medmol

INTRODUCERE ÎN MEDICINA MOLECULARĂ

Șef de lucrări Dr. Lucian Negură UMF Iași – Disciplina Imunologie

Departamentul Oncogenetică [email protected]

C1. Biologie moleculară fundamentală – noţiuni generale 1.1. Structura, funcţiile şi sinteza acizilor nucleici

1.2. De la ADN la proteine: expresia genomului eucariot C2. Tehnici de biologie moleculară utilizate în diagnostic 2.1. Tehnici de detecţie a variaţiilor genice; PCR; secvenţiere ADN

2.2. Tehnici de cuantificare a acizilor nucleici: Real-Time PCR C3. Oncogenetică moleculara 3.1. Factorii de risc in cancer; rolul factorului ereditar

3.2. Predispoziţia ereditară la cancer: sindroame asociate C4?. Tehnici avansate în cercetarea biomedicală și în diagnostic 4.1. Clonarea moleculară – aplicații în terapia genică

4.2. Identificarea umană (HID) în medicina legală și criminalistică

mailto:[email protected]

BIOLOGIE MOLECULARĂ Definiție ?

molecular biology 1. The branch of biology that deals with the formation,

structure, and function of macromolecules essential to life, such as nucleic acids and proteins, and especially with their role in cell replication and the transmission of genetic information.

2. The branch of biology that deals with the manipulation of DNA so that it can be sequenced or mutated. If mutated, the DNA is often inserted into the genome of an organism to study the biological effects of the mutation.

molecular biology the study of biological phenomena at the molecular level

http://fr.wikipedia.org/wiki/Image:ADN_animation.gif

BIOLOGIE MOLECULARĂ Noțiuni generale

1. Structura, funcţiile şi sinteza acizilor nucleici 2. De la ADN la proteine: expresia genomului eucariot

ADN – Acidul dezoxiribonucleic ARN – Acidul ribonucleic


Importanţa biomedicală a acizilor nucleici: baza chimică a eredităţii

• Iniţial s-a crezut că proteinele poartă informaţia genetică, pînă la mijlocul secolului XX, cînd s-a descoperit că ADN-ul este baza eredităţii, datorită faptului că este capabil de auto-replicare.

• 1865: Un călugăr din secolul XIX pe nume Gregor Mendel a

introdus pentru prima oară noţiunea de genă: unitate de bază responsabilă pentru deţinerea şi transmiterea a unei caracteristici unice. Prezentând cercetările sale asupra eredității la mazăre, el a pus bazele geneticii moderne.

• 1869: Friedrich Miescher a izolat nucleina din nucleul leucocitelor și a stabilit că aceasta era compusă dintr-o fracțiune acidă (acizi nucleici!) și din una alcalină (care, ulterior, s-a dovedit a fi formată din proteine!).

ACIZI NUCLEICI - ISTORIC


• 1900: Phoebus Levene studiază acizii nucleici și izolează două tipuri diferite, ce pot fi distinse prin glucidul ce intră în compoziția lor : Acidul dezoxiribonucleic (ADN) s-a dovedit ulterior a conține dezoxiriboză, iar acidul ribonucleic (ARN) s-a dovedit a conține riboză. Tot Levene a arătat că unitățile compozante ale acizilor nucleici (nucleotide) sunt compuse din baze azotate, pentoze și radicali fosforici.

• 1928: Fred Griffith a demonstrat că, atunci când unei colonii bacteriene nepatogenice i se adaugă o colonie patogenică (responsabilă de boală), colonia inițial nepatogenică devine patogenică. Acesta a devenit principiul transformărilor, cu participarea materialului ereditar. Există deci posibilitatea de a transfera material ereditar de la o colonie la alta.

• 1944: Echipa formată din Oswald Avery, Colin MacLeod et Maclyn McCarty descoperă faptul că ADN este substanța responsabilă de transformările (transferările) descoperite mai devreme de Griffith.



• 1940: Erwin Chargaff descoperă că, în orice eșantion ADN, cantitatea de Adenină este întotdeauna egală cantității de Timină, iar cantitatea de Citozină este întotdeauna echivalentă cantității de Guanină (baze azotate!). Acest raport este cunoscut și în ziua de astăzi ca Raportul Chargaff: A=T. C=G). Este probabil principiul călăuzitor ce a permis clarificarea structurii intime a ADN.

• 1950; Rosalind Franklin: O importanță decisivă în cercetările vizând

determinarea structurii ADN. Lucrând prin difracție cu raze X, R. Franklin a demonstrat structura helicoidală a moleculei de ADN. Contribuția sa nu a fost recunoscută la atribuirea premiului Nobel pentru identificarea structurii ADN. Există, probabil, două cauze majore: – Atitudinea negativă față de femei în știința anilor ’50 – Rosalind Franklin a murit de cancer la vârsta de 38 de ani.

• În schimb, la 25 aprilie1953………


La 25 aprilie1953, Crick și Watson descoperă structura ADN

Premiul Nobel pentru Medecină în 1962 F. Crick, J. Watson et M. Wilkins

Erwin Chargaff

Rosalind Franklin

Acizii nucleici sunt substanţe macromoleculare polimerice, alcătuite din unităţi structurale (monomeri) care se repetă – nucleotide Acizii nucleici sunt, prin urmare, polinucleotide.

ACIZI NUCLEICI

Nucleotidele reprezintă unitatea monomerică a acizilor nucleici şi sunt compuse din: o bază azotată heterociclică: - purine: adenină (A) şi guanină (G) - pirimidine: citozină (C) şi timină (T) (ADN) citozină (C) şi uracil (U) (ARN) o pentoză: - dezoxiriboza (este prezentă în ADN) - riboza (este prezentă în ARN) un fosfat (radical fosforic)

Bazele azotate – purinice (A, G) sau pirimidinice (C, T, U)

(R) (Y)

(Doar în ARN !)

ACIZI NUCLEICI

Bazele azotate – numerotarea atomilor

Atomii heterociclului pirimidinic sunt numerotaţi de la 1 la 6 (astfel încat atomii de N din ciclu să primească indicele minim). Atomii heterociclului purinic sunt numerotaţi de la 1 la 9 (astfel încat atomii de N din ciclu să primească indicele minim).

ACIZI NUCLEICI

Bazele azotate purinice – numerotarea atomilor

PURINA

ADENINA (6-amino purina)

GUANINA (2-amino purin-6-ona)

ACIZI NUCLEICI

Bazele azotate pirimidinice – numerotarea atomilor

PIRIMIDINA

CITOZINA (4-amino pirimid-2-ona)

TIMINA (5-metil pirimid-2,4-diona)

URACIL (pirimid-2,4-diona)

(Doar în ARN !)

ACIZI NUCLEICI

Bazele azotate – TAUTOMERIA

Tautomeria este capacitatea unor substanţe de a se afla în forme diferite (izomeri de poziţie) datorită legăturilor chimice conjugate pe care le conţin.

N

NH

NH2

O

NC

NH2NH

CNH

forma lactam forma lactim

forma amino forma imino

CN OH

CHN O

Citozina

Formele mai stabile: Forma lactam este mai stabilă decît forma lactim Forma amino este mai stabilă decît forma imino

În acizii nucleici există formele lactam şi amino.

ACIZI NUCLEICI

Zaharul (pentoza) – Riboza (în ARN) sau Dezoxiriboza (în ADN)

ACIZI NUCLEICI

Zaharul (pentoza) – numerotarea atomilor

• Atomii de carbon ai pentozelor sunt numerotaţi de la 1’ la 5’. • Pentoza din ADN este dezoxiriboza, căruia îi lipseşte gruparea hidroxil 2’-OH. • Pentoza din ARN este riboza.

OHO

CH2OH

OHOH

OHO

CH2OH

OH

Riboza Dezoxiriboza

1’

2’ 3’

4’

5’

lipseşte 2’-OH

1’

2’ 3’ 4’

5’

ACIZI NUCLEICI

ACIZI NUCLEICI

Conformatiile “plic“ ale ribozei sunt esentiale in acizii nucleici, determinând orientarea relativă a substituienților fosfat la fiecare rest de riboză. În B-ADN, conformatia este C2’-endo, pe cand in A-ADN conformația este C3’-endo. În schimb, în Z-ADN nucleotidele purinice au toate conformația 3’-endo, iar nucleotidele pirimidice au toate conformația 2’-endo.

Zaharul (pentoza) – forma spațială (pliată)

NUCLEOZIDELE = Baza azotată + zahar

Nucleozidele sunt derivaţi ai bazelor azotate care au o pentoză legată de un atom de azot din heterociclu (N9 pentru purine / N1 pentru pirimidine), printr-o legătură β-N-glicozidică.

ACIZI NUCLEICI

NUCLEOTIDELE = Baza azotată + zahar + fosfat

ACIZI NUCLEICI

Generarea Nucleotidelor Pirimidinice

(ex. Adenina)

Generarea Nucleotidelor

Purinice (ex. Citozina)

NUCLEOTIDELE = Baza azotată + zahar + fosfat = Nucleozide + fosfat

Nucleotidele sunt compose din nucleozide (bază + pentoză) şi 1, 2, sau 3 grupări fosfat (se formează o legătură esterică între fosfat şi 5’-OH). Mononucleotide (nucleozid-monofosfat)= nucleozid + 1 fosfat Nucleozid-difosfat = nucleozid + 2 fosfat Nucleozid-trifosfat = nucleozid + 3 fosfat

ACIZI NUCLEICI

Terminologie Ribonucleozide/Ribonucleotide (când pentoza = riboză)

ACIZI NUCLEICI

Baza Nucleozidul Nucleotidul

Adenina (A) Adenozina (A)

Adenozin monofosfat (AMP) Adenozin difosfat (ADP) Adenozin trifosfat (ATP)

Guanina (G) Guanozina (G)

Guanozin monofosfat (GMP) Guanozin difosfat (GDP) Guanozin trifosfat (GTP)

Citozina (C) Citidina (C) Citidin monofosfat (CMP) Citidin difosfat (CDP) Citidin trifosfat (CTP)

Uracil (U) Uridina (U)

Uridin monofosfat (UMP) Uridin difosfat (UDP) Uridin trifosfat (UTP)

Timina (T) Timidina (T) Timidin monofosfat (TMP) Timidin difosfat (TDP) Timidin trifosfat (TTP)

Terminologie Dezoxiribo-nucleozide/nucleotide (cînd pentoza = dezoxiriboză)

ACIZI NUCLEICI

Baza Nucleozidul Nucleotidul

Adenina (A) Dezoxiadenozina (A)

Dezoxiadenozin monofosfat (dAMP) Dezoxiadenozin difosfat (dADP) Dezoxiadenozin trifosfat (dATP)

Guanina (G) Dezoxiguanozina (G)

Dezoxiguanozin monofosfat (dGMP) Dezoxiguanozin difosfat (dGDP) Dezoxiguanozin trifosfat (dGTP)

Citozina (C) Dezoxicitidina (C) Dezoxicitidin monofosfat (dCMP) Dezoxicitidin difosfat (dCDP) Dezoxicitidin trifosfat (dCTP)

Uracil (U) Dezoxiuridina (U)

Dezoxiuridin monofosfat (dUMP) Dezoxiuridin difosfat (dUDP) Dezoxiuridin trifosfat (dUTP)

Timina (T) Dezoxitimidina (T) Dezoxitimidin monofosfat (dTMP) Dezoxitimidin difosfat (dTDP) Dezoxitimidin trifosfat (dTTP)

NUCLEOZIDELE : Orientarea bazei azotate

ACIZI NUCLEICI

Flexibilitatea conformatională a ADN-ului este limitată Conformația unei unități de nucleozidă/nucleotidă indică prezența a 6 unghiuri de torsiune pentru partea de fosfo-zahar și un unghi de torsiune atribuit legăturii glicozidice. Rotația în jurul legăturii glicozidice este împiedicată. Rezidurile purinice au două conformații, sin si anti, ultima dintre acestea fiind mai stabilă. În marea majoritate a acizilor nucleici, toate bazele adopta conformația anti.

ACIZI NUCLEICI

Funcţiile fiziologice ale nucleotidelor “Cărămizi” pentru sinteza acizilor nucleici

Compuşi macroergici care furnizează energia necesară diferitelor procese biologice (ex. ATP, GTP) Reglatori alosterici ai diferitelor enzime (ex.ADP e activator alosteric al ICDH din ciclul Krebs) Donori de grupe metil (ex.S-adenozilmetionina)

Mesageri intracelulari ai hormonilor hidrofili (ex. AMPc, GMPc)

Nucleotide naturale libere : exemplu 3’,5’adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) este mesager secund imlicat în transmiterea mesajului hormonal din mediul extracelular în interiorul celulei. O

CH2

OPO

O

Adenine

N

N

N

N

NH2

O

OH

Ribose

AMPc

ACIZI NUCLEICI

STRUCTURA ADN

1. structura primară (secvența !)

2. structura secundară (dublu helix)

3. structura terţiară (cromozomi)

ACIZI NUCLEICI

STRUCTURA PRIMARĂ A ADN Nucleotidele se leagă între ele prin intermediul radicalului fosforic formând catene

ADN este în structură primară o structură monocatenară rezultată în urma

polimerizării nucleotidelor;

Caracteristica unei structuri primare este dată de ordinea nucleotidelor.

Ordinea 5’-3’ a nucleotidelor în catena ADN reprezintă secvența moleculei ADN

ADN este un polidezoxiribonucleotid în care gruparea 3’OH a unui

dezoxiriobonucleotid este legată la gruparea 5’OH a dezoxiriobonucleotidului vecin

printr-o legătură fosfat diesterică.

Lanţul polinucleotidic este polar:prezintă două capete distincte.

Capătul 3’este cel cu gruparea 3’-OH liberă.

Capătul 5’este cel cu gruparea 5’-OH liberă sau fosforilată.

Lanţul polinucleotidic al ADN este încărcat negativ la pH-ul fiziologic.

ACIZI NUCLEICI

STRUCTURA PRIMARĂ A ADN

Nucleotidele se leagă între ele prin intermediul radicalului fosforic formând catene.

ADN este o structură monocatenară rezultată în urma polimerizării nucleotidelor;

Caracteristica unei structuri primare este dată de ordinea nucleotidelor.

Nucleotidă

Polinucleotidă

ACIZI NUCLEICI

STRUCTURA PRIMARĂ A ADN

ADN este un polidezoxiribonucleotid în care gruparea 3’OH a unui dezoxiriobonucleotid este legată la gruparea 5’OH a dezoxiriobonucleotidului vecin printr-o legătură fosfat diesterică. Lanţul polinucleotidic este polar:prezintă două capete distincte. Capătul 3’este cel cu gruparea 3’-OH liberă. Capătul 5’este cel cu gruparea 5’-OH liberă sau fosforilată.

ACIZI NUCLEICI

STRUCTURA

PRIMARĂ A

ADN

N

NH

N

N

NH2

O Guanine

OCH2OH

O

OCH2

O

POO

O

PO OO

N

N

NH2

O

Cytosine

OCH2

OH

POO

O

NH

NH

O

O

CH3

Thymine

3' end

5' end1’

3’linkage

5’linkage

ADN este un polidezoxiribonucleotid în care

gruparea 3’OH a unui dezoxiriobonucleotid este

legată la gruparea 5’OH a dezoxiriobonu-

cleotidului vecin printr-o legătură fosfat

diesterică.

5’

3’

N

NH

N

N

NH2

O Guanine

OCH2OH

O

OCH2

O

POO

O

PO OO

N

N

NH2

O

Cytosine

OCH2

OH

POO

O

NH

NH

O

O

CH3

Thymine

3' end

5' end

P

P

P

G

C

T

OH

OH

Reprezentare simplificată a lanţului ADN

3’

3’

3’

5’

5’

5’

Pentoza: linie orizontală

Baza: litera corespondentă

Leg. fosfodiesterică:

linie oblică şi P la mijloc

ACIZI NUCLEICI

5’

3’

5’

3’

N

NH

N

N

NH2

O Guanine

OCH2OH

O

OCH2

O

POO

O

PO OO

N

N

NH2

O

Cytosine

OCH2

OH

POO

O

NH

NH

O

O

CH3

Thymine

3' end

5' end

Reprezentarea simplificată a catenei de ADN

Prin convenţie o catenă de ADN se scrie în direcţia 5’- 3’. ex. GCT înseamnă 5’GCT 3’

ACIZI NUCLEICI

5’

3’

Dublu helixul ADN

• Watson şi Crick au decoperit că structura secundară a ADN este un dublu helix –formată din două catene de ADN asociate prin împerecherea bazelor.

• Inelele glucidice legate prin resturi fosfat constituie scheletul extern al dublu helixului, în timp ce bazele azotate hidrofobe sunt orientate spre interior şi perpendicular pe axa helixului.

• ADN-ul uman conţine aproximativ 3,5 x 109 “perechi de baze”.

ACIZI NUCLEICI

STRUCTURA SECUNDARĂ A ADN

1. Stabilitatea ADNdc este asigurată de:

- interacţiunile hidrofobe dintre bazele azotate suprapuse (stivuite) de pe aceeaşi catenă

- legăturile de hidrogen ce se stabilesc între bazele azotate de pe o catenă şi cele complementare de pe cealaltă catenă.

2. Cele două catene de ADN sunt antiparalele.

Dublul helix al ADN ( structura secundară)

ACIZI NUCLEICI

ADN, perechi de baze azotate: A=T, C≡G

NN

N

NN

NN

O

O

H

HH

R

R

AT NN

N

N O

N

NN

N

O

C

HH

H

HH

R

R G

ACIZI NUCLEICI

3. G-C are 3 legături de H. A-T are 2 legături de H. 4. Cele două catene sunt

complementare (G complementar cu C, A complementar cu T).

4. Regula lui Chargaff Nr. A = Nr. T Nr. G = Nr. C

ACIZI NUCLEICI Dublul helix al ADN

( structura secundară)

O

HO

NN

O

O

OP

OO

-O

O NN

N

O

OP

O

-O

O

NN

N O

N

NO

OP

O O

-O

NN

N

N NO

OP

-O

-O

O

HH

H

HH

HH

H

N N

O

OH

NN

N

O

HH

NN

N

NO

NH

H

H

NN

N

NNHH

OOH

OP

OO

O-

O

OP

O

O-

O

O

OP

OO

O-

O

OP

O-

O-

O

3’

5’

5’

3’

T

C

G

A

A

G

C

T

ADN, două catene antiparalele

ADN, dublu helix ACIZI NUCLEICI

6. Există mai multe confomaţii ale ADN; - Conformaţia B (clasică): descrisă de Watson şi Crick are orientare dreaptă,

pasul dublu helixului este 34 Å (3,4nm), diametrul de 2nm, iar nr. perechi baze per tur este 10; cea mai răspîndită.

- Conformaţia A: dublu helix de dreapta dar mai compact, pasul elicei este de

2,8nm, nr. perechi baze per tur este 11. Întâlnită în cazul unor concentrații saline mari și în cazul unor deshidratări parțiale. Prezentă la hibrizii ADN/ARN și în structurile secundare (regiuni bicatenare) ale ARN.

- Conformaţia Z: dublu helix de stinga, pasul elicei 4,56nm şi nr. perechi baze per

tur este 12. Este singurul tip cu răsucire “spre stânga”, și este întâlnit doar “in vitro”.

Dublul helix al ADN ( structura secundară)

ACIZI NUCLEICI

ACIZI NUCLEICI Care este lungimea totală a ADN-ului unei celule ?

Lungimea unei nucleotide: 0.34 × 10-9 m În 46 de cromozomi ai unei celule, există peste 3 miliarde de nucleotide. Răspuns: 3 până la 5 metri

Care este lungimea totală a ADN-ului uman ?

Lungimea unei nucleotide: 0.34 × 10-9 m Număr de nucleotide într-o celulă : 6 x 109 Lungimea unei nucleotide: 0.34 × 10-9 m Număr de celule în corpul uman : 1013

Răspuns: 2 x 1013 metri !!!!!

ACIZI NUCLEICI

2 x 1013 metri = echivalentul a 70 călătorii dus-întors Pământ-Soare

ACIZI NUCLEICI Cum încape ADN-ul unei celule (3-5 metri)

într-o celulă (diametru max 100 µm = 10-4 m) ? Răspuns: dublul helix ADN (structura secundară) se organizează în structuri terțiare. Moleculele de ADN formează lungi fibrile numite cromatină. Un cromozom este un astfel de filament de cromatină, înfășurat de mai multe ori în jurul unor proteine denumite histone.

ACIZI NUCLEICI STRUCTURA TERTIARĂ A ADN: polinucleozomul

Lungimea unei molecule de ADN: 3-5 metri Nu încape în nucleu! (aprox. 50 nm = 50 x 10-9 m) La începutul fiecărei mitoze sau meioze, fiecare moleculă de ADN (în dublu exemplar!) se condensează în cromozomi, măsurând aproximativ 5 µm, ceea ce este de 10000 de ori mai mic ! Există 5 nivele de condensare (compactera a ADN-ului, pentru a asigura a ceastă reducere de talie.

r • Dublul helix de ADN se înfăşoară în jurul unui octamer proteic format din histone- fiecare unitate de ADN spiralată de 1,75 ori în jurul unui compelx histonic se numeşte nucleozom.

• Histonele sunt proteine bazice cu masă moleculară mică (max. 20.000), bogate în aa bazici (Arg pt.H2A, H2B şi, Lys pt H3, H4).

ACIZI NUCLEICI Nivelele de compactare a

ADN în nucleu -Primul nivel-

r • În jurul octamerului histonic (H2A H2B H3 H4)x2 este spiralat

ADN-ul nucleozomic fomat din 140 perechi de baze.

• Nucleozomii sunt legaţi între ei prin ADN internucleozomic sau ADN linker format din 30 perechi de baze). Histona H1 itercaţionează cu ADN linker, avînd rol în superspiralizarea nucleozomilor.

• Polinucleozomul seamănă cu nişte “mărgele pe aţă” (=fibrile de cromatină de 10nm ).


ADN în nucleu -Primul nivel-


ADN în nucleu -Al doilea nivel-

Polinucleozomul se superspiralează pentru a forma structura de solenoid. Solenoidul conţine 6-7 nucleozomi per tur. Pasul e de 10nm, diametrul de 30 nm. Solenoidul formează fibrele de cromatină de 30 nm.

- Fibrele de cromatină se compactează şi mai mult form domenii în formă de buclă. - Aceste domenii în buclă sunt superspiralizate şi organizate în structuri distincte numite cromozomi. - ADN -ul uman nuclear ( genomul) constă în 23 perechi de cromozomi. Majoritatea celulelor eucariote conţin perechi de cromozomi şi sunt astfel denumite diploide. Celulele care conţin cromozomi nepereche sunt denumite haploide.


ADN în nucleu -Nivelele 3, 4 și 5-

Cromozomii genomului uman ACIZI NUCLEICI

CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

ACIZI NUCLEICI Denaturarea ADN

Hyp

erch

rom

icité

DNA#1

DNA#2

ACIZI NUCLEICI Denaturarea ADN

ARN (acidul ribonucleic) • Trei diferențe:

– 1. Zahăr: Riboza înlocuiește dezoxiriboza – 2. Uracilul înlocuiește Timina – 3. ARN este monocatenar

Trei tipuri de ARN:

ARN-m

ARN-r

ARN-t

ACIZI NUCLEICI

ARN (acidul ribonucleic) ACIZI NUCLEICI

ARN (acidul ribonucleic)

ACIZI NUCLEICI

ARN – poliribonucleotid monocatenar Lungimea ARN: 10-10000 nucleotide (ADN: miliarde !) În celule se găsesc diferite tipuri de ARN. Proporția lor este diferită: o mare cantitate este reprezentată de ARNr (80-90% din ARN-ul celular), ARNt în proporție de 10-15% și doar o cantitate mică de ARNm (mai puțin de 5%).


ARN – Absența grupării metil (-CH3) din molecula de uracil nu împiedică complementaritatea (punțile hidrogen) cu Adenina

Doar legături convenționale

Legături neconvenționale

ARN (acidul ribonucleic)

ACIZI NUCLEICI

ARN-ul mesager este ARN-ul ce va servi ca tipar pentru sinteza proteinelor. Complexul enzimatic ARN polimerază sintetizează inițial un ARN mesager precursor ce conține secvențele corespunzătoare exonilor și intronilor genei. Prin procesul ulterior de maturare ARN-ul premesager este modificat pentru a duce la formarea ARN-ului mesager matur ARN-ul ribozomal este un constituient principal al ribozomilor, structuri celulare la nivelul cărora se realizează sinteza proteinelor. ARN-ul ribozomal este sintetizat prin transcripția genelor corespunzătoare situate în anumite regiuni ale cromozomilor numite organizatori nucleolari. ARN-ul de transport (notat ARNt) este un ARN scurt, de 75-100 nucleotide, cu o structură terțiară „în treflă” (cu patru regiuni scurte dublu catenare și trei bucle) ce fixează un anumit aminoacid si care are o regiune specifică de trei nucleotide numită anticodon. Acest ARN fixează un aminoacid pe care îl transportă și în poziționează în dreptul unui codon (prin complementaritatea codon (de pe molecula de ARNm) – anticodon (de pe molecula de ARNt) în cursul procesului de translație.

BIOLOGIE MOLECULARĂ Noțiuni generale

1. Structura, funcţiile şi sinteza acizilor nucleici 2. De la ADN la proteine: expresia genomului eucariot

FUNCȚIILE ADN - Replicarea - Sinteza proteinelor


ARN

Proteină

ADN

Propusă de către Francis Crick în 1958 pentru a descrie fluxul informaţiei genetice în celulă. Informaţia depozitată în ADN este transferată ARN-ului, care mai departe o transferă proteinelor. Dogma Centrală propusă de Crick a suferit numeroase revizii în ultimii 47 de ani.

Acid dezoxiribonucleic

Acid ribonucleic

Dogma Centrală a geneticii moleculare

Replicare

Transcripție

Translație

AAA

mRNA

tRNA

PROTEINĂ

TRANSCRIPȚIE

ADN

REPLICARE

TRANSLAȚIE


• ADN ARN proteine

Transcriere Traducere

• Transcrierea / Transcripția = transferul informaţiei genetice de la ADN la ARN (sinteză de ARN pe matriţă de ADN)

• Traducerea / Translația = transferul informaţiei genetice de la ARN la proteinele functionale, a căror secvenţă de aminoacizi este codificată în structura ADN-ului.

• Replicarea = transferul informaţiei genetice de la celula mamă la celulele-fiice prin copierea ADN-ului parental cu formarea a două molecule de ADN cu structură identică ADN-ului parental


• Recombinarea= rearanjarea materialului genetic

• Mutaţii/Reparare =

lezarea ADN cu alterarea informaţiei genetice/ corectarea leziunilor ADN

• Revers- transcrierea

= transferul informaţiei genetice de la ARN la ADN

Recombination

Mutation/Repair


DENATURAREA ADN REPLICAREA ADN

A+T-rich

G+C-rich

REALIZAREA LEGĂTURII FOSFODIESTER REPLICAREA ADN

http://www.mbi.ufl.edu/facilities/msg/bch4024m/lecture45.pdf

α β γ

1. MATRICE 2. 3’-OH liber

Pirofosfat

Fosfat anorganic

Nucleozid tri-P

P i

P i

i P P

REPLICAREA ADN REPLICAREA = Dublarea întregii cantități de ADN, înaintea diviziunii

celulare, în scopul transmiterii fidele a informației genetice (materialului

genetic) din generație în generație.

Monomerul replicării : Nucleotidul (nucleozid trifosfatul)

Nucleozid trifosfatul este activ din punct de

vedere chimic, datorită sarcinilor negative

ale celor 3 grupări fosfat. Prin legarea la

catena ADN în formare, nucleotidul pierde

două grupări fosfat (pirofosfat).

Hidroliza pirofosfatului în două molecule

de fosfat anorganic generează energia

necesară legării nucleotidului la catena ADN

în formare.

Replicarea ADN precede diviziunea celulara

REPLICAREA ADN

1. Fiecare moleculă de ADN dublu catenar se derulează și se separă în două catene independente (se rup punțile de hidrogen intercatenare A=T și C≡G), care vor servi ca matrice pentru sinteza a două catene noi de ADN (se refac punți de hidrogen intercatenare A=T și C≡G, între o catenă veche și una nou formată). Astfel din 2 catene ADN obținem 4 catene. Fiecare moleculă-fiică va conține o catenă din molecula-mamă și o catenă nou sintetizată. Moleculele de ADN nou formate se înfăşoară la rândul lor în dublu helix . Din acest motiv, replicarea este semiconservativă.

2. Nucleozidele trifosfat (nucleotidele), deja sintetizate şi prezente în nucleu, se apropie de extremităţile 3’ ale catenelor de ADN în formare. Nucleotidele vor fi incorporate în noua catenă prin fomare de legături: - fosfodiester, cu ultimul nucleotid 3’ de pe aceeaşi catenă - de hidrogen (A=T și C≡G), prin complementaritate cu nucleotidele de pe cealaltă catenă (matrice).

REPLICAREA ADN

3. Enzima (complex enzimatic) resposabilă de biosinteza ADN este o ADN polimerază ADN-dependentă. Aceasta eliberează pirofosfatul fiecărui nucleotid nou adăugat, utilizând energia rezultată pentru polimerizarea nucleotidelor între ele prin formare de legături fosfodiester. Punţile de hidrogen intercatenare se formează spontan (necatalitic), prin complementaritate.

4. Polimerizarea (extinderea catenelor nou formate) se realizează întotdeauna în sensul 5’ către 3’. Enzima se va deplasa deci, pe fiecare catenă veche (matrice), în sensul 3’ către 5’, iar catenele noi se vor extinde 5’ către 3’. Complementaritatea şi antiparalelismul se respectă şi pentru moleculele nou formate.

5. Datorită faptului că un singur complex de polimerizare lucrează simultan pe ambele catene matrice, şi că acestea sunt antiparalele, pe una din catene sinteza va fi continuă, iar pe cealaltă discontinuă.

REPLICAREA ADN

Catenă matrice Catenă nouă

Nucleozid tri-P

Carbon 3’ al ribozei

ADN polimerază

Legătură fosfodiester

REPLICAREA ADN

Formarea legăturii fosfodiester

REPLICAREA ADN Catenă matrice Catenă matrice Catenă nouă Catenă nouă

1. MATRICE 2. 3’-OH liber

Replicarea la bacterii Genom bacterian = un singur cromozom circular, aproximativ 4,6 milioane de perechi de nucleotide. ADN polimeraza recunoaşte o secvenţă particulară de ADN (originea replicării), se fixează şi separă cele două catene, formând astfel un ochi de replicare. Replicarea este continuă, până la copierea întregului cromozom. Viteza: 500 nucleotide / secundă. Mai puţin de o oră pentru replicarea întregului cromozom.

Originea replicării

Ochiul replicării

Sfârşitul replicării

REPLICAREA ADN

Ochi de replicare

Ochi

Furci de replicare

Replicarea la eucariote (om) Genom uman = 46 cromozomi lineari, aproximativ 3 miliarde de perechi de nucleotide. Sute, chiar mii de ochi de replicare se deschid pe fiecare cromozom. Replicarea se produce la extremităţile fiecărui ochi (furci de replicare), până când toată molecula este copiată, iar ochii de replicare se unesc. Viteza: 50 nucleotide / secundă. Câteva ore pentru replicarea întregului genom.

REPLICAREA ADN

Catena directoare sau continuă (leading strand) Pe măsură ce furca de replicare se deschide (la fel ca la un fermoar), nucleozidele se adaugă unele după altele, 5’ către 3’. Extremitatea 3’-OH a acestei catene este întotdeauna disponibilă, catena avansând către furca de replicare.

5’

3’ OH

OH 3’

5’

3’

5’

5’

3’

REPLICAREA ADN Elongarea unei noi catene la nivelul furcii de replicare (FR) este antiparalelă Catena discontinuă

(lagging strand) Nucleozidele se adaugă unele după altele, 5’ către 3’, catena avansând în sens opus furcii de replicare. Din acest motiv, de fiecare dată când furca de replicare se deschide câte puțin, va fi sintetizat un mic fragment de ADN (Fragment Okazaki) La bacterii: 1000-2000 nts La om: 100-200 nts

3’ cresterea catenei ADN

5’

cresterea catenei ADN 3’ 5’

directia de deplasare a furcii de replicare

REPLICAREA ADN

• Limitarea este impusa de sinteza ADN, strict in directia 5’ spre 3’

• Cele doua catene ADN sunt utilizate diferit la

nivelul furcii de replicare – catena conducatoare (leading strand) este

sintetizata continuu – catena intarziata (lagging strand) este

sintetizata de o maniera discontinua • sunt sintetizate fragmente Okazaky • fragmentele sunt cuplate intre ele cu

ajutorul ADN ligazei

leading

lagging

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

REPLICAREA ADN

REPLICAREA ADN

Amorsa este produsă de ARN Primaza (4)

O amorsă (primer) ARN este produsă la începutul fiecărei catene nou sintetizate (3)

Helicazele derulează ADN (1)

ADN Ligaza sudează fragmentele rezultate (7)

ADN Polimeraza I înlocuiește amorsele ARN cu ADN (6)

Proteine stabilizează cele două catene separate (2) 5’

3’ 5’

3’

ADN Polimeraza III prelungește catena (5)

Amorsele extremităților nu pot fi înlocuite, deoarece ADN Polimeraza I nu găsește o extremitate ADN 3’ de care să se “agațe” pentru a degrada amorsa. La fiecare replicare, ADN-ul se scurtează !!!. (8)

3’

5’

REPLICAREA ADN

REPLICAREA ADN

În timpul replicării apar numeroase erori la nivelul incorporării de nucleotide în catenele noi (aprox. 1 / 105 nucleotide). ADN Polimeraza III posedă o activitate de verificare/reparare (proofreading) a erorilor, majoritatea acestora fiind corectate (atenție! Întotdeauna varianta “corectă” este varianta de pe catena matrice). Erorile nereparate de ADN Polimeraza III vor fi identificate și reparate de sistemele proteice celulare de reparare ADN (cam 100 la bacterii – puțin performat, peste 130 la om – foarte performant) În medie, la fiecare replicare rămân 1 / 108 nucleotide erori nereparate. Acestea reprezintă motorul evoluției speciilor.

REPLICAREA ADN

Mismatch (necomplementaritate)

Enzimă de reparare

ADN Polimeraza III

ADN Ligaza

TELOMERII sunt prelungiri “de rezervă” la capetele cromozomilor (repetiții ale secvenței TTAGGG, la om). Deși există sute/mii de astfel de repetiții, telomerii se erodează la fiecare replicare /diviziune celulară. Cu trecerea anilor, prin erodarea telomerilor ne apropiem de regiuni importante, genice. Îmbătrânim. Atunci când telomerii devin prea scurți, și înainte ca genele să fie afectate, celulele își încetează diviziunile și intră în senescență. Interesantă este povestea lui Dolly….

Telomer

Telomer

Porțiune «utilă»

Amorsă neînlocuită

Amorsă ARN

REPLICAREA ADN

EXPRESIA GENELOR • Genele (ADN) dictează caracteristicile fizice ale individului prin

intermediul proteinelor. • Genă = unitate din molecula de ADN (succesiune de nucleotide) care

codifică informaţia pentru sinteza unei proteine (unităţi funcţionale ARN)

• Informaţia genetică este codificată : CODUL GENETIC • Transcripţia : Sinteza ARN pornind de la ADN (enzima responsabilă:

ARN polimerază ADN-dependentă • Translaţia : traducerea informaţiei ARN în proteină (succesiunea de

nucleotide devine succesiune de aminoacizi. Ordinea succesiunii aminoacizilor în molecula proteică (secvenţa proteinei) este dictată de ordinea succesiunii nucleotidelor în molecula ARN (secvenţa ADN).

• Modificarea secvenţei ADN = Modificarea proteinei ??? • Proteinele reprezintă legătura dintre GENOTIP (gene) şi FENOTIP

(caractere aparente). Suntem reflecţia proteinelor noastre, iar proteinele noastre sunt codificate în genele noastre.

Genom uman

3000 Mb

Gene şi alte secvenţe înrudite

900 Mb

ADN extra-genic

2100 Mb

ADN codant

90 Mb

ADN non-codant

810 Mb

ADN repetitiv

420 Mb

ADN în copie unică / număr mic de copii

1680 Mb

Pseudogene Fragmente de gene

Introni, etc Repetiţii în tandem

Repetiţii intercalate (« interspersed »)

ADN satelit

ADN minisatelit

ADN microsatelit Elemente LTR Elemente SINE

Elemente LINE Transpozoni

EXPRESIA GENELOR Genomul uman

< 3%

83

EXPRESIA GENELOR Genomul uman

Bacterii : 500 gene Om : 30000 gene

codant codant Exon1 Exon2 Exon3 Intron 1 Intron 2

5’UTR 3’UTR

Regiunea 5’

START

ATG

Ordinea 5’-3’ a nucleotidelor în catena ADN reprezintă secvența moleculei ADN Structura unei gene este asemănătoare unei cărți...

Fraze (exoni)

Punctuație(introni)

promotor

Prefața

Capitol1

Sfârșit

enhancer

Sfatul unui prieten

silencer

Critică

ACIZI NUCLEICI

EXPRESIA GENELOR Sinteza proteinelor : Proces care constă în polimerizarea aminoacizilor, în celule sau in vitro. Intr-o celulă pot exista circa 10000 proteine care au rol esenţial în funcţionarea şi reproducerea celulei şi organismului. Biosinteza proteinelor se desfăşoară în următoarele momente. 1. În primul moment are loc transcripţia, care constă în sinteza mARN de

către una dintre catenele de ADN dintr-o genă. 2. În al doilea momont are loc migrarea mARN în citoplasmă şi asocierea

mARN cu ribozomii activi în sinteza proteică 3. În al treilea moment are loc activarea aminoacizilor 4. În al patrulea moment are loc translaţia, polimerizarea sau asamblarea

aminoacizilor.

EXPRESIA GENELOR Transcripţia • Sinteza de ARN pornind de la ADN.

(se trece, prin complementaritate, din limbajul nucleotidelor ADN în limbajul nucleotidelor ARN).

• Se pot sintetiza molecule de ARN mesager (ARNm), ARN de transfer (ARNt), ARN ribozomal (ARNr), etc…

• Genă = unitate din molecula de ADN (succesiune de nucleotide) care codifică informaţia pentru sinteza unei proteine (unităţi funcţionale ARN)

Traducerea • Sinteza unui polipeptid (proteină),

pornind de la un ARNm. • Se trece, prin codul genetic, de la

limbajul nucleotidelor ARN la limbajul aminoacizilor în proteină.

EXPRESIA GENELOR Gradul transcripţiei fiecărei gene determină proporţia de proteine într-o celulă. Reglajul transcripţiei determină metabolismul celular.

Bacterii (celule procariote) • Transcripţia şi translaţia sunt cuplate, producându-se aproape

simultan, în compartimentul din zona nucleoidului. • Transcripţia produce o moleculă de ARNm matur, tradus imediat în

proteină, la nivelul ribozomilor din zona nucleoidului. • Întreg procesul este extrem de rapid.

Om (celule eucariote) • Transcripţia şi translaţia sunt decalate şi separate în compartimente

celulare diferite: Transcripţia are loc în nucleu, în timp ce traducerea are loc în citoplasmă.

• Transcripţia produce iniţial o moleculă de ARNm imatur (transcript primar sau ARN pre-mesager), care va trebui să suporte anumite transformări (maturare) pentru a deveni ARN mesager matur.

• ARNm este responsabil de transportul informaţiei din nucleu, acolo unde este sintetizat, până la nivelul ribozomilor din citoplasmă, acolo unde se va sintetiza proteina.

• Întreg procesul este mult mai lent.

EXPRESIA GENELOR

Transcripţie

Traducere

ADN

ARNm

Ribozom Catenă polipeptidică

Transcripţie

Traducere

ADN

ARNm

Ribozom

ARNpm Maturare

Catenă polipeptidică

Nucleu

Citoplasmă

EXPRESIA GENELOR Bacterii (celule procariote) Om (celule eucariote)

EXPRESIA GENELOR Bacterii (celule procariote) Om (celule eucariote)

Ribozomi

ARNm (pe cale de a fi tradus în catene polipeptidice, de către mai mulţi ribozomi)

ADN (pe cale de a fi transcris în molecule ARNm, de către mai multe polimeraze)

ADN ARN polimeraze

EXPRESIA GENELOR

La bacterii (celule procariote), transcripţia şi translaţia sunt cuplate

EXPRESIA GENELOR Transcripţia : analogii cu replicarea • Denaturarea celor două catene din molecula ADN

• Derularea unei mici porţiuni din molecula ADN

• Utilizarea uneia din cele două catene ADN ca matrice

• Incorporarea de nucleotide prin complementaritate

• Nucleotidele nou incorporate sunt unite prin legături fosfodiester

• Secvenţa catenei nou sintetizate este complementară celei matrice.

• Polimerizarea are loc 5’ către 3’ Transcripţia : diferenţe faţă de replicare • Molecula de ARN nou sintetizată nu rămâne legată de catena ADN matrice

• Helixul ADN se reformează după trecerea polimerazei, între catenele ADN.

• Moleculele ARN formate conţin maxim câteva mii de nucleotide.

93

EXPRESIA GENELOR

Catena sens (5’-3’) conţine informaţia genetică. Catena antisens (5’-3’) este copiată. Se obţina secvenţă ARNm complementară catenei antisens, deci identică cu catena sens. Polimerizarea are loc 5’ către 3’. În cursul transcripţiei, o singură catenă ADN este transcrisă în ARN – catena sens. O catenă sens pentru o genă poate fi antisens pentru altă genă.

94

EXPRESIA GENELOR ARN Polimeraza

• Se deplasează de-a lungul moleculei de ADN (5’ către 3’ pe catena sens)

• Derulează molecula ADN

• Iniţiază transcripţia la nivelul unui promotor

• Adaugă nucleotide progresiv, prin complementaritate, copiind catena antisens

• Substraturi nucleotidice : ATP,CTP,UTP,GTP

• ARN format fiind eliberat foarte rapid, se poate începe sinteza unei noi molecule

înainte de terminarea sintezei moleculei precedente.

• Viteza : 20 de nucleotide incorporate / secundă

• Într-o singură oră, pornind de la o singură genă pot fi generaţi mai multe mii de

transcripţi (ARNm)

ARN polimeraza

• Ribonucleotide • Nu necesită amorsă • 1 eroare la fiecare 104

• Erori cu consecinţe de mică importanţă

• Sistem de reparare rudimentar

ADN polimeraza • Dezoxiribonucleotide • Necesită amorsă • 1 eroare la fiecare 107

• Erori cu consecinţe de maximă importanţă

• Sistem de reparare foarte complex

EXPRESIA GENELOR

EXPRESIA GENELOR Gena ce trebuie transcrisă:

- Un promotor (amont, câteva zeci de nucleotide) : iniţierea transcripţiei

- O regiune codantă (matrice)

- O regiune de terminare (aval)

Etapele Transcripţiei:

Iniţierea : ARN polimeraza ADN-dependentă se leagă la promotor. Cele două

catene sunt desfăşurate şi începe încorporarea de nucleotide.

Elongarea : 5’ către 3’, antiparalel şi complementar cu catena de ADN copiată.

Polimeraza expune 10-20 de baze pe catena ADN copiată. Sunt recrutate şi

incorporate nucleotide, la fel ca în procesul replicării, fabricându-se de astă dată o

moleculă ARN. ADN-ul se reînrulează după trecerea polimerazei.

Terminarea : transcripţia continuă până la capătul regiunii terminale, după care

polimeraza şi molecula de ARN sunt eliberate.

5’

3’

ARN polymérase

Iniţiere

Elongare

Terminare

EXPRESIA GENELOR

EXPRESIA GENELOR

GD : genon de debut GF : genon de final CD : codon de debut CF : codon de final

5’ 3’

Promotor Catenă sens necodantă

Catenă antisens codantă Regiune terminală

3’ 5’ Genoni GD GF

UNITATE DE TRANSCRIPŢIE (ADN)

5’ 3’

CD CF Copie a regiunii terminale Codoni

3’UTR 5’UTR

TRANSCRIPTUL (ARN)

Copia catenei codante (porţiune a ARN care va fi tradusă în proteină)

Copie a unei părţi din promotor

DEBUTUL TRANSCRIPŢIEI

UTR = UnTranslated Region = regiune netradusă

← Amont Aval →

1. Transcripția are loc doar atunci când celula are nevoie de o proteină sau

de o moleculă de ARN particulară (nu este un proces “by default”. Prin

urmare, trenscripția necesită (mai ales la eucariote) un reglaj complex.

2. La procariote o singură enzimă e responsabilă de transcripție: ARN

polimeraza. La eucariote, există ARN polimeraza I, ARN polimeraza II

(cea mai importantă), și ARN polimeraza III.

3. Fixarea enzimei la promotor se face spontan la procariote, în timp ce la

eucariote necesită participarea unor proteine numite factori de

transcripție (în plus față de secvențele Enhancer și Silencer).

4. ARN polimeraza nu posedă activitate “proofreading” = erori (1 / 100 nt)

5. La eucariote, viteza transcripției = 60 nucleotide / secundă.

6. O genă poate fi transcrisă simultan de mai multe ARN polimeraze.

EXPRESIA GENELOR

La eucariote, transcriptul primar (ARN pre-mesager) suferă transformări post-transcripționale pentru a fi maturat : 1. Adăugarea unei structuri protectoare în 5’ (Capping) 2. Adăugarea unei structuri protectoare în 3’ (poly-A:

50-250 adenine) 3. Eliminarea intronilor necodanți (splicing) Structurile protectoare ajută de asemenea la transportul ARNm către ribozom și la fixarea ARNm pe ribozom.

EXPRESIA GENELOR

Codon de start

3’UTR 5’UTR

Segment codant pentru proteină

Codon stop

Coadă poly-A M7-Gppp

ARN pre-mesager

Cap 5’

7 5 6 1 8 4 2 9 3

O grupare metil «CH3» este adăugată în poziția 7 a guaninei

EXPRESIA GENELOR

EXPRESIA GENELOR SPLICINGUL Transcriptul eucariotic primar conține regiuni codante (exoni) și regiuni necodante (introni), așa cum sunt distribuite acestea la nivelul genelor (discontinue la eucariote). Procesul de splicing permite eliminarea intronilor și alipirea exonilor, într-o secvență continuă codantă, la nivelul ARN mesager matur. Lungimea medie a unui ARM pre-m este de 8000 nucleotide, în timp de un ARNm are în jur de 1200 nucleotide (codând pentru o proteină medie de 400 de aminoacizi). Astfel, 85% din secvența ARN pre-m este eliminată. Procesul permite unei gene să codifice simultan pentru mai multe polipeptide (proteine), de vreme ce asamblarea exonilor este deseori alternativă (splicing alternativ – mai multe variante de ARNm). Aceasta explică posibilitatea celulei eucariote de a avea peste 100000 polipeptide diferite cu doar 30000 gene codante.

I Exon Exon E Intron

AAA…AAA m7Gppp

I Intron

5’UTR 3’UTR

EXPRESIA GENELOR SPLICINGUL

Rezumat

I I Intron

5’ UTR E I E I Exon Intron E 3’ UTR

CA CD AUG

AAAAAAAAAAA 5’ UTR E I E I E I E 3’ UTR

AAAAAAAAAAA 5’ UTR E E E E 3’ UTR

Genă de transcris (catenă codantă ADN)

ARNpm

Transcripție

Maturarea ARN Adăugare capping 5’ și coadă 3’

Traducere

Maturarea ARN Splicing

ATT ACT ATC

UAA UGA UAG

Polipeptid (Succesiune de aminoacizi)

ARN m «matur»

NUCLEU

Citoplasmă

AAAAAAAAAAA 5’ UTR 3’ UTR

3’ Promotor E I E I Exon Intron E Regiune terminală 5’

GF GD TAC

Cap (guanină) Coadă poly-A

ARN m «matur»

||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| |||

||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| |||

||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| |||

||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| |||

||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| ||| |||

M7•G

I = Intron Regiune necodantă E = Exon Regiune codantă

CODUL GENETIC 1. Codul genetic decriptează triplete de nucleotide în aminoacizi echivalenţi

GENON (ADN) – CODON (ARNm) - ANTICODON (ARNt) – AMINOACID (proteină)

CODUL GENETIC 2. Prin convenţie, codul genetic defineşte lista de codoni şi aminoacizii

echivalenţi.

3. 43 = 64 de codoni codifică pentru 20 de aminoacizi. Dar:

- 60 de codoni codifică pentru aminoacizi

- Un codon (AUG) codifică simultan pentru Met şi START

- Trei codoni (UAG, UGA, UAA) sunt codoni STOP

1 codon codifică Metionina şi este codon START

61 codoni codifică pentru aminoacizi

3 codoni nu codifică pentru aminoacizi şi sunt codoni STOP

CODUL GENETIC

Rolul redundanţei Minimizează efectul mutaţiilor: o substituţie poate fi silenţioasă, dacă modificarea la nivelul ADN nu implică o modificare la nivelul proteinei.

4. Codul genetic este degenerat: redundanţă a mai multor codoni pentru acelaşi aminoacid

CODUL GENETIC

5. Codul genetic este universal = origini comune ! Excepţii : mitocondrii, cloroplaste

In anul 1489, Ștefan cel Mare a luptat cu turcii pentru a oferi poporului grâu. In anul 1489, Ștefan cel Mare a luptat cu turcii pentru a oferi poporului frâu. In anul 1489, Ștefan cel Mare a luptat cu murcii pentru a oferi poporului grâu. In anul 1489, Ștefan cel Mare a luptat cu turcii pentru a oferi popoorului grâu. In anul 1989, Ștefan cel Mare a luptat cu turcii pentru a oferi poporului grâu. In anul 1489, Ștefan del Mare a luptat cu turcii pentru a oferi poporului grâu. In anul 1489, Ștefan cel Mare a luptat cu turcii centru a oferi poporului grâu. Pentru a oferi poporului grâu, Ștefan cel Mare a luptat cu turcii în anul 1489. In anul 1489 turcii au luptat cu grâu pentru a oferi poporului Ștefan cel Mare. A oferi în anul poporului cel Mare au luptat 1489 turcii grâu au cu Ștefan . Domnișoara Maria Popescu se căsătorește cu domnul Ionel Timofte. Domnișoara Maria Ponescu se căsătorește cu domnul Ionel Timofte. Domnișoara Maria Popescu se căsăpește cu domnul Ionel Timofte. Domnișoara Maria Popescu se căsătorește. Domnișoara Maria Popescu nu se căsătorește cu domnul Ionel Timofte. Domnișoara Maria Popescu se căssătorește cu domnul Ionel Timofte. Marcel îi da lui Ninel 200 RON. Marcel îi ia lui Ninel 200 RON. Marcel îi da lui Ninel 2000 RON. Marcel îi da lui Gigel 200 RON. NOR 002 leniN iul ad iî lecraM.

CODUL GENETIC

CODUL GENETIC 6. Codul genetic este puctuat (are punctuaţie):

Codonul iniţiator AUG (Met) defineşte începutul mesajului şi cadrul de lectură în

care se va citi acest mesaj.

Întrebare: câte cadre de lectură diferite pot exista pentru acelaşi mesaj,

dacă citirea se face pe codoni (3 câte 3 litere) ?

YXDNDJSNSHSSTARTIARMAIIAUDOIPUIDINCOŞCÂTPOTSTOPXBSGSBSKM YXDNDJSNSHSSTARTIARMAIIAUDOIPUIDINCOŞCÂTPOTSTOPXBSGSBSKM

IAR MAI IAU DOI PUI DIN COŞ CÂT POT

ARM AII AUD OIP UID INC OŞC ÂTP OT

RMA IIA UDO IPU IDI NCO ŞCÂ TPO T

SINTEZA PROTEINELOR TRANSLAŢIA (TRADUCEREA) : Sinteza unei catene polipeptidice (succesiune de aminoacizi) pornind de la informaţia conţinută de o moleculă de ARNm (succesiune de nucleotide), prin codul genetic. PARTICIPANŢI : - ARNm matur : succesiune codoni = succesiune aminoacizi - Aminoacizi (20) : prezenţi în citoplasmă - ARNt : transportă (transferă) aminoacizii din citoplasmă către ribozomi - Ribozomi : sediul sintezei proteice. Complexe ribonucleoproteice (ARNr + proteine) ETAPE : 1. Ribozomul se fixează pe ARNm. 2. ARNm este scanat până la iddentificarea AUG iniţiator. 3. Un ARNt aduce o metionină echivalentă cu AUG. 4. ARNm traversează ribozomul, fiind citit codon cu codon. 5. De fiecare dată când un codon este citit, ARNt echivalent aduce aminoacidul

echivalent pentru a fi legat prin legătură peptidică la proteina nascentă. 6. Atunci când este citit un codon de terminare (UAA; UAG sau UGA), nu mai

este incorporat nici un aminoacid şi procesul ia sfârşit 7. ARNm este citit 5’ către 3’, proteina sitetizată Nter către Cter

3’UTR

5’UTR

Codoni

ARNm «ARN matur»

AAA…

AUGCUUCAGAGGCUGUAA

Semnal de terminare a traducerii

Met— Leu— Gln— Arg— Leu

M7•G CD CF

SINTEZA PROTEINELOR

ARN (acidul ribonucleic) ARN-ul mesager este ARN-ul ce va servi ca tipar pentru sinteza proteinelor. Complexul enzimatic ARN polimerază sintetizează inițial un ARN mesager precursor ce conține secvențele corespunzătoare exonilor și intronilor genei. Prin procesul ulterior de maturare ARN-ul premesager este modificat pentru a duce la formarea ARN-ului mesager matur ARN-ul ribozomal este un constituient principal al ribozomilor, structuri celulare la nivelul cărora se realizează sinteza proteinelor. ARN-ul ribozomal este sintetizat prin transcripția genelor corespunzătoare situate în anumite regiuni ale cromozomilor numite organizatori nucleolari. ARN-ul de transport (notat ARNt) este un ARN scurt, de 75-100 nucleotide, cu o structură terțiară „în treflă” (cu patru regiuni scurte dublu catenare și trei bucle) ce fixează un anumit aminoacid si care are o regiune specifică de trei nucleotide numită anticodon. Acest ARN fixează un aminoacid pe care îl transportă și în poziționează în dreptul unui codon (prin complementaritatea codon (de pe molecula de ARNm) – anticodon (de pe molecula de ARNt) în cursul procesului de translație.

SINTEZA PROTEINELOR

ARN (acidul ribonucleic) SINTEZA PROTEINELOR

aminoacizi ARNt

Ribozom

ARNm

Codon

Anticodon

5’ 3’

LP

LP : Legături peptidice

SINTEZA PROTEINELOR

3’ — AAG — 5’

Buclă destinată legării la aminoacid

Buclă de fixare la ribozom

Situs de legare a aminoacidului specific

• Buclă anticodon • Parte specifică fiecărei mulecule

de ARNt (restul moleculei este comună la toate ARNt)

A C C

Baze neobişnuite împiedică legarea, creând bucle

SINTEZA PROTEINELOR ARN de transfer


• Este produs prin transcripţie şi migrează în citosol • Aproximativ 80 nucleotide cu structură secundară complexă • Fiecare buclă joacă un rol distinct • Fiecare ARNt este specific unui anumit aminoacid, pe care îl transportă la ribozom. Odată eliberată, molecula de ARNt se leagă de alt aminoacid. • Aproximativ 45 tipuri de ARNt sunt suficiente •Pentru 61 de codoni, datorită “relaxării” regulilor •De complementaritate

A

G

În poziţia 3, U se poate lega de A sau de G În poziţia 3, Inozina

(bază neobişnuită) se poate lega de A, U sau G

1. Se leagă la aminoacidul specific (anticodonului) Cu ajutorul enzimei: aminoacil- ARNt sintetaza şi cu energie de la ATP. Pentru 20 de aminoacizi, există în celulă 20 de enzime specifice, câte una pentru fiecare aminoacid.

2. Transportă aminoacidul la ribozom Datorită asocierii anticodonului cu codonul echivalent din ARNm (complementaritate !)

ENZIMA

ARNt legat la aminoacidul specific

ARNt

a.a.

Eliberare AMP din ATP

Aminoacid «activat»

Două roluri ale ARNt

Ribozom procariot 70S

Subunitate mare 50S : 2 filamente ARNr şi 31 proteine Subunitate mică 30S : 1 filament ARNr şi 21 proteine

Ribozom eucariot 80S

Subunitate mare 60S : 3 filamente ARNr şi 50 proteine Subunitate mică 40S : 1 filament ARNr şi 33 proteine

S : constantă de sedimentare, reflectă masa ARNr

3 filamente ARNr

Polipeptid pe cale de a fi sintetizat

ARNm

Subunitate mică

Subunitate mare

SINTEZA PROTEINELOR Ribozomul

Două subunităţi ribonucleoproteice (1/3proteine + 2/3ARNr) ARNr produs prin transcripţie, apoi maturat Asamblajul subunităţilor se face în nucleu, apoi sunt exportate Asamblajul ribozomului se face pe o moleculă ARNm

E P A

Situs M Fixează ARNm la începutul traducerii

Situs P Reţine ARNt legat de polipeptidul pe cale de a fi sintetizat

Situs A Reţine ARNt care tocmai soseşte Situs E

Permite ieşirea ARNt care şi-a încheiat misiunea

Polipeptid în formare

Aminoacid Legătură peptidică

M

SINTEZA PROTEINELOR

Ribozomul conţine mai multe situsuri de fixare pentru partenerii săi

5’ 3’

ARNm

5’ 3’

Site E

Site P

UUU AAA

CCC

3’

H H | | N —C — RX | C = O | O

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Site A

Polipeptid

H RX H RX H H H H I I I I I I I I H— N— C— C— N— C— C— N— C — C — N— C— C I II I II I II I II H O H O RX O RX O

3’ 5’

AGC

3’

H H | | HN — C — RX | C = O | O

AGC

5’

H H | | H N — C — RX | C = O | O

3’

UCG

SINTEZA PROTEINELOR Rolurile ribozomului : 1. Aduce în apropiere (plasează în context conformațional ARNm și ARNt 2. Plasează următorul aminoacid în sensul corect: gruparea amino în proximitatea

grupării carboxil a catenei polipeptidice deja existente. 3. Catalizează legăturile peptidice ce se vor forma între aminoacizii ce se adaugă

unii după alții în polipeptid

SINTEZA PROTEINELOR Translația (Traducerea) reprezintă “transformarea” codonilor ARNm în catenă

polipeptidică.

Necesită participarea a numeroși factori proteici și a ARNm, ARNt, ARNr.

Consumă energie provenind de la GTP (guanozin trifosfat).

Necesită activitatea catalitică a ARNr.

ETAPELE TRANSLAȚIEI:

1. Inițierea : etapa cea mai lungă și mai complexă, necesită asamblarea tuturor

participanților și identificarea codonului START.

2. Elongarea : ciclică, la fiecare ciclu este citit un codon pe ARNm și este

adăugat aminoacidul corespunzător la catena polipeptidică.

3. Terminarea : Atunci când este citit un codon STOP, toți actorii translației

sunt eliberați, precum și produsul rezultat, catena polipeptidică.

3’

O H O I C — NH — C — C I H R O

Grupare formil

Situs «M»

Metionină

Rezumat: 1. ARNt inițiator purtător de Metionină

formilată se instalează pe subunitatea mică a ribozomului.

2. Subunitatea mică fixează ARNm la nivelul situsului «M», apoi scanează ARNm (regiunea 5’-UTR) ]n căutarea codonului Start «CD», echivalent metioninei

3. ARNt inițiator se leagă la codonul start AUG, prin anticodonul echivalent (CAU !!!). La acest moment este generat situsul «P», metionina fiind primul aminoacid N-ter al proteinei.

4. Subunitatea mare a ribozomului se fixează datorită energiei degajate prin hidroliza GTP.

CD

ARNt inițiator

GTP GDP

Ribozom

Situs P

E A

F• Met— ARNt

Anticodon

INIȚIEREA

2 GTP

Legătură peptidică

2 GDP

A E

A

Noul aa este incorporat C-ter

P

GTP

GDP

P E

Durata : ± 0,1 sec Ribozomul și ARNm se deplasează în sensuri contrare

Începutul unui nou ciclu 5’ 3’

← ARNm Ribozom →

P A E

A P E

Recunoașterea unui codon Un aa•ARNt se adaugă la situsul A.

1

Legătură peptidică Legătura se formează între aa nou venit și catena polipeptidică în fomare. Transfer al catenei de la situsul P la ARNt din situsul A, astfel aa devine C-ter. Catalizat de ARNr.

2

Translocarea Catena, împreună cu ARNt (ultimul venit) trece din A în P. A rămâne astfel liber. ARNt din situsul P, rămas fără catenă, trece în situsul E (exit), după care părăsește ribozomul.

3

ELONGAREA

E P A

Codon STOP UAG, UAA ou UGA

Factor de terminare

A P

Ribozomul citește un codon STOP. Un factor proteic de terminare se leagă la situsul A.

1 Factorul de terminare hidrolizează legătura dintre polipeptid și ARNt, ambele fiind astfel eliberate.

2 Subunitățile ribozomului se deteșează și ARNm este eliberat.

3

TERMINAREA

SINTEZA PROTEINELOR ARNm, ARNt și ARNr servesc de mai multe ori până a fi degradate.

ARNt și ribozomii sunt aproape identici la toate eucariotele.

ARNm diferă de la o specie la alta, și de la o genă la alta, permițând

producerea de proteine specifice.

O moleculă de ARNm este tradusă simultan de mai mulți ribozomi, generând un

poliribozom sau polizom, generator de mai multe proteine simultan.

ARNm Ribozomi

Sinteza oricărui polipeptid începe la nivelul unui ribozom liber, în citoplasmă, însă finalitatea procesului depinde de identificarea, N-terminal la proteine, a unei eventuale secvențe «semnal».

În absența secvenței «semnal» sinteza proteinei are loc până la capăt în citoplasmă

1. Sinteza se întrerupe.

2. Ribozomul se leagă de membranele externe ale reticulului endomplasmic (rugos).

3. Sinteza este reluată.

SINTEZA PROTEINELOR

În prezența Secvenței «semnal»

Proteine fabricate în ribozomii liberi din citosol

Proteine care se dizolvă în citosol, unde își îndeplinesc funcțiile, sau se dirijează către organite ce nu fac parte din rețeaua intracelulară de membrane: peroxizomi, cloroplaste, mitocondrii.

Proteine fabricate în ribozomi legați la membrane

Proteine aparținând rețelei intracelulare de membrane: membrana nucleară, RE, complex Golgi, lizozomi, vacuole, membrana celulară, precum și proteine ce vor fi secretate în afara celulei.

SINTEZA PROTEINELOR

medmol

Documents