisieMicroscopie optica de transmisie• Microscopie de baleiaj utilizand lasereMicroscopie de baleiaj utilizand lasere

➢ Microscopie confocalaMicroscopie confocala➢ Microscopie in camp apropiatMicroscopie in camp apropiat

Microscopie Microscopie electronicaelectronica• Microscopie electronica de transmisieMicroscopie electronica de transmisie• Microscopie electronica de baleiajMicroscopie electronica de baleiaj

Microscopie Microscopie de forta atomicade forta atomica


Componentele unui microscopComponentele unui microscop

OcularulOcularul (1) – contine lentilele (1) – contine lentilele ocular; valori tipice ale maririi: 5x, ocular; valori tipice ale maririi: 5x, 10x si 2x10x si 2x

Obiectivul Obiectivul (2); valori tipice ale (2); valori tipice ale maririi: 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x maririi: 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x si 100x; interschimbabilesi 100x; interschimbabile

MasaMasa (3) – sustine proba de (3) – sustine proba de examinatexaminat

Sursa de luminaSursa de lumina (4) – situata (4) – situata sub masasub masa

CondensorulCondensorul (5) – sistem de (5) – sistem de lentile si diafragme care lentile si diafragme care controleaza cantitatea de lumina controleaza cantitatea de lumina prin proba si focalizarea luminiiprin proba si focalizarea luminii

MacrovizaMacroviza (6) si (6) si microvizamicroviza (7) (7)


Microscopie opticaMicroscopie optica Microscopie optica de transmisieMicroscopie optica de transmisie

• Lumina traverseaza proba microscopica; Lumina traverseaza proba microscopica;

• Lumina este absorbita diferentiat de diferite componente ale Lumina este absorbita diferentiat de diferite componente ale probeiprobei

• Este nevoie frecvent de colorarea artificiala a probei pentru a Este nevoie frecvent de colorarea artificiala a probei pentru a vizualiza mai bine anumite componente celulare etc.vizualiza mai bine anumite componente celulare etc.

• Imaginea finala este virtuala, marita si rasturnataImaginea finala este virtuala, marita si rasturnata

A

BA’

B’

A”

B”

F1

F1’ F2 F2’

Ob

Oc

e

Formarea imaginii intr-un microscop opticAB – obiect

A’B’ – imagine intermediara

A’’B’’ – imagine finala

Ob – lentila obiectiv

Oc – lentila ocular

F1, F1’ – focare obiectiv

F2, F2’ – focare ocular

f1 – distanta focala obiectiv

f2 – distanta focala ocular

e – distanta intre F1’ si F2


Putere separatorie η=1/d

Rezolutie d = 1,22λ/(2nsinu)

λ - lungimea de unda a luminii folosite

n – indicele de refractie al mediului dintre obiectiv si preparat

u – unghiul de apertura al obiectivului

nsinu = NA (apertura numerica a obiectivului)

Putere P = tga2/AB

Grosisment G = P/4 = e/4f1f2

G = tga2/tga1

G = A”B”/AB

G = GobGoc

Microscopie opticaMicroscopie optica

Parametrii unui microscop opticParametrii unui microscop optic


Activitate experimentalaActivitate experimentala

Caracterizarea dimensiunii intr-o Caracterizarea dimensiunii intr-o populatie de celule eritrocitarepopulatie de celule eritrocitare

Obiective:Obiective:

• Calibrarea microscopului (determinarea factorului de conversie CF)

• Masurarea diametrului a 20-30 hematii seleactate aleator de pe un frotiu de sange

• Calculul mediei si deviatiei standard• Prezentarea grafica a rezultatelor


Activitate experimentalaActivitate experimentala

Micrometrul ocular = Micrometrul ocular = reticulreticul

Micrometru obiectivMicrometru obiectiv – diviziuni de 10 – diviziuni de 10 µµM / 20 M / 20 µµM (dupa cum este indicat pe M (dupa cum este indicat pe micrometru)micrometru)

Prin suprapunerea imaginii celor doua micrometre se poate determina Prin suprapunerea imaginii celor doua micrometre se poate determina factorul de factorul de conversieconversie ( (CFCF) al microscopului () al microscopului (µµM/div)M/div)

Micrometrul obiectiv este apoi inlocuit cu un frotiu de sangeMicrometrul obiectiv este apoi inlocuit cu un frotiu de sange

ΦΦ celulacelula ( (µµ M) = NM) = Ndivdiv x CF x Ob x CF x Obcalibrarecalibrare/Ob/Obmasuraremasurare ( (ΦΦcelulacelula = diametrul unei celule; N = diametrul unei celule; Ndivdiv = = numarul corespunzator de diviziuni de pe reticul (diametrului celulei); Obnumarul corespunzator de diviziuni de pe reticul (diametrului celulei); Obmasuraremasurare = = obiectivul cu care s-a realizat masurarea diametrelor; Obobiectivul cu care s-a realizat masurarea diametrelor; Obcalibrarecalibrare = marirea obiectivului = marirea obiectivului cu care s-a realizat calibrarea (determinarea CF))cu care s-a realizat calibrarea (determinarea CF))

Calibrarea microscopului

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.html

Micrometru ocular (reticul)

Micrometru obiectiv


Activitate experimentalaActivitate experimentalaReticul (micrometru ocular)

Determinarea CF si masurarea diametrului eritrocitar


Activitate experimentalaActivitate experimentalaAnaliza datelor

Measured diameter

d1 X1

d2 X2

d3 X3

.

.

.

.

.

.

.

.

dn Xn

Rezultate experimentale (n celule)

• Diametrul mediu:

• Deviatia standard:

n

XX

n

i∑= 1

∑ −=n

i XXn 1

2)(1σ


Materiale suplimentareMateriale suplimentare

http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.htmlhttp://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.html

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/index.htmlhttp://www.olympusmicro.com/primer/techniques/index.html

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.htmlhttp://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.html

http://www.bioteach.ubc.ca/CellBiology/confocal/index.htmhttp://www.bioteach.ubc.ca/CellBiology/confocal/index.htm

http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.html

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/index.html

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.html

http://www.bioteach.ubc.ca/CellBiology/confocal/index.htm


ApendixApendix

• Diferite tipuri de microscopieDiferite tipuri de microscopie• ImaginiImagini


Microscoape optice specialeMicroscoape optice speciale

• UltramicroscopulUltramicroscopul➢ Preparatul este iluminat lateral, imaginea finala se Preparatul este iluminat lateral, imaginea finala se

formeaza pe baza luminii difuzateformeaza pe baza luminii difuzate

• Microscopia in contrast de fazaMicroscopia in contrast de faza➢ Pentru obiecte transparente; imaginea este formata Pentru obiecte transparente; imaginea este formata

pe baza diferentei de faza indusa luminii care pe baza diferentei de faza indusa luminii care travereseaza medii optice diferite, din preparatul travereseaza medii optice diferite, din preparatul microscopicmicroscopic

• Microscopia de fluorescentaMicroscopia de fluorescenta➢ Necesita markeri speciali (fluorescenti); preparatul Necesita markeri speciali (fluorescenti); preparatul

este iluminat in UV si emite lumina in domeniul vizibileste iluminat in UV si emite lumina in domeniul vizibil


Imagini de microscopie opticaImagini de microscopie optica

http://www.ptei.org


Microscopie de fluorescentaMicroscopie de fluorescenta

http://neuroscience.nih.gov

Neuron hipocampic marcat cu YFP (yellow fluorescent protein)


Microscopie in contrast de fazaMicroscopie in contrast de faza

http://www.wallawalla.edu/academics/departments/biology/rosario/inverts/Porifera/Mycale_adhaerens.html


Microscopie optica folosind lasereMicroscopie optica folosind lasereMicroscopie confocalaMicroscopie confocala

Raza laser este focalizata succesiv in Raza laser este focalizata succesiv in sectiuni diferite ale preparatului. Este posibila sectiuni diferite ale preparatului. Este posibila reconstructia 3D ulterioara, pe baza reconstructia 3D ulterioara, pe baza imaginilor seriateimaginilor seriate

Microscopie in camp apropiatMicroscopie in camp apropiatDistanta dintre preparat si obiectiv este mai Distanta dintre preparat si obiectiv este mai

mica decat lungimea de unda a radiatiei laser mica decat lungimea de unda a radiatiei laser utilizateutilizateNu mai apar artefacte de difractieNu mai apar artefacte de difractiePermite rezolutii la nivel molecularPermite rezolutii la nivel molecular


Microscopie confocalaMicroscopie confocala

http://www.meade.com/dsi/gallery/molecular_probes.html

Imagine de fluorescenta a unei celule endoteliale, folosind trei markeri: rosu pentru mitocondrii, verde pentru citoschelet si albastru pentru nucleu


Microscopia electronica de Microscopia electronica de transmisietransmisie

•Utilizeaza lentile electromagnetice

Imagine a jonctiunii neuromusculare


Microscopie electronica de baleiajMicroscopie electronica de baleiaj

www.bacteria-world.com

•Vizualizarea suprafetelor

microscopie

Documents