REZUMAT

Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar a Banatului Timioara

Facultatea de Zootehnie i Biotehnologii

Doctorand:Ing. Ivan (Boleman) Alexandra

REZUMAT TEZ DE DOCTORATESTIMAREA VIABILITII EMBRIONILOR DE MAMIFERE DUP CRITERII MORFOLOGICE I TESTE DE COLORAREConductor tiinific:

Prof. Dr. Ing. Pcal Nicolae

2009

REZUMAT

Dezvoltarea embrionilor preimplantaionali depinde de o serie de factori de origine matern, dar i de origine embrionar. Embrionii n stadii timpurii de dezvoltare pot crete i se pot diferenia in vitro n absena factorilor endogeni care stimuleaz dezvoltarea acestora, ns manifest adesea heterogenitate n parcurgerea stadiilor de dezvoltare, concomitent cu o variabilitate a competenei de dezvoltare, necesitnd pentru dezvoltare un timp mai ndelungat i, cel mai frecvent, manifest, ca rspuns la condiiile de cultur suboptime, un numr mai redus de celule, comparativ cu embrionii dezvoltai in vivo.

Metodele de examinare a embrionilor au suferit schimbri semnificative n ultimii 20 de ani. Criteriile morfologice de apreciere a calitii embrionilor au fost dezvoltate, astfel nct, s creasc probabilitatea de selecie a embrionilor api pentru transfer. n prezent, la bovine, transferul unui singur embrion n ziua a 3-a de la fecundaie, asigur o rat de gestaie de 10-30%, iar pentru un embrion n stadiul de blastocist se apreciaz o rat de implantare de 40-60% (Mendoza, 2005). mbuntirea ratelor de gestaie este strns legat de creterea preciziei de estimare i selecie a embrionilor.

Teza de doctorat intitulat ESTIMAREA VIABILITII EMBRIONILOR DE MAMIFERE DUP CRITERII MORFOLOGICE I TESTE DE COLORARE elaborat de doctoranda Ing. Ivan (cs. Boleman) Alexandra, sub ndrumarea domnului Prof. Dr. Ing. Nicolae Pcal, este compus din dou pri, structurate pe 8 capitole, la care s-au adugat concluziile generale i recomandrile. Teza cuprinde 203 de pagini din care prima parte (Studiul bibliografic) se ntinde pe 59 de pagini, iar partea a doua (Cercetrii proprii) cuprinde 144 de pagini.

Partea I a tezei, Studiul bibliografic, cuprinde 3 capitole, structurate astfel:

n capitolul I, intitulat Fecundaia i stadiile dezvoltrii preimplantaionale a embrionilor de mamifere, au fost prezentate stadiile parcurse n dezvoltarea preimplantaional a embrionilor de mamifere.n capitolul II, intitulat Mecanisme i semnale implicate n dezvoltarea preimplantaional a embrionilor de mamifere, au fost prezentate principalele mecanisme i semnale implicate n dezvoltarea preimplantaional a embrionilor de mamifere.n capitolul III, intitulat Criterii morfologice i teste de colorare pentru evaluarea calitii embrionilor preimplantaionali de mamifere, au fost prezentate diferite sisteme de evaluarea a calitii embrionilor de mamifere dup criterii morfologice i teste de colorare.

n Partea a II-a a tezei, intitulat Cercetri proprii, am prezentat scopul lucrrii, modelul experimental parcurs pentru atingerea obiectivelor propuse, modul de realizare al experimentelor, rezultatele i discuiile desprinse n urma cercetrilor efectuate.

Scopul lucrrii a fost de a testa o serie de metode de evaluare a calitii i viabilitii embrionilor de mamifere, n vederea selectrii celei mai obiective, expeditive i rentabile metode i introducerea ulterioar a acesteia n lucrrile practice efectuate n cadrul Laboratorului de Embriotransfer i biotehnologii asociate embrionului i n practica transferului de embrioni la speciile de interes zootehnic.

n vederea realizrii obiectivelor propuse au fost parcurse o serie de etape de lucru dup cum urmeaz:

1. Obinerea de embrioni. Pentru realizarea experimentelor am folosit embrioni de oarece (n majoritatea cazurilor) obinui in vivo i embrioni de suine produi prin fecundaie in vitro.2. Aprecierea calitii embrionilor dup criterii morfologice i realizarea de msurtori morfometrice n vederea stabilirii unei legturi ntre calitatea embrionilor i anumii parametrii morfologici cum ar fi: diametrul embrionului, grosimea zonei pelucide, diametrul blastomerelor;

Alctuirea unor grupuri de embrioni i testarea viabilitii acestora prin teste de colorare. Pentru aceast etap am folosit 5 teste de viabilitate, pe baz de colorani vitali:

Metoda de colorare cu Trypan blue;

Metoda de colorare cu Neutral red;

Metoda de colorare cu Diacetat de fluorescein;

Metoda de colorare cu Iodur de propidiu;

Metoda de colorare cu Diacetat de fluorescein i Iodur de propidiu.

3. Testarea viabilitii i a capacitii de dezvoltare n cultur a embrionilor de oarece. Pentru aceast etap s-au cultivat embrioni de oarece, n stadii timpurii de dezvoltare (2, 4 i 8 celule), n cteva variante de medii de cultur: mediul KSOM, mediul M16, mediul Hams Nutrient mixture 12 suplimentat cu 4% BSA (albumin seric bovin) i pe mediul Hams Nutrient mixture 12 fr BSA. Observarea evoluiei embrionilor s-a fcut pe o perioad de 72 de ore, interval n care s-au apreciat stadiile de dezvoltare ale acestora.

4. Testarea viabilitii i a capacitii de dezvoltare n cultur a embrionilor de oarece supui testelor de viabilitate cu Trypan blue, Neutral red, Diacetat de fluorescein i Iodur de propidiu. Embrionii de oarece, supui protocoalelor de lucru specifice testelor de viabilitate amintite, au fost cultivai timp de 48 de ore n mediu de cultur adecvat (mediul M16). Evaluarea viabilitii embrionilor s-a fcut n funcie de capacitatea de dezvoltare a acestora n cultur, ulterior aplicrii testului de viabilitate.

5. ncercri de producere in vitro a embrionilor de suine i evaluarea capacitii de dezvoltare a acestora n cultur. Pentru producerea in vitro a embrionilor, am folosit ovocite recoltate din ovare provenite de la scroafe abatorizate. Ovocitele imature au fost maturate i fecundate n laborator prin cultivarea pe medii specifice i cultivate timp de 7 zile pe mediul de cultur SOF. Evaluarea maturrii ovocitelor s-a fcut microscopic prin aprecierea gradului de dezvoltare a celulelor feeder i prin teste de viabilitate: testul de viabilitate cu Trypan blue i Neutral red. Ulterior etapei de fecundaie s-au fcut observaii cu privire la stadiile de dezvoltare atinse de embrionii obinui.

Partea a II-a este alctuit din 5 capitole, dup cum urmeaz:n capitolul IV, intitulat Obinerea in vivo a embrionilor de oarece, au fost prezentate modul de recoltare a embrionilor de oarece, aspecte referitoare la prepararea mediilor de manipulare i cultivare a embrionilor de mamifere i compoziia chimic a acestora i modul de prelucrare a datelor rezultate n urma experimentelor efectuate.n capitolul V, intitulat Stabilirea calitii embrionilor de oarece dup criterii morfologice, am prezentat materialul i metoda de lucru folosit pentru obinerea embrionilor de oarece de la femele cu ciclul normal, comparativ cu femelele supuse tratamentelor de superovulaie i criteriile morfologice folosite pentru evaluarea calitii acestora. n urma recoltrii a 20 de femele donatoare rasa Swiss, cu ciclu normal, s-au obinut 195 de embrioni, n medie 9,751,58 embrioni/femel donatoare. De la femelele supuse la tratamentele de superovulaie (37) au fost obinui 741 de embrioni, n medie 20,582,60 embrioni/femel donatoare.

Cei mai muli embrioni obinui de la femelele cu ciclu normal au fost n stadiul de blastocist (76), n medie 3,800,98 embrionifemel donatoare, valoare uor mai ridicat, comparativ cu numrul de embrioni, n acelai stadiu de dezvoltare, obinui de la femelele superovulate (122), la care media a fost de 2,451,75 embrionifemel donatoare. Diferen apreciat statistic ca semnificativ (testul t, p0,05). La femele supuse tratamentelor de superovulaie, cei mai muli embrioni obinui au fost n stadiul de morul (254), n medie 6,861,76. Compararea statistic a acestora cu embrionii n acelai stadiu de dezvoltare, obinui de la femelele recoltate pe ciclu normal (67), n medie 3,351,15, a indicat diferene foarte semnificative statistic (testul t, p 0,001).

n urma aprecierii calitii embrionilor pe baza criteriilor morfologice i ncadrrii acestora n coduri de calitate s-a observat c cei mai muli embrioni obinui (45,12%) de la femele recoltate pe ciclu normal au avut o calitate bun (codul de calitate 2), n medie de 4,402,63 embrionifemel donatoare. n ceea ce privete embrionii obinui de la femelele supuse tratamentelor de superovulaie, cei mai muli embrioni recoltai (39,27%) au fost apreciai ca avnd o calitate satisfctoare (codul 3), n medie de 7,861,83 embrionifemel donatoare.

Conform datelor obinute, tratamentele de superovulaie permit obinerea unui numr de embrioni considerabil mai mare, comparativ cu numrul de embrioni obinui de la femelele recoltate pe ciclu normal ns, adesea, o proporie considerabil dintre embrionii obinui este ncadrat n codul de calitate 4, cu o calitate slab i foarte slab.

n capitolul VI, intitulat Aprecierea viabilitii embrionilor de mamifere prin teste de viabilitate, am evaluat viabilitatea embrionilor de mamifere prin diferite metode de colorare. Metodele utilizate au testat att capacitatea celulelor de a exclude anumii colorani cum sunt: Trypan bule sau Iodura de propidiu, ct i de a ncorpora i de a transforma anumii colorani, ca de exemplu Neutral red i Diacetatul de fluorescein.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilitii embrionilor de oarece dup metoda cu Trypan bluen cadrul primei grupe experimentale (Trypan blue 0,1 g/ml n mediu PBS) procentul de viabilitate al embrionilor a fost de 100%. La aceiai grup experimental, pe baza criteriilor morfologice, 40% dintre embrioni au fost evaluai ca fiind de calitate slab i foarte slab (codul 4). Diferen asigurat statistic ca foarte semnificativ (testul 2; p 0,001).

n cadrul celei de a 2-a grupe experimentale (Trypan blue 0,4 g/ml n mediu PBS) au fost constate diferene foarte semnificative statistic ntre procentul de embrioni viabili (97,77%) i cel al celor neviabili (2,23%). Pe baza criteriilor morfologice, 28,88% dintre embrioni au fost ncadrai n codul de calitate 4. Diferen asigurat statistic ca foarte semnificativ (testul 2; p 0,001).

n grupa a 3-a, dup aplicarea testului de colorare (Trypan blue 0,1 g/ml n mediu M2), proporia de embrioni viabili a fost de 92,30% i 7,69% pentru embrionii neviabili. Pe baza criteriilor morfologice, 34,61% dintre embrioni au fost ncadrai n codul de calitate 4. Diferenele au fost asigurate statistic ca foarte semnificative (test 2, p 0,001).

Pentru cea de a 4-a grup experimental (Trypan blue 0,4 g/ml n mediu M2), au fost de asemenea observate diferene foarte semnificative statistic ntre procentul de embrioni viabili (90,62%) i cel al celor neviabili (9,37%). Pe baza criteriilor morfologice, procentul de embrioni de calitate slab i foarte slab (codul 4) a fost de 56,25% (test 2, p 0,001).

n cadrul grupei a 5-a din experiment (Trypan blue 0,4%), au fost observate diferene foarte semnificative n ceea ce privete procentul de embrioni viabili (96,55%) i cel al celor neviabili (3,44%). Aprecierea calitii embrionilor pe baza criteriilor morfologice a indicat un procent de 34,48% de embrioni de calitate slab i foarte slab (codul 4) (test 2, p 0,001).

ntre cele 5 grupe experimentale, dup aplicarea testului de colorare cu Trypan blue, nu au existat diferene semnificative din punct de vedere statistic (test 2, p>0,05), n ceea ce privete procentele de embrioni apreciai ca viabili i cei neviabili.

Calculul coeficientului de corelaie simpl a lui Pearson a indicat o corelaie liniar pozitiv puternic (r = 0,914) ntre procentele de embrioni viabili, evaluai prin testul de viabilitate cu Trypan blue, i a celor ncadrai n codurile de calitate 1, 2 i 3. n cazul embrionilor evaluai ca neviabili s-a observat o tendin de scdere a corelaiei dintre procentul de embrioni evaluai ca neviabili i a celor ncadrai n codul de calitate 4 (r = 0,513).

Evaluarea viabilitii embrionilor de oarece pe baza criteriilor morfologice, comparativ cu testul de colorare cu Trypan blue, a indicat diferene foarte semnificative n ceea ce privete proporia de embrioni de calitate slab, neviabili. n urma aplicrii testului de colorare cu Trypan blue am observat c ptrunderea colorantului n embrionii de calitate slab, cu grad avansat de fragmentare, s-a fcut diferit. Numrul embrionilor evaluai ca neviabili prin aceast metod a fost mult redus, comparativ cu numrul de embrioni evaluai ca nesatisfctori pe baza criteriilor morfologice. Acest lucru considerm c se datoreaz faptului c testul de colorare cu Trypan blue testeaz integritatea membranei celulare, iar n cazul embrionilor de calitate slab, dei a avut loc fragmentarea blastomerelor, zona pelucid a rmas intact o perioad mai ndelungat i nu a permis ptrunderea colorantului n celul.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilitii embrionilor de oarece dup metoda cu Neutral redPentru evaluarea viabilitii cu testul cu Neutral red am folosit 4 soluii de colorare, de concentraii diferite: 1%, 2%, 0,5% i 0,1%. Procentele de embrioni viabili, observate n urma aplicrii testului de colorare cu Neutral red, au fost ridicate la toate cele patru concentraii folosite. Valorile maxime au fost obinute pentru concentraia de 1% NR (94,11%) i, respectiv, 2% NR (93,02%). n urma comparrii statistice a rezultatelor obinute la cele 4 grupe experimentale, diferenele au fost nesemnificative (testul 2 p>0,05).

La utilizarea n concentraii mici a colorantului (0,1% i 0,5%), nu s-au observat diferene n ceea ce privete gradul de penetrare a membranei celulare nici n cazul ovocitelor, nici al embrionilor testai. Neutral red este un colorant foarte puternic penetrant pentru membranele celulare fapt pentru care, utilizarea unor concentraii ridicate de colorant, nu se justific (1 - 2%).

Aplicarea coeficientului de corelaie simpl a lui Pearson a indicat o corelaie liniar foarte puternic (r = 0,988) ntre procentele de embrioni viabili, evaluai prin testul de colorare cu Neutral red, i a celor ncadrai n codurile de calitate 1, 2 i 3. n cazul embrionilor evaluai ca neviabili i cel al embrionilor ncadrai n codul de calitate 4, corelaia a fost mult mai sczut (r = 0,239).

Acumularea intracelular a colorantului are loc, n cantiti mai reduse, i n cazul embrionilor de calitate slab, cu diferite grade de fragmentare. Acest lucru poate conduce la erori n procesul de evaluarea i crete subiectivitatea acestui test n evaluarea viabilitii embrionilor.

Neutral red este un colorant cationic capabil de a penetra cu uurin membranele celulare i de a se acumula la nivelul lizozomilor. Studii recente au evideniat faptul c, alturi de modificrile produse la nivel mitocondrial, modificarea permeabilitii membranei lizozomale reprezint un eveniment declanator al apoptozei celulare (Wei Chen, et al., 2005). Pe baza acestor considerente, capacitatea de legarea a colorantului Neutral red la membrana lizozomal scade n embrionii cu grad foarte avansat de fragmentare. Cantitatea de colorant acumulat n embrionii nesatisfctori, dei redus comparativ cu cea acumulat n embrionii cu blastomere nefragmentate, poate induce erori de evaluare a viabilitii, ceea ce crete subiectivitatea acestei metode.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilitii embrionilor de oarece dup metoda cu Diacetat de fluoresceinPe baza criteriilor morfologice, din cei 37 de embrioni testai, 18 (64,8%) dintre acetia au fost evaluai ca slabi/foarte slabi, iar n urma testului de viabilitate cu Diacetat de fluorescein 15 embrioni (35,2%) au fost evaluai ca neviabili. Diferen asigurat statistic i interpretat ca distinct semnificativ (test 2, p 0,01).

Aplicarea testului cu Diacetat de fluorescein a indicat activitate enzimatic i n embrionii cu grad avansat de fragmentare care, conform metodei dup criterii morfologice, au fost ncadrai n codul de calitate 4, cu o calitate slab i foarte slab. Testul de viabilitate cu Diacetat de fluorescein pentru testarea activitii esterazice din celule este simplu, rapid i poate fi folosit cu eficien pentru testarea activitii enzimatice a celulelor i, totodat, a integritii membranei celulare.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilitii embrionilor de oarece dup metoda cu Iodur de propidiuPrin metoda cu Iodur de propidiu au fost evaluai 53 de embrioni, mprii n 2 grupe experimentale (Iodur de propidiu 50 l/ml mediu PBS i Iodur de propidiu 50 l/ml mediu M2).

Pentru prima grup experimental, la care s-a testat viabilitatea embrionilor cu soluia Iodur de propidiu 50 l/ml mediu PBS, procentul de embrioni viabili a fost de 82,14%, iar a celor neviabili a fost de 17,86%. Diferena a fost estimat ca foarte semnificativ (testul 2, p 0,001). Pentru grupa a doua, din cadrul experimentului (Iodur de propidiu 50 l/ml mediu M2), procentul de embrioni viabili a fost de 80%, iar a celor neviabili a fost de 20%. Diferena a fost estimat ca foarte semnificativ (testul 2, p 0,001).

Aplicarea coeficientului de corelaie a lui Pearson a indicat o corelaie foarte strns (r = 0,989) ntre cele dou metode utilizate pentru evaluarea calitii i viabilitii embrionilor de oarece, ceea ce sugereaz utilizarea testului de colorare cu Iodur de propidiu ca o metod obiectiv pentru evaluarea viabilitii embrionilor.

n urma testelor efectuate nu au existat diferene semnificative din punct de vedere statistic (test 2, p>0,05) ntre grupele experimentale, ceea ce indic faptul c solvenii folosii pentru prepararea soluiei de colorare (mediul PBS grupa 1 i mediu M2 grupa 2 ) nu influeneaz semnificativ rezultatele, alegerea acestuia rmnnd un considerent economic.

Acest test de viabilitate permite marcarea celulelor cu membrana celular deteriorat i n care nu mai este prezent activitate metabolic. Testul de viabilitate cu Iodur de propidiu este un test rapid, protocolul de lucru este simplu i neinvaziv pentru celulele viabile n interiorul crora Iodura de propidiu nu poate ptrunde. Legarea selectiv, doar la nivelul nucleului celulelor n care nu mai este prezent activitate metabolic, indic testul de viabilitate cu Iodur de propidiu, ca fiind obiectiv i neinvaziv. Acesta se poate utiliza pentru testarea viabilitii embrionilor de mamifere, fr a ridica probleme asociate cu toxicitatea la nivel celular, datorat acumulrii i incapacitii de metabolizare a substanelor de marcare utilizate.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilitii embrionilor de oarece dup metoda cu Diacetat de fluorescein i Iodur de propidiuPentru evaluarea viabilitii embrionilor prin testul cu Diacetat de fluorescein i Iodur de propidiu am utilizat un amestec al celor doi colorani care s ne permit marcarea simultan att a celulelor viabile ct i a celor neviabile. Embrionii considerai viabili au emis fluorescen verzuie la expunerea la o surs de fluorescen cu o lungime de und de 494-518 nm, lungime de und corespunztoare spectrului de absorbie pentru fluorescein i cei considerai neviabili au emis fluorescen roie, la expunerea la o surs de fluorescen cu o lungime de und de 515-560 nm, corespunztoare pentru Iodura de propidiu.

n urma aplicrii testului de viabilitate cu Diacetat de fluorescein i Iodur de propidiu din cei 28 de embrioni evaluai, 25 (86,22%) au fost apreciai ca fiind viabili (au emis fluorescen verzuie la expunerea la o surs de fluorescen cu o lungime de und de 494-518 nm) i 4 (13,79%) au fost apreciai ca fiind neviabili (au emis fluorescen roie la expunerea la o surs de fluorescen cu o lungime de und de 515-560 nm).

Compararea statistic a datelor obinute a indicat diferene foarte semnificative (testul 2, p 0,001) ntre procentul de embrioni viabili i cel al embrionilor apreciai ca fiind neviabili. Imaginile 6,36; 6,37; 6,38; 6,39 indic avantajele folosirii, n paralel, a celor doi colorani (Diacetat de fluorescein i Iodur de propidiu) pentru testarea viabilitii embrionilor. Totodat, ele evideniaz neajunsurile tehnicii de evaluare a viabilitii embrionilor pe baza criteriilor morfologice. Evaluarea viabilitii embrionilor doar pe baza criteriilor morfologice nu ofer informaii cu privire la prezena activitii enzimatice i metabolice n celule.

Dei, din aceste puncte de vedere, folosirea testelor de viabilitate pe baz de colorani, capabili s marcheze prezena sau absena n celule a activitii metabolice, pare a fi mai obiectiv. Coloranii ridic totui problema toxicitii la nivel celular.

n capitolul VII, intitulat Determinarea viabilitii embrionilor de oarece prin cultivarea in vitro pe termen scurt, am urmrit modul de dezvoltare n cultur al embrionilor de oarece supui colorrii cu colorani vitali i modul de dezvoltare a embrionilor de oarece pe diferite medii de cultur (M 16, KSOM, HAM F 12 suplimentat cu 4% BSA i HAM F12 fr BSA). Cu embrionii care s-au dezvoltata pn n stadiul de morul i blastocist au fost efectuate cteva msurtori morfometrice (grosimea zonei pelucide, diametrul interior i exterior, perimetrul interior i exterior al embrionului).

Rezultate referitoare la aprecierea dezvoltrii in vitro a embrionilor de oarece supui testelor de colorare pentru evaluarea viabilitii i calitii acestoraMetodele de colorare, dei se doresc a fi neinvazive pentru embrioni, folosesc anumii colorani care au capacitatea de a penetra zona pelucid i de a ajunge n interiorul embrionilor unde fie se acumuleaz, fie intr n diferite ci metabolice i sufer diferite transformri (Diacetatul de fluorescein este hidrolizat sub aciunea esterazelor celulare la fluorescein). Cultivarea embrionilor s-a fcut pe o perioad de 48 de ore.

Dup 24 de ore de cultivare in vitro pe mediu M 16, la toate variantele experimentale a fost atins stadiul de morul. Diferenele procentuale ntre proporia de embrioni care au evoluat pn n stadiul de morul au fost asigurate statistic ca fiind distinct semnificative (testul 2 , p 0,01), 56,66% pentru grupul control, 21,73% pentru grupul tratat cu FDA i Pi, 19,04% pentru grupul testat cu Neutral red i 16,66% pentru grupul testat cu Trypan blue.

Dup 48 de ore de cultivare, procentul de embrioni care au continuat dezvoltarea a fost redus, fa de proporia de embrioni retardai (test 2, p 0,001). Doar la grupul control au fost embrionii au evoluat pn n stadiul de eclozare (13,33%). La restul grupelor experimentale, embrionii i-au continuat dezvoltarea pn n stadiul de blastocist expandat (FDA i Pi - 4,34% i NR 4,76%), blastocist propriu-zis (FDA i Pi - 13,04% respectiv 4,76% pentru grupul tratat cu Neutral red) i morul compact (4,76% pentru grupul tratat cu Neutral red).

n urma cultivrii s-a putut observa c i embrionii expui colorrii cu Neutral red au fost capabili s evolueze n dezvoltare pn n stadiu de blastocist expandat (4,76%). Aceste rezultate, indic capacitatea celulelor de a metaboliza colorani folosii. Dei, procentul de embrioni retardai a fost mare pentru ambele teste folosite (FDA i Pi 73,91%, respectiv 80,95% pentru testul cu Neutral red) totui nu au fost semnificative statistic (p>0,05), fa de procentul de embrioni observai ca retardai n grupul de control.

Surprinztor a fost procentul de embrioni retardai, observat la grupul de embrioni testai cu Trypan blue (87,55%), comparativ cu procentul de embrioni retardai observat la grupul de control (56,68%). Diferen asigurat statistic ca semnificativ (p0,05).

Embrionii care au reuit s se dezvolte pn n stadiul de blastocist, indic faptul c acetia sunt capabili s metabolizeze coloranii (Diacetatul de fluorescein i Neutral red) dar, procentul mare de embrioni ntrziai indic o oarecare ncetinire pn la blocarea capacitii de dezvoltare a acestoara.

Rezultate referitoare la evaluarea viabilitii embrionilor de oarece prin cultivarea in vitro pe durat scurt de timp

Capacitatea de dezvoltare a embrionilor, pe parcursul cultivrii in vitro, a variat foarte mult, ntre cele 4 variante experimentale (M 16, KSOM, HAM F 12 suplimentat cu 4% BSA i HAM F12 fr BSA). La 24 de ore de cultivare, dou dintre variantele experimentale folosite s-au detaat: mediul Nutrient mixture Ham F 12, suplimentat cu BSA, n care 19,14% dintre embrioni au fost n stadiul de blastocist incipient, respectiv 8,51% embrioni n acelai stadiu de dezvoltare n mediul M 16.

Dup 48 de ore de cultivare, la 3 dintre variantele experimentale (KSOM, M16 i Ham F 12 cu 4% BSA) s-au observat diferene foarte semnificative statistic (test 2 , p 0,001) ntre embrionii n stadiul de blastocist expandat. Procentul cel mai mare de embrioni n stadiul de blastocist expandat a fost observat n mediul M 16 (34,02%), iar cel mai mic n mediul HAM F 12 cu 4% BSA (6,38%).

Dup 72 de ore de cultivare, mediul M16 a fost singurul mediu n care 14,90% dintre embrioni au atins stadiul de blastocist eclozat.

La ambele variante de mediu Nutrient mixture Ham F12 (suplimentat cu 4% BSA, respectiv fr BSA), dup 72 de ore de cultivare, toi embrionii obinui au fost ncadrai ca retardai sau degenerai. Proporii ridicate de embrioni degenerai au fost observate i la mediul KSOM (63,04%). ntre mediul KSOM i HAM F 12, suplimentat cu 4% BSA, nu au fost observate diferene semnificative statistic (test 2 , p>0,05), n ceea ce privete proporia de embrioni retardai, respectiv degenerai.

Rezultate referitoare la efectuarea de msurtori morfometrice pe embrionii de oarece obinui in vivo i supui cultivrii ulterior evalurii viabilitii acestora prin teste de viabilitate

Parametrii urmrii n cadrul experimentelor realizate au fost: grosimea zonei pelucide, diametrul interior i exterior al embrionului, perimetrul interior i exterior al embrionului. Determinarea parametrilor s-a realizat cu ajutorul softului Quick Photo Micro 2.2.

La embrionii supui cultivrii in vitro s-a observat o tendin de cretere a valorilor parametrilor urmrii. Grosimea zonei pelucide a variat de la 9,81,7 m la embrionii n stadiul de morul recoltai la 72 de ore de la observarea dopului vaginal, pn la 11,11 m, la embrionii cultivai in vitro i supui colorrii, cu colorani vitali. Diferena fiind nesemnificativ statistic (p>0,05). O variaie asemntoare se poate observa i la ceilali parametrii studiai: diametrul interior (de la 98,43,3 m, la 111,63,2 m,) i exterior al embrionului (de la 116,72,5 m, la 129,44,8 m), perimetrul interior (de la 3020,5 m, la 3380,4 m) i perimetrul exterior (de la 3520,8 m, la 3910,4 m). Aceleai diferene se observ i n cazul embrionilor n stadiul de blastocist (6,20,5 m la embrionii recoltai n stadiul de blastocist la 72 de ore de la observarea dopului vaginal i 8,71 m la embrionii supui testelor de colorare anterior cultivrii).

Valorile obinute la msurarea parametrilor embrionilor cultivai in vitro, fr a fi supui colorrii n vederea evalurii viabilitii, au fost uor mai ridicate, comparativ cu valorile observate la embrionii obinui in vivo, recoltai la 72 de ore de la observarea dopului vaginal (10,81,2 m la embrionii cultivai in vitro respectiv 9,81,7 m pentru grosimea zonei pelucide a embrionilor recoltai n stadiul de morul la 72 de ore de la observarea dopului vaginal), diferenele nu au fost semnificative statistic (p>0,05).

Embrionii supui testelor de viabilitate au avut valori uor mai ridicate, comparativ cu embrionii cultivai in vitro, fr a fi colorai, ns nu au fost observate diferene semnificative statistic ntre aceste valori (10,81,2 m, respectiv 11,11 m, pentru grosimea zonei pelucide la morulele supuse testelor de viabilitate i 7,31 m, i 8,71 m, pentru embrionii n stadiul de blastocist).

n capitolul VIII, intitulat Evaluarea viabilitii embrionilor produi in vitro, am urmrit evaluarea viabilitii embrionilor de suine produi in vitro pornind de la ovocite recoltate din ovare provenite de la scroafe abatorizate. Protocolul de lucru a inclus maturarea in vitro a ovocitelor, urmat de fecundaia in vitro a acestora i cultivarea in vitro a zigoilor obinui timp de 7 zile pe mediul de cultur SOF (Synthetic oviductal fluid).n urma experimentelor realizate am observat c ovocitele cu cumulus ooforus (COC) se matureaz in vitro ntr-o proporie mai mare (73,68%), comparativ cu ovocitele fr cumulus ooforus (9,67%), diferenele au fost distinct semnificative (p 0,001).

Referitor la ratele de fecundaie in vitro, cei mai muli embrioni s-au obinut din ovocitele cu cumulus ooforus (73,68%), comparativ cu ovocitele fr cumulus (9,67%), diferenele au fost foarte semnificative statistic (p 0,001).

Dup parcurgerea protocolului n vederea fecundaie in vitro, la 72 de ore de cultivare dintre cele 28 de ovocite cu celule cumulare evaluate ca fecundate am obinut 2 embrioni n stadiul de dou celule (7,14%) i 9 embrioni n stadiul de 4 celule (32,14%), 20 dintre ovocite (71,43%) au fost evaluate ca degenerate.

Dup 7 zile de cultivare n mediul SOF, din cele 28 de ovocite cu celule cumulare s-au obinut 2 embrioni n stadiul de morul (7,14%), 3 embrioni n stadiul de 8 celule (10,71%), 5 n stadiul de 4 celule (17,86%), 1 n stadiul de 2 celule (3,57%) i 17 degenerai (60,71%). Compararea statistic a datelor obinute a indicat diferene foarte semnificative ntre numrul de embrioni degenerai i cei aflai n curs de dezvoltare (test 2, p 0,001).

Ratele foarte reduse de dezvoltare a embrionilor indic mediul SOF ca fiind nesatisfctor pentru a asigura cerinele embrionilor de suine produi in vitro aflai n dezvoltare, i determin un procent foarte mare de embrioni degenerai (60,71%).

Rezultate referitoare la aprecierea viabilitii ovcitelor de suine prin colorarea cu Trypan blue i Neutral red

Capacitatea de dezvoltare a ovocitelor include abilitatea acestora de a forma un embrion viabil dup parcurgerea procedeului de fertilizare in vitro. Aceast abilitate este condiionat de maturarea citoplasmatic i nuclear a ovocitei. n condiii naturale, ovocitele prezint o competen ridicat de dezvoltare, dar atunci cnd mediul natural este nlocuit cu un mediu artificial, iar procesul se desfoar n cadru experimental, capacitatea de dezvoltare a ovocitelor scade drastic n ciuda optimizrilor aduse n acest domeniu (Lucid, et al., 2003, Rath et al., 1995, Nimann, et al., 2001).

n urma cultivrii n mediul de maturare pe baza aspectului morfologic, la 46 de ore, 42% dintre ovocitele cultivate n prima variant experimental (TCM IVM suplimentat cu 10% FSB - ser fetal bovin) i 50% dintre ovocitele cultivate n mediu TCM-IVM suplimentat cu 10% FSB i hormonii au fost apreciate ca fiind maturate. Diferena nu a fost semnificativ (Test 2 p>0,05).

n urma aplicrii testului de colorare cu Trypan blue, din totalul de 52 de ovocite cultivate n mediu de maturare TCM-IVM suplimentat cu 10% FSB, 100% au fost apreciate ca fiind viabile (au rmas necolorate dup expunerea la Trypan blue). Acelai procent (100%) a fost observat i pentru ovocitele cultivate pe mediu TCM-IVM, suplimentat cu 10% FSB i hormoni. Diferene foarte semnificative (test 2 , p 0,001) au fost observate ntre proporia de ovocite evaluate ca fiind viabile comparativ cu cele neviabile. Nu au fost observate diferene semnificative (test 2 , p>0,05) ntre rezultatele obinute prin cele dou variante de mediu de maturare.

n urma aplicrii testului de colorare cu Neutral red, din 55 de ovocite cultivate pe mediul TCM-IVM suplimentat cu 10%FSB, 39 (70,90%) au fost evaluate ca fiind viabile, iar 16 (29,10%) au fost evaluate ca fiind neviabile. Compararea statistic a rezultatelor obinute a indicat diferene foarte semnificative (test 2 , p 0,001) ntre procentul de ovocite evaluate ca fiind viabile, comparativ cu procentul de ovocite neviabile.

Dintre cele 24 de ovocite cultivate pe mediul TCM-IVM suplimentat 10% FSB i hormoni, 19 (79,16%) au fost evaluate ca fiind viabile, iar 5 (20,08%) au fost evaluate ca fiind neviabile. Compararea statistic a rezultatelor obinute a indicat diferene foarte semnificative (test 2 , p 0,001) ntre procentul de ovocite evaluate ca fiind viabile, comparativ cu procentul de ovocite neviabile.

Nu au fost observate diferene semnificative (test 2, p>0,05) ntre proporia de ovocite viabile, obinut n mediul suplimentat doar cu 10% FSB (70,90%), comparativ cu proporia de ovocite viabile, obinut n mediul suplimentat cu 10% FSB i hormoni (79,16%).

Concluzii generale

1. Dei aplicarea tratamentelor de superovulaie influeneaz calitatea embrionilor obinui cei mai muli embrioni (39,27%) au fost ncadrai n codul de calitate 3, comparativ cu embrionii obinui de la femelele recoltate pe ciclu normal care au fost ncadrai n codul de calitate 2 (45,12%), totui aplicarea tratamentelor de superovulaie permite obinerea unui numr de embrioni considerabil mai mare, n medie 20,582,60 embrioni/femel donatoare, comparativ cu numrul mediu de embrioni obinui de la femelele recoltate pe ciclu normal 9,751,58 embrioni/femel donatoare.

2. Testul de viabilitate cu Diacetat de fluorescein i Iodur de propidiu poate fi folosit cu succes pentru evaluarea viabilitii embrionilor de oarece. Acesta asigur marcarea simultan a celulelor n care este prezent activitate enzimatic i a celor n care activitatea metabolic a ncetat.

3. n urma testelor efectuate nu au existat diferene semnificative din punct de vedere statistic (test 2, p>0,05) ntre grupele experimentale la care dizolvarea colorantului s-a realizat direct n mediul PBS i mediul M 2, ceea ce indic faptul c solventul folosit pentru prepararea soluiei de colorare nu influeneaz semnificativ rezultatele, alegerea acestuia rmnnd un considerent economic.

4. Referitor la embrionii supui testelor de colorare i cultivai pe durat scurt de timp (48 de ore) n mediul M 16, se observ c procentul de embrioni pornii n dezvoltare scade dup primele ore de cultivare. Astfel, doar la grupul control au fost observai embrioni n stadiul de blastocist eclozat (13,33%). La restul grupelor experimentale embrionii i-au continuat dezvoltarea pn n stadiul de blastocist expandat (FDA i Pi 4,34% i NR 4,76%), blastocist propriu-zis (FDA i Pi - 13,04% respectiv 4,76% pentru grupul tratat cu Neutral red). Diferenele dintre grupele experimentale i lotul martor au fost nesemnificative statistic (p>0,05).

5. n urma aplicrii testelor de viabilitate se poate observa c doar testele cu FDA+Pi i NR au permis dezvoltarea embrionilor pn n stadiul de blastocist expandat (4,34% i respectiv 4,76%). Surprinztor, embrionii supui testrii cu TB i-au oprit dezvoltarea n stadiul de morul (12,5%).

6. Referitor la intervalul de timp n care s-a efectuat cultivarea embrionilor de oarece produi in vivo (24 72 de ore), se observ c o proporie mare din embrionii pornii n dezvoltare n primele ore de cultivare se prezint ca retardai spre sfritul intervalului. La 48 de ore de cultivare in vitro cei mai muli embrioni retardai s-au observat n mediul KSOM (36,95%), iar proporia cea mai redus s-a observat n mediul Nutrient mixture Ham F 12, cu 4% BSA (2,12%). Diferenele au fost apreciate ca foarte semnificative (test 2 , p0,001). La 72 de ore de cultivare, procentele de embrioni degenerai au crescut n mediul KSOM (63,04%), Nutrient mixture Ham F 12, cu 4% BSA (46,80%) i au fost de 100% n mediul Ham F 12, fr BSA.

7. n ceea ce privete mediile de cultivare utilizate pentru cultivarea embrionilor de oarece produi in vivo (KSOM, M 16, Ham F 12 cu 4% BSA i Ham F 12 fr BSA), se observ c mediul M 16 a fost singurul mediu care a susinut dezvoltarea embrionilor pn n stadiul de blastocist eclozat (14,90%). Un numr redus de embrioni au evoluat pn n stadiul de blastocist expandat n mediul KSOM (8,69%) i n mediul Ham F 12 suplimentat cu 4% BSA (6,38%).

8. Cultivarea in vitro a embrionilor de oarece pe medii de cultur sintetice determin creterea uoar a grosimii zonei pelucide. Valorile obinute variaz de la 9,81,7 m, la embrionii n stadiul de morul recoltai la 72 de ore de la observarea dopului vaginal, pn la 11,11 m, la embrionii cultivai in vitro i supui colorrii, cu colorani vitali. Diferenele sunt nesemnificative (p>0,05). 9. Grosimea zonei pelucide, la embrionii supui testelor de viabilitate, a avut valori uor mai ridicate, comparativ cu embrionii cultivai in vitro fr a fi colorai, ns nu au fost observate diferene semnificative statistic ntre aceste valori (p>0,05) (10,81,2 m, respectiv 11,11 m pentru grosimea zonei pelucide la morulele supuse testelor de viabilitate i 7,31 m i 8,71 m pentru embrionii n stadiu de blastocist).

10. Referitor la ratele de fecundaie in vitro, cei mai muli embrioni se obin din ovocitele cu cumulus ooforus (73,68%), comparativ cu ovocitele fr cumulus (9,67%), diferenele sunt foarte semnificative statistic (p 0,001).

11. Ratele foarte reduse de dezvoltare a embrionilor indic mediul SOF ca fiind nesatisfctor pentru a asigura cerinele embrionilor de suine produi in vitro, aflai n dezvoltare, i determin un procent foarte mare de embrioni degenerai (60,71%).

12. Utilizarea testelor de viabilitate (Trypan blue i Neutral red) pentru evaluare viabilitii ovocitelor pot s completeze metoda de evaluare pe baza aspectului morfologic, ns nu o pot nlocui n totalitate. De asemenea, trebuie acordat atenie modului n care capacitatea de dezvoltare i formare a viitorului embrion este afectat de utilizarea coloranilor vitali n stadii incipiente ale procesului de formare.

Recomandri

1. Pentru prepararea soluiei de lucru cu Diacetat de fluorescein recomandm utilizarea acetonei ca solvent, deoarece asigur o dizolvare rapid, n proporie de 90%, a Diacetatului de fluorescein i previne rmnerea n suspensie a colorantului.

2. Pentru evaluarea viabilitii embrionilor de mamifere recomandm utilizarea n paralel a metodei dup criterii morfologice si a testului de viabilitate prin colorare simultan cu Diacetat de fluorescein (FDA) i Iodur de propidiu (Pi), deoarece acesta crete precizia evalurii i permite testare att a celulelor viabile (FDA), ct i celulelor neviabile (Pi).

3. Nu recomandm cultivarea in vitro a embrionilor n medii de cultur simple, complexe i sintetice pe o perioad mai mare de 48 de ore, deoarece dup acest interval s-a observat stagnarea dezvoltrii acestora i apariia proceselor degenerative. De asemenea, n cazul embrionilor supui anterior testelor de colorare, nu recomandm cultivarea pe o perioad mai lung de 24 de ore, deoarece pe lng influena negativ a mediului artificial, utilizarea coloranilor determin scderea viabilitii embrionilor aflai n cultur.

4. n urma rezultatelor observate nu recomandm utilizarea mediului SOF pentru cultivarea embrionilor de suine produi in vitro deoarece, acesta nu poate asigura cerinele embrionilor de suine aflai n dezvoltare i determin un procent mare de embrioni degenerai (60,71%).

5. Pentru procedeele de obinere in vitro a embrionilor de suine recomand utilizarea ovocitelor cu cumulus ooforus a cror rat de producere a embrionilor este de aproximativ 40%. n urma utilizrii ovocitelor fr celule cumulare, n cadrul procedeelor de producere in vitro a embrionilor, se obine un numr redus de embrioni de calitate foarte proast.

PAGE 16