valoarea ªi utilitateamicroscopiei confocale ...aparatului de microscopie confocalã, cu apariþia...

177

VALOAREA ªI UTILITATEA MICROSCOPIEI CONFOCALEDE REFLECTANÞÃ ÎN DERMATOLOGIE

THE VALUE AND UTILITY OF REFLECTANCE CONFOCALMICROSCOPY IN DERMATOLOGY

DANIELA ªERBAN*, MARIA MAGDALENA CONSTANTIN*,**

1. Consideraþii generale

În sfera dermatologiei, diagnosticul prezumtivse bazeazã pe examenul clinic al leziunilor ºieventual examenul dermatoscopic, însã confir-marea se realizeazã doar prin examen histo-

1. General considerations

In dermatology, the presumptive diagnosis isbased on the clinical examination of lesions andpossibly the dermatoscopy examination but theconfirmation is only obtained through

Rezumat

În sfera dermatologiei, diagnosticul prezumtiv sebazeazã pe examenul clinic al leziunilor ºi eventualexamenul dermatoscopic, însã confirmarea se realizeazãdoar prin examen histopatologic. Provocarea este stabilireaunui diagnostic cât mai coerent într-un mod cât mai puþininvaziv. Din acest motiv, în ultimii ani, atenþia s-aîndreptat asupra tehnicilor non-invazive, iar dintre acestea,microscopia confocalã de reflectanþã a demonstrat cele maipromiþãtoare rezultate.

La nivel mondial, melanomul înregistreazã o creºtereatât în incidenþã, cât ºi în mortalitate. În ciuda studiilorcontinue, melanomul în stadii avansate rãmâne încontinuare incurabil, soluþia cea mai adecvatã în acest cazreprezintã detecþia precoce cu excizia chirurgicalã completãîn timp util. Microscopia confocalã, efectuatã competent,reprezintã astãzi o alternativã valoroasã pentru obþinereaunui diagnostic rapid ºi corect.

Cuvinte cheie: microscopie confocalã, dermatoscopie,leziuni pigmentare, melanom.

Summary

In dermatology, the presumptive diagnosis is based onthe clinical examination of lesions and possibly thedermatoscopy examination but the confirmation is onlyobtained through histopathological examination. Thechallenge consists of determining a diagnosis as coherent aspossible in a manner as non-invasive as possible. For thisreason, during the past years, focus has been orientedtowards non-invasive techniques and among these,reflectance confocal microscopy has shown the mostpromising results.

Globally, the melanoma occurrence rate is increasingboth as incidence and mortality. Despite ongoing studies,melanoma in advanced stages remains incurable, and themost appropriate solution is this case is the early detectionwith full surgical excision in due time. Nowadays,appropriately performed confocal microscopy is a valuablealternative for obtaining a rapid and accurate diagnosis.

Key words: confocal microscopy, dermatoscopy,pigmented lesions, melanoma.

Intrat în redacþie: 1.07.2014Acceptat: 2.09.2014

Received: 1.07.2014Accepted: 2.09.2014

* Universitatea de Medicinã ºi Farmacie Carol Davila.Carol Davila Medicine and Pharmacy University.

** Clinica II Dermatologie, Spitalul Clinic Colentina – Bucureºti.Dermatology II Clinic, Colentina Hospital - Bucharest.

REFERATE GENERALEGENERAL REPORTS

178

DermatoVenerol. (Buc.), 59: 177-192

patologic. Provocarea este stabilirea unuidiagnostic cât mai coerent într-un mod cât maipuþin invaziv. Din acest motiv, în ultimii ani,atenþia s-a îndreptat asupra tehnicilor non-invazive, iar dintre acestea, microscopiaconfocalã de reflectanþã a demonstrat cele maipromiþãtoare rezultate.

La nivel mondial, melanomul prezintã ocreºtere a incidenþei ºi a mortalitãþii. Întrucâtmelanomul în stadii avansate rãmâne încontinuare incurabil, soluþia cea mai adecvatã înacest caz reprezintã detecþia precoce cu exciziachirurgicalã completã în timp util, însã protocoluldiagnosticãrii leziunilor suspecte de malignitatelasã de cele mai multe ori cicatrici nedorite înurma biopsierii leziunilor benigne.

2. Principiul microscopiei confocale dereflectanþã

Microscopia confocalã de reflectanþã este otehnicã de imagisticã opticã ce utilizeazã o diodãlaser ca ºi sursã de luminã monocromaticã ºicoerentã care penetreazã þesutul ºi ilumineazã unpunct unic la nivelul acestuia. Lumina de lanivelul secþiunii stimulate luminos se reflectã ºitrece printr-un filtru, formând astfel imaginea lanivelul detectorului. Acest filtru permite excitaþiaselectivã a unui anumit punct asupra cãruia serealizeazã focusarea ºi respectiv rejecþia luminiireflectate din afara planului focusat. Aceastapermite, spre deosebire de microscopia opticãconvenþionalã, analiza unor secþiuni obþinute înplan bi- sau tri-dimensional ºi controluladâncimii de câmp, precum ºi posibilitateaeliminãrii artefactelor de focalizare. Contrastuleste rezultatul diferenþelor indicilor de refracþie ai

histopathological examination. The challengeconsists of determining a diagnosis as coherent aspossible in a manner as non-invasive as possible.For this reason, during the past years, focus hasbeen oriented towards non-invasive techniquesand among these, reflectance confocalmicroscopy has shown the most promisingresults.

Globally, the melanoma occurrence rate isincreasing both as incidence and mortality. Asmelanoma in advanced stages remains incurable,the most appropriate solution is this case is theearly detection with full surgical excision in duetime but the diagnosis protocol for lesionssuspicious for malignancy often causesundesired scars following the biopsy of benignlesions.

2. The principle of reflectance confocalmicroscopy

The reflectance confocal microscopy is anoptical imaging technique that uses a laser diodeas monochromatic and coherent source of lightwhich penetrates the tissue and lightens a singlepoint. The light reflected from the stimulatedsection passes through a filter, thus forming theimage in the detector. This filter enables theselective excitation of a certain point in focus andthe rejection of light reflected from outside thefocal plane. As opposed to traditional opticalmicroscopy, this enables the analysis of sectionsobtained in bidimensional plane or threedimensions and the control of depth of field, aswell as the possibility to remove focus artefacts.Contrast results from the differences in refraction

DetectorDetector

Aperturã confocalãConfocal aperture

LaserLaser

Oglindã dicromicãMirror dichromate

ObiectivObjective

Obiect în afara planului focalizatObject off plan focused

Obiect în planul focalizatObject focused plan

Fig. 1. Principiul microscopiei confocale de reflectanþã(Reprodus dupã: *Extended Topic* Microscopy Enhancedby the Wave Characteristics of Light. OpenStax College.[Accesat 15 octombrie 2014]; Disponibil pe: URL:http://cnx.org/contents/0cc2b3c8-487e-49ea-925f-ff51cb2a0591@2/*Extended_Topic*_Microscopy_En)

Fig. 1. The principle of reflectance confocal microscopy(Adapted from: *Extended Topic* Microscopy Enhanced bythe Wave Characteristics of Light. OpenStax College.[Accessed on 15 October 2014]; Available on: URL:http://cnx.org/contents/0cc2b3c8-487e-49ea-925f-ff51cb2a0591@2/*Extended_Topic*_Microscopy_En )

179


organitelor celulare ºi ai microstructurilor ce apara fi luminoºi pe un fond negru (Fig. 1).

3. Utilitatea în dermatologie

Microscopia confocalã de reflectanþã repre-zintã unica tehnicã ce permite vizualizarea înplan orizontal a pielii pânã la nivelul dermuluisuperficial (aproximativ 300 µm, la o rezoluþie denivel celular (0,5-1 µm în dimensiunea lateralã ºi4-5 µm în cea axialã).1

În dermatologie, aceastã tehnicã are utilitateîn diagnostic in vivo (VivaScope® 1500, VivaScope® 1500 Multilaser ºi VivaScope® 3000, LucidInc) cât ºi ex vivo (VivaScope® 2500 Multilaser).2

Utilizãrile in vivo sunt urmãtoarele:

• Leziuni pigmentare• Leziuni melanocitare• Leziuni non-melanocitare• Controlul marginilor þesuturilor excizate• Monitorizarea în dinamicã a leziunilor

Utilizãrile ex vivo sunt:

• Chirurgie Mohs• Efectele radiaþiilor UV asupra pielii• Leziuni pigmentare• Mãsurarea grosimii epidermului• Diagnostic diferenþial dermatitã alergicã vs.

dermatitã de contact• Cicatrici ºi procese asociate vindecãrii• Efectele celulitei• Examinarea firelor de pãr

Microscopia confocalã de reflectanþã are ovaloare deosebitã în special în diagnosticulleziunilor melanocitare, întrucât melanina ºimelanozomii reprezintã o sursã puternicã decontrast, evidenþiind prin aceastã tehnicã celulelemelanocitare (Fig. 2).3

4. Protocolul de examinare

Procedura de examinare a unei leziuni cuajutorul microscopiei confocale de reflectanþãeste uºoarã, rapidã ºi nedureroasã pentru pacient.Totodatã trebuie menþionat ºi faptul cã artefactelesunt minime întrucât pielea nu este modificatã deaceastã procedurã.1

Protocolul de examinare cuprinde urmãtoriipaºi:

indices of cell organelles and of microstructures,as they appear as lightened on a blackbackground (Fig. 1).

3. Utility in dermatology

Reflectance confocal microscopy is the onlytechnique enabling horizontal viewing of skin upto the superficial dermis (about 300 µm, with aresolution equal to the cell dimensions (0.5-1 µmin lateral dimension and 4-5 µm in the axialdimension).1

In dermatology, this technique is useful for invivo diagnosis (VivaScope® 1500, VivaScope®

1500 Multilaser and VivaScope® 3000, Lucid Inc)as well as ex vivo diagnosis (VivaScope® 2500Multilaser).2

In vivo use consists of:

• Pigmented lesions• Melanocytic lesions• Non-melanocytic lesions• Control of excised tissue edges• Dynamic monitoring of lesions

Ex vivo uses are:

• Mohs surgery• The effects of UV radiations on skin• Pigmented lesions• Measurement of epidermis thickness• Differential diagnosis allergic dermatitis vs.

contact dermatitis• Scars and healing-related processes• Cellulitis effects• Hair examination

Reflectance confocal microscopy is veryimportant mainly in the diagnosis of melanocyticlesions because melanin and melanosomes are apowerful contrast source, thus highlightingmelanocytic cells (Fig. 2).3

4. Examination protocol

The examination procedure of a lesion byreflectance confocal microscopy is easy, rapid andpainless for the patient. It is also important tomention that artefacts are minimum as skin is notmodified by this procedure.1

180


1. Se introduc principalele date ale pacientului:nume ºi prenume, vârstã ºi sediul leziunii

2. Se aplicã pe suprafaþa leziunii un mediu deimersie (ulei sau gel ecografic), cu scopul de acupla optic fereastra de sticlã sau polimer lapiele (indicele de refracþie al uleiului = 1,50, ovaloare apropiatã de cea a stratului cornos =1,55);

3. Se ataºeazã fereastra de sticlã sau polimer la uninel metalic, dupã care întreg ansamblul seataºeazã pielii prin intermediul unei benziadezive speciale aplicate ferestrei de sticlã saupolimer (împiedicã miºcarea imaginii), cumenþiunea cã leziunea trebuie sã fie centratãde inelul metalic;

4. Se ataºeazã dispozitivului dermatoscopic(VivaCam®) la inelul metalic pentru a obþine oimagine dermatoscopicã care va putea fifolositã ca ºi o mapã care va ghida obþinereaimaginilor cu ajutorul microscopiei confocalela nivelul subregiunilor leziunii;

5. Se aplicã un mediu de imersie lichid (apã saugel ecografic care are un indice de refracþie de1,3) în interiorul inelului, astfel încât acestmediu de imersie lichid va avea un indice derefracþie apropiat de cel al epidermului,reducând astfel aberaþiile sferice produse detrecerea razei de luminã prin aer ºi permiþând

The examination protocol comprises thefollowing steps:1. The main information of the patient are

entered: full name, age and the lesion site.2. An immersion medium (ultrasound oil or gel)

is applied on the lesion surface for the purposeof optically coupling the glass or polymerwindow to the skin (the oil refraction index =1.50, a value similar to stratum corneum =1.55);

3. The glass or polymer window is attached to ametal ring and afterwards the entire assemblyis attached to skin by means of a specialadhesive tape applied on the glass or polymerglass (it prevents image movement), providedthat the lesion is centred by the metal ring;

4. The dermatoscopy device (VivaCam®) isattached to the metal ring in order to obtain adermatoscopy image that can be used as a mapto guide the capture of images throughconfocal microscopy on lesion subregions;

5. A liquid immersion medium (water orultrasound gel with a refraction index of 1.3)inside the ring, so that this liquid immersionmedium will have a refraction index closed tothat of the epidermis, thus reducing the

Detector

Laser

“scanner”

Lens

MM

Lens

Filter

Pin hole

Fig. 2. Examinarea leziunilor melanocitare cu ajutorul microscopiei confocale de reflectanþã (Reprodus dupã: Kolm I. HowReflectance Confocal Microscopy Works. În Hofmann-Wellenhof R, Pellacani G, Malvehy J, Soyer HP. Reflectance Confocal

Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 7-10)Fig. 2. The examination of melanocytic lesions by means of reflectance confocal microscopy(Adapted from: Kolm I. How

Reflectance Confocal Microscopy Works. In Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P. Reflectance ConfocalMicroscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 7-10)

181


formarea unei imagini cât mai complete aepidermului ºi a dermului;

6. Se conecteazã inelul metalic la obiectivulaparatului de microscopie confocalã, cuapariþia imaginii real-time de 500 x 500 µm lanivelul monitorului aparatului de microscopieconfocalã;

7. Se iniþiazã protocolul de obþinere a imaginii:7.1. Prin intermediul funcþiei de navigare în

plan orizontal (x/y) ºi respectiv vertical(z) se seteazã punctul de referinþã z = 0la nivelul stratului cornos (stratul cu ceamai puternicã reflexie luminoasã);

7.2. Se activeazã funcþia automatã deobþinere a mozaicurilor la trei nivele:stratul granular/spinos (z = 30 µm),stratul joncþiunii dermoepidermice (z =60-90 µm) ºi stratul dermului papilar (z= 90-120 µm);

7.3. Se recomandã obþinerea a patru stack-uri la nivelul centrului leziunii ºirespectiv alte douã sau mai multe lanivelul ariei ce prezintã un interesspecial.

8. Prin intermediul funcþiei Video capture se potobþine filmãri real-time de tip AVI cu scopul dea înregistra procese dinamice precum curgereasângelui la nivelul vaselor;

9. Dupã obþinerea înregistrãrilor se detaºeazãinelul metalic de piele, se îndepãrteazãfereastra de sticlã sau de polimer de unicãfolosinþã ºi se îndepãrteazã gelul ecografic dela nivelul inelului metalic ºi respectiv de lanivelul pielii (Fig. 3).

O menþiune specialã trebuie adusã asupranoþiunilor utilizate în obþinerea imaginilor. Prinintermediul VivaScope® 1500 se obþin imagini(basic image) de dimensiuni prestabilite într-unplan orizontal (coordonate x,y) de 500 x 500 µm lao adâncime preselectatã (coordonata z). Acesteapot fi vizualizate real-time pe ecranul aparatului,putând fi înregistrate ca ºi imagini de tip .BMP.Cu ajutorul acestor imagini de bazã se potconstrui ulterior 3 tipuri înregistrãri: stack,mosaic/block ºi respectiv cube.

Un stack reprezintã o secvenþã de basic imagesobþinutã la acelaºi nivel orizontal (x, y)preselectat, dar la adâncimi diferite(z) selectatede cãtre utilizator (de la 5 µm la 120 µm).

spherical aberrations caused by the passage ofthe light beam through air and enabling toobtain an image as complete as possible of theepidermis and dermis.

6. The metal ring is connected to the lens of theconfocal microscopy device, with the real time500 x 500 µm image capture on the confocalmicroscopy device;

7. The image-capture protocol is initiated:7.1. By means of the horizontal (x/y) and

vertical (z) navigation function, the setpoint z = 0 is set on the stratum corneum(the layer with the most powerful lightreflection);

7.2. The automatic function for obtainingthree-level matrix is enabled: thegranular/spike layer (z = 30 µm), thedermoepidermal junction layer (z = 60-90 µm) and the papillary dermis layer (z= 90-120 µm);

7.3. It is recommended to obtain four stacksin the centre of the lesion and other twoor more in the area of special interest.

8. By means of the Video capture function, AVI realtime videos can be obtained for to purpose ofrecording dynamic processes such as bloodflow within vessels;

9. After the records are obtained, the metal ring isdetached from the skin, the disposable glass orpolymer window is removed and theultrasound gel is removed from the metal ringand from the skin, respectively (Fig. 3).

Special remarks have to be made on thenotions used for obtaining the images.VivaScope® 1500 enables the capture of basicimages with preset size in an horizontal section(x,y coordinates) of 500 x 500 µm, at a presetdepth (z coordinate). These can be viewed in realtime on the device screen and can be recorded as.BMP images. These basic images enable furthercreation of 3 types of records: stack, mosaic/blockand cube respectively.

A stack is a sequence of basic images obtainedon the same preset horizontal level (x, y) but ondifferent depths (z) selected by the user (from 5µm to 120 µm).

182


Ataºarea ferestrei de polimer la nivelul inelului metalic

Ataºarea dispozitivului de obþinere a imaginii dermoscopice(VivaCam®)

Aplicarea mediului de imersie în interiorulinelului metalic (ulei sau gel ecografic)

Ataºarea dispozitivului de obþinere aimaginii de microscopie confocalã

Aplicarea mediului de imersie la nivelul cutanat (ulei sau gel ecografic)

Ataºarea inelului metalic la nivelul pieliiconform indicaþiilor sãgeþilor

Direction Mark

Fig. 3. Protocolul de obþinere a imaginii cu ajutorul microscopiei confocale de reflectanþã. (Reprodus dupã: Wurm E.M.T. Ahands-on guide to confocal imaging. În Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P. Reflectance Confocal

Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 12)

Attaching the polymer to the windowmetal ring

Attachment device for obtaining image dermoscopice(VivaCam®)

Applying immersion environment insidemetal ring (oil or ultrasound gel)

Attachment device for the preparation ofconfocal microscopy image

Applying immersion environment atcutaneous (oil or ultrasound gel)

Attachment of the metal ring in the skinas indicated arrows

Direction Mark

Fig. 3. The protocol for capturing the image by means of reflectance confocal microscopy. (Adapted from: Wurm E.M.T. Ahands-on guide to confocal imaging. In Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P. Reflectance Confocal


183


Un block/mosaic reprezintã o secvenþã derezoluþie înaltã de pânã la 256 de basic imagesobþinute la acelaºi nivel vertical(z) preselectat,dar la nivele orizontale diferite(x, y) selectateautomat de cãtre programul aparatului.Utilizatorul poate alege în schimb mãrimeaacestora, care variazã de la 1 x 1 mm pânã la 8 x 8mm (echivalentul a 2 x 2 pânã la 16 x 16 de basicimages).

Un cube reprezintã o secvenþã de blocksobþinute la diferite adâncimi(z) selectate automatde cãtre programul aparatului (Fig. 4). 1

5. Examinarea leziunilor melanocitare cuajutorul microscopiei confocale dereflectanþã

În faþa unei leziuni melanocitare examinareaeste aceeaºi ca pentru orice arie cutanatã,respectiv examinarea celor trei straturi:epidermul, joncþiunea dermoepidermicã, dermulpapilar, având în vedere totodatã ºicaracteristicile tipice ale leziunilor melanocitare.Acestea sunt tipice fiecãrui strat examinat dupãcum urmeazã: 1

5.1 Epidermul superficial: În ceea ce priveºtearhitectura generalã, la nivelul leziunilor mela-nocitare pot fi prezente urmãtoarele tipuri depattern: cobblestone pattern, broadened honeycombedpattern, irregular-shaped keratinocytes pattern saudisarranged pattern.

Cobblestone pattern poate fi tipic atunci cândeste alcãtuit din celule poligonale de dimensiuni

A block/mosaic is a sequence of high resolutionup to 256 of basic images obtained on the samepreset vertical (z) level, but on differenthorizontal levels (x, y) automatically selected bythe device software. But the user can select theirsize, ranging from 1 x 1 mm up to 8 x 8 mm (theequivalent of 2 x 2 up to 16 x 16 of basic images).

A cube is a sequence of blocks obtained atdifferent depths (z) automatically selected by thedevice software (Fig. 4).1

5. The examination of melanocyticlesions by means of reflectanceconfocal microscopy

The examination of a melanocytic lesion isthe same as for any skin area, i.e. the examinationof the three layers: epidermis, dermoepidermaljunction, papillary dermis, having at the sametime the typical features of melanocytic lesions.These are specific to each examined layer, asfollows:1

5.1 The superficial epidermis: Regarding theoverall architecture, the following types ofpatters on melanocytic lesions can occur:cobblestone pattern, broadened honeycombed pattern,irregular-shaped keratinocytes pattern or disarrangedpattern.

Cobblestone pattern can be typical when itconsists of small size polygonal cells, with

basic image (500x500 µm)

Stack

Block/mosaic

Cube

Fig. 4. Tipuri de înregistrãri obþinute cu ajutorulmicroscopiei confocale de reflectanþã. (Reprodus dupã:Wurm E.M.T. A hands-on guide to confocal imaging. ÎnHofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., SoyerH.P. Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases.Springer; 2012. p. 16)Fig. 4. Types of records obtained by means of reflectanceconfocal microscopy. (Adapted from: Wurm E.M.T. Ahands-on guide to confocal imaging. In Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P.Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases.Springer; 2012. p. 16)

184


mici, cu o citoplasmã refractivã, care suntseparate de margini mai puþin refractile ºi atipicatunci când existã iregularitate în mãrimea ºi/saurefractilitatea celulelor (Fig. 5).4

Honeycombed pattern este de douã tipuri: tipicfiind alcãtuit din celule poligonale de dimensiunireduse, având nuclei nerefractili ºi citoplasmãrefractivã în cantitãþi reduse care delimiteazãcelulele sau atipic atunci când se descriuneregularitãþi în mãrimea celulelor ºi în grosimeacontururilor. O formã specialã este broadenedhoneycombed pattern care este asemãnãtor formeitipice, cu deosebirea cã spaþiile intercelularerefractive sunt de dimensiuni mai mari.

Irregular-shaped keratinocytes pattern descrie ostructurã alcãtuitã din keratinocite cu nere-gularitãþi atât în mãrime cât ºi în formã.

Absenþa patternului honeycombed saucobblestone cu o dezorganizare a arhitecturiistraturilor superficiale epidermice, alcãtuite dinparticule ºi celule refractive cu o distribuþieasimetricã este definitã sub forma patternuluidisarranged.

Celulele pagetoide sunt o entitate caracteristicãa leziunilor maligne, însã pot fi întâlnite într-o

refractive cytoplasm and atypical when cell sizeand/or refractivity are irregular (figure 5).4

Honeycombed pattern has two types: typicalconsisting of small size polygonal cells, with non-refractory nuclei and refractory cytoplasm in lowquantities which confines cells, and atypical whenirregularities occur in cell size and contourthickness. A special form is the broadenedhoneycombed pattern which is similar to the typicalform except that the refractory intercellularspaces are larger.

Irregular-shaped keratinocytes pattern describesa structure consisting of keratinocytes both sizeand shape irregular.

The absence of the honeycombed orcobblestone pattern with a dislocation ofepidermal superficial layer architecture,consisting of refractory particles and cells with anasymmetrical distribution is defined asdisarranged pattern.

Pagetoid cells are a specific entity of malignantlesions but they can also be found less frequentlyin some benign lesions. These are large cells, withhighly refractory cytoplasm and non-refractory

Fig. 5. Epiderm superficial, aspect în microscopia confocalã de reflectanþã: Cobblestone pattern (Reprodus dupã Ferrari B.Semiology and pattern analysis in melanocytic lesions. În Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P.

Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 42)Fig. 5. Superficial epidermis, appearance in reflectance confocal microscopy: Cobblestone pattern (Adapted from Ferrari B.

Semiology and pattern analysis in melanocytic lesions. In Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P.Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 42)

185


mai micã mãsurã ºi la nivelul unor leziunibenigne. Acestea sunt celule de dimensiuni mari,cu o citoplasmã intens refractivã ºi cu un nucleuexcentric nefractil ce se întâlnesc tipic la nivelulepidermului superficial. Din punct de vederemorfologic se descriu douã tipuri de astfel decelule: rotunde ºi dendritice. Celule pagetoiderotunde sunt întâlnite în special la nivelulmelanomului, deºi un procent redus se întâlnescºi la nivelul nevilor Spitz/Reed. Celulele pagetoidedendritice au o valoare diagnosticã mai redusãdeoarece pot fi fie melanocite ce se rãspândescsuperficial într-un tipar pagetoid, fie celuleLangerhans. Pleomorfismul reprezintã varia-bilitatea în morfologia celulelor pagetoide,acestea fiind prezente atât în forma rotundã, cât ºiîn cea dendriticã ºi/sau acestea pot avea o formãbizarã. Un alt aspect important este densitateacelularã care poate fi „micã” atunci când suntprezente < 5celule/mm3, „medie” atunci cândsunt 5-10 celule/ mm3 sau „mare” atunci cândsunt mai mult de >10 celule/ mm3. În ceea cepriveºte distribuþia acestor celule, se defineºte a fi„localized” atunci când sunt concentrate într-oporþiune limitatã a leziunii, „sparse” atunci cândacestea sunt distribuite sub forma unor foci lanivelul leziunii ºi respectiv „widespread” atuncicând sunt rãspândite la nivelul întregii leziuni.Distribuþia de tip „localized” poate fi întâlnitã ºila nivelul unor nevi Spitz sau a unor nevi atipici,în timp ce „widespread” denotã prezenþa unuimelanom.

5.2 Joncþiunea dermoepidermicã ºi dermulpapilar: Analiza unei leziuni melanocitare începecu descrierea arhitecturii generale. La nivelulacesteia se descriu urmãtoarele patternuri:

Ringed pattern descrie o structurã alcãtuitã dininele refractive ce corespund papilelor încon-jurate de celulele bazale refractive, cu menþiuneacã spaþiile interpapilare sunt subþiri.

Meshwork pattern descrie o structurã asemã-nãtoare celei de mai sus cu deosebirea cã papileleau dimensiuni mai mici ºi nu sunt delimitate deinele refractive, iar spaþiul interpapilar esteîngroºat.

Clod pattern este alcãtuit din structuri ovalaredense, constituite din cuiburi de melanocitesituate la nivelul dermului papilar.

Non-specific pattern descrie o structurã care nucorespunde niciuneia de mai sus. Fig. 7

eccentric nucleus that are typically found on thesuperficial epidermis. From a morphologicalpoint of view, two types of cells are described:round and dendritic. Round pagetoid cells aremainly found in the melanoma, although a few ofthem are also found in Spitz/Reed naevi.Dendritic pagetoid cells have a lower diagnosisvalue as they can be either melanocytessuperficially distributed in a pagetoid pattern orin Langerhans cells. Pleomorphism is variability inpagetoid cell morphology, and they are eitherround or dendritic and/or they can have astrange shape. Another important issue is the celldensity that can be ”low” when < 5 cells/mm3 arepresent, ”average” when 5-10 cells/ mm3 arepresent or ”high” when >10 cells/ mm3 arepresent. Regarding the distribution of these cells,they are defined as ”localized” when they areconcentrated in a limited area of the lesion,”sparse” when they are distributed as foci in thelesion and ”widespread” when they aredistributed on the entire lesion. ”Localized”distribution can also be found on Spitz or atypicalnaevi, while ”widespread” distribution indicatesthe presence of a melanoma.

5.2 Dermoepidermal junction and papillarydermis: The analysis of a melanocytic lesionstarts with the description of the generalarchitecture. The following patterns are found onthis:

Ringed pattern describes a structure consistingof refractory rings corresponding to papillaesurrounded by refractory basic cells, mentioningthat interpapillary spaces are thin.

Meshwork pattern describes a structure similarto the above structure with the difference that thepapillae are smaller and are not confined byrefractory rings and the interpapillary area isthickened.

Clod pattern consists of dense oval structurescomprising melanocyte nests located in thepapillary dermis.

Non-specific pattern describes a structure notcorresponding to any of the above. Fig. 7

Based on the description of the generalarchitecture, the features of dermal papillaecontours are described below. There are two

186


Fig. 6. Epiderm superficial, aspect în microscopia confocalã de reflectanþã: Celule pagetoide rotunde (Reprodus dupã Ferrari B.Semiology and pattern analysis in melanocytic lesions. În Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P.

Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 44)Fig. 6. Superficial epidermis, appearance in reflectance confocal microscopy: Round pagetoid cells (Adapted from Ferrari B.


Fig. 7. Joncþiune dermoepidermicã, aspect în microscopia confocalã de reflectanþã: Meshwork pattern (Reprodus dupã Ferrari B.Semiology and pattern analysis in melanocytic lesions. În Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P.

Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 47)Fig. 7. Dermoepidermal junction, appearance in reflectance confocal microscopy: Meshwork pattern (Adapted from Ferrari B.


187


Dupã descrierea arhitecturii generale, încontinuare se descriu caracteristicile contururilorpapilelor dermice. Acestea pot fi de douã tipuri:edged papillae, care descriu papilele dermice cu uncontur clar alcãtuit dintr-un ºir de celulerefractive ºi respectiv non-edged papillae, atuncicând papilele dermice nu sunt însoþite de acelaºicontur complet, acesta fiind alcãtuit din celulesolitare sau din agregate de celule. Atunci cândpapilele dermice nu sunt vizibile, termenul denon-visible papillae este folosit. De menþionatexistenþa celor douã forme la nivelul aceleaºileziuni, în acest caz denumirea fiind edged & non-edged papillae.

Jonctional nests este o altã caracteristicãutilizatã în descrierea structurilor întâlnite lanivelul joncþiunii dermoepidermice. Acesteareprezintã agregate celulare ovalare compacte,fiind alcãtuite din celule care se aflã în conexiunedirectã cu stratul bazal, care bombeazã la nivelulpapilelor dermice sau mãresc spaþiul interpapilar.Se descriu douã tipuri de jonctional nests:homogenous jonctional nests, care nu conþin celuleatipice, fiind caracteristice leziunilor benigne ºirespectiv non-homogeneous jonctional nests ceconþin celule atipice, fiind întâlnite la nivelulnevilor atipici ºi a melanomului.

Agregatele celulare refractive rotund-ovalarealcãtuite din cuiburi melanocitare în microscopiaconfocalã de reflectanþã poartã numele de dermalnests. În funcþie de aspectul acestora se descriutrei tipuri: dense nests, dense & sparse nests ºicerebriform nests. Dense nests descrie agregatecompacte cu margini bine definite ºi cu celuleomogene în morfologie ºi în gradul derefractivitate. Dense & sparse nests corespundagregatelor cu margini mai prost definite,alcãtuite din celule care nu aderã la cuibul celular.Acestea se pot întâlni atât la nivelul nevilorcongenitali, când sunt de dimensiuni mari ºialcãtuite din celule mari rotunde monomorfice,cât ºi la nivelul melanomului, atunci cândmãrimea cuiburilor este variabilã, fiind alcãtuitepredominant din celule pleomorfice. Cerebriformnests sunt alcãtuite din agregate celulare cu unaspect asemãnãtor creierului, cu „fisuri” tipicehiporeflective. Celulele de la nivelul acestoragregate au margini prost definite ºi orefractivitate scãzutã, cu o citoplasmã granularã,fãrã nuclei evidenþi. Sunt rar întâlnite, fiind

types: edged papillae, describing dermal papillaewith a clear contour consisting of a row ofrefractory cells and non-edged papillae respectively,when dermal papillae do not have the samecomplete contour, consisting of solitary cells orcell aggregates. When dermal papillae are notvisible, the non-visible papillae term is used. It isimportant to mention that two forms are found inthe same lesions, called edged & non-edged papillae.

Junctional nests is another feature used todescribe the structures found in thedermoepidermal junction These are compact ovalcell aggregates as they consist of cells directlyconnected to the basic layer protruding at thelevel of dermal papillae or they increase theinterpapillary space. There are two types ofjunctional nests: homogenous junctional nests, notcontaining atypical cells, specific to benignlesions and non-homogeneous junctional nestsrespectively, containing atypical cells and foundin atypical naevi and in the melanoma.

Round-oval refractory cell aggregatesconsisting of melanocyte nests in reflectanceconfocal microscopy are called dermal nests.Depending on their appearance, there are threetypes: dense nests, dense & sparse nests andcerebriform nests. The term Dense nests describescompact aggregates with clearly defined edgesand homogenous cells in the morphology and inthe refractoriness degree. Dense & sparse nestscorrespond to aggregates with poorer edges,consisting of cells outside the cell nest. These canbe found in the congenital naevi when they arelarge sized and consisting of monomorphicround large cells, as well as in the melanoma,when the nest size varies, as they predominantlyconsist of pleomorphic cells. Cerebriform nestsconsist of cell aggregates with an appearancesimilar to the brain, with hyporeflective typical”cracks”. Cells in these aggregates have poorlydefined edges and a low refractivity, with agranular cytoplasm, no obvious nuclei. These arerarely found as they are mainly located in thenodular component of the melanoma. Fig. 8

Cells found in the epidermal-dermal passageand associated in the same plan but not formingnests form the structure called cells in sheet-like.

188


localizate în special la nivelul componenteinodulare a melanomului. Fig. 8

Celulele care se gãsesc la nivelul tranziþieiepidermo-dermice ºi se asociazã în acelaºi plan,dar nu formeazã cuiburi alcãtuiesc structuranumitã cells in sheet-like. Aceste celule sunt deobicei pleomorfice, având o citoplasmã intensrefractivã.

Celulele atipice au dimensiuni mari, cu o formãrotund-ovalarã sau dendriticã, bine delimitate, cuo citoplasmã refractivã ºi cu un nucleu evidentnerefractiv care se gãsesc la nivelul joncþiuniidermoepidermice. Acestea reprezintãechivalentul melanocitelor atipice întâlnite maifrecvent la nivelul leziunilor maligne, deºiprezenþa acestora la nivelul leziunilor benigne nueste complet exclusã, în acest caz numãrulacestora este redus, cu o morfologie monoformã.În descrierea acestora, urmãtorii parametri suntimportanþi: aspectul, numãrul ºi distribuþia. Înceea ce priveºte aspectul, se noteazã existenþa adouã tipuri de morfologii: “roundish-polygonal”sau “dendritic- spindled”. Pleomorfismul sedefineºte ca fiind variabilitatea în morfologiaacestor celule, fiind caracterizatã de prezenþaambelor tipuri de morfologii ºi/sau prezenþa

These cells are usually pleomorphic, with ahighly refractory cytoplasm.

Atypical cells are large, round-oval ordendritic shape, well confined, with refractorycytoplasm and a non-refractory obvious nucleus,found in the dermoepidermal junction. They arethe equivalent of atypical melanocytes morefrequently found in malignant lesions, althoughtheir presence in benign lesions is not entirelyexcluded, in this case their number is reduced,with a monoform morphology. The followingparameters are important in their description:appearance, number and distribution. Regardingthe appearance, there are two types ofmorphologies: “roundish-polygonal” or“dendritic-spindled”. Pleomorphism is definedas the variability in the morphology of these cells,being characterized by the presence of both typesof morphologies and/or the presence of cellswith strange shapes. Another important issue isthe cell density that can be ”low”, when < 5cells/mm3 are present, ”average” when 5-10cells/ mm3 are present or ”high” when >10 cells/mm are present3. Regarding the distribution of

Fig. 8. Dermul papilar, aspect în microscopia confocalã de reflectanþã: Dense nests. (Reprodus dupã Ferrari B. Semiology andpattern analysis in melanocytic lesions. În Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P. Reflectance Confocal

Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 53)Fig. 8. Papillary dermis, appearance in reflectance confocal microscopy: Dense nests. (Adapted from Ferrari B. Semiology andpattern analysis in melanocytic lesions. In Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P. Reflectance Confocal


189


unor celule cu forme bizare. Un alt aspectimportant este densitatea celularã care poate fi„micã” atunci când sunt prezente < 5celule/mm3,„medie” atunci când sunt 5-10 celule/ mm3 sau„mare” atunci când sunt mai mult de >10 celule/mm3. În ceea ce priveºte distribuþia acestor celule,se defineºte a fi „localized” atunci când suntconcentrate într-o porþiune limitatã a leziunii,„sparse” atunci când acestea sunt distribuite subforma unor foci la nivelul leziunii ºi respectiv„widespread” atunci când sunt rãspândite lanivelul întregii leziuni. În plus, un alt parametruimportant este ºi organizarea acestor celule lanivelul joncþiunii dermoepidermice, acesteaputând fi întâlnite fie individual fie în agregatecelulare, cu sau fãrã infiltrarea papilelor dermice.Fig. 9

Infiltrarea leucocitarã este tradusã înmicroscopia confocalã de reflectanþã prinprezenþa fie a plump bright cells, care se descriu afi celule refractive cu formã neregulatã ºi marginiprost definite, fãrã un nucleu vizibil, fie smallbright particles care sunt celule mici cu ocitoplasmã intens refractivã ºi cu nuclei vizibili.

Fibrele de colagen de la nivelul dermuluipapilar sunt denumite coarse collagen structures ºi

these cells, they are defined as ”localized” whenthey are concentrated in a limited area of thelesion, ”sparse” when they are distributed as fociin the lesion and ”widespread” when they aredistributed on the entire lesion. Moreover,another important parameters is the organizationof these cells in the dermoepidermal junction, asthey can be found in cell aggregates, with ourwithout infiltration of dermal papillae. Fig. 9

Leukocyte infiltration is translated inreflectance confocal microscopy through thepresence of either plump bright cells, which arerefractory cells with irregular shape and poorconfined edges, without a visible nucleus, orsmall bright particles which are cells with highlyrefractory cytoplasm and with visible nuclei.

Collagen fibres in the papillary dermis arecalled coarse collagen structures and they occur asfibrillary amorphous material with distributioneither reticular or fascicular.

It is also possible to see in the papillarydermis the presence of vessels and theirrelationship with the melanocytic lesion withmalignancy suspicion is very important.

Fig. 9. Dermul papilar, aspect în microscopia confocalã de reflectanþã: Celule atipice pleomorfice (Reprodus dupã Ferrari B.Semiology and pattern analysis in melanocytic lesions. În Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P.

Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 56)Fig. 9. Papillary dermis, appearance in reflectance confocal microscopy: Pleomorphic atypical cells (Adapted from Ferrari B.


190


apar sub forma unui material amorf fibrilar cu odistribuþie fie reticulatã, fie fasciculatã.

Tot la nivelul dermului papilar se poateobserva prezenþa vaselor, iar relaþia acestora culeziunea melanocitarã suspectã a fi malignã estefoarte importantã.

6. Aspectele melanomului în cadrulanalizei cu ajutorul microscopieiconfocale de reflectanþã

Fiecare subtip de melanom are propriilecaracteristici epidemiologice, clinice, dermo-scopice ºi histopatologice. În urma cercetãrilorºtiinþifice s-au identificat ºi caracteristicilespecifice microscopiei confocale de reflectanþã,astfel încât specificitatea diagnosticului pre-biopsie este în creºtere. Leziunile maligne diferãde cele maligne în principal prin urmãtoarelecaracteristici: infiltrare pagetoidã, arhitecturãgeneralã dezorganizatã la nivelul joncþiuniidermo epidermice, prezenþa celulelor melano-citare atipice la nivelul stratului bazal ºi dermuluipapilar, prezenþa agregatelor celulare dermicesub formã de cerebriform nests. S-a propus unmodel de diagnostic ce necesitã identificarea a 6parametri, independent corelaþi cu diagnosticulde melanom. Astfel prezenþa a cel puþin doiparametri, unul major ºi unul minor (scor ³ 3)susþine diagnosticul de melanom.

Criteriile majore sunt valorificate cu câte 2puncte fiecare ºi sunt urmãtoarele: prezenþacelulelor atipice la nivelul joncþiuniidermoepidermice ºi respectiv conturul papilar detip non-edged papillae.

Criteriile minore sunt valorificate în schimbcu câte un punct fiecare, acestea fiind: prezenþacelulelor pagetoide rotunde, infiltrare pagetoidãde tip „widespread”, agregate dermice de tipcerebriform nests ºi respectiv prezenþa celuleloratipice nucleate la nivelul dermului superficial.5

Fig. 10

7. Concluzii

Stabilirea unui diagnostic cât mai coerentîntr-un mod cât mai puþin invaziv, este foartenecesarã, în acest caz microscopia confocalã dereflectanþã demonstrând cele mai promiþãtoarerezultate. Microscopia confocalã de reflectanþãpoate contribui la confirmarea diagnosticului

6. The aspects of melanoma within theanalysis performed by means ofreflectance confocal microscopy

Each subtype of melanoma has its ownepidemiological, clinical, dermoscopical andhistopathological features. The scientific researchenabled the identification of features specific ofreflectance confocal microscopy, so that the pre-biopsy diagnosis specificity is increasing. Benignlesions differ from malignant lesions mainlyregarding the following characteristics: pagetoidinfiltration, disordered general architecture onthe dermoepidermal junction, presence ofatypical melanocytic cells in the basic layer and inthe papillary dermis, the presence of dermal cellaggregates as cerebriform nests. A diagnosismodel was proposed requiring the identificationof 6 parameters, independently correlated withthe melanoma diagnosis. Thus, the presence of atleast two parameters, a major and a minor one(score ³ 3) supports the melanoma diagnosis.

Major criteria are scored with 2 points eachand are as follows: the presence of atypical cellsin the dermoepidermal junction and the non-edged papillae papillary contour, respectively.

Minor criteria are scored with 1 point eachand they are: the presence of round pagetoidcells, ”widespread” pagetoid infiltration,cerebriform nests dermal aggregates and thepresence of atypical nucleated cells in thesuperficial dermis.5. Fig. 10

7. Conclusions

Determining a diagnosis as coherent aspossible in a manner as non-invasive as possibleis very necessary and reflectance confocalmicroscopy demonstrates the most promisingresults in this case. Reflectance confocalmicroscopy can contribute to confirmation of theclinical-dermatoscopical diagnosis, the increaseof confidence and the reduction of the number ofuseless surgical excisions in these patients andthe increase of specificity. Thus, according to theinformation in literature, it was determined thatreflectance confocal microscopy enhances theaccuracy of diagnosis both in pigmented

191


clinico-dermatoscopic (creºterea confidenþei) ºila reducerea numãrului de excizii chirurgicaleinutile la aceºti pacienþi (creºterea specificitãþii).Astfel conform datelor din literaturã s-a stabilitcã microscopia confocalã de reflectanþã creºteacurateþea diagnosticului atât în cazul leziunilormelanocitare pigmentare, cât ºi în cazul celorhipopigmentare/apigmentare. În cazul leziunilormelanocitare pigmentate, specificitatea oferitã demicroscopia confocalã de reflectanþã faþã dedermoscopie este semnificativ superioarã (p <0,001), însã sensibilitatea nu prezintã diferenþesemnificative (p = 0,81), dermoscopia prezentândastfel o sensibilitate de 91% ºi o specificitate de31%, în timp ce microscopia confocalã dereflectanþã prezintã o sensibilitate de 92% ºi ospecificitate de 65%. În ceea ce priveºte diag-nosticul leziunilor melanocitare hipopig-mentare/apigmentare s-a constatat cã micro-scopia confocalã de reflectanþã prezintã o creºteresemnificativã în specificitate în raport faþã deleziunile pigmentare (p < 0,05); de asemenea s-aconstatat o creºtere semnificativã (p < 0,001) aspecificitãþii diagnosticului de melanom pentru

melanocytic lesions and in hypopig-mented/nonpigmented lesions. Regardingpigmented melanocytic lesions, the specificityprovided by reflectance confocal microscopyagainst dermoscopy is highly superior (p< 0.001),but sensitivity has no significant differences (p=0.81), and thus dermoscopy has a 91% sensitivityand a 31% specificity while reflectance confocalmicroscopy has a 92% sensitivity and a 65%specificity. Regarding the diagnosis of hypopigmented/nonpigmented melanocytic lesions,it was noticed that reflectance confocalmicroscopy has a significant increase in terms ofspecificity against pigmented lesions (p< 0.05); itwas also observed a significant increase (p<0.001) of specificity of melanoma diagnosis forthese lesions provided by reflectance confocalmelanoma compared with dermoscopy, withoutany significant changes on sensitivity (p= 0.09) sothat dermoscopy provides a 61.5% sensitivity anda 39% specificity while reflectance confocalmicroscopy provides a 85% sensitivity and a 84%specificity.6

Fig. 10. Melanom nodular: sãgeþile proliferare celularã cu formarea structurilor de tip sheet-like, asociatã cu formareaagregatelor celulare neomogene, cu o neovascularizaþie crescutã (Reprodus dupã Malvehy J. Nodular melanoma. În Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P. Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases. Springer; 2012. p. 201)Fig. 10. Nodular melanoma: cell proliferation arrows with the formation of sheet-like structures, connected with the formation

of non-homogenous cell aggregates, with increased neovascularization (Adapted from Malvehy J. Nodular melanoma. InHofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer H.P. Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases. Springer;

2012. p. 201)

192


aceste leziuni conferitã de microscopia confocalãde reflectanþã comparativ cu dermoscopia, fãrãmodificãri semnificative asupra sensibilitãþii (p =0,09), astfel încât dermoscopia asigurã osensibilitate de 61,5% ºi o specificitate de 39%, întimp ce microscopia confocalã de reflectanþãasigurã o sensibilitate de 85% ºi o specificitate de 84%.6

La nivel mondial, melanomul înregistreazã ocreºtere atât în incidenþã, cât ºi în mortalitate. Înciuda studiilor continue, melanomul în stadiiavansate rãmâne în continuare incurabil, soluþiacea mai adecvatã în acest caz reprezintã detecþiaprecoce cu excizia chirurgicalã completã în timputil.

Globally, the melanoma occurrence rate isincreasing both as incidence and mortality.Despite ongoing studies, melanoma in advancedstages remains incurable, and the mostappropriate solution is this case is the earlydetection with full surgical excision in due time.

Bibliografie/Bibliography

1. Hofmann-Wellenhof R., Pellacani G., Malvehy J., Soyer, H.P. Reflectance Confocal Microscopy for Skin Diseases.Springer; 2012.

2. MAVIG VivaScope [online]. [Accesat 15 octombrie 2014]; Disponibil pe: URL:http://www.vivascope.de/en/confocal-laser-scanning-microscopy.html

3. Rajadhyaksha M., Grossman M., Esterowitz D., Webb R. H., Anderson R. R. (1995). In vivo confocal scanning lasermicroscopy of human skin: melanin provides strong contrast. The Journal of Investigative Dermatology, 104(6),946–52.

4. In vivo reflectance confocal microscopy [online]. [Accesat 1 februarie 2015]; Disponibil pe: http://www.skinconfocalmicroscopy.org/tutorial.php

5. Pellacani G., Cesinaro A. M., Seidenari S. (2005). Reflectance-mode confocal microscopy of pigmented skinlesions—improvement in melanoma diagnostic specificity. Journal of the American Academy of Dermatology,53(6), 979–85. doi:10.1016/j.jaad.2005.08.022.

6. Guitera P., Pellacani G., Longo C., Seidenari S., Avramidis M., & Menzies S. W. (2009). In vivo reflectanceconfocal microscopy enhances secondary evaluation of melanocytic lesions. The Journal of InvestigativeDermatology, 129(1), 131–8. doi:10.1038/jid.2008.193.

valoarea ªi utilitateamicroscopiei confocale ...aparatului de microscopie confocalã, cu apariþia...

Documents