MICROSCOAPE FOTONICE Definiţie – Instrument optic de mărit care utilizează ca sursă de radiaţie FOTONUL. Puterea de rezoluţie (PR) – distanţa între două puncte care se pot vedea

separat – 0,2 m (microni). Pentru ochiul normal, PR este de 0,2 mm iar pentru microscopul electronic, PR este de 0,2 nm (nanometri). MICROSCOPUL FOTONIC CLASIC Părţi componente:

1. parte mecanică a. talpa microscopului în care este sursa de lumină şi o oglindă b. coloana microscopului la care sunt ataşate:

i. platina (măsuţa microscopului) ii. sistemul de punere la punct a imaginii format din

macroviză şi microviză, alături de şurubul condensorului iii. capul microscopului cu oculare superior şi obiective (5)

inferior 2. partea optică:

a. sistemul obiectivelor – 5 obiective care măresc de 6x (nu îl folosim), 10x, 20x, 40x şi 100x (obiectivul cu imersie)

b. sistemul ocular – două oculare care trebuie reglate ca la binoclu, pentru a vedea o singură imagine cu ambii ochi, simultan.

c. sistemul condensor – sistem de lentile sub platină, util pentru focalizarea luminii pe preparat.

Părți componente ale microscopului fotonic (figura de mai jos) : A. Părți mecanice

a. Statice [1]. Coloana [2]. Piciorul / soclul [3]. Platina sau măsuța microscopului

b. Mobiles [4]. Macroviza [5]. Microviza [6]. Surub de deplasare anteroposterioară a măsuței/probei [7]. Surub de deplasare laterală a măsuței/probei [8]. Șurubul condensorului (deplasări sus-jos)

B. Părți optice [9]. Ocular [10]. Port-ocular [11]. Revolver support pentru obiective [12]. Obiective [13]. Preparat biologic (lama și sectiune de tesut acoperită cu lamela) [14]. Condensor [15]. Diafragm [16]. Lampă neon / LED [17]. Întrerupator

Părți componente ale microscopului fotonic

Tehnica de lucru – etape - se conectează sursa de fotoni la transformator şi transformatorul la priză - se roteşte sistemul cu obiective şi se aduce în axul optic obiectivul de

10x - se priveşte prin oculare şi se ridică sau coboară condensorul pentru o

iluminare corectă a preparatului. Dacă doresc o iluminare mai bună, ridic condensorul, dacă iluminarea e prea puternică, voi coborî condensorul. Cu cât voi folosi un obiectiv mai mare, cu atât condensorul va trebui ridicat, fiind nevoie de o iluminare mai bună. Iniţial, pentru obiectivul de 10x este suficientă o poziţie la 1 cm sub platină.

- se aşează lama cu preparatul biologic colorat pe platină şi se fixează cu ajutorul cavalerilor

- privind DIN LATERAL se coboară tubul microscopului cu ajutorul macrovizei cât se poate de mult. Coloana se va opri automat cam la 1 cm de platină

- acum, privind prin oculare, se ridică tubul cu ajutorul macrovizei până se obţine o imagine clară şi colorată

- pentru o punere la punct de fineţe se utilizează microviza - pot examina acum cu obiectivul 20x. ATENŢIE. Examinarea cu

obiectivul 20x se poate face numai după ce am obţinut o imagine foarte clară cu obiectivul 10x. După ce am obţinut această imagine, nu mai umblu la macroviză sau microviză!

- Aduc în axul optic obiectivul de 20x - Pun la punct imaginea NUMAI cu microviza - Apoi pot examina cu obiectivul de 40x - Aduc în axul optic obiectivul de 40x - Pun la punct imaginea NUMAI cu microviza - Obiectivul cu imersie se utilizează numai cu o picătură de lichid de

imersie pus pe lamă între preparat şi obiectiv. Se va folosi la frotiu. - după utilizare, se scoate lama de pe platină, se aduce obiectivul de 10x în ax, se deconectează de la priză şi se acoperă microscopul cu o husă de protecţie. MICROSCOPIA PRIN FLUORESCENŢĂ Fluorescenţa reprezintă o emisie luminoasă spontană, indusă de variate forme de excitaţie asupra materiei, mai puţin căldura (de unde şi denumirea de „lumină rece”). Emisia luminoasă spontană are loc atunci când substanţa fluorescentă a absorbit un fascicul luminos sau altă radiaţie electromagnetică de o lungime de undă diferită. De obicei radiaţia

emisă are o lungime de undă mai mare şi implicit o energie mai redusă decât radiaţia absorbită. Dacă însă intensitatea radiaţiei absorbite este mai mare, este posibil ca un electron să absoarbă doi fotoni iar această absorbţie să determine emisia unei radiaţii cu lungime de undă mai mică decât cea a radiaţiei absorbite. Cel mai evident exemplu de fluorescenţă este proprietatea unor substanţe care, iradiată cu un fascicul de ultraviolete (lungime de undă 300-400 nm), emite alte radiaţii cu lungime de undă mai mare, implicit în spectrul vizibil. Din punct de vedere fotochimic, fluorescenţa apare când un orbital electronic al unei molecule, atom sau nanostructuri se relaxează pentru a ajunge în stadiul energetic zero prin emisia unui foton, după ce a fost excitat printr-un tip oarecare de energie. Mai precis, fluorescenţa este un fenomen prin care moleculele sensibile emit fotoni (emit „lumină”) atunci când ajung în stări de excitaţie electronică, induse prin factori fizici (absorbţia unei radiaţii electromagnetice), mecanici (frecare) sau mecano-chimici. Moleculele capabile de a realiza fenomenul de fluorescenţă conţin grupări chimice numite cromofori care determină această proprietate. Clasificarea fluorescenţei: Fluorescenţă primară sau autofluorescenţă – substanţe care emit spontan în spectrul vizibil dacă sunt iradiate cu ultraviolete (UV). Exemple: clorofila, petrolul, colagenul, elastina, fibrilina, flavinele, indolaminele, pigmenţii, aminoacizii etc Fluorescenţă secundară – substanţe care devin fluorescente numai după ce sunt tratate cu o altă substanţă, normal fluorescentă, denumită fluorocrom – exemple: acridin orange, DAPI (4’6’diamidino-2-fenil-indol). Se pot detecta astfel substanţe care devin fluorescente – acizi nucleici (ADN – fluorescenţă albastră cu DAPI), colagen, fibre elastice Aplicaţii microscopice ale fluorescenţei Scopul microscopiei în fluorescenţă este de a identifica şi deosebi pe un preparat biologic substanţe care nu pot fi deosebite în mod normal prin coloraţii uzuale. Astfel, pentru a identifica o substanţă care este natural fluorescentă şi care nu se poate observa diferit printr-o coloraţie obişnuită, vom examina preparatul care o conţine în microscopul cu fluorescenţă. La acest microscop, pe un fond negru, vor apărea spoturi luminoase, colorate diferit, care vor arăta prezenţa substanţelor fluorescente (fie cele care sunt natural fluorescente, fie cele care sunt tratate cu un fluorocrom – secundar fluorescente).

Microscopia prin fluorescenţă se adresează atât secţiunilor de ţesut fixat cât şi celulelor vii, în culturi primare sau secundare. Microscopul cu fluorescenţă este un tip de microscop convenţional la care se adaugă diferite componente şi proprietăţi care îi ameliorează funcţiile. Spre deosebire de alte microscoape optice care speculează caracteristicile elementelor preparatului biologic (absorbţia luminii, gradienţi de fază, birefringenţă), microscopia prin fluorescenţă poate forma imaginea distribuţiei speciilor moleculare simple care emit fluorescenţă (primară sau secundară). Limite. Datorită difracţiei luminii, puterea de rezoluţie în microscopia prin fluorescenţă este de circa 200 nm. Aplicaţii practice ale marcării fluorescente Spectrul vizibil (spectrul optic) reprezintă domeniul spectrului electromagnetic ce poate fi detectat de ochiul uman. În condiții normale, ochiul uman percepe în aer lungimile de undă din domeniul 380 - 750 nm. Substanţe cu fluorescenţă primară:

1. pigmenţi a. porfirine – fluorescenţă roşie – apar ca spoturi roşii pe fond

negru b. pigmenţi carotenoizi – fluorescenţă verde – apar ca spoturi

verzi pe fond negru c. cromolipidele – fluorescenţă galben-verde – apar ca spoturi

galben verzi pe fond negru d. lipofuscina – fluorescenţă roşu-maro

2. aminoacizi a. fenilalanina şi tirozina – fluorescenţă albastră

3. bacilul Koch – factorul etiologic al tuberculozei – fluorescenţă verde strălucitoare

4. dintele natural 5. amine biogene – adrenalina, noradrenalina – fluorescenţă verde

Substanţe cu fluorescenţă secundară (care devin fluorescente după tratarea cu fluorocromi variaţi – acridin-orange-AO sau DAPI, de exemplu):

1. acizi nucleici a. ADN – fluorescenţă verde / albastră cu DAPI b. ARN – fluorescenţă roşie

2. fibre de colagen şi reticulină – fluorescenţă verde 3. mucinele – fluorescenţă verde 4. nucleii leucocitelor – fluorescenţă verde

Marcarea simplă pentru fluorescenţă secundară se realizează prin afinitatea unui fluorocrom pentru molecula de marcat (de exemplu, DAPI se cuplează pe molecula de ADN determinând o fluorescenţă albastră). Fluorocromii diferă prin spectrele de absorbţie şi emisie. Fluoresceina (FITC – Fluoresceine-Iso-Thio-Cyanate) absoarbe radiaţiile de culoare albastră (max 541 nm) şi redă o fluorescenţă verde (max 520 nm). Rhodamina (TRITC Tetra-methyl Rhodamine Iso-Thio-Cyanate) absoarbe radiaţiile de culoare verde (max 541 nm) restituind o fluorescenţă roşie (max 572 nm). Rezultatele marcării fluorescente variază în funcţie de elementele subcelulare implicate. Aplicaţii speciale

1. Delimitarea precisă a componentelor intracelulare marcate cu fluorocromi specifici (fluorescenţă secundară), coeficientul de difuziune al acestor substanţe, caracteristicile mecanismelor lor de transport, interacţiuni posibile cu alte biomolecule. Modificările de fluorescenţă induse de variaţia unor parametri biochimici locali permite investigarea variaţiilor de pH, viscozitate, indice de refracţie, concentraţii ionice, potenţial de membrană sau polaritatea celulelor vii.

2. Imuno-fluorescenţa – identificarea unei substanţe cu ajutorul unui anticorp marcat fluorescent.

substanţa de identificatîmpotriva căreia se

sintetizează anticorpipe o altă specie

anticorpmarcat fluorescent

+complex antigen-substanţă

de identificat

Anticorpii sunt sintetizaţi specific pentru a se fixa numai pe substanţa de identificat. După aplicarea pe preparatul biologic a anticorpilor marcaţi cu fluorocrom, aceştia se vor fixa pe secţiunea de ţesut numai acolo unde găsesc substanţa de identificat cu care se cuplează specific. Apoi se examinează la microscopul cu fluorescenţă şi apar spoturi luminoase (fluorescenţă secundară) numai acolo unde anticorpul marcat s-a cuplat cu substanţa de identificat. Metoda este utilă în diagnosticul diferitelor tumori maligne.

MICROSCOPIA ÎN CONTRAST DE FAZĂ Contrastul de fază este o tehnică utilizată pe scară largă şi care permite amplificarea diferenţelor dintre indicii de refracţie sub forma diferenţelor de contrast. Tehnica a fost pusă în practică de fizicianul olandez Frederik Zernike în anul 1934 (primind premiul Nobel în anul 1953). Tehnica de contrast de fază utilizează faptul că lumina care traversează o parte transparentă a preparatului microscopic va fi încetinită în raport cu lumina a cărei traiectorie nu este modificată. Această diferenţă de fază nu este vizibilă pentru ochiul uman. Sistemul imaginat de Zernike accentuează defazarea la jumătatea unei lungimi de undă prin intermediul unei plăci de fază, transparentă, care transformă defazarea în diferenţă de amplitudine a undei şi deci de luminozitate. Obiectul transparent devine mai luminos decât mediul ambiental. Principiul microscopiei prin contrast de fază. Preparatele biologice necolorate care nu absorb lumina se numesc obiecte de fază, deoarece modifică uşor faza luminii difractate de preparat, realizând de obicei o defazare de ¼ din lungimea de undă faţă de lumina directă, nedeviată, care trece nemodificată pe lângă preparat. Ochiul uman este sensibil numai la culorile spectrului vizibil (variaţii în frecvenţa undei incidente) sau la diferenţele dintre nivelele de intensitate (variaţii de amplitudine a undei). Pentru obiectele de fază, raza ordinară trece direct şi nedeviat prin sau pe lângă acest obiect. În acelaşi timp, razele difractate de preparat este încetinită cu aproximativ ¼ din lungimea de undă şi ajunge defazată la planul imaginii faţă de raza ordinară, dar fără a fi diminuată ca intensitate. Microscopul cu contrast de fază accelerează raza ordinară cu ¼ din lungimea de undă; astfel diferenţa de fază între raza ordinară şi cea difractată pentru un obiect de fază devine ½ din lungimea de undă. În consecinţă, undele directe şi cele difractate ajunse la nivelul ocularelor sunt capabile de a produce fenomenul de interferenţă distructivă. Astfel, detaliile apar mai întunecate pe fond luminos, iar contrastul de fază se numeşte pozitiv. Dacă unda directă este defazată cu ¼ din lungimea de undă, atunci unda difractată şi unda directă ajung în acelaşi timp la ocular iar interferenţa este constructivă; acum imaginea este luminoasă pe fondul mai întunecat; contrastul de fază este negativ.

Principiul de funcţionare al microscopului prin contrast de fază

Aplicaţii practice Contrastul de fază este o metodă excelentă pentru a studia evenimente celulare în dinamică, în special în celulele vii, nefixate, necolorate. Tehnica microscopiei în contrast de fază este aplicată la scară largă în cercetarea biomedical, în special în citologie şi histologie. Putem examina astfel:

- celule vii, - ţesuturi nefixate, necolorate, - microorganisme transparente la iluminarea pe fond luminos, - organite celulare, - membrane celulare, - nuclei, - mitocondrii, - fusul de diviziune şi cromozomii, - aparatul Golgi - granulaţii citoplasmatice ale celulelor vegetale şi animale

Microscopia în contrast de fază este utilizată pentru evidenţierea celulelor tumorale, dinamica şi comportamentul celulelor în cultură. Celulele în cultură se examinează cu un microscop inversat cu contrast de fază.

Hematii în microscopia cu contrast de fază (x400) exemplu: o granulă de colesterol în sânge, printre hematii

MICROSCOPIA ÎN LUMINĂ POLARIZATĂ Microscopul polarizant sau microscopul polarizor analizor reprezintă un tip de microscop optic care foloseşte două filtre polarizante: unul polarizor şi unul analizor. Este util în special în mineralogie şi de asemenea în biologie şi cercetarea biomedicală. Principiul microscopiei în lumină polarizată. Lumina naturală sau artificială are o natură dublă – ondulatorie şi corpusculară. Este o undă electromagnetică care vibrează în toate direcţiile, într-un plan perpendicular pe traiectoria de propagare. Dacă această lumină este filtrată cu un filtru polarizant, ea va vibra pe o singură direcţie şi devine lumină polarizată.

Microscop polarizant

Lumina trece prin filtrul polarizant şi devine lumină polarizată neanalizată; este formată numai din unde care vibrează în acelaşi plan. Un al doilea filtru (analizor) lasă să treacă lumina şi undele care vibrează într-un singur plan. Planul polarizorului şi analizorului sunt perpendiculare. În absenţa probei de examinat, lumina traversează polarizorul şi păstrează un singur plan de vibraţie. Odată polarizată, lumina nu mai poate traversa analizorul. În absenţa unei probe care să posede proprietatea de birefringenţă, lumina nu mai ajunge la ochiul observatorului. Preparatul birefringent este plasat între polarizor şi analizor. Lumina polarizată este deviată de proba biologică astfel încât, la ieşirea din acesta, vibraţiile au loc din nou în toate direcţiile.

Birefringenţa reprezintă fenomenul de dedublare a luminii polarizate în două unde de polarizare diferită care se propagă cu o viteză diferită. Acest fenomen este descris ca o rotaţie a polarizării. Ca şi exemplu, avem descoperirea lui Erasmus Bartholin, în anul 1669. Acesta a remarcat dedublarea imaginii formate într-un cristal de spat de Islanda (CaCO3).

Exemple de birefringenţă (dublă refracţie)

Fenomenul de dedublare a luminii este cunoscut sub numele de dublă refracţie (birefringenţă). Dacă rotim cristalul, o imagine rămâne staţionară iar cealaltă se roteşte în jurul celei dintâi. Una dintre unde, numită rază ordinară trece direct prin cristal (generează imaginea staţionară) în timp ce raza cealaltă este refractată diferit. Raza refractată se numeşte extraordinară şi se roteşte în jurul celei ordinare. Birefringenţa poate fi:

- pozitivă: dacă raza ordinară este transmisă mai rapid decât raza extraordinară (ex. colagen, fibre mielinice, fibre ale muşchiului striat)

- negativă: dacă raza extraordinară este transmisă mai repede decât raza extraordinară (ex. calcit, fibre nucleoproteice)

- birefringenţa intrinsecă: descrie materialele naturale care au un indice de refracţie asimetric, pe direcţii diferite. Exemple : cristale anizotrope, minerale, produşi chimici normali sau sintetici

- birefringenţa de structură: depinde de structura probei de analizat şi este de asemenea dependentă de variaţiile indicelui de refracţie al mediului. Caracterizează structuri macromoleculare cum ar fi cromosomii, fibrele musculare, microtubulii, ADN, proteine fibrilare (caracteristice firului de păr).

- birefringenţa cristalină, caracteristică pentru cristale proteice sau lipidice

- birefringenţa de tensiune: apare în structuri supuse unor tensiuni mecanice (muşchi, ţesuturi embrionare, polimeri, lentile de plastic)

APLICAŢII Acest tip de microscop este utilizat în mai multe domenii: medicină, biologie, geologie, ştiinţa materialelor, industria alimentară.

Ca şi avantaj, microscopul cu lumină polarizată poate deosebi materialele izotrope de cele anizotrope. Materialele isotrope, cum ar fi cristalele cu simetrie cubică, lichidele şi gazele, nu au limitări în termeni vibraţionali referitor la lumina care le traversează. Invers, materialele anizotrope au o gamă largă de proprietăţi refringente. În medie, 90% dintre substanţele solide sunt materiale anizotrope. Pentru microscopia în lumină polarizată putem utiliza lumina reflectată sau lumina transmisă prin preparat. Lumina reflectată este utilă pentru studiul materialelor opace cum ar fi ceramicele, oxizii şi sulfurile minerale, metalele, aliajele, compozitele.

1. examinarea fibrelor de colagen, fibrelor musculare 2. studiul membranelor biologice 3. examinarea pentru detectarea granulelor de lipide, colesterol

colesterol colagen