Fuziunea protoplastilor

Pentru a obtine o fuziune eficienta este necesar sa se lucreze cu un numar mare de

protoplasti viabili. Fuziunea este in general indusa prin incubarea intr-o concentratie mare de

PEG (polietilena glicol), o concentratie mare de Ca2+¿ ¿ si un pH relativ crescut. Accest

tratament este necesat pentru a indeparta incarcatura negativa din protoplasti. Ionii PEG si

Ca2+¿ ¿ sunt spalati dupa ce fuziunea a avut loc. Electrofuziunea a devenit populara in ultimii

ani. Zimmermann a anticipat posibilitati mari pentru aceasta tehnica din care rezulta

protoplasti mai viabili decat prin utilizarea de PEG. Kameya (1984) a realizat fuziunea

protoplastilor cu ajutorul dextranului si a stimulilor electrci.

Daca 2 protoplasti diferiti fuzioneaza (provenind de la 2 genotipuri sau specii diferite)

rezulta un heterocarion, iar daca fuzioneaza 2 protoplasti similari se obtine un homocarion.

Dupa ce a avut loc fuziunea celulara, fuziunea nucleara poate sa apara atunci cand nucleii se

divid simultan.

Dupa hibridizarea somatica , cea mai mare problema o reprezinta selectarea hibrizilor

somatici din populatia celulara. Daca de exemplu, fuziunea are loc intre doua tipuri de

protoplasti, A si B, atunci se va obtine o populatie care contine protoplasti nefuzionati A si B ,

homocarionii AA si BB, heterocarionii AB si diversi carioni multipli (fuziuni). Au fost

dezvoltate multe proceduri de selectie pentru a selecta eficient doar heterocarionii AB din

amestec.

Multi hibrizi somatici au fost produsi in ultimii ani, mai ales dintre membrii Familiei

Solanaceae. Faptul ca hibridizarea somatica intre Brassica si Arabidopsis si intre Daucus

carota si Aegopodium podagraria a fost un succes arata ca este posibila chiar si hibridizarea

intergenerica. Acest lucru este foarte interesant din moment ce acesti hibrizi nu pot fi obtinuti

pe cale sexuala. Insa utilitatea practica a acestora este foarte indoielnica deoarece plantele

obtinute sunt sterile.

Hibridizarea somatica este foarte importanta pentru regenerarea plantelor intregi

pornind de la protoplasti. Exemple: Brassica napus, Brassica campestris x Brassica

oleraceae, Medicago tuberosum, Trifolium repens, Daucus carota, Nicotiana sp. si Petunia

sp.

Culturile de protoplasti

Cultura de protoplasti prezinta cerinte specifice, doarece ea consta in: regenerarea

peretelui celular, diviziune celulara, formare de calus si, in final, diferentiere embrionara

si/sau diferentiere de organe. In timpul regenerarii peretelui celular, concentratiile de Ca2+¿ ¿ ar

trebui sa fie ridicate, iar potentialul osmotic (negativ) al mediului de nutritie sa fie scazut, in

timp ce densitatea celulara ( ca si in cazul culturilor celulare in suspensie) joaca un rol

important. Dupa regenerarea peretelui celular (in primele zile), potentialul osmotic (negativ)

al mediului trebuie crescut gradat. Prima diviziune celulara are de obicei loc la 2-7 zile dupa

izolarea protoplastilor.

Cultivarea protoplastilor:

1. Suspensie intr-un strat subtire de mediu lichid intr-o placa Petri.

2. Pe un mediu solid utilizand tehnica Bergmann.

3. In microcamere intre placi de sticla sau suspendate in picaturi.

4. In picaturi de mediul lichid ( metoda micropicaturilor) care sunt plasate intr-o

placa Petri.

5. In “culturi-crese” , in special cand densitatea protoplastilor este mica. Stratul de

alimentare poate fi folosit in locul culturilor-cresa. Aici protoplastii sunt crescuti

pe un strat celular de care sunt separati printr-un celofan sau hartie de filtru.

6. Intr-un strat sau mediu semi-lichid care este pe un mediu solid.

7. In culturi cu discuri de agaroza sau margele de agaroza. \

Cultivarea protoplastilor cu perete celular este foarte similara cu cea a celulelor

individuale, necesitand o atentie speciala pentru compozitia mediul de cultura si a factorilor

de crestere fizici. Protoplastii sunt crescuti in cea mai mare parte la intuneric sau la lumina

foarte slaba. Dupa producerea de microcalusuri, sunt necesare subcultivari pe alte medii

pentru a induce regenerarea.

Regenerarea plantelor

Sansa regenerarii unei plante din protoplasti izolati este relativ mica. Pana in anul

1983 aceasta tehnica era posibila doar la 66 de specii din tre care majoritatea apatniceau

familiei Solanaceae. Gramineele (cu exceptia orezului) sunt foarte dificil de regenerat.

Urmatorii factori determina rata de succes in regenerarea palntelor din protoplasti:

1. Familia, specia si genotipul.

2. Starea de diferentiere a celulelor donatoare; celulele juvenile si cele din meristemul

apica (shoot tips?) au un potential regenerativ mai mare.

3. Starea fiziologica a materialului donator.

4. Folosirea unui mediu de nutritie imbogatit. Formarea de calus din protoplasti

izolati este frecvent indusa pe mediile Kao si Michayuluk, in timp ce formarea de

embrioni si organe este indusa pe mediul B5 la care se adauga 5-10% lapte de

cocos. Mediul Murashige si Skoog este des folosit.

Relevanta hibridizarii somatice

Posibile avantaje ale hibrizilor somatici:

1. Utilizand hibridizarea somatica este posibil sa fie creati hibrizi care nu pot fi obtinuti

din incrucisari normale, datorita barierei taxonomice sau a altor bariere. Un exemplu

interesant il constituie hibridizarea somatica intre Solanum tuberosum (formare de

tuberculi, rezistenta la boli foarte mica sau absenta) cu Solanum brevidens (fara

formare de tuberculi, rezistenta la boli), fapt ce nu ar fi posibil in vivo. Alte exemple:

Brassica oleracea x B. campestris , Medicago sativa x M. falcata . Totusi, ultimele

doua exemple pot fi obinute si pe cale sexuala, insa aceste incrucisari sunt mai greu de

realizat in vivo si depind de genotip.

2. Hibridizarea somatica poate fi folosita ca o alternativa in obtinerea tetraploizilor, daca

tratament cu colchicina nu da rezultate. Hibridizarea somatica este valoroasa doar in

cazul in care metodele normale ale duplicarii prin mitoza sunt imposibile.

3. In principiu, se pot obtine hibrizi de la plante subletale, a caror organe sexuale sunt

anormale sau a caror masculi sunt complet sterili, insa accesti hibrizi pot stoca

caractere recesive nedorite la nivelul materialului genetic.

4. Hibridizarea este posibila intre plante juvenile (ca nu au inflorit) si intre cele deja

inflorite,mature.

5. Hibridizarea partiala da nastere la asa numitii hibrizi asimetrici la care nu toti

cromosomii se combina dupa fuziunea nucleara.

6. In timpul reproducerii sexuale doar cromosomii de la gametul mascul sunt transferati

descendentilor. Prin hibridizare somatica atat gametii femeli cat si cei masculi

transfera nucleul si citoplasma hibrizilor si descendentilor. Prin hibridizare

citoplasmatica, nucleul unuia din partenerii fuziunii ar trebui sa fie eliminat, fie

inaintea fuziunii (prin iradiere) sau dupa fuziune (dupa hibridizarea somatica).

Dezavantaje si probleme ale hibridizarii somatice

1. Lipsa unei metode eficiente de selectie

2. Produsul rezultat in urma hibridizarii somatice este uneori steril, malformat, instabil,

deci nu sunt viabili, in special daca fuziunea a avut loc intre specii taxonomic

indepartate.

3. Dezvoltarea de calusuri chimerice in locul hibrizilor. Acest lucru se datoreaza faptului

ca nucleii nu fuzioneaza dupa ce celulele au fuzionat, si se divid separat. Plantele

regenerate din chimere ulterior is pierd caracteristicile chimerice.

4. Hibridizarea somatica intre doi diploizi duce la formarea unui amfidiploid care este in

general nefavorabila ( cu exceptia formarii intentionate a tetraploizilor). Hibridizarea a

2 protoplasi diploizi este in general recomandata.

5. Plantele regenerate in urma hibridizarii somatice sunt in general foarte variabile, ca

rezultat al:

a. Eliminarii cromosomilor, lucru comun in hibridizarea speciilor taxonomic

diferite pentru ca nucleii sunt incompatibili. Rezulta aneuploizi si cibrizi.

b. Translocatiei

c. Variabilitatii somaclonale

d. Segregarii organitelor.

6. Niciodata nu este sigur ca o anumita caracteristica va fi exprimata dupa hibridizarea

somaclonala.

7. Stabilitate genetica scazuta

8. Numar mic al plantelor regenerate din protoplasti

9. Se presupune ca hibridizarea somatica este posibila in vitro la 2 specii incompatibile

in vivo.

10. Producerea de cibrizi (hibrizi citoplasmatici) nu prea a avut succes. Un exemplu de

succes il constituie hibridizarea intre Nicotiana plumbaginifolia (neiradiata) si

Nicotiana tabacum ( iradiata cu cobalt radioactiv). Nucleul de la N. tabacum este

eliminat, in timp ce citoplasma este transferata noului hibrid.

Fig1. Fuziunea protoplastilor

Fig2. Hibridizare somatica