Protocolul de extractie al ADN-ului genomic

Kitul este destinat izolarii ADN-ului din sange (GA), tesuturi, bacterii etc.Procesul de extractie are la baza 4 etape:

1. Primul pas consta in liza celulelor si a nucleilor pentru obtinerea ADN-ului. In cazul in care este sange, se lizeaza mai intai celulele rosii cu solutie de liza si apoi celulele albe

2. si nucleii lor cu solutia de liza pentru nuclei. Digestia RN-azelor in acest moment este un pas optional inclus pentru cateva aplicatii.

3. proteinele celulare vor fi indepartate prin precipitare cu o sare, dar trebuie sa avem in vedere ca sunt precipitate doar proteinele cu masa moleculara mare.

4. ADN-ul genomic va fi apoi concentrat, iar sarea indepartata din sistem, prin precipitare cu izopropanol.

ADN-ul purificat pe aceasta cale va putea fi utilizat pt o serie de aplicatii ca: amplificare, digestie cu endonucleaze de restrictie si hibridizari pe membrane (Southern and dot/slot blots).

Kitul contine reactivi pentru 100 de izolari pentru 300µL sange periferic/proba100mL Solutie de liza celulara50mL Solutie de liza pt nuclei25mL Sol. De precipitare proteica50mL Sol. De rehidratare ADN250µL Sol. RN-aza

Materiale necesare: Tuburi sterile de 1,5mL, pentru microcetrifuga, pentru probe de 300µL sange

periferic; Tuburi sterile de 15mL, pentru cetrifuga, pentru probe de 3mL sange periferic; Baie de apa la 37ºC; Izopropanol la temperatura camerei; Etanol 70% la temperatura camerei; Baie de apa la 65ºC (optional, pentru rehidratarea rapida a ADN-ului);

IMPORTANT: sangele trebuie sa fie prelevat in tuburi pe anticoagulant cu EDTA, heparina sau citrat.

Mod de lucru:

1. Pentru volume de 300µL sange: se adauga 900µL Solutie de liza celulara, in tuburi sterile de 1,5mL, pentru microcetrifuga. Pentru volume de 3mL sange: se adauga 9mL Solutie de liza celulara in tuburi sterile de 15mL, pentru cetrifuga.

2. Se mixeaza cu grija de 5-6 ori cu micropipeta.3. Amestecul se incubeaza pentru 10 minute la temperatura camerei, apoi se

centrifugheaza 20 secunde la temperatura camerei, la 13,000-16,000xg (pentru probe de 3mL, centrifugarea se face 10minute la 12,000xg si temperatura camerei)

4. Se arunca cat mai mult din supernatant, dar fara a se atinge supernatantul (pellet-ul) alb vizibil. Astfel ca in tub sa mai ramana aproximativ 10-20µL de supernatant (pentru proba cu 3mL sange lichidul rezidual va fi de 50-100µL). Daca sangele a fost congelat etapele 1-4 se repeta pana cand se obtine un pelet alb. Prin inghetare exista riscul de a se pierde o parte din ADN.

5. tubul va fi vortexat 10-15 secunde pentru resuspendarea GA.

1

6. Solutia de liza a nucleilor se adauga in cantit de 300µL pentru o proba de 300µLsange (si 3mL pentru 3 mL proba) in tubul cu GA resuspensionate si se mixeaza cu pipeta de 5-6 ori. Amestecul trebuie sa devina foarte vascos. Daca acest lucru nu se intampla, atunci se incubeaza amestecul la 37ºC timp de o ora si daca nici atunci nu se intampla nimic, se mai adauga 100µL solutie de liza pentru nuclei.

7. Optional se adauga 1,5µL solutie RN-aza pentru o proba de 300µL(15µL solutie RN-aza pentru o proba de 3mL) si se amesteca de 2-5 ori cu pipeta, dupa care se incubeaza 15 minute la 37ºC.

8. Se adauga 100µL (130µL) solutie de precipitare a proteinelor pentru o proba de 300µL (1mL (eventual 1,3mLsolutie de precipitare) solutie pentru 3 mL proba). Lizatul nuclear este vortexat 10-20sec, precipitatul proteic putand fi vizibil dupa vortexare.

9. La temperatura camerei se centrifugheaza timp de 3 minute la 13,000-16,000xg. Supernatantul (pelet-ul) contine proteinele precipitate si 10 minute la 2,000xg pentru 3mL proba.

10. Intr-un nou tub steril de 1,5mL in care avem 300µL izopropanol la temperatura camerei se adauga supernatantul care a fost centrifugat anterior (3mL proba va fi transferata intr-un tub de 15mL). Dar, pentru a nu contamina supernatantul cu proteinele care au fost precipitate se mai lasa foarte putin lichid in tub (nu se ia tot supernatantul).

11. Cu miscari usoare si atente se intoarce cu grija tubul, masa de ADN devenind vizibila.12. La temperatura camerei se centrifugheaza pentru 1 minut, la 13,000-16,000xg, ADN-

ul fiind vizibil ca un mic pelet alb (1 minut la 2,000xg pt 3mL proba la temperatura camerei).

13. Supernatantul se indeparteaza, iar peletul de ADN va fi spalat cu 300uL alcool 70% la temperatura camerei, prin rasucirea de cateva ori, cu grija a tubului, dupa care se centrifugheaza ca la pasul 12.

14. Cu o micropipeta, se aspira cu foarte mare grija etanolul pentru a nu pierde peletul de ADN spalat cu alcool etilic.Apoi tubul este intors cu mare grija cu capacul in jos pe o hartie de filtru curata pentru a se scurge tot alcoolul. Aerul va usca peletul de ADN timp de 10-15 minute.

15. Se adauga 100µL solutie de rehidratare ADN in tub si se incubeaza 1 ora la 65ºC si periodic se agita foarte usor tubul (250µL solutie rehidratare pentru o proba de 3mL). Alternativ, ADN-ul poate fi rehidratat prin incubarea solutiei la temperatura camerei sau 4ºC timp de o noapte.

16. ADN-ul genomic astfel obtinut se pastreaza la 2-8ºC.

Probleme care pot sa apara in extractia ADN:

1. Impuritati in proba de sange- Cauze posibile: stocarea incorecta a tuburilor, sangele nu a fost omogenizat corect sau tuburile au mai fost utilizate si au urme de sange uscat.

2. O cantitate redusa de ADN- Cauze posibile: sangele contine o cantitate redusa de GA (si atunci se corecteaza prin prelevarea unei noi probe de sange), peletul de celule albe nu a fost resuspendat corespunzator la etapa 5 (trebuie vortexat foarte bine), proba de sange a fost prea veche (probele trebuie sa fie proaspete sau stocate la 2-5ºC daca sunt tinute mai mult de 5 zile) sau peletul de ADN a fost pierdut la precipitarea cu izopropanol (trebuie sa avem foarte mare grija atunci cand este mutat peletul de ADN in izopropanol).

3. ADN degradat (<50kb)- Cauze posibile: obtinerea probei in conditii improprii.

2

4. Absenta peletului proteic- Cauze posibile: proba nu a fost la temperatura camerei inainte de precipitarea cu solutie de precipitare a proteinelor (in aceasta situatie proba la temperatura camerei este vortexata timp de 20 secunde si centrifugata pentru 3 minute la 13,000-16,000xg (10 minute la 2,000xg pentru 3mL proba) continuand protocolul). Alta cauza ar fi aceea ca solutia de precipitare proteica nu a fost suficient de puternic omogenizata cu lizatul nuclear (se face intotdeuna complet acest lucru).

5. Dificultatea dizolvarii peletului de ADN- Cauze: proba este uscata (se rehidrateaza ADN-ul incubandu-l o 1h la 65ºC sau la temperatura camerei sau o noapte). Alta cauza ar fi ca nu a fost proba suficient de omogenizata dupa etapa de rehidratre (se va face acest lucru corespunzator).

Compozitia solutiei de rehidratare a ADN-ului : 10mM Tris-HCl (pH 7,4) 1mM EDTA (pH 8,0)

PROTOCOL

Cantitatea de proba (sange)

Solutia de liza Sol de precipitare a proteinelor

Izopropanol Sol de rehidratare ADN

Celule Nuclei 300µL 900µL 300µL 100µL 300µL 100µL1mL 3mL 1mL 330µL 1mL 150µL3mL 9mL 3mL 1mL 3mL 250µL10mL 30mL 10mL 3,3mL 10mL 800µL

Liza GR din proba de sange1. Se utilizeaza tuburi adecvate pentru volumul de sange si solutia de liza, conform

tabelului. Omogenizarea se face prin inversarea pozitiei tubului.2. Se incubeaza 10 minute la temperatura camerei.3. Se centrifugheaza la 13,000-16,000xg, 20 secunde pentru o proba ≤300µL proba si 10

minute la 2,000xg pentru o proba de 1-10mL sange.4. Se arunca supernatantul si se vortexeaza peletul.

Liza nucleilor si precipitarea proteinelor5. Se utilizeaza volumul de solutie de liza a nucleilor conform tabelului si se

omogenizeaza prin inversarea tubului.6. Se adauga sol utie de precipitare si se vortexeaza 20 secunde.7. Se centrifugheaza la 13,000-16,000xg, 3minute pentru o proba ≤300µL proba si 10

minute la 2,000xg pentru o proba de 1-10mL sange.Precipitarea ADN si rehidratarea ADN-ului

8. Supernatantul este transferat intr-un nou tub care contine izopropanol in volum corespunzator tabelului. Se amesteca.

9. Se centrifugheaza la 13,000-16,000xg, 1minut pentru o proba ≤300µL proba si 1 minut la 2,000xg pentru o proba de 1-10mL sange.

10. Se arunca supernatantul si se adauga etanol 70% in acelasi volum ca si izopropanolul11. Se centrifugheaza la 13,000-16,000xg, 1minut pentru o proba ≤300µL proba si 1

minut la 2,000xg pentru o proba de 1-10mL sange (ca la etapa 9).12. Se aspira etanolul si se lasa pell\etul sa se usuce in aer 10-15minute.13. Se rehidrateaza ADN-ul cu volum corespunzator de solutie de rehidratare timp de 1ora

la 65ºC sau o noapte la 4ºC. ( Plesca Simona-Elena )

3

4