Cursul 7

NEUROGENEZA LA ADULT

S-a considerat mult timp că sistemul nervos central nu îşi poate înlocui celulele degenerate. Această incapacitate era pusă pe seama interferenţei cu cicatricile gliale, lipsei factorilor neurotrofici care susţin supravietuirea şi creşterea celulară, prezenţei factorilor neurotoxici care împiedică remielinizarea. Formele de neuroplasticitate cunoscute explicau recuperarea parţială a funcţiei unui sistem prin preluarea funcţiei de către alte structuri nervoase, prin activarea unor circuite secundare, prin mecanisme adaptatorii celulare (ex. înmugurirea sau sproutingul neuronal) sau prin reînvăţare.

Cercetări recente au demonstrat că neuroplasticitatea este susţinută şi la nivelul producerii şi integrării funcţionale a unui număr mare de neuroni în creierul adult. Studierea sistemelor care continuă să producă noi neuroni de-a lungul vieţii poate fi cheia stimulării neurogenezei în creierul lezat (ex: boli degenerative, epilepsie, traumatisme cranio-cerebrale severe, accidente vascular-cerebrale), dar există dovezi şi asupra implicării neurogenezei ca suport specific al memorării şi învăţării.

Revenind la definiţia pe care am propus-o la inceput pentru neuroplasticitate, notăm că şi neurogeneza la adult are drept scop tot optimizarea functională a sistemului nervos. Conceptul de neuroplasticitate evoluează pe mai multe dimensiuni. Se remarcă dimensiuni ale manifestărilor neuroplastice, fiind cunoscute astăzi fenomene de plasticitate sinaptică şi plasticitate neuronală sub forma de neurogeneză şi creşteri ale numărului sau dimensiunii prelungirilor neuronale ce susţin modificările continue ale hărţilor corticale ca suport al exerciţiului învăţării şi memoriei. Mai distingem o evolutie a acestui concept de neuroplasticitate pe dimensiunea temporală în perioada de dezvoltare şi în viaţa adultă. De asemenea, neuroplasticitatea poate fi studiată în funcţie de nivelul de acţiune, cercetările pivotând de la neuroplasticitatea sistemelor cerebrale, la cea a reţelelor neuronale, a celulelor nervoase individuale şi a resorturilor moleculare ce se modulează în urma procesărilor specifice învăţării şi memoriei. În fine, neuroplasticitatea permite flexibilitatea reacţiilor structurale şi functionale solicitate de scopuri diferite: neuroplasticitatea compensatorie, care se manifestă pentru repopularea unor zone degenerate, reconstrucţia sau preluarea funcţiei unor circuite neuronale perturbate şi neuroplasticitatea constructivă, care asigură suportul nervos pentru realizarea învăţării şi memoriei.

Iniţial, se credea că neurogeneza, procesul de generare al neuronilor

integraţi din punct de vedere funcţional din celule progenitoare, are loc doar în timpul etapelor embrionare ale sistemului nervos central (SNC) al mamiferelor.

1

Cursul 7

Însă descoperiri recente au arătat că noi neuroni apar în regiuni discrete ale mamiferelor adulte. La majoritatea mamiferelor, neurogeneza apare în timpul vieţii în zona subventriculară (SVZ) a ventriculului lateral şi în zona subgranulară (SGZ) a girusului dentat din hipocampus. Neurogeneza apare extrem de rar în afara acestor regiuni sau chiar nu există. După stimularea patologică, cum ar fi leziuni ale creierului, neurogeneza la adult apare şi în regiuni considerate non-neurogenetice.

Metode de investiare a neurogenezei la adult Analiza neurogenezei endogene la adult in vivo 1. Analiza bazată pe încorporarea de nucleotide analoge în timpul

diviziunii celulare În timpul replicării ADN-ului în faza S a ciclului celular, nucleotidele

exogene de tipul timidinei sau 5-bromodeoxiuridina (BrdU) sunt încorporate în ADN-ul nou sintetizat şi apoi transmise la celulele viitoare (fig. 7-1). Doi analogi diferiţi pot fi folosiţi secvenţial pentru a măsura lungimea ciclului celular. Această tehnică simplă permite analiza cantitativă a proliferării, diferenţierii şi supravieţuirii celulelor nou formate. BrdU poate fi detectat imunohistochimic şi permite atât analiza fenotipică cât şi cuantificarea stereologică a celulelor noi.

Fig. 7-1 – Analiza bazată pe încorporarea de nucleotide analoge în timpul replicării ADN-ului în faza S a ciclului celular.

Există totuşi câteva limitări ale acestei abordări. În primul rând, necesită fixarea ţesutului şi denaturarea ADN-ului şi astfel nu este potrivită pentru analiza celulelor vii. În al doilea rând, marcarea celulelor este restricţionată doar

2

Cursul 7

la nucleu şi necesită microscopie confocală pentru a confirma colocalizarea cu diferiţi markeri celulari specifici (fig. 7-2).

Fig. 7-2 – Co-localizarea BrdU cu diferiţi markeri specifici: DCX – pentru neuroni imaturi; NeuN pentru neuroni maturi.

În al treilea rând, cantitatea de analogi nucleotidici încorporată dentr-o singură injecţie este diluată către nivele nedetectabile după câteva diviziuni celulare.

2. Analiza bazată pe marcarea genetică cu retroviruşi Expresia transgenelor din retroviruşi necesită integrarea virală în genomul

gazdei. Pentru retrovirusuri ce nu posedă mecanisme de import nucleare, cum ar fi în cazul virusul leucemiei murine, integrarea virală are loc doar atunci când membrana nucleară se rupe în timpul mitozei, fiind astfel un bun indicator al diviziunii celulare (fig. 7-3).

Fig. 7-3 - Analiza bazată pe marcarea genetică cu retroviruşi.

3

Cursul 7

Expresia GFP (proteina fluorescentă verde) permite vizualizarea directă şi analiza celulelor nou formate. Acestă tehnică necesită însă injectarea invazivă în regiuni specifice ale creierului. 3. Analiza bazată pe expresia unor markeri specifici

Neuronii în curs de dezvoltare exprimă markeri distincţi în timpul procesului lor de maturare. Dintre markerii comuni folosiţi pentru neuronii imaturi putem aminti PSA-NCAM (poly-sialytated-neuronal cell-adhesion molecule), Tuj1 (β tubulina izoforma III) şi DCX (doublecortin). Markerii folosiţi pentru neuronii maturi includ MAP-2ab (microtuble-associated protein-2 formele a şi b) şi Neu N (nuclei neuronali). Neuronii nou formaţi pot fi identificaţi prin prezenţa de markeri imaturi şi absenţa de markeri maturi ai neuronilor.

Un progres important în neurogeneza la adult l-a constituit generarea de modele animale ce permite vizualizarea şi manipularea specifică a neuronilor nou formaţi în SNC adult (fig. 7-4).

Fig. 7-4 - Analiza bazată pe expresia unor markeri specifici.

Au fost generaţi câţiva şoareci transgenici pentru a exprima genele specifice interesate sub acţiunea unui promotor ales. De exemplu, şoarecii adulţi ce exprimă GFP sub controlul regiunilor reglatorii ale genei Nestin (marker neuronal timpuriu) arată atât progenitorii naturali cât şi neuronii imaturi.

Analiza fenotipică a celulelor nou formate necesită examinarea co-localizării markerilor specifici celulari. Deoarece celulele sunt strâns legate între ele în SNC adult, metoda actuală îşi propune reconstrucţia tridimenională cu ajutorul mocroscopiei confocale (vezi fig. 7-2). Microscopul electronic a fost utilizat de asemenea pentru a arăta ultrastructura celulelor nou formate.

Analiza neurogenezei la adult in vitro şi ex vivo Progenitorii neuronali multipotenţi au fost izolaţi din regiuni variate ale

SNC adult al mamiferelor. Aceste celule au fost dezvoltate şi modificate genetic şi păstreză în continuare capacitatea lor multipotentă de-a lungul mai multor

4

Cursul 7

generaţii. Datorită accesibilităţii uşoare şi condiţiilor de cultură definite, manipularea progenitorilor neuronali adulţi în monostrat permite analiza precisă a mecanismelor intrinseci şi extrinseci ce controlează etapele variate ale neurogenezei, incluzând proliferarea, supravieţuirea, soarta, migrarea neuronală, maturarea şi formarea sinapselor.

Culturile progenitorilor neuronali din SNC adult sunt stabilite în mare măsură pe baza creşterii preferenţiale faţă de alte alte tipuri de celule în medii de cultură definite cu factori de creştere specifici (fig. 7-5).

Fig. 7-5 – Metodologia pentru analiza neurogenezei adulte in vitro şi ex vivo. Progenitori neuronali multipotenţi au fost cultivaţi din regiuni variate ale SNC adult.

5

Cursul 7

Celulele extrase din ţesuturile specifice sunt plasate fie direct, sau după o purificare parţială în prealabil pentru a înlătura contaminanţii majori. Metodele de izolare prospectivă folosind sortarea celulelor fluorescent-active (FACS) au fost dezvoltate recent pe baza proprietăţilor celulelor. Se folosesc două tipuri de culturi celulare progenitoare. În culturile neurosferice, progenitorii neuronali individuali proliferează pe un substrat non-adeziv şi generează un grup de celule suspendate. În culturile adezive, progenitorii neuronali cresc în monostrat pe laminină. Cei mai frecvenţi factori de creştere folosiţi pentru a menţine reînnoirea progenitorilor neuronali adulţi cultivaţi sunt EGF (factorul de creştere epidermal) şi FGF-2 (factorul de creştere al fibroblaştilor).

Neurogeneza activă are loc doar în regiuni discrete ale SNC adult intact.

Neuronii sunt generaţi continuu în zona subventriculară (SVZ) şi migrează anterior de-a lungul reţelei migratorii rostrale (RMS) către bulbul olfactiv pentru

Fig. 7-6 – Generarea de noi int

a deveni interneuroni (fig. 7-6).

erneuroni în bulbul olfactiv din celule stem

eurogeneza la adult în zona subventriculară/sistemul olfactiv prezintă patru

liferarea: celulele stem (albastru) din zona subventriculară a ventri

ţierea: celulele amplificatorii tranzitorii se diferenţiază în neuron

neuronale din zona subventriculară. N

etape: 1. Proculului lateral dau naştere la celule amplificatoare tranzitorii (albastru

deschis). 2. Difereni imaturi (verde). Celulele ependimale adiacente (cenuşiu) ale

ventriculului lateral sunt esenţiale pentru stabilirea soartei neuronilor prin furnizarea de inhibitori de glicogeneză.

6

Cursul 7

3. Migrarea: Neuronii imaturi (verde) migrează în lanţ de-a lungul reţelei migratorii rostrale către bulbul olfactiv. Odată ajunşi la bulb, noii neuroni migrează radial către straturile celulare exterioare.

Cum pot însă aceste celule să se mişte şi să se orienteze de-a lungul unor distanţe atât de mari şi să traverseze parenchimul dens al creierului adultului?

În zona subventriculară adultă (SVZ) şi în RMS, celulele A (galben) au o

morfologie elongată cu un proces proeminent (fig. 7-7).

Fig. 7-7 - Migraţia în lanţ – neuronii tineri din reţeaua SVZ şi din RMS

lanţurile reconstituite in vitro, neuroblaştii se deplasează cu paşi mărun

nţiază fie în neuroni granul

dendritici.

migrează alături cu formarea de lanţuri lungi. Lanţurile de celule migratorii (roşu) sunt flancate de către celulele gliale (albastru) ce au caracteristici de astrocite. Aici sunt ilustrate 2 lanţuri.

Înţi la o viteză de ~120µm/h. Mecanismul celular ce propulsează neuronii

tineri cu o astfel de viteză nu este cunoscută. Este posibil ca polimerizarea microtubulilor şi depolimerizarea să joace un rol important. Dublucortina (DCX), o proteină asociată microtubulului este exprimată predominant de către celulele din lanţurile reţelei migratorii rostrale, sugerând că migrarea către bulbul olfactiv (OB) la adult presupune mecanisme moleculare cheie asemănătoare celor care au loc în dezvoltarea embrionară.

4. Integrarea sinaptică: neuronii imaturi se difereari (portocaliu), fie neuroni periglomerulari (roşu). Aceşti interneuroni

neobişnuiţi nu au axon, şi în schimb eliberează neurotransmiţătorul din spinii

7

Cursul 7

Neurogeneza hipocampică la primatele adulte

Neurogeneza la adult a fost semnalată prima dată la rozătoare, unde neuronii granulari sunt generaţi de-a lungul vieţii dintr-o populaţie de celule progen dentat. Aceste celule migrează până în stratul celulelor granulare, se diferenţiază şi exprimă fenotipuri neuron

iune transversală a hipocam jore: DG (girusul dentat), EC (cortexul entorinal), S (subiculum); Jos – celulele progenitoare neruonale (NPCs) sunt distribuite de-a lungul zonei subgranulare (SGZ), la graniţa dintre

atta care aveau între 5 şi 23 de ani au primit injecţii intraperitoneale de 5-bromodeoxiuridină (BrdU, ex. un analog al timinei care este în

itore prezentă în zona subgranulară a girusului

ale (fig. 7-8).

Fig. 7-8 – Neurogeneza în girusul dentat adult – Sus - secţpului ilustrând diviziunile citoarhitectonice ma

stratul celular granular (GCL) şi hil (H); ML-strat molecular; MF-fibre muşchioase.

Gould et al (1999) au investigat în ce mod neurogeneza la adult se produce şi la primate. Unsprezece maimuţe adulte Maccaca fascicularis şi Maccaca mul

corporat de celule în faza S, de sinteză a ADN, a diviziunii mitotice). Erau consideraţi adulţi tineri indivizii maturi sexuali (4 ani fem./masc.), dar care nu au atins greutatea corporală maximă (6 ani fem./9 ani masc.) şi adulti de vârstă medie indivizii care au trecut de perioada greutăţii corporale maxime. Pentru

8

Cursul 7

identificarea fenotipului celulelor, s-a realizat marcarea dublă cu BrdU şi cu markeri specifici celulari (ex. TOAD-64, pentru celulele în curs de diviziune, NSE, NeuN şi calbidina pentru neuroni şi GFAP pentru celule gliale) şi examinarea prin metode imunocitochimice pentru aceşti markeri. Intervalul dintre ultima injecţie BrdU şi prelevarea secţiunilor a variat de la 2h, perioada suficientă pentru ca BrdU să fie preluat de celulele în faza S, dar insuficient pentru mitoză sau migrare, la 1-2 saptămâni, pentru maximizarea şansei de a observa celule noi (BrdU pozitive) care exprimă markerii neuronali şi minimizarea probabilităţii ca aceste celule să moară în interval.

Rezultatele au indicat că, la toţi indivizii, celulele BrdUp pot fi observate în girusul dentat, în zona subventriculară (SVZ) aliniată la peretele ventriculilor laterali şi într-o regiune corespunzătoare reţelei migratorii rostrale (RMS).

identificate în zona subgranulara şi în hilus. În general, tinerii adulţi prezintă mai multe

are reduce neurogeneza la adult. O posibilitate este ca scăderea neurogenezei adulte în funcţie de vârstă să fie media

dezvoltare, majoritatea neuronilor fiind deja prezenţi în a şaptea lună de gestaţie şi des n studiu al lui Eriksson et al

La lotul la care secţiunile au fost prelevate la 2h după ultima infuzie BrdU, celulele BrdUp erau observate ocazional în reţeaua migratorie rostrală, girusul dintat şi zona subventriculară, iar grupuri mici de celule BrdUp erau

celule BrdUp în girusul dintat faţă de maimuţele de vârstă medie sau senescente (23 ani). La animalele sacrificate la 1-2 săptămâni după ultima injecţie, celulele noi (BrdU/TOAD-64, NSE, NeuNp, dar nu BrdU/GFAPp) erau prezente în aspectul profund al girusului dentat în proporţii variind de la 780 la 4308 celule; multe din celule prezentau caracteristicile morfologice ale neuronilor granulari, ex. corpuri celulare de mărime medie, rotunde sau ovale. La animalele care au primit injecţii multiple de BrdU, numărul mediu de celule BrdUp era semnificativ: 1230 celule BrdUp în curs de diviziune (TOAD-64p), 822,1 celule BrdUp cu fenotip neuronal (NSE, NeuNp), 793 celule BrdUp cu fenotip neuronal granular (calbidinap). Celulele noi în curs de diviziune prezentau caracteristicile morfologice ale neuronilor granulari, inclusiv dendrite care se extindeau prin stratul molecular.

Analizele stereologice au relevat scăderea numărului de celule BrdU/TOAD-64p cu înaintarea în varsta. Se ştie că stresul determină creşterea nivelului glucocorticoizilor circulanţi c

tă tot de creşterile asociate ale glucocorticoizilor. Nu s-au observat diferenţe între distribuţia celulelor BrdUp sau TOAD-64p între cele două specii.

Neurogeneza în hipocampul uman adult

Generarea de neuroni se credea că este limitată la o perioadă discretă de

ăvârşindu-şi migrarea în viaţa prenatală. U

9

Cursul 7

(1998

acienţi cu cancer care primiseră o injecţie cu BrdU în scopuri diagnostice (ex. pentru monitorizarea metastazelor). Celulele BrdUp au fost cuanti

) confirmă neurogeneza la adult ca pe o formă de neuroplasticitate prezentă şi la om.

S-a prelevat post-mortem ţesut hipocampic şi din SVZ adiacentă nucleului caudat de la cinci p

ficate în stratul granular, zona subgranulară a girusului dentat şi în hilus (ex. aria CA4). Variaţia inter-individuală a numărului de celule BrdUp a fost determinată de diferenţa intervalului post-infuzie (16-781 zile) şi vârsta diferită a subiectilor (57-72 de ani).

Celulele gliale stelate cu nuclei neregulaţi şi corpi celulari mici (BrdU/GFAPp:18,1+1,8%) erau prezente în jurul neuronilor, dar nu coincideau cu celulele BrdUp cu fenotip neuronal. Acestea din urmă erau localizate în stratul granular sau în apropierea acestuia, prezentau corpi celulari mici sau medii cu nuclei rotunzi sau ovali; proporţia medie de celule noi cu fenotip neuronal era de 22,0+2,4%, iar numărul celulelor BrdU/NSEp (neuroni) şi BrdU/calbidinap (neuroni granulari) era de 22,7+2,8%, respectiv, 7,9+2,2%.

În zona subventriculară, toate secţiunile au conţinut celule BrdUp, dar nu au exprimat markerii specifici celulelor post-mitotice. Aceste celule noi au un nucleu mic rotund sau oval, similare cu progenitorii observaţi la SVZ a rozăto

eze pentru a se putea diferenţia.

Unele studii (Altman et al, 1965, 1967) indicau o corelaţie interesantă între c rea repetată a drumului, comportamentele de extindere a teritoriului care se sprijină pe ab

h/1-3 săptămani s-au prelevat secţiuni din cortexul prefrontal, cortexul temporal inferior, posterior parietal

arelor.

Deci SVZ umană conţine populaţii mari de celule pluripotente care e nevoie să migr

Neurogeneza corticală la adult: un posibil suport pentru învăţare

omportamente complexe (ex. construirea cuibului care solicită reface

ilităţi spaţiale complexe) şi neurogeneză. Intensificarea ciclurilor neurogenice se corelează cu creşteri ale performanţei. Dat fiind rolul cunoscut al hipocampului în sarcinile de memorare şi învăţare, s-a sugerat ideea că neurogeneza la adult ar asigura un suport pentru sarcinile de învăţare dependente de hipocamp. Ulterior, cercetările efectuate la păsări adulte au arătat că neurogeneza se produce şi în hiperstriatum, o structură omoloagă cortexului cerebral de la mamifere. Pe aceste premise, evidenţierea neurogenezei neocorticale la mamiferele adulte era previzibilă.

Experimentele s-au realizat la 12 maimuţe Maccaca fascicularis adulte care au fost injectate cu BrdU. La intervale de 2

10

Cursul 7

(locali

aliniate cu peretele ventriculilor laterali. Aceste celule precursor originare în SVZ migrează ca neuroblaşti prin substa

rează în circuite locale. Deci neuroblaştii se diferentiază, se agregă şi devin funcţionali numai

ca substrat specific pentru învăţare. Adăugarea de noi neuroni neocortexului în timpu

învăţării şi memorării la nivel celular. În această etapă, eforturile teoretice de sinteză şi elaborarea unor modele alternative care să încerce explic

zări implicate în procesări cognitive laborioase) şi cortexul striat (unde se realizează procesarea primară a stimulilor vizuali) care au fost analizate prin metode histochimice pentru markerii celulari.

La animalele la care secţiunile s-au prelevat la 2h după injecţia BrdU, celulele BrdUp au fost localizate în SVZ,

nţa albă către regiunile din neocortex unde se diferenţiază în neuroni maturi. La animalele la care s-au prelevat secţiuni la 1-3 săptămani după injecţia BrdU, s-au observat celule cu nuclei ovali sau rotunzi, cu morfologie specific neuronală, în cortexul prefrontal, posterior parietal şi temporal inferior, precum şi în substanţa albă din porţiunea intermediară SVZ-zona neocorticală. În cortexul striat s-au identificat celule gliale noi, dar nici un neuron nou.

Prin metoda etichetării retrograde, s-a determinat că celulele nou generate şi care au migrat în respectivele zone corticale îşi extind axoni şi se integ

în zonele implicate în procesări cognitive laborioase. Oferim drept posibilă explicaţie faptul că neurogeneza depinde şi de acţiunea neurotrofinelor care, asa cum am vazut, acţionează preferenţial asupra sinapselor activate.

Zonele prefrontală, parietală şi temporală inferioară sunt implicate în plasticitatea comportamentală. Neuronii noi adăugaţi acestor zone pot servi

l vieţii adulte asigură un continuum de neuroni de diferite “vârste”, care ar putea forma complexul neuronal al dimensiunii temporale a memoriei (Gould, 1999).

Descifrarea neurogenezei adulte pare să readucă, cel puţin temporar, teoriile

area felului în care neurogeneza la adult susţine învăţarea pot debloca cercetarea.

11